CN109943602A - 一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：原料基体包括米糠50‑60％，板栗壳40‑50％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体，制备发酵培养基，接种酵母菌，均质破壁，分离、过滤、脱色，将滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。本发明利用酵母菌将米糠和板栗进行降解，从米糠和板栗壳中提取神经酰胺，酵母菌本身也含有神经酰胺，原料易得、绿色环保，制备工艺简单，产量高，成本低。

Description

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺

技术领域

本发明涉及神经酰胺加工技术领域，具体涉及一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺。

背景技术

神经酰胺是细胞膜的组成成分神经鞘磷脂的基本单位，由长链脂肪酸(FA)中的羧基与长链碱(LCB)的氨基脱水以酰胺键相连而形成，存在酵母、植物、哺乳动物中，它与细胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的关系，在工业应用中主要作为化妆品的中药活性因子而行使功能，在食品行业中可作为食品添加剂来使用，近年来，神经酰胺的药物功能也逐渐被发现，在治疗心血管疾病方面有效果。

米糠中含有多种营养素和生理活性物质，近期的研究中发现米糠中含有与皮肤极具亲和力的神经酰胺和角鳌烯，其中板栗的外果皮中海油神经酰胺的分子结构，目前采用的方法大都是浸提的方法，但是米糠和板栗壳的植物细胞壁较难分解，产量低，成本高，提取液中杂质多，后期纯化处理难度大。研究发现酿酒酵母菌、假丝酵母菌和汉逊氏酵母菌中发现了神经酰胺，且此类酵母菌，可以对米糠和板栗壳进行发酵降解，释放出米糠和板栗壳中的神经酰胺，所以对酵母菌发酵制备神经酰胺的研究有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，产量高、成本低。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠50-60％，板栗壳40-50％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1-1.5％的葡萄糖、0.3-0.5％的氯化钙、0.1-0.2％的氯化钠、0.05-0.1％的磷酸氢二钾，0.1-0.3％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的1-2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液10-15％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于25-35℃下静置培养48-72h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中得到的滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用假丝酵母菌、汉逊酵母菌和酿酒酵母菌中的一种。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，所述步骤五中，脱色工艺在50-100rpm搅拌状态下加入0.3-0.8％活性炭脱色，升温至45-55℃，保温25-50min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复2-4次。

具体地，所述步骤六中，连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为40-50％乙醇洗脱，最后用体积浓度为60-90％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

本发明的有益效果：本发明利用酵母菌将米糠和板栗进行降解，从米糠和板栗壳中提取神经酰胺，酵母菌本身也含有神经酰胺，原料易得、绿色环保，制备工艺简单，产量高，成本低。

具体实施方式

现在对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠50％，板栗壳50％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1％的葡萄糖、0.5％的氯化钙、0.1％的氯化钠、0.05％的磷酸氢二钾，0.1％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的1倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液10％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于25℃下静置培养48h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质4次，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤采用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，过滤工艺先用纯化水将陶瓷膜温度提升至70℃，排出纯水后过滤浓缩液，过膜温度控制在70℃，进膜操作压力0.15MPa，控制陶瓷膜的出料流速与缓冲罐进料流速持平，快进完料时改进热纯化水，前段出料0.5倍膜容量的出料，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用假丝酵母菌33M。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，脱色工艺在50rpm搅拌状态下加入0.3％活性炭脱色，升温至45℃，保温25min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复4次。

具体地，所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为40％乙醇洗脱，最后用体积浓度为60％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

实施例2

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠55％，板栗壳55％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1.2％的葡萄糖、0.4％的氯化钙、0.15％的氯化钠、0.08％的磷酸氢二钾，0.2％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液12％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于28℃下静置培养60h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质3次，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，过滤工艺先用纯化水将陶瓷膜温度提升至70℃，排出纯水后过滤浓缩液，过膜温度控制在70℃，进膜操作压力0.15MPa，控制陶瓷膜的出料流速与缓冲罐进料流速持平，快进完料时改进热纯化水，前段出料0.5倍膜容量的出料，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用假丝酵母菌33M。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，所述步骤五中，脱色工艺在70rpm搅拌状态下加入0.5％活性炭脱色，升温至48℃，保温30min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复3次。

具体地，所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为45％乙醇洗脱，最后用体积浓度为80％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

