KR20170035004A - 알긴산 올리고당의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 포함하는 비만치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents
알긴산 올리고당의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 포함하는 비만치료 또는 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 상기 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법은 다시마 용매 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 슈도알터로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 알긴산 분해균주를 처리하여, 알긴산 올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 알긴산 올리고당에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유산균인 발효균주를 접종시키고, 발효시켜 알긴산 올리고당 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로 상기 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법은 다시마 용매 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 슈도알터로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 알긴산 분해균주를 처리하여, 알긴산 올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 알긴산 올리고당에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유산균인 발효균주를 접종시키고, 발효시켜 알긴산 올리고당 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알긴산 올리고당 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
경제수준 향상에 의한 영양과잉, 환경오염, 운동부족, 스트레스 증가 등에 따른 각종 생활습관병 및 만성퇴행성질환의 만연이 우리 사회의 큰 문제로 대두되고 있다. 이 중, 최근에 가장 관심이 집중되고 있는 질병이 비만이다.비만은 일반적으로 음식물로 섭취한 에너지(energy intake)가 신체활동 등으로 소비한 에너지(energy expenditure)와 균형을 이루지 못하여, 잉여의 에너지가 체내에 지방세포(adipocyte)의 양적, 수적 증가를 일으켜 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 유전적 요인, 환경적 요인, 정신적 요인 또는 식사습관 및 운동부족 등의 생활습관 등에 의하여 신체 내 에너지 밸런스가 무너져 생기는 질환을 의미한다.
상기 비만과 관련하여 지방화(Adipogensis)에 대한 연구가 진행되고 있다. 상기 지방화란 전구지방세포로부터 지방세포가 분화되어 지방을 축적하게 되는 과정을 말하며, 상기 지방화는 비만, 당뇨병, 지방간 및 관상 심장질환 등 대사성질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상기 지방세포는 단순히 에너지 저장고 역할 뿐만 아니라 내분비 기관으로서 adipocytokine이라는 단백질성 호르몬을 분비하여 체내 에너지 항상성 유지를 위한 다양한 기능을 수행하고 있다. 그러나, 과다한 지방세포의 분화와 불균형적인 에너지 대사는 지방세포의 비정상적인 유전자 발현과 신호전달 체계 이상을 초래하여 adipocytokine의 분비 이상을 야기시킬 수 있다.
상기 지방세포의 분화과정을 유도하는 전사인자(transcription factors)로는 ADD1/SREBP1c(adipocyte determination and differentiation dependent factor 1/sterol response element binding protein 1c), PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ) 및 C/EBP(CCAAT enhancer binding protein)가 보고되어 있다. 상기 전사인자는 지방세포 분화과정 중 각기 다른 시점에서 발현이 유도되며, 서로 상호작용을 통하여 지방세포 특이 유전자들의 발현을 조절하고 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 점진적으로 유도해 나간다.
우선, PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)는 핵수용체에 속하며, 지방세포 특이적인 fatty acid binding protein인 aP2뿐 만 아니라 다른 많은 유전자들의 발현을 유도한다. 이와 관련하여, 기존 연구에서는 레트로바이러스를 이용하여 전구지방세포가 아닌 섬유아세포에 PPARγ를 과발현시킨 경우, 일반적인 섬유아세포에서도 지방세포 분화가 일어난다는 것이 보고되어 있다.
상기 전사인자들에 의해 유도되는 지방세포의 분화는 confluence, hormonal induction, clonal expansion, growth arrest 및 terminal differentiation의 단계로 진행된다. 먼저, 전구지방세포는 confluence 상태가 되면 세포주기가 G0/G1 시기가 되어 growth arrest가 일어난다. 이후, 적당한 분화 자극과 C/EBPβ와 C/EBPδ의 발현에 의해 한 번 혹은 두 번의 세포분열이 일어나는 clonal expansion 단계에 들어간다. 이어 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 통하여 전구지방세포는 완전한 분화의 형태를 보이기 직전의 단계인 growth arrest의 시기로 접어들게 된다. 마지막 단계인 terminal differentiation은 수 일에서 수 주의 시간이 걸리고, 지속적인 growth arrest가 일어나면 성숙된 지방세포의 특징이 점차 나타나게 된다.
