JP6172700B2

JP6172700B2 - トルラ酵母由来グルコシルセラミドの線維芽細胞増殖促進剤としての利用

Info

Publication number: JP6172700B2
Application number: JP2012238743A
Authority: JP
Inventors: 小依里和田; 祥子福永; 佐藤　寿哉; 寿哉佐藤; 勇亮佐内; 智寛中川; 直人梶
Original assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Kohjin Life Sciences Co Ltd
Current assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Kohjin Life Sciences Co Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: JP2014087278A

Description

本発明は、食経験があり安全性が認められているトルラ酵母を使用し、菌体培養後に酵母エキスを抽出した酵母菌体から抽出し、得られたグルコシルセラミドを利用した線維芽細胞増殖促進効果に優れた組成物を提供するものである。

グルコシルセラミドとは、スフィンゴイド塩基と脂肪酸がアミド結合したセラミド骨格に、１分子のグルコースが結合したスフィンゴ糖脂質の一種である。動植物や微生物に幅広く分布し、サプリメント等で摂取した場合、肌機能の改善効果や、大腸がんの予防効果があることなどから近年、健康食品素材として注目を集めている。

線維芽細胞増殖促進剤としてのグルコシルセラミドについては、これまでコメ由来の植物性グルコシルセラミドについて報告があったが、酵母由来のグルコシルセラミドについては報告がなかった。またこんにゃく由来グルコシルセラミドについては、グルコシルセラミドそのものには線維芽細胞増殖促進効果はなく、分解物であるスフィンゴイド塩基に線維芽細胞増殖促進効果があるという報告がされていた。

特開２００６−１４３６０５号公報

オリザ油化株式会社発行「オリザセラミドカタログ」

本発明の課題は、酵母エキスの抽出後に得られた酵母菌体という産業廃棄物から抽出することで、安全性が高く、安価な酵母由来のグルコシルセラミドを利用することを特徴とし、これまでの植物原料由来のグルコシルセラミドに比較して、線維芽細胞増殖促進効果に優れた飲食品、皮膚外用剤及び医薬品を提供することである。

本発明では酵母由来、特にトルラ酵母由来のグルコシルセラミドについて線維芽細胞増殖促進効果を確認したところ、植物原料のコメ、トウモロコシ、こんにゃく由来のグルコシルセラミドに比較して、優れた線維芽細胞増殖促進効果があることを見出した。

つまり、本発明は、以下のとおりである。
（１）、酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体から抽出されたグルコシルセラミドを含有する線維芽細胞増殖促進剤、
（２）、（１）の線維芽細胞増殖促進剤を含有する飲食品、
（３）、（１）の線維芽細胞増殖促進剤を含有する化粧品、
（４）、（１）の線維芽細胞増殖促進剤を含有する皮膚外用剤及び医薬品。

トルラ酵母から酵母エキスを抽出して得られた酵母菌体からは、夾雑物の少ない高品質のグルコシルセラミド組成物を得ることが可能であり、本発明ではこのようにして得られたトルラ酵母由来のセラミドについて、ヒト正常線維芽細胞による線維芽細胞増殖促進効果を確認したところ、植物を原料とする植物性セラミドに比較して、優れた線維芽細胞増殖促進効果が得られることを確認した。また本発明では酵母エキスの残渣であり線維芽細胞増殖促進効果である酵母菌体を有効利用できるため、コスト、廃棄物削減の点でも、きわめて有利で安価な線維芽細胞増殖促進効果を提供することが可能である。

図１は各濃度の酵母セラミドの増殖率図２は各種セラミドのヒト皮膚線維芽細胞の増殖作用

本発明で使用する酵母は、グルコシルセラミドを含有する酵母であればよい。特に好ましくは、一般名トルラ酵母と称されるＣａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓである。酵母の培養形式はバッチ培養、あるいは連続培養のいずれかが用いられる。培地には炭素源として、ブドウ糖、酢酸、エタノール、グリセロール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩などが使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源も過リン酸石灰、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の通常の工業用原料でよく、その他亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を添加する。その他、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等を添加したり、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。培養温度は２１〜３７℃、好ましくは２５〜３４℃で、ｐＨは３．０〜８．０、特に３．５〜７．０が好ましい。培養条件によりアミノ酸や核酸の生産性が変動するため、目的とする酵母エキスの製品仕様に合わせて条件設定を行う。

酵母の培養は一般的な培地組成で行う。菌体培養後にエキス抽出を行う。本願では、エキス抽出後の酵母を酵母残渣としている。抽出法は、とくに制限がないが、一般的に、自己消化法、熱水抽出法、酵素抽出法、酸、若しくはアルカリ抽出法、又はこれらの組み合わせにより行うことが可能である。

自己消化により酵母エキスを抽出する場合は、例えば、５５℃で４時間攪拌する。酵素抽出法であれば、細胞壁溶解酵素又はプロテアーゼ等で攪拌抽出する。酸抽抽出法であれば、硫酸等で酸性に調整後、抽出する。アルカリ抽出法であれば、アルカリに調整後、抽出する。又は、自己消化後（例えば５５度で４時間攪拌）に、酵素抽出をする等の組み合わせも可能である。