实施例3

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠60％，板栗壳40％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1.2％的葡萄糖、0.4％的氯化钙、0.15％的氯化钠、0.08％的磷酸氢二钾，0.2％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液12％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于28℃下静置培养60h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质3次，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，过滤工艺先用纯化水将陶瓷膜温度提升至70℃，排出纯水后过滤浓缩液，过膜温度控制在70℃，进膜操作压力0.15MPa，控制陶瓷膜的出料流速与缓冲罐进料流速持平，快进完料时改进热纯化水，前段出料0.5倍膜容量的出料，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用假丝酵母菌33M。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，所述步骤五中，脱色工艺在100rpm搅拌状态下加入0.8％活性炭脱色，升温至55℃，保温40min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复3次。

具体地，所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为50％乙醇洗脱，最后用体积浓度为70％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

实施例4

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠55％，板栗壳45％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1.5％的葡萄糖、0.4％的氯化钙、0.15％的氯化钠、0.08％的磷酸氢二钾，0.2％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液13％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于35℃下静置培养72h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质4次，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，过滤工艺先用纯化水将陶瓷膜温度提升至70℃，排出纯水后过滤浓缩液，过膜温度控制在70℃，进膜操作压力0.15MPa，控制陶瓷膜的出料流速与缓冲罐进料流速持平，快进完料时改进热纯化水，前段出料0.5倍膜容量的出料，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用汉逊酵母菌。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，所述步骤五中，脱色工艺在70rpm搅拌状态下加入0.5％活性炭脱色，升温至48℃，保温35min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复4次。

具体地，所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为45％乙醇洗脱，最后用体积浓度为80％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

实施例5

一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠55％，板栗壳45％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1.5％的葡萄糖、0.4％的氯化钙、0.15％的氯化钠、0.08％的磷酸氢二钾，0.2％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液13％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于35℃下静置培养72h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质4次，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，过滤工艺先用纯化水将陶瓷膜温度提升至70℃，排出纯水后过滤浓缩液，过膜温度控制在70℃，进膜操作压力0.15MPa，控制陶瓷膜的出料流速与缓冲罐进料流速持平，快进完料时改进热纯化水，前段出料0.5倍膜容量的出料，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

具体地，所述酵母菌选用酿酒酵母1912。

具体地，所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

具体地，所述步骤五中，脱色工艺在70rpm搅拌状态下加入0.5％活性炭脱色，升温至48℃，保温35min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复4次。

具体地，所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为45％乙醇洗脱，最后用体积浓度为80％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。

本发明不局限于所述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (5)

1.一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、原料基体准备：原料基体包括米糠50-60％，板栗壳40-50％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体；

步骤二、制备发酵培养基：取原料基体，向原料基体中加入原料基体质量的1-1.5％的葡萄糖、0.3-0.5％的氯化钙、0.1-0.2％的氯化钠、0.05-0.1％的磷酸氢二钾，0.1-0.3％的七水合硫酸镁，加入原料基体重量的1-2倍水，1倍的马铃薯液为发酵底物；

步骤三、接种酵母菌：将种子液10-15％的接种量接种于发酵培养基上，菌种与发酵培养基混菌后于25-35℃下静置培养48-72h，得到发酵液；

步骤四、均质破壁：将步骤三中所得发酵液通过高压均质机，常温下，高压均质，得到破壁均浆物；

步骤五、分离、过滤、脱色：将步骤四中所得破壁均浆物通过粗过滤或者离心的方式，去除粗杂质，然后将得到液体进行二次过滤，二次过滤用孔径为500nm的陶瓷膜进行处理，然后进行脱色处理，得到滤液；

步骤六、选择分离：将步骤五中所得滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。

2.根据权利要求1一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于：所述酵母菌选用假丝酵母菌、汉逊酵母菌和酿酒酵母菌中的一种。

3.根据权利要求1一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于：所述种子液的制备方法为，用接种钩挑取低温保藏的斜面菌株，接种于液体种子培养基中，置于恒温摇床培养箱中，在28℃、120r/min条件下培养24h，其中液体种子培养基采用葡萄糖1％、蛋白胨0.5％，麦芽膏0.3％，蒸馏水配置。

4.根据权利要求1一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于：所述步骤五中脱色工艺在50-100rpm搅拌状态下加入0.3-0.8％活性炭脱色，升温至45-55℃，保温25-50min,当脱色后清液透光率达到70％以上后经板框滤除废炭，并吹出废炭中的残液，接着再顶水后吹空气，如此重复2-4次。

5.根据权利要求1一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于：所述步骤六中连续色谱采用大孔树脂连续色谱柱，先用体积浓度为20％的乙醇除去杂质，再用体积浓度为40-50％乙醇洗脱，最后用体积浓度为60-90％的乙醇洗脱，得到富含神经酰胺的溶液。