구체적으로, 분화 초기에 섬유아세포와 유사했던 전구지방세포는 형태적으로 둥글게(morphological rounding-up)되고, lipoprotein lipase 등의 mRNA가 발현되기 시작하며, 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPδ의 transient induction이 일어난다. 이후, PPARγ와 C/EBPα가 발현되어 실제로 지방세포의 표현형을 결정짓는 대부분의 유전자들을 조절하거나 그 발현을 활성화 시킨다. 이러한 과정을 통해서 지질 방울들이 세포질로 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 방울(droplet)이 된다.
또한, 상기 비만은 당뇨병과 같은 대사증후군과 함께 문제가 되기도 하고, 상기 대사증후군에 의하여 비만이 초래되거나 비만에 의하여 대사증후군이 초래되기도 한다.
또한, 당뇨병과 관련 인슐린 저항성은 제2형 당뇨병의 발병과정 동안 혈당치가 정상적인 포도당 내성 범위 내에 있는 경우에도 발생할 수 있다. 또한 상기 인슐린 저항성은 혈액 내 유리지방산의 영향을 받기도 한다. 상기 유리지방산은 세포내 중성지방이 유리지방산과 글리세롤로 가수분해되는 지질분해과정 동안 생성되어 지방세포로부터 분비된다. 지방분해 활성이 높은 복강 내 지방에서 배출된 다량의 유리지방산이 간으로 유입되면 간에서 포도당 이용률은 낮아지고 인슐린 결합 및 작용이 방해된다. 따라서 간의 인슐린 제거율이 떨어져서 말초에서의 인슐린 농도가 높아진다. 또한 유리지방산은 지방, 근육 등의 말초에서 포도당 이용률을 감소시켜 인슐린 저항성을 증가를 초래한다.
상기 비만 또는 당뇨병과 같은 대사증후군을 해소하고 적정한 체중을 유지하기 위한 비만치료기전으로는 식욕의 조절, 지방의 소화 및 흡수 방해, 에너지 소비의 증가, 지질대사의 조절 등이 있는데, 기존의 비만 치료제의 경우에는 상당한 부작용을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물 중에서 비장세포의 성장 및 분화 조절, 지방조직의 과다나 지방대사 이상으로 유발되는 대사성 질환을 치료할 수 있는 약물의 개발이 요구되고 있다.
알긴산(alginic acid)은 주로 갈조류의 세포벽을 구성하고 있어, 갈조류로부터 추출할 수 있다. 알긴산은 a-L-글루론산(guluronate)과 C5 에피머(epimer)인 β - D - 만뉴론산(1,4’-β-D-mannuronate)이 α - 1,4 결합 또는 β - 1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류로, pG block, pM block 및 pM/G stretch 형식으로 결합된 복잡한 당중합체이다.
상기 알긴산은 독특한 물리적 성질 때문에 예로부터 광범위하게 사용되어 왔다. 예를 들어, 식품산업, 인쇄산업 및 제약산업을 포함한 다양한 산업분야에서 안정제, 점질제 또는 겔화제로 사용되고, 미립구, 비드, 마이크로캡슐 또는 정제 등과 같은 약물전달시스템의 원료로 사용되며, 조직공학에서 매트릭스 담체 등으로 사용되어 왔다. 또한, 알긴산은 비만 억제, 장의 연동운동 촉진을 통한 변비 치유, 항콜레스테롤 억제, 체내의 중금속 흡수와 제거 또는 유해물질의 독성 억제와 같은 다양한 생리활성이 보고되어, 기존 용도에 추가로 기능성 식품 소재로 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
또한, 상처를 보호하는 창상피복재 및 지혈 등의 생리활성효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 최근 알긴산 유래 올리고당의 항균/항암 작용, 면역 증강, 항콜레스테롤 효과, 항응고 효과 등 다양한 생체조절기능에 대해 보고되었다. 이러한 다양한 기능성으로 인해 알긴산 자체뿐만 아니라 알긴산을 이용한 올리고당 제조에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다.
