CN112544342A - 一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉5‑15g/L、维生素B1 40‑70mg/L、肉豆蔻酸钾盐0.5‑1mmol/L、酵母浸粉2‑8g/L。本发明的中华鹅膏菌专用培养基能高效地进行中华鹅膏菌的菌丝繁育，96％的组织块能够在培养基上萌发形成菌落，极大提升了菌丝繁育的成功率，能满足大量生产需要，解决了中华鹅膏菌的母种培养技术难题；同时，本发明所需培养材料成本低廉，易于获取，培养基的配制简单易操作。对于后续开展中华鹅膏菌人工接种、林下栽培具有重要的价值，同时为开展后续中华鹅膏研究提供有力支持，具有较大的经济和社会效益。

Description

一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食用菌技术领域，尤其涉及一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用。
背景技术
中华鹅膏(Amanita sinensis Zhu L.Yang)是一种在中国南部一带很受欢迎的野生食用菌，广泛分布于广东、广西、福建、云南和四川等省份，是一种非常重要的林下食用菌资源，中华鹅膏菌的外观图如图1所示。中华鹅膏隶属于鹅膏科鹅膏属鹅膏亚属鹅膏组，但并不具有该组物种常见的毒性，其营养丰富，鲜美可口，具有极高的应用开发价值。作为外生菌根菌，中华鹅膏可与松科、壳斗科等树种共生，这种共生功能是森林维持和发展的基础，并在森林植被保存、恢复和发展方面起着重要的作用，在森林生态系统中具有重要的价值。中华鹅膏在植物根部定植后，可与根部细胞相互作用，在细胞间隙形成哈氏网结构，增加菌丝与根部细胞物质能量交互的膜面积，并显著促进植物的生长。然而，外生菌根真菌生长的能量代谢机制并不明确，通常人工培养非常困难，这是目前外生菌根真菌繁育的热点及难点。已有研究表明脂肪酸代谢是在共生交互膜结构的形成及生长中不可或缺的成分，而肉豆蔻酸盐也已被证明是一种能够显著促进共生真菌菌根形成的脂肪酸类物质，肉豆蔻酸盐在外生菌根真菌的繁育研究中具有极大的潜力。
目前，我国中国鹅膏菌可使用的专用培养基发明专利有两项。发明一(CN107686386 A)：使用黑豆皮5-10份、银杏树木屑5-10份、山药淀粉3-5份、红树莓5-8份、黑莓果渣4-8份、螺旋藻粉2-5份、竹笋叶3-8份、辣木叶2-5份、玉米须2-5份、枸杞1-3份、叶酸0.1-1份、维生素B12 0.05-0.2份、石膏2-4份、石灰1-3份。发明二(CN 103980060 A)：使用马铃薯100g/L、玉米粒20～30g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、马尾松松针汁液150～300mL/L。
现有的两种发明专利制备方法存在明显的局限性和缺点：第一，中华鹅膏菌是松科等少数植物专性共生的外生菌根菌，通常菌体内存在菌寄生菌，受限于目前已有的外生菌根真菌的培养基极不完善，通常菌寄生菌更容易被分离且快速生长，而外生菌根菌的长势却较为缓慢，接种后长出的菌丝并不一定代表真正的中华鹅膏菌菌丝，这也是目前外生菌根真菌分离的难点，菌种分离时一定要选择菌幕完整的幼嫩个体；第二，中华鹅膏菌作为专性共生菌，仅松科等少数植物可为其提供生长所需能量(碳源)，发明一中培养基所需材料较多且并不容易获得，多数材料是否能够提供中华鹅膏利用的能量，是否能提升其营养价值，都未有明证，中华鹅膏菌的营养价值在于其本身；第三，接种选用新鲜中华鹅膏个体未完全开伞状态下的菌盖菌柄交接处组织块，初期快速出现的短毛状白色菌丝极大可能是原有野生个体菌丝的惯性继续生长，但并不能在常规培养基上正常持续生长，不可代表母种，且使用以上两种培养基进行母种选育的成功率也未有进行验证。
发明内容
本发明为解决现有技术中存在的不足，提供一种高效中华鹅膏菌专用培养基及其制备方法与应用。
本发明的目的是通过以下技术方实现的：
一种高效中华鹅膏菌专用培养基，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉5-15g/L、维生素B1 40-70mg/L、肉豆蔻酸钾盐0.5-1mmol/L、酵母浸粉2-8g/L。
进一步，一种高效中华鹅膏菌的专用培养基，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉10g/L、维生素B1 50mg/L、肉豆蔻酸钾盐1mmol/L、酵母浸粉4g/L。
本发明还提供一种高效中华鹅膏菌专用培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1制备肉豆蔻酸钾盐溶液：取1.14g肉豆蔻酸和0.28g氢氧化钾加入500ml水中，加热充分溶解，配置成10mmol/L的肉豆蔻酸钾盐溶液备用；
S2制备高效中华鹅膏菌专用培养基：50-100ml肉豆蔻酸钾盐溶液，40g PDA培养基干粉，5-15g麦芽浸粉，40-70mg维生素B1，2-8g酵母浸粉加热至材料全部溶解，定容至1L，自然pH，121℃高压灭菌30分钟，倒平板后得到中华鹅膏菌专用培养基。
