JP2010022218A

JP2010022218A - 新種微生物及びグルコシルセラミドの製造方法

Info

Publication number: JP2010022218A
Application number: JP2008184034A
Authority: JP
Inventors: Terubumi Matsumoto; 光史松本; Tadashi Matsunaga; 是松永; Takeshi Tanaka; 剛田中
Original assignee: Electric Power Development Co Ltd; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture
Current assignee: Electric Power Development Co Ltd; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2010-02-04
Anticipated expiration: 2028-07-15
Also published as: JP5283064B2

Abstract

【課題】グルコシルセラミド生産能を有する新種微生物、及び該微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法を提供する。
【解決手段】キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）が属する種に属する微生物；２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列が、特定の塩基配列と９６％以上の相同性を有し、グルコシルセラミド生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物；キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）；かかる微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、新種微生物、及び該微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法に関する。

スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴイド塩基（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄｂａｓｅ）を基本骨格として脂肪酸と糖鎖とが結合したものであり、哺乳類、植物、微生物に存在し（非特許文献１参照）、糖鎖や脂肪酸の炭素数、並びに二重結合や水酸基の有無などの違いに基づく種々の構造が報告されている（非特許文献２参照）。
スフィンゴ糖脂質の構成成分であるセラミド（Ｃｅｒ）は、ヒトの角質層の細胞間脂質の主成分として４０〜６０％を占めており、その親水性部分に水分子を保持することで水分の蒸発を抑えると共に、細菌などの体外刺激物が体内へ侵入することを防止する役割を担っていると考えられている。そして、セラミドは加齢に伴い減少し、しわ、肌荒れの原因となることが報告されている。セラミドや、セラミドにグルコースが付加した構造のグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）は、ヒトの乾燥落屑性皮膚への塗布による水分保持機能改善効果、経口摂取による経皮水分蒸発量の低減効果を有するが報告されており、化粧品や健康食品の原料として注目されている。例えば、セラミドやグルコシルセラミドの日本国内の市場規模は、グルコシルセラミド５％含有の粗抽出物として２００５年では５．８トン、金額にすると約１３．５億円であり、毎年約２０％の伸びが見込まれている。

従来は、スフィンゴ糖脂質の原料として、セラミドとガラクトースとが結合した構造を有するガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）が使用され、これを豊富に含む牛脳が抽出源として利用されてきた。しかし、２００１年の狂牛病の大流行を受け、牛脳由来物質に関する安全性評価の確立が未だ不十分であることから、抽出源として他の生物を利用することが求められるようになってきた。化学合成品は、安全性の観点から食品素材としての利用が制限されるからである。このような背景から、現在では米糠や小麦胚芽などの植物が、グルコシルセラミドの主な抽出源として利用されている。

しかし、植物の乾燥単位質量あたりから抽出可能なグルコシルセラミドの量は非常に少なく、例えば、精米からは０．００２５質量％、小麦からは０．０２１質量％程度にとどまる（非特許文献３参照）。したがって、抽出・精製工程に多大なコストと労力を要する。そのため、グルコシルセラミドの市場価格は、３％含有品で２００〜３００円／ｇ、すなわち、グルコシルセラミド純品に換算して６７００〜１００００円／ｇとなっており、非常に高価である。そこで、安価なグルコシルセラミドの製造技術の開発が強く望まれている。

このような中、生育速度が速く、大量培養による物質の大量生産が可能な微生物の利用が注目されている。そして、グルコシルセラミド生産能を有する微生物の探索も開始されており（非特許文献４参照）、これまでに、例えば、クルブロマイセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、デバリオマイセスハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎｉ）等、いくつかの酵母がグルコシルセラミド生産能を有していることが報告されている。これら酵母は、培養時間が２４〜４８時間程度と短いこと、植物と比較してグルコシルセラミドの抽出が容易であること、消費者に好印象で捉えられていること、等の理由から、グルコシルセラミドの抽出源として期待される。
Ｄ．ＷａｒｎｅｃｋｅａｎｄＥ．Ｈｅｉｎｚ（２００３）Ｒｅｃｅｎｔｌｙｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅｓｉｎｐｌａｎｔｓａｎｄｆｕｎｇｉ．ＣＭＬＳ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．６０，９１９−９４１．Ｒ．Ｘ．ＴａｎａｎｄＪ．Ｈ．Ｃｈｅｎ（２００３）ＴｈｅｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓＮａｔＰｒｏｄＲｅｐ．２０：５０９−３４．Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｔ．ａｎｄＭｉｙａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓｆｒｏｍｅｄｉｂｌｅｐｌａｎｔｓｏｕｒｃｅｓｂｙｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌｉｐｉｄｓ，３４：１２３１−１２３７．ＭａｓａｈｉｋｏＴａｍｕｒａ，ＯｓａｍｕＭａｔｓｕｍｏｔｏ，ＮａｏｙａＴａｋａｋｕｗａ，ＹｕｊｉＯｄａ，ＭａｓａｏＯｈｎｉｓｈｉ（２００５）ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｆｒｏｍＢｅｅｔＭｏｌａｓｓｅｓｂｙｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｋｌｕｙｖｅｒｉＦｏｏｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９：９５−１０５．