上記の酵母中のエキス抽出により、タンパク質や核酸が抽出除去されると共に、ステロール配糖体など一部の脂溶性夾雑物が除去され、結果としてグルコシルセラミドが富化された酵母残渣が製造される。なお、本願では、夾雑物の除去及びグルコシルセラミドの定性分析をＴＬＣで、定量分析をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで行った。

エキス抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、残渣を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄を行う。洗浄後の残渣を必要に応じて、凍結乾燥又は熱風乾燥することも可能である。得られた酵母残渣をトルラ酵母由来グルコシルセラミド原料とする。

続いて上記原料を用いてグルコシルセラミドの精製を行う。精製の方法に制限はないが、食品として用いることができる精製法が望ましい。例えば、特開２００２−２８１９３６に記載されている方法で精製することができる。アルコール抽出を行う場合は、トルラ酵母由来グルコシルセラミド原料に対して２倍量の９０％エタノールを使用し、攪拌によりグルコシルセラミドの抽出を行う。抽出後は抽出液を遠心分離で回収し、濃縮及び凍結乾燥または熱風乾燥させることでグルコシルセラミド組成物が得られる。

必要に応じて、グルコシルセラミド組成物をさらに精製することにより、グルコシルセラミド含有量の高い組成物を製造することもできる。精製法は、既知の方法により精製可能であり、例えば、シリカゲルやイオン交換樹脂などのカラム精製等を用いることができる。

本発明の組成物には、本発明の効果を維持・促進しうる他の成分を混合してもかまわない。混合可能な物質としては、例えばグルタチオン、ビタミン類、コラーゲン、スクワラン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ヒアルロン酸、プラセンタエキス、ソルビトール、キチン、キトサン、及び種々の植物抽出物等が挙げられる。これらの混合量については、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではない。

本発明は、上記した本発明の組成物を含有することを特徴とする飲食品、化粧品、皮膚外用剤又は医薬品を提供するものである。

本発明における飲食品とは、上記組成物を配合した、食料品、飲料品、嗜好品、サプリメント等、経口で摂取するものを指す。その形態は特に限定されるものではなく、パン類、麺類等主菜となりうるもの、チーズ、ハム、ウインナー、魚介加工品等副菜となりうるもの、果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品等とすることができる。また、サプリメントとしての形態も特に限定されるものではなく、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク状の形態をとることもできる。

飲食品におけるグルコシル組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば酵母由来グルコシルセラミドが飲食品の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

本発明の化粧品とは、上記組成物を配合した化粧水、乳液、ファンデーション、口紅などを指す。

組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば酵母由来グルコシルセラミドが組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

また本発明の皮膚外用剤又は医薬品とは、上記組成物を配合したローション、クリーム、軟膏、スプレー、貼付剤（材）などの形状のものを指すが、その形態は特に限定されるものではなく、本発明の目的とする効果を発揮しうるものであればいかなる形態でもかまわない。

皮膚外用剤又は医薬品におけるグルコシル組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えばグルコシルセラミドが組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（ＴＬＣ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４ＮＫＯＨＥｔＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４ＮＨＣｌＥｔＯＨを２ｍｌ加えて中和し、遠心分離後の上清４ｕｌをＴＬＣに供した。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、層厚０．２５ｍ）を使用し、クロロホルム：エタノール：水＝６５：１６：２（容量比）で展開した。展開後はシリカゲルプレートを乾燥させ、アニスアルデヒド硫酸試液を噴霧して加熱することで発色させた。

（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４ＮＫＯＨＥｔＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４ＮＨＣｌＥｔＯＨを２ｍｌ加えて中和し、塩類をフィルター除去してからＨＰＬＣに供した。カラムにはＧＬサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ１００Ａを用い、グルコシルセラミドの検出は蒸発光散乱検出器（島津製ＥＬＳＤ−ＬＴＩＩ）で行った。溶出溶媒にはクロロホルムとメタノール：水＝９５：５（容量比）のグラジエントを用いた。カラム温度は３５℃、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、ドリフトチューブ温度は４０℃で窒素ガス圧力は３５０ｋＰａであった。

（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽に１８L培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行い、アンモニアを添加しｐＨのコントロールを行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。

（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁するか、凍結乾燥または熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁し、以下の条件に調整することでエキス抽出を行った。
自己消化：１ＮＨＣｌでｐＨ５．０に調整後、５５℃で４時間攪拌
酵素抽出：１ＮＮａＯＨでｐＨ７に調整後、細胞壁溶解酵素（ツニカーゼ）或いはプロテアーゼで５５℃、４時間攪拌抽出（再現性確認中）
酸抽出：１Ｎ硫酸でｐＨ２以下に調整後、６５℃で２分間攪拌抽出
アルカリ抽出：２ＮＮａＯＨでｐＨ１３に調整後、７０℃で２０分間攪拌抽出