기존 알긴산을 제조하는 방법은 갈조류와 같은 해조류에서 알긴산 또는 알긴산 유래 올리고당 등과 같은 유효성분을 추출하는 방법들이 제시되어 있다. 일 예로, 고압처리, 고온고압처리 또는 방사선처리를 통해 해조류를 연화시킨 뒤 추출하는 방법 또는 산 알칼리 처리를 이용한 방법 등이 보고되고 있다. 그러나, 기존의 방법은 해조류 유래의 탄수화물 대부분이 산이나 알칼리에 비교적 안정하기 때문에 알긴산의 추출에 다소 어려움이 있어 추출효율이 낮다는 문제점이 있다.
따라서, 최근에는 기능성 해조 올리고당을 생산하기 위해, 해조 유래 다당류를 화학적으로 분해하는 화학적 분해방법 보다는 효소를 이용한 효소적 분해방법에 대한 관심이 증대되고 있다.
알긴산을 분해하는 분해효소인 알지네이트 분해효소(alginate lyase)는 그 분해 기전이 명확하게 밝혀져 있지는 아니하나, β-elimination 반응에 의한 알긴산 분해반응을 수행하는 것으로 알려져 있다. 알지네이트 분해효소는 pM-block(polymannuronate block) 또는 pG-block(polyguluronate block)에 작용하여 주로 어떤 위치를 분해하느냐에 따라 분류되며, 한 종류는 만뉴로네이트(mannuronate)와 만뉴로네이트(mannuronate) 사이의 β-1,4 당 결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.3, β-D-mannuronan lyase)이고, 다른 한 종류는 글루로네이트(guluronate)와 글루로네이트(guluronate) 사이의 α-1,4 당결합을 분해하는 알지네이트 분해효소(EC 4.2.2.11, α-D-guluronan lyase)이다.
다양한 용도로 산업적 이용이 가능한 알긴산 올리고당의 효율적 생산을 위해서는 알긴산 분해효소가 필요하므로, 이를 위해서 알긴산 분해효소를 분비하는 미생물의 탐색을 위한 연구가 필요하다.
그러나, 기존까지의 연구가 단순히 일간산 올리고당의 생산량의 측면에서 진행되어온 연구라면, 앞으로는 알긴산 올리고당의 기능성에 집중하여, 특정 기능성이 향상될 수 있는 알긴산 올리고당의 제조방법에 관한 연구의 필요성이 증가되고 있다.
우리나라는 3면이 바다이고, 제주도와 남해 해안 일대에서 품질이 우수한 알긴산을 생산할 수 있는 다양한 해조류가 대량생산되고 있다. 상기한 바와 같이 해조류 유래 알긴산 올리고당과 해조류는 우리나라에 풍부한 수산자원 중 하나이기는 하나, 현재 생산된 대부분의 한천을 1차 가공품 형태의 저부가가치 제품형태로 수출하고 있는 실정이다. 따라서 품질이 우수한 국내에서 생산되는 해조류를 이용한 고부가가치 제품의 생산은 수산 경제 발전을 위해 필수적이라 할 것이다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 본 발명은 항비만 활성이 우수한 알긴산 올리고당 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항비만 활성이 우수한 알긴산 올리고당 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 비만 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물은 약학 조성물 또는 의약 조성물 일 수 있다.
상기 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 포함한 것 일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 비만 개선 또는 예방용 조성물은 제공한다. 상기 비만 개선 또는 예방용 조성물은 식품 조성물 일 수 있다. 상기 식품 조성물은 기능성 식품 조성물 일 수 있다.
상기 비만 개선 또는 예방용 조성물은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 포함한 것 일 수 있다.