しかし、グルコシルセラミド生産能を有する酵母は、まだ十分に探索されているとは言えず、より生産性の高いグルコシルセラミドの製造方法の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、グルコシルセラミド生産能を有する新種微生物、及び該微生物を利用するグルコシルセラミドの製造方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）が属する種に属する微生物である。
請求項２に記載の発明は、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有し、グルコシルセラミド生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物である。
請求項３に記載の発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）である。
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法である。

本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造できる。その結果、安価なグルコシルセラミドを提供できる。

以下、本発明について詳しく説明する。
なお、以下において、「キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）」のことを「ＪＰＣＣＹ００２４」と略記することがある。
また、本発明において「グルコシルセラミド」とは、例えば、下記式（１）で表されるように、スフィンゴシン骨格（ａ）中のアミノ基と、脂肪酸骨格（ｂ）中のカルボキシ基とがアミド結合を形成した構造を有するセラミド骨格（ａ＋ｂ）中のうち、前記スフィンゴシン骨格（ａ）の分子末端の１級水酸基に相当する水酸基が、グルコースの１位の炭素原子に結合した構造を有する化合物の総称を指すものとする。したがって、「グルコシルセラミド」には、前記スフィンゴシン骨格（ａ）に由来する炭化水素基の種類や、前記脂肪酸骨格（ｂ）に由来する炭化水素基の種類、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置等が異なる複数の化合物を含む。

＜ＪＰＣＣＹ００２４の獲得＞
ＪＰＣＣＹ００２４は、以下の手順に従って獲得した。
まず、下記手順で分離培地を作製した。
分離培地：酵母エキス５ｇ、グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、人工海水３７ｇ、クロラムフェニコール０．３ｇ、ストレプトマイシン０．１５ｇ、アンピシリン０．１ｇ、粉末寒天１２ｇを純水１Ｌに添加し、１２１℃で１０分間滅菌処理した後、適量を滅菌済み平板に分取して、寒天平板を作製した。
次いで、奄美大島の原生林から採取した土壌を１００倍量（質量比）の生理食塩水で激しく撹拌し、上澄みを前記分離培地に塗布し、２５℃でインキュベーションを行なった。植菌後３日目に確認できたコロニーを滅菌済み爪楊枝で釣菌し、新たな酵母培地に植菌し、生育を繰り返すことで単菌化を行った。

＜ＪＰＣＣＹ００２４の同定＞
ＪＰＣＣＹ００２４の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。そして取得した検体を用いて、「簡易形態観察」、「生理・生化学的性状試験（以下、生理性状試験と略記する）」、「２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定」を行った。なお、供試菌体としては、下記条件で培養した菌株を使用した。
［培養条件］
培地；Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ−ｍａｌｔａｇａｒ（ＹＭａｇａｒ）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）
培養温度；温度耐性試験を除き２５℃
培養期間；１週間〜１ヶ月間
その他の培養条件；好気培養

［簡易形態観察］
以下のものを使用して観察を行なった。
顕微鏡；光学顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス株式会社製）（微分干渉観察）
マウント液；滅菌蒸留水
（１）巨視的観察（コロニー観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養７日間でコロニーは表１に示す性状を示した。

（２）微視的観察（形態性状観察）
ＹＭ平板培地上で２５℃の温度条件下、培養開始１０日目に、栄養細胞は球形から広楕円形であり、増殖は多極出芽によることが確認された。培養開始から１ヶ月経過した平板で、有性生殖器官の形成は認められなかった。