（線維芽細胞の賦活活性の評価）
比較例１〜３の評価（コメ、トウモロコシ、こんにゃく）
植物性グルコシルセラミドであるコメ（比較例１）、トウモロコシ（比較例２）、及びこんにゃく由来グルコシルセラミド（比較例３）について、ヒト皮膚線維芽細胞の賦活作用を測定した。

正常ヒト皮膚線維芽細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種（５×１０²／ｗｅｌｌ）し、２４時間前培養した（５％ＣＯ_２、３７℃）。培養液は、１％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を使用した。その後、コメ（比較例１）、トウモロコシ（比較例２）、こんにゃく由来グルコシルセラミド（比較例３）含有エタノール溶液を最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように添加し、新鮮な培地に交換した。播種３日目にＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同人化学製）で処理後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することで生細胞数を求めた。エタノールを添加したものをコントロールとし、コントロールを１００％としたときの細胞の増殖率を求めた。

実施例１の評価（酵母）
次に、上記製法により得られた本発明の線維芽細胞増殖促進剤である酵母由来グルコシルセラミドについて、線維芽細胞増殖促進作用を測定した。

正常ヒト皮膚線維芽細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種（５×１０^３／ｗｅｌｌ）し、２４時間前培養した（５％ＣＯ_２、３７℃）。培養液は、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を使用した。その後、前記で調整した酵母セラミド（実施例１）を最終濃度が０．５、１、２．５、５、７.５、１０、２５μｇ／ｍＬになるように調整して添加した新鮮な培地に交換した。播種３日目にＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８で処理後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することで生細胞数を求めた。エタノールを添加したものをコントロールとし、コントロールを１００％としたときの細胞の増殖率を求めた。

比較例１
コメ由来グルコシルセラミドには一般的に市販で入手可能なコメ由来のグルコシルセラミドを使用した。線維芽細胞増殖促進効果の評価においてコメ由来グルコシルセラミド濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加したところ、ヒト正常線維芽細胞で１１０％の増殖促進作用を示した。

比較例２
トウモロコシ由来グルコシルセラミドには一般的に市販で入手可能なトウモロコシ由来のグルコシルセラミドを使用した。線維芽細胞増殖促進効果の評価においてトウモロコシ由来のグルコシルセラミドをセラミド濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加したところ、ヒト正常線維芽細胞において、１１６％の線維芽細胞の増殖を促進した。

比較例３
こんにゃく由来グルコシルセラミドには一般的に市販で入手可能なこんにゃく由来のグルコシルセラミドを使用した。線維芽細胞増殖促進効果の評価においてこんにゃく由来のグルコシルセラミドをセラミド濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加したところ、ヒト正常線維芽細胞において、６９％の線維芽細胞の増殖率を示した。

実施例１
菌体培養後に洗浄し、熱風乾燥させたトルラ酵母の乾燥菌体５ｋｇを蒸留水５０Ｌに懸濁し、２ＮＮａＯＨでｐＨ１３．０に調整した後、７０℃で３０分間エキス抽出した。抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、酵母残渣の蒸留水への懸濁と遠心分離を３回繰り返すことで洗浄した。洗浄後は酵母残渣を真空乾燥することで３．３ｋｇのエキス抽出酵母残渣が得られた。得られた酵母残渣全量を２倍量の９０％エタノールに懸濁し、６０℃で１０時間攪拌してグルコシルセラミドを抽出した。遠心分離により抽出液を回収し、酵母残渣をエタノールで３回洗浄した洗浄液と合わせて濃縮した結果、抽出物３００ｇが得られた。これをグルコシルセラミド含有組成物とし、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで分析した結果、グルコシルセラミドが２．１％含有されていた。またＴＬＣによる分析の結果、夾雑物のステロール配糖体は確認されなかった。線維芽細胞促進効果の確認には、上記抽出物１５ｇをさらにシリカカラムで精製することで、グルコシルセラミド含量を３４％含有する組成物１１ｇが得られた。得られた酵母由来グルコシルセラミド粗精製物を使用して線維芽細胞増殖促進効果の評価を行った。

実施例１の結果を図１に示す。図１に示すように、酵母由来グルコシルセラミドは、濃度依存的に正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖率を上昇させた。サンプル添加量５μｇ／ｍＬにおける正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖率が１２０％を超え、優れた細胞賦活作用を示した。

また図２に、実施例１と比較例１、２、３について、同一濃度で培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖率を比較した結果を示した。図２によれば、酵母セラミド（実施例１）は、比較例１、２、３のコメ、トウモロコシ、こんにゃく由来よりも正常ヒト皮膚線維芽細胞の増殖率が高く、良好な細胞賦活作用を示すことが判る。

Claims

酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体由来のグルコシルセラミド組成物を含有する線維芽細胞増殖促進剤。
請求項１の線維芽細胞増殖促進剤を含有する飲食品。
請求項１の線維芽細胞増殖促進剤を含有する化粧品。
請求項１の線維芽細胞増殖促進剤を含有する医薬品。