CN100367872C - 柠檬酸提取梨花粉原生质体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明梨花粉和花粉管原生质体的提取方法，涉及植物体细胞壁的破除和原生质体获取的方法，是属于生物化学及食品科学领域；本发明主要是依据植物花粉细胞壁的特性来获取完整的花粉或花粉管原生质体，而且保持原有的活力。利用柠檬酸去除花粉壁的方法，该方法是将干燥的花粉放入2-3mol/L柠檬酸液中，经过约30分钟左右的培养，可看到花粉的原生质体逐渐从萌芽口处出来，通过离心能够获得脱壁的花粉原生质体，该方法获得了原生质，能够保持原有的营养价值，没有污染，方法简单，成本低，非常适合于在食品科学领域的应用。

Description

柠檬酸提取梨花粉原生质体的方法

技术领域

本发明是梨花粉和花粉管原生质体提取的方法，涉及植物细胞破壁和获取具有活力原生质体的方法，属于生物化学及食品科学领域。

背景技术

植物花粉(pollen)不仅在植物繁衍后代、扩大遗传组成与分布范围等方面起极其重要作用，而且其营养极其丰富。近年来研究表面：花粉含有种类繁多的碳水化合物、有机酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、色素、维生素与矿物质等营养成分。其中蛋白质的含量十分丰富，达7％-40％，胜过酪蛋白。花粉中含有18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，其含量多于牛奶、鸡蛋的5-7倍，尤其是赖氨酸的含量特别丰富，它有利儿童生长发育。花粉还含有维生素A、维生素B群(B₁、B₂、B₆、B₁₂)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素P以及泛酸、叶酸、烟酸等10多种维生素，特别是维生素E，C，P，能增强人体免疫功能，促进延年益寿，软化血管，预防动脉硬化和冠心病。花粉还含有90多种酵酸素、酶和辅酶，这些酶类保存着天然活力，是生命活动过程中的重要物质，是一种天然高级营养品，因而，也为国际上誉为“完全营养食品”(perfect foods)。

我国土地辽阔，种子植物有3万余种。花粉虽小，但植物产花粉数量十分惊人，一株玉米可产5000万粒花粉。我国耕地约有1.0005亿hm²(15亿亩)，所以花粉资源十分丰富，居世界首位。目前全国养蜜蜂700万群左右，假如每群蜂一年采集10Kg花粉，那么每年就会产7000万Kg，如果再加上人工或机器收集花粉，那将是一种非常可观的潜在的食物资源。但目前开发利用不到1/200，所以研究、开发、应用花粉，对人类的幸福生存，具有深远的意义。

虽然花粉的食用营养及药用价值很大，但是由于花粉壁的构造、组成较为特殊、结构坚硬，如果不去壁，其营养很难被人体有效的吸收利用，特别是花粉口服液饮料等更应选用去壁后的花粉原生质体为原料。为此，在食品科学领域，有许多学者开展相关的开发研究，现有的花粉去壁的方法可以归结为以下三类：1)物理方法：这种方法也比较常见，对花粉进行干燥或冰冻，然后再对花粉进行研磨，该方法多用于食品工业，用于提取花粉的内容物；2)生理方法：用一定渗透压的溶液浸泡花粉，让原生质体膨胀，撑破花粉壁，而获得原生质体或花粉内含物，但该方法应用较少，3)发酵法：直接利用花粉本身所有的酶类和微生物，使花粉达到发酵破壁的目的。虽然已经有这些去壁的方法，但是，这些方法存在很多问题，主要问题有：其一是用这些方法所获得的花粉原生质体不仅失去原有的生物活力，而且对营养成分还会带来一定的破坏性，在很大程度上降低所具有的营养价值；其二是这些获取花粉原生质体的方法不能适合于所有的植物花粉，比如，用这些方法无法获取梨、苹果等蔷薇科果树花粉的原生质体。

发明内容

技术问题本发明的目的是提供梨等蔷薇科植物花粉原生质体的提取方法，有效地分离出具有活力的、保存原有养分和活性的花粉原生质体。该方法可用于分离提纯其他蔷薇科果树(苹果、桃、杏、李等)花粉原生质体，也为其他组织器官的原生质体的分离提供参考。

技术方案  本发明是用柠檬酸(citric acid anhydrate)去除花粉壁来获得花粉的内容物(原生质)的方法，可用于绝大多数植物的花粉，也就是说，只要所用的植物花粉具有萌发孔或萌发沟，就能获取其原生质，这种方法非常适合于食品科学领域的开发应用。

该方法包含下列步骤：

1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)柠檬酸液的制备：2-3mol/L的柠檬酸，加入5～10mmol/L的MES(Fatty AcidMethl Ester Sulfonic Acid(salt)，α-磺基甲脂磺酸钠)溶液和0.01～0.02mmol/L的BSA(Bovine SerumAlbumin，牛血清蛋白)；

3)花粉破壁：取充分干燥的花粉放入配制好的柠檬酸液中，置于摇床中，温度为30-37℃，100-120rpm，30min后，就可见花粉的原生质体逐渐从萌芽口处出来，从而获得破壁的花粉原生质，一般处理时间掌握在1小时之内。花粉的去壁数量是随着处理时间的延长而增多，但时间过长时，大部分花粉原生质体将变得不完整，原生质体的活力也下降；