［生理性状試験］
試験方法は、Ｂａｒｎｅｔｅｔａｌ．（２０００）及びＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＦｅｌｌ（１９９８）に準拠し、培養は温度耐性試験を除き２５℃で行った。結果を表２〜６に示す。なお、表中、「＋」は反応が陽性であることを、「−」は反応が陰性であることを、「Ｗ（ｗｅｅｋ）」は弱い陽性反応であることをそれぞれ示す。また、「Ｓ（ｓｌｏｗ）」は試験開始後に２週間から３週間以上かけて徐々に陽性反応が認められたことを、「Ｌ（ｌａｔｅｎｔ）」は試験開始２週間以降に急速に陽性反応が認められたことをそれぞれ示す。

［２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の同定］
ＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの各操作は、下記の各プロトコールに基づいて行った。
ＤＮＡ抽出；物理的破壊及びＭａｒｍｕｒ（１９６１）の改変法
ＰＣＲ；ｐｕＲｅＴａｑＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＰＣＲｂｅａｄｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
サイクルシークエンス；ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
プライマー；ＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ３及びＮＬ４（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９３）
シークエンス；ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
配列決定；ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ１．４（ＴｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍＰｔｙＬｔｄ）
相同性検索及び簡易分子系統解析；アポロン２．０（ソフトウェア、テクノスルガ・ラボ）、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０（データベース、テクノスルガ・ラボ）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）

ＪＰＣＣＹ００２４の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列を同定した結果、配列番号１に示す塩基配列であることが判った。

アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、ＪＰＣＣＹ００２４の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母の一種であるキャンディダヴァルディヴィアナ（Ｃａｎｄｉｄａｖａｌｄｉｖｉａｎａ）の基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１^Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）と８塩基の相違で９８．６％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ等の国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果でも、ＪＰＣＣＹ００２４の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、キャンディダヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１^Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５及びＤＱ４３８２２０）に対し８塩基の相違を有し、９８．６％の相同率を示した。一般に酵母の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を使用した解析では、基準株との相違塩基数が０〜３塩基であれば、同種又は姉妹種である可能性が高く、相違が１％以上である場合には、別種である可能性が高いとされている（ＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＲｏｂｎｅｔｔ，１９９８）。本同定試験では、９９％以上の相同率を示す既知種が存在しなかったことから、ＪＰＣＣＹ００２４は新種である可能性が示唆された。図１は、アポロンＤＢ−ＦＵ２．０に対する相同性検索で得られた上位１０塩基配列を基に作成した系統樹であり、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダ属の種で構成される系統群に含まれたことから、キャンディダ属に帰属する可能性が示唆された。また、ＪＰＣＣＹ００２４が含まれる系統群を構成するキャンディダ属の種において、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１^Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）とクラスターを形成し、その信頼性を表すブートストラップ値は１００％で支持されたことから、ＪＰＣＣＹ００２４と最も近縁な菌種は、キャンディダヴァルディヴィアナであると考えられた。しかし、ＪＰＣＣＹ００２４と、キャンディダヴァルディヴィアナの基準株ＮＲＲＬＹ−７７９１^Ｔ（アクセッション番号：Ｕ４５８３５）には距離が存在し、異なる分子系統学的位置を示した。以上より、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダヴァルディヴィアナに近縁なキャンディダ属の新種であると推定された。