本发明还提供了一种高效中华鹅膏菌专用培养基在诱导中华鹅膏菌母种中的应用。
进一步，所述诱导中华鹅膏菌母种的应用，母种的分离方法包括以下步骤：
S1：在野外采集中华鹅膏菌新鲜的长势健壮的子实体；
S2：于超净工作台上紫外消毒灭菌后，取出组织块；
S3：将组织块放入平板培养基，于24-26℃下恒温培养30-50天，组织培养块上长出灰褐色“愈伤”状结构并向外延伸形成菌落，即为中华鹅膏菌母种，继续培养则母种表面会变白；
S4：钩取母种的菌丝继续转管培养，即为子代母种，可用于后续生产和试验。
进一步，所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，步骤S1中，所述子实体为未开伞，菌幕完整，无丝毫脱落。
进一步，所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，步骤S1中，所述子实体为部分开伞，菌幕完整，无丝毫脱落。
进一步，所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，步骤S2中，所述组织块为剔除菌环后取菌褶与菌盖交接处组织。
进一步，所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，步骤S2中，所述组织块为剔除菌环后取菌盖与菌柄交接处组织。
相对于现有技术，本发明的优点如下：
本发明所述的中华鹅膏菌专用培养基能高效地进行中华鹅膏菌的菌丝繁育，96％的组织块能够在培养基上萌发形成菌落，极大提升了菌丝繁育的成功率，能满足大量生产需要，解决了中华鹅膏菌的母种培养技术难题；同时，本发明所需培养材料成本低廉，易于获取，培养基的配制简单易操作。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是中华鹅膏菌的外观图；
图2是实施例1、2和对比实施例的取样点示意图；
图3是实施例1其中一个平板培养50天的母种组织形态图；
图4是实施例2其中一个平板培养50天的母种组织形态图。
具体实施方式
本发明公开的一种高效中华鹅膏菌专用培养基，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉5-15g/L、维生素B1 40-70mg/L、肉豆蔻酸钾盐0.5-1mmol/L、酵母浸粉2-8g/L。
本发明所述的高效中华鹅膏菌专用培养基配方中加入了0.5-1mmol/L肉豆蔻酸钾盐，其是一种能够显著促进共生真菌菌根形成的脂肪酸类物质，为缺乏脂肪酸从头合成相关酶类的中华鹅膏菌提供了必需营养物质，补足了中华鹅膏菌脂肪酸代谢的不足，因此可以高效地繁育菌丝并诱导中华鹅膏菌的母种。
现结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
野外采集生长健壮，未开伞，菌环完整的子实体，放入冰盒内当日带回实验室，超净工作台内立即进行分离，获得培养用组织块，组织块的面积为0.25-2.5cm2，取样点如图2所示。
将切取的组织块，接种入平板培养基内，所述培养基成分为：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉10g/L、维生素B1 50mg/L、肉豆蔻酸钾盐1mmol/L、酵母浸粉4g/L。所述培养基制备方法：取40g PDA培养基干粉，100ml肉豆蔻酸钾盐溶液，10g麦芽浸粉，50mg维生素B1，4g酵母浸粉，加热至材料全部溶解，定容至1000ml，自然pH，121℃高压灭菌30分钟，冷却后倒平板备用。
接取50个平板，放置在温度26℃恒温培养箱中培养5天，可看到所有组织块表面都变白，继续培养，组织块周围可形成灰褐色“愈伤“状结构，并逐渐表面变白，请参照图3，其为本实施例其中一个平板培养50天的组织形态图，可以看到其组织块已经产生少量愈伤状的菌落结构且表面发白；继续培养至60天后可看到48个组织块边缘都产生愈伤状的菌落结构，转接后可看到母种菌落持续扩大。2个平板组织变褐色，但未看到菌落形成。实验结果说明，该中华鹅膏菌专用培养基适用于中华鹅膏菌母种的诱导和培养，诱导中华鹅膏菌母种的成功率为96％。
实施例2
野外采集生长健壮，未开伞，菌环完整的子实体，放入冰盒内当日带回实验室，超净工作台内立即进行分离，获得培养用组织块，组织块的面积为0.25-2.5cm2，取样点如图2所示。
将切取的组织块，接种入平板培养基内，所述培养基成分为：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉8g/L、维生素B1 60mg/L、肉豆蔻酸钾盐0.5mmol/L、酵母浸粉2g/L。所述培养基制备方法：取40g PDA培养基干粉，100ml肉豆蔻酸钾盐溶液，8g麦芽浸粉，60mg维生素B1，2g酵母浸粉，加热至材料全部溶解，定容至1000ml，自然pH，121℃高压灭菌30分钟，冷却后倒平板备用。