본 발명의 발명자들은 비만에 효과가 있는 천연 식물 유래 성분에 대하여 연구 하던 중, 기존 알긴산 올리고당의 다양한 기능성에 착안하여 연구를 수행하던 중, 다시마로부터 알긴산 올리고당을 제조함에 있어, 추출조건, 알긴산 분해균주의 선택 및 유산균 발효를 위한 발효균주의 선택과 관련하여, 최적의 조합을 선택하는 경우 기존 알긴산 올리고당에 비해 우수한 비만 치료, 개선 및 예방 효과가 있어, 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 유효성분이란 조성물, 구체적으로 의약 조성물 또는 식품 조성물에 있어서 항비만 효과를 제공하는 성분을 의미한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
이러한 측면에서 본 발명은, 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법은 다시마 용매 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 알긴산 분해균주를 처리하여, 알긴산 올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 알긴산 올리고당에 발효균주를 접종시키고, 발효시켜 알긴산 올리고당 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법일 수 있다.
상기 다시마 추출물 제조단계는 30% 에탄올 수용액으로 용매 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 알긴산 올리고당 제조단계의 알긴산 분해균주는 슈도알터로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 균주일 수 있다.
상기 알긴산 올리고당 발효물 제조단계의 알긴산 발효균주는 유산균일 수 있다. 상기 유산균은 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 식품 조성물은 비만 개선 또는 예방용 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 의해 생산된 알긴산 올리고당은 항비만 효과가 우수하며, 생산효율도 뛰어나므로, 고기능성을 가진 고부가가치 상품인 알긴산 올리고머을 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 해조류를 이용한 것이므로, 해조류 생산 어가의 수익향상에도 이바지할 수 있으며, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당이 가지는 항비만 효과는 세포 독성도 낮고, 식용으로 오랜기간 사용된 다시마를 이용하여 제조된 것이므로 부작용 등이 문제되지 않으므로 경제적인 효과와 기술적인 효과가 우수하여 산업적 효과가 뛰어난 것으로 인정된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 알긴산첨가 최소배지를 이용한 후보균주의 배양에서 생성된 환원당의 농도 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알긴산 분해효소 활성 시료의 TLC 분석 결과를 나타낸 사진으로, 각 균주를 알긴산 첨가 최소배지에서 24시간(A) 및 48시간(B) 배양한 후 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 조효소액으로 알긴산 분해 효소활성을 측정하였으며, 반응액을 대상으로 TLC분석을 수행하였다. 상기 도 2에서 1은 Glucose, 2는 1012 균주, 3은 1013 균주, 4는 1203 균주, 5는 1248 균주, 6은 1505 균주, 7은 2164 균주, 8은 1493 균주를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 기질농도와 반응시간을 달리한 효소활성에서 1493균주의 조효소액의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다시마 추출물 농도에 따른 1493균주 조효소액의 분해활성의 결과를 나타낸다.
도 5는은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다시마 추출물의 알긴산 분해물의 농도별 대조구 대비 PTP1B 저해활성의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 조효소액에 의해 24시간 반응한 다시마추출물 (7 brix)의 PTP1B 저해 활 성의 결과를 나타낸다.
도2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알긴산 분해효소 활성 시료의 TLC 분석 결과를 나타낸 사진으로, 각 균주를 알긴산 첨가 최소배지에서 24시간(A) 및 48시간(B) 배양한 후 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 조효소액으로 알긴산 분해 효소활성을 측정하였으며, 반응액을 대상으로 TLC분석을 수행하였다. 상기 도 2에서 1은 Glucose, 2는 1012 균주, 3은 1013 균주, 4는 1203 균주, 5는 1248 균주, 6은 1505 균주, 7은 2164 균주, 8은 1493 균주를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 기질농도와 반응시간을 달리한 효소활성에서 1493균주의 조효소액의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다시마 추출물 농도에 따른 1493균주 조효소액의 분해활성의 결과를 나타낸다.
도 5는은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다시마 추출물의 알긴산 분해물의 농도별 대조구 대비 PTP1B 저해활성의 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 조효소액에 의해 24시간 반응한 다시마추출물 (7 brix)의 PTP1B 저해 활 성의 결과를 나타낸다.