また、簡易形態観察の結果、ＪＰＣＣＹ００２４の栄養細胞は、球形から広楕円形であり、栄養増殖は多極出芽により、子嚢及び子嚢胞子の形成は認められず、ことが確認され、キャンディダ属の形態学的特徴を示した。
２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４が帰属すると推定したキャンディダ属には、「ＴｈｅＹｅａｓｔｓ，ａｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ第４版（ＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＦｅｌｌ，１９９８）」において１６３種が記載されており、これら１６３種は生理性状に基づき１２のグループに分けられている。生理性状試験の結果、ＪＰＣＣＹ００２４は、炭素源としてイノシトールを資化することから、「キャンディダ属生理性状グループＩ（ＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＦｅｌｌ，１９９８）」に分類される推定された。一方、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において、ＪＰＣＣＹ００２４が近縁であると推定したキャンディダヴァルディヴィアナもまた、「キャンディダ属生理性状グループＩ」に分類されている。さらに、「キャンディダ属生理性状グループＩ」に分類されている１０種の区別に有効とされる生理・生化学的特徴において、ＪＰＣＣＹ００２４は、ラフィノース及び硝酸塩を資化し、Ｌ−ラムノース及びエリスリトールを資化せず、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果においてＪＰＣＣＹ００２４が近縁であると推定したキャンディダヴァルディヴィアナの特徴と良く一致した。その一方で、「ＴｈｅＹｅａｓｔｓ，ａｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ第４版（ＫｕｒｔｚｍａｎａｎｄＦｅｌｌ，１９９８）」及び「ＹＥＡＳＴＳ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ第３版（Ｂａｒｎｅｔｅｔａｌ．，２０００）」を参考に、ＪＰＣＣＹ００２４とキャンディダヴァルディヴィアナについて、その他の生理・生化学的特徴を比較したところ、キャンディダヴァルディヴィアナは、グリセロール、コハク酸、クエン酸を資化し、ビタミン欠乏培地において生育性を示さないとされているのに対し、ＪＰＣＣＹ００２４は、グリセロール、コハク酸、クエン酸を資化せず、ビタミン欠乏培地において生育し、異なる特徴を示した。したがって、生理性状試験の結果において、ＪＰＣＣＹ００２４は、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果において近縁である推定したキャンディダヴァルディヴィアナと類似した性状を示すものの、グリセロール、コハク酸及びクエン酸の資化能、並びにビタミン要求性において異なる特徴を示すことが明らかとなり、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果を支持した。

以上より、「簡易形態観察」、「生理性状試験」及び「２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列解析」の結果から、ＪＰＣＣＹ００２４は、キャンディダヴァルディヴィアナに近縁であり、キャンディダ属の新種であると推定された。そして、Ｋｉｒｋｅｔａｌ．（２００１）に基づく分類学的位置から、ＪＰＣＣＹ００２４は、子嚢菌系アナモルフ（無性時代）酵母であるキャンディダヴァルディヴィアナグリンブ．＆ヤロウ（ＣａｎｄｉｄａｖａｌｄｉｖｉａｎａＧｒｉｎｂ．＆Ｙａｒｒｏｗ）に近縁であり、キャンディダ属の新種であると推定された。

ＪＰＣＣＹ００２４は、平成２０年５月１４日付けで受託番号ＮＩＴＥＰ−５７１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されている。

本発明の微生物は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）である。そして本発明は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）が属する種に属する微生物、及び２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有し、グルコシルセラミド生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物を包含する。このような微生物は、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）と同種の微生物であると考えられる。
また、本発明のグルコシルセラミドの製造方法は、上記本発明の微生物を培養する工程を有するものである。

上記微生物を培養して得られる培養物中には、該微生物により生産されたグルコシルセラミドが含有される。該培養物は、そのまま目的の用途に使用しても良いし、適宜任意の精製操作を行ってから使用しても良い。
ＪＰＣＣＹ０００４等のキャンディダ属に属する微生物は、公知の手法で培養すれば良い。ＪＰＣＣＹ０００４であれば、例えば、上記の獲得手順に記載した分離培地や、酵母エキス、バクトトリプトン（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ）、グルコース等を含有する培地を使用すると良い。なかでも糖類としては、前記の資化性を有するものであればいずれも使用し得るが、グルコースが特に好ましい。

また、培地中には、所定濃度の塩類を含有させることが好ましく、該塩類としては塩化ナトリウムが好ましい。塩類の濃度は０．１〜３質量％であることが好ましく、０．３〜２．５質量％であることがより好ましく、２質量％程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。

培地は中性〜弱アルカリ性であることが好ましい。具体的には、培地のｐＨは６．５〜１０．５であることが好ましく、７．０〜１０．３であることがより好ましく、１０程度であることが特に好ましい。このような範囲とすることで、グルコシルセラミドの生産性が一層向上する。

培地は固形培地及び液体培地のいずれでも良い。
培養時の温度は、１８〜３６℃であることが好ましく、２３〜３３℃であることがより好ましい。
培養時間は、培養温度にもよるが、１２時間以上であることが好ましく、２０時間以上であることがより好ましい。培養時間の上限は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すれば良いが、通常は、５０時間程度で十分である。
培養方法は、静置培養、振とう培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すれば良い。そして、好気培養することが好ましい。