接取50个平板，放置在温度26℃恒温培养箱中培养5天，可看到所有组织块表面都变白，继续培养，组织块周围可形成灰褐色“愈伤“状结构，并逐渐表面变白，请参照图4，其为本实施例其中一个平板培养50天的组织形态图，可以看到其组织块边缘已经产生少量愈伤状的菌落结构且表面发白；继续培养至60天后可看到43个组织块边缘都产生愈伤状的菌落结构，转接后可看到母种菌落持续扩大。7个平板组织变褐色，但未看到菌落形成。实验结果说明，该中华鹅膏菌专用培养基适用于中华鹅膏菌母种的诱导和培养，诱导中华鹅膏菌母种的成功率为86％。
对比实施例
野外采集生长健壮，未开伞，菌环完整的子实体，放入冰盒内当日带回实验室，超净工作台内立即进行分离，获得培养用组织块，组织块的面积为0.25-2.5cm2，取样点如图2所示。
将切取的组织块，接种入平板培养基内，所述培养基成分为：PDA培养基干粉40g/L、玉米粒25g/L、马铃薯100g/L、马尾松新鲜松针50g/L、自来水1L，自然pH。所述培养基制备方法为：采集马尾松新鲜松针50g加水约500ml，加热沸水后煮30min，过滤弃马尾松松针，得松针汁液约250ml，冷却备用；洗净玉米粒25g加水1000ml，加热煮沸后持续30分钟，即可加入洗净去皮马铃薯小块100g，继续煮沸30min，过滤，得玉米马铃薯水煮液，约450ml；马尾松松针汁液与马铃薯汁液混合，加热，再加入琼脂15～20g，继续加热，待琼脂溶解后，加入葡萄糖20g，溶解后冷却并补足水分至1L，121℃灭菌30min，冷却后取出倒平板，贮存备用。
接种小组织块平板50份，放置在26℃下暗培养5天，50个平板中有38个组织块变白，60天后组织边缘未出现褐色类愈伤组织，转管后也未出现白色快速生长的菌丝。实验结果说明，对比实施例所述的中华鹅膏菌培养基不能成功诱导和培养出中华鹅膏菌母种。
比较实施例1、2和对比实施例的实验结果可知，本发明所述的培养基配方与现有技术相比可以高效地进行中华鹅膏菌的菌丝繁育，组织块能够在培养基上萌发形成菌落，极大提升了菌丝繁育的成功率。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高效中华鹅膏菌专用培养基，其特征在于，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉5-15g/L、维生素B1 40-70mg/L、肉豆蔻酸钾盐0.5-1mmol/L、酵母浸粉2-8g/L。
2.根据权利要求1所述的一种高效中华鹅膏菌专用培养基，其特征在于，包括以下组分：PDA培养基干粉40g/L、麦芽浸粉10g/L、维生素B1 50mg/L、肉豆蔻酸钾盐1mmol/L、酵母浸粉4g/L。
3.如权利要求1所述的一种高效中华鹅膏菌专用培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1制备肉豆蔻酸钾盐溶液：取1.14g肉豆蔻酸和0.28g氢氧化钾加入500ml水中，加热充分溶解，配置成10mmol/L的肉豆蔻酸钾盐溶液备用；
S2制备高效中华鹅膏菌专用培养基：50-100ml肉豆蔻酸钾盐溶液，40g PDA培养基干粉，5-15g麦芽浸粉，40-70mg维生素B1，2-8g酵母浸粉加热至材料全部溶解，定容至1L，自然pH，121℃高压灭菌30分钟，倒平板后得到中华鹅膏菌专用培养基。
4.如权利要求1所述的一种高效中华鹅膏菌专用培养基在诱导中华鹅膏菌母种中的应用。
5.根据权利要求4所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，其特征在于，母种的分离方法包括以下步骤：
S1：在野外采集中华鹅膏菌新鲜的长势健壮的子实体；
S2：于超净工作台上紫外消毒灭菌后，取出组织块；
S3：将组织块放入平板培养基，于24-26℃下恒温培养30-50天，组织培养块上长出灰褐色团状结构并向外延伸形成菌落，即为中华鹅膏菌母种，继续培养则母种表面会变白；
S4：钩取母种的菌丝继续转管培养，即为子代母种，可用于后续生产和试验。
6.根据权利要求5所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，其特征在于，步骤S1中，所述子实体为未开伞，菌幕完整，无丝毫脱落。
7.根据权利要求5所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，其特征在于，步骤S1中，所述子实体为部分开伞，菌幕完整，无丝毫脱落。
8.根据权利要求5所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，其特征在于，步骤S2中，所述组织块为剔除菌环后取菌褶与菌盖交接处组织。
9.根据权利要求5所述的诱导中华鹅膏菌母种的应用，其特征在于，步骤S2中，所述组织块为剔除菌环后取菌盖与菌柄交接处组织。
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