본 발명은, 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법은 다시마 용매 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계; 상기 다시마 추출물에 알긴산 분해균주를 처리하여, 알긴산 올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 알긴산 올리고당에 발효균주를 접종시키고, 발효시켜 알긴산 올리고당 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법일 수 있다.
상기 다시마 추출물 제조단계는 30% 에탄올 수용액으로 용매 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 추출물 제조단계는 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 추출용매는 물, 유기용매 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 상기 알코올 희석수 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성 용매 도는 이들의 혼합용매 일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 알코올 희석수는 알코올 50%(v/v) 내지 99.9%(v/v)로 물에 희석한 것 일 수 있다.
상기 추출용매는 바람직하게는 물, 탄소수 1내지 5의 알코올, 알코올 희석수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 30% 에탄올 수용액 일 수 있다.
상기 추출시간은 특별히 한정되지 않으나, 30분 이상 추출할 수 있고, 일 예로 28분 내지 35 분 동안 추출할 수 있다.
상기 추출온도는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 식물 추출 시 통상적으로 이루어지는 추출온도에서 행해질 수 있다.
상기 추출방법은 통상의 식물 추출물, 구체적으로 해조류의 제조방법에 따라 제조된 것 일 수 있고, 일 예로 냉침 추출법, 온침 추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 통상의 추출기기, 초음파 분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
상기 분획용매는 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매, 바람직하게는 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매일 수 있다.
상기 분획 시 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 추출물의 분획물을 제조할 수 있다.
상기 분획과정은 일 예로, 4℃ 내지 120℃, 또는 50℃ 내지 90℃, 또는 60℃ 내지 80℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 알긴산 올리고당 제조단계의 알긴산 분해균주는 슈도알터로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 균주일 수 있다.
상기 알긴산 올리고당 발효물 제조단계의 알긴산 발효균주는 유산균일 수 있다. 상기 유산균은 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물은 의약 조성물 또는 약학 조성물 일 수 있다.
상기 비만은 체내에 지방세포(adipocyte)가 양적, 수적 증가로 인해 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하고, 이러한 지방세포의 양적 수적 증가는 지방화 즉, 지방세포의 분화와 지방의 축적에 의하여 발생하는 것을 의미한다.
상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 포함 할 수 있다.
또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분 즉, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
상기 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 20 중량% 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분 즉, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은, 상기 유효성분 이외에 공지의 비만 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 천연물에 대한 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 200 중량부로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물 일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 조성물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.
상기 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당 100 중량부 당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
상기 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g이다.
또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당은 고추과육 추출물과 비교하여 항비만 효과, 구체적으로 지방세포 분화 억제 효과 및 지방세포 크기 증가 억제능이 현저하게 우수하다는 것이 확인되어, 본 발명의 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 뛰어난 비만 예방 또는 개선 효과를 보이는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
모든 실험결과는 최소한 3회 이상 반복하여 평균치로 표시하였고, 각 군과의 비교는 ANOVA test를 이용하여 각각 p<0.05인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.
실시예
1. 재료 및 방법
1. Alginate 분해균주 탐색 .
Alginate 분해 미생물을 선별하기 위해, 24종의 세균은 5 ㎖의 alginate 최소액체배지(Alginate-minimal liquid medium, AMM; 0.3%(w/v) sodium alginate, NH4NO3 1.2 g/L, NaCl 24 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0.3 g/L, FeCl2·4H2O 0.01 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, CaCl2?2H2O 0.2 g/L)에 1 colony를 접종하여 25℃, 150 rpm에서 2일간 진탕배양 하였다. 배양액은 원심분리 (15,000 rpm, 10분)한 뒤 배양 상층액을 회수하였으며 환원당, 분해효소활성 및 TLC 분석을 수행하였다.
2. Alginate 농도 따른 조효소액의 분해활성
20 mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)를 이용하여 농도(0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%)에 따른 sodium alginate 용액을 제조하였다. 각 농도별 sodium alginate 기질용액 900 ul와 조효소액인 배양상등액 100 ul를 혼합한 후 40℃에서 반응을 진행하였으며 각 농도별로 5개의 반복수를 갖도록 하였다. 반응시간은 각 농도별로 0, 10, 20, 40, 60분마다 시료를 회수하여 냉각시킨 후 환원당과 TLC를 수행하였다. 이때 무처리구는 조효소액 대신 증류수를 이용하였다.