生産されたグルコシルセラミドは、公知の手法で培養物から分離すれば良い。例えば、培養物から遠心分離等の手法でＪＰＣＣＹ００２４等の菌体を回収し、必要に応じて洗浄後、凍結乾燥等の手法で乾燥菌体を得る。そして、得られた乾燥菌体をホモジナイズし、次いで、有機溶媒／水の混合溶媒を使用して、有機溶媒中にグルコシルセラミドを抽出する。さらに、溶媒を除去することでグルコシルセラミドが得られる。ホモジナイズは、クロロホルム／メタノール混合溶媒等の有機溶媒とアルカリ性水溶液とを併用して行うことが好ましく、抽出時の有機溶媒も同様のものを使用することが好ましい。

従来の微生物のうち、例えば、クルブロマイセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）ＮＢＲＣ１０９０株は、高いグルコシルセラミド生産性を有することが知られている。そして、ＪＰＣＣＹ００２４は、クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株よりもさらに高いグルコシルセラミド生産性を有する。これは、ＪＰＣＣＹ００２４が、クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株と同等の増殖能を有し、さらに、クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株よりも、一菌体あたりのグルコシルセラミド生産性に優れることが理由であると推測される。

ＪＰＣＣＹ００２４は種々のグルコシルセラミドを生産する。そのうち生産量が多い代表的なものとして、下記式（１）で表されるものが例示できる。
そして、ＪＰＣＣＹ００２４が生産するその他のグルコシルセラミドとしては、下記式（１）中のスフィンゴシン骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、脂肪酸骨格に由来する炭化水素基の種類が異なるもの、あるいは構造式中のいずれかの基の立体配置が異なるものが例示できる。ここで、「炭化水素基の種類が異なる」とは、例えば、炭素数、側鎖の有無、側鎖の位置、二重結合の有無、二重結合の位置等が異なることを指す。
クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株も、同様のグルコシルセラミドを生産することが知られている。

ＪＰＣＣＹ００２４は、酵母の一種であり、容易に大量培養でき、しかもグルコシルセラミドの生産性が高い。また、生産されたグルコシルセラミドの分離も容易である。したがって、本発明によれば、高品質のグルコシルセラミドを簡便且つ大量に製造でき、安価なグルコシルセラミドを提供できる。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］
＜ＪＰＣＣＹ００２４を使用したグルコシルセラミドの製造＞
（グルコシルセラミドの定量）
酵母エキス１質量％、バクトペプトン（ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅ）２質量％、グルコース２質量％、バクトアガー（ＢａｃｔｏＡｇａｒ）１質量％を含有する固形培地を使用して２日間、試料を静置培養し、コロニー形成が確認された酵母（アルカリ耐性株）１８株を選別した。これらの中には、ＪＰＣＣＹ００２４が含まれていた。
次いで、酵母エキス１質量％、バクトトリプトン（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ）２質量％、グルコース２質量％、塩化ナトリウム２質量％を含有し、ｐＨを１０に調整した液体培地５０ｍｌを使用して、５００ｍｌの坂口フラスコ中で上記１８株の酵母を３０℃、１２０ｒｐｍの条件で４８時間振とう培養した。振とう培養後、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで菌体を回収し、さらに蒸留水で２回洗浄した。得られた菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体の質量を測定した。
得られた乾燥菌体１００ｍｇに対して、クロロホルム／メタノール（１／１，ｖ／ｖ）１ｍｌと、０．８Ｍ水酸化カリウム水溶液１ｍｌを加え、５分間超音波によりホモジナイズした後、４２℃で３０分間インキュベートした。次いで、クロロホルム２．５ｍｌと水１．１２ｍｌを加えて混合した後、有機層を分取し、エバポレーターを使用して４０℃で減圧乾固後、凍結乾燥した。得られたサンプルをクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）１００μｌに溶解させ、そのうち１０μｌをＴＬＣ分析し、オルシノール硫酸試薬（硫酸／水／エタノール（５／１３／２７，ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶液４５ｍｌにオルシノール０．１ｇを溶解させた試薬）を噴霧後、ホットプレートを使用して１１０℃で５分間加熱し、呈色させた。この時、ＴＬＣの展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／水（６５／１６／２，ｖ／ｖ／ｖ）を使用した。さらに、グルコシルセラミドの標準物質として、下記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ）をクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させたものを使用した。また、画像解析ソフトＳｃｉｏｎＩｍａｇｅを使用してスポットの大きさとその呈色の平均強度を求め、これらを掛け合わせてスポットの呈色強度を算出することで、検量線を作成した。そして、この検量線を使用して、乾燥菌体１ｇあたりから抽出可能なグルコシルセラミドを定量した。