4)离心：破壁后的花粉先进行高速离心(5000rpm以上，5-10min)，取沉淀物。沉淀物放入蒸馏水中，进行低速成离心(500rpm以下，3min)用以去除花粉外壳。上清即为所需的花粉原生质体。

有益效果

本发明的积极效果：

1)首次从蔷薇科果树梨花粉及花粉管中分离出具有活力的原生质体，可以用于各种相关的科学研究，尤其是梨花粉生理生化特性的基础性研究；比如，花粉原生质体适合于作为研究植物细胞的分子结构的实验材料；

2)应用本发明的方法提取的具有活力的原生质体，在植物的杂交育种领域，有较大的应用前景，通过同一来源或者不同来源的具有活力的原生质体的相互融合，可以重新发育成新的植株，这种方法称为体细胞杂交，是创新种质的重要手段；

3)本发明是基于对梨花粉及花粉管生理生化及细胞信号转导等特性研究的工作基础。花粉原生质体具有单倍性、结构简单、发育同步和群体数量大等优点，被认为是″遗传操作和突变研究的卓越体系”，提供“研究花粉生理学和个体发育的新途径”。另外，在研究植物受精生理学中，许多重要的生理生化反应都是发生在花粉管内，如自交不亲和反应等；因此，获得花粉管原生质体是开展这些科学理论研究的重要前提。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法较简便，易于操作和实际应用。

4)采用本发明方法提取梨花粉及花粉管原生质体，柠檬酸可以反复使用，节省投资；柠檬酸是食品添加剂，用它作为花粉破壁的药剂，不会对环境产生污染，副产品少；柠檬酸对花粉的破壁，对条件要求不高，方法简便，易于操作，实际应用性强，适合于食品科学领域的花粉保健品的生产，因此，有很好的开发应用前景。

附图说明

图1柠檬酸去除花粉破壁流程图

图2柠檬酸处理花粉效果图

a柠檬酸处理花粉10min

b柠橡酸处理花粉1h

c柠檬酸处理花粉2h

具体实施方式

提取植物花粉(管)原生质体，是研究花粉(管)的生理、生化特性及其功能的必要前提之一。我们应用本发明的方法，获取了具有活力的梨花粉管原生质体，利用膜片钳直接鉴定出花粉管的钙通道及花粉管内的钙梯度及其相关功能，为拓宽和深入研究花粉管的电化学特性奠定基础。众所周知，获取花粉(管)原生质体是开展膜片钳实验研究的前提，而迄今，在根毛、藻类的假根及菌丝都是采用激光切除细胞壁，这种方法需要较为昂贵的实验设备，其次，目前关于获取花粉有活性且完整的原生质体，都是以幼嫩和新鲜的花粉为材料，而对于一年只能采收一次，而且是成熟的花粉没有报道，如梨、苹果、桃等。更没有关于如何获取花粉管原生质体的报道。

实验以梨花粉作为材料，采用本发明方法获取了具有活力的花粉管原生质体，并利用膜片钳成功鉴定出梨花粉管尖端的钙通道。实验过程如下：

1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)柠檬酸液的制备：2-3mol/L的柠檬酸，加入5～10mmol/L的MES(FattyAcidMethl Ester Sulfonic Acid(salt)，α-磺基甲脂磺酸钠)溶液和0.01～0.02mmol/L的BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清蛋白)；

3)花粉破壁：取充分干燥的花粉放入配制好的柠檬酸液中，置于摇床中花粉破壁处理，温度为30-37℃，100-120rpm，30min后，就可见花粉的原生质体逐渐从萌芽口处出来，从而获得破壁的花粉原生质，一般处理时间掌握在1小时之内。花粉的去壁数量是随着处理时间的延长而增多，但时间过长时，大部分花粉原生质体将变得不完整，原生质体的活力也下降(图2)。

4)离心：破壁后的花粉先进行高速离心(5000rpm以上，5-10min)，取沉淀物。沉淀物放入蒸馏水中，进行低速成离心(500rpm以下，3min)用以去除花粉外壳。上清即为所需的花粉原生质体。

Claims (1)

1.柠檬酸提取梨花粉原生质体的方法，包括下列步骤：

1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)柠檬酸液的制备：2-3mol/L的柠檬酸，加入5～10mmol/L的α-磺基甲脂磺酸钠溶液和0.01～0.02mmol/L的牛血清蛋白；

3)花粉破壁：取充分干燥的花粉放入配制好的柠檬酸液中，置于摇床中花粉破壁处理，温度为30-37℃，100-120rpm，30min后，就可见花粉的原生质体逐渐从萌芽口处出来，从而获得破壁的花粉原生质，花粉破壁处理时间掌握在1小时之内；

4)离心：破壁后的花粉先进行高速离心5000rpm以上，5-10min，取沉淀物；沉淀物放入蒸馏水中，进行低速离心500rpm以下，3min用以去除花粉外壳，上清即为所需的花粉原生质体。

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