定量結果より、ＪＰＣＣＹ００２４の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり４．５ｇであり、ＪＰＣＣＹ００２４乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．７２ｍｇであることが確認された。以上より、ＪＰＣＣＹ００２４の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり３．２ｍｇであることが確認された。

（グルコシルセラミドの同定）
得られたグルコシルセラミドの構造を、下記二種類の手法で決定した。
（１）ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
グルコシルセラミドの標準物質として、前記式（２）で表される大豆由来の粉末グルコシルセラミド（Ａｖａｎｔｉｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ）を使用し、検出条件を最適化した。
具体的には、前記大豆由来グルコシルセラミドをクロロホルム／メタノール（２／１，ｖ／ｖ）に溶解させ、濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、正イオンモードの条件で、ＥＳＩ−ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析では、衝突エネルギーを３０％から７０％まで５％間隔で増大させ、そのスペクトルパターンから、グルコシルセラミドの構造を最も正確に反映したスペクトルが得られるエネルギーを決定することで、検出条件を最適化した。

（２）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
上記グルコシルセラミド定量時に調製したサンプル２０μｌを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。分析には、前記大豆由来のグルコシルセラミドと、下記式（３）で表されるグルコシルセラミドＣ１２β−Ｄ−ＧｌｕｃｏｓｙｌＣｅｒａｍｉｄｅ（Ａｖａｎｔｉｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ）の化学合成品を使用した。カラムとしてはＡｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｏｎｄｅｄｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩ．Ｄ×２５０ｍｍＬ）を使用した。また、移動層Ａとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル／メタノール／酢酸（９７／２／１，ｖ／ｖ／ｖ）、移動層Ｂとして５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノール／酢酸（９９／１，ｖ／ｖ／ｖ）を使用し、下記グラジエント条件（Ａ．Ｈ．ＭｅｒｒｉｌｌＪｒ．ｅｔａｌ．，２００５参照）で、移動層の流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとし、正イオンモードで検出を行った。
グラジエント条件：０％Ｂ（０分）−０％Ｂ（５分）−１０％Ｂ（７．５分）−１０％Ｂ（１２分）−１８％Ｂ（１６分）−１８％Ｂ（２２分）−１００％Ｂ（２６分）−停止（２６．０１分）。「％」はいずれも「容量％」を示す。
ＭＳ／ＭＳ分析の親イオンとしてはナトリウム付加物のイオンを選択し、衝突エネルギーを４０％に設定した。最適化した検出条件に基づいて対象酵母由来の脂質を含むサンプル２０μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。

［比較例１］
＜クルブロマイセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）ＮＢＲＣ１０９０株を使用したグルコシルセラミドの製造＞
ＪＰＣＣＹ００２４の代わりに、クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株を使用したこと以外は、実施例１と同様にグルコシルセラミドを製造し、得られたグルコシルセラミドの構造を確認した。クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した。
その結果、本菌株の乾燥菌体量は、培養液１Ｌあたり４．８ｇであり、本菌株の乾燥菌体１ｇあたりの前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの含有量は０．４２ｍｇであることが確認された。以上より、本菌株の前記式（１）で表されるグルコシルセラミドの生産性は、培養液１Ｌあたり２．０ｍｇであることが確認された。

上記結果より、ＪＰＣＣＹ００２４は、クルブロマイセスラクチスＮＢＲＣ１０９０株よりもグルコシルセラミドの生産性が高いことが確認できた。

本発明は、化粧品や健康食品の製造に利用可能である。

ＪＰＣＣＹ００２４の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を使用して得られた分子系統樹を示す図である。

Claims

キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）が属する種に属する微生物。
２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有し、グルコシルセラミド生産能を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物。
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ＪＰＣＣＹ００２４株（ＮＩＴＥＰ−５７１）。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程を有するグルコシルセラミドの製造方法。