3. 다시마 추출물의 농도(brix)에 따른 조추물의 분해활성
다시마 추출물은 참여기업으로부터 제공받았으며 다시마 추출물을 기질로 이용하기 위해 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8)을 이용하여 7, 10, 15, 21 brix로 조절하였다. 각 brix별 기질용액 900 ul와 조효소액 100 ul을 넣고 40℃에서 1, 2, 6, 12, 24 hr간 반응하였으며 무처리구는 효소액 대신 증류수로 대신하였다. 각각의 반응액으로 부터 환원당과 TLC를 수행하였다.
4. Alginate의 효소활성 및 이화학적 분석
가. Alginate의 효소활성
Alginate의 효소 활성은 0.1%(w/v) alginate가 포함된 기질용액(20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4)과 조효소액을 혼합하여 40℃에서 10분간 반응시킨다. 효소 반응액내에 환원당 정량은 dinitrosalicylic acid (DNS) 방법에 의해 측정하였다. Alginate lyase의 효소 활성은 1분에 1 μ㏖의 glucose를 생산하는 효소의 양을 1 unit (1U)로 정의하였다.
나. 환원당 정량
환원당 정량은 dinitrosalicylic acid (DNS) 방법에 따름. 시험관에 효소 반응액 100ul와 DNS 용액 900ul을 첨가한다. 100℃에서 5분간 열처리 후 ice에서 충분히 냉각 시킨다. Spectrophotometer를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 Glucose standard curve를 작성한 후 환원당으로 환산하였다.
다. 총당 정량 방법(Phenol-H2SO4)
Phenol-Sulfuric acid 방법(33)에 의해 정량하였다. 조효소액 500 ul를 시험관에 넣은 후 5%(v/v) phenol 용액 0.25 ml, 95%(v/v) H2SO4 용액 1.25 ml을 첨가한다. 상온에서 30분간 반응한 후, Spectrophotometer를 이용하여 492nm에서 흡광도 측정하였다. 이후 Glucose standard curve를 작성한 후 총 당으로 환산하였다.
라. 단백질 정량 방법
단백질은 Lowry 방법에 의해 정량하였다. BCA protein assay reagent A시약에 BCA protein assay reagent B시약 1/50의 양을 첨가한다. 시료 10 ul에 반응시약 혼합액 200 ul를 첨가한 후 30분간 실온에서 반응하였다. 이후 ELISA READER를 이용하여 540nm에서 측정하였다. 표준품은 BSA를 이용하였으며 동일한 실험방법에 의해 표준곡선을 작성한 후 단백질농도로 환산하였다.
마. Thin layer chromatography (TLC)
TLC silica gel 60 F254 (25 Aluminium sheets 10×10 ㎝, MERCK, Germany)에 시료를 점적한 후 전개용매(1-butanol:formic acid:water=4:6:1)로 전개하였다. 발색은 10% (v/v) H2SO4-ethanol 용액으로 분무한 후 150℃에서 10분간 반응하여 band확인하였다. 표준품은 Glucose를 이용하였다.
5. 항당뇨(비만) 활성
항당뇨시험은 대사성질환에 대한 분자적지표로 이용하는 탈인산화효소인 PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B) 효소억제 능력을 이용하여 평가하였다. Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B, human, recombinant)는 BIOMOL Reserach Laboratories, Inc.로부터 구입하였다. 효소활성은 0.1M NaCl, 1mM EDTA, 1mM dithiothreitol (DTT)가 포함된 50mM citrate (pH 6.0) 완충용액에 2mM ρ-nitrophenyl phosphate (pNPP), 0.003 uM PTP1B enzyme 및 시료로 조성된 반응혼합물을 이용하여 측정하였다. 시료는 DMSO를 이용하여 stock solution을 제조한 후 final concentration 30ug/ml가 되도록 희석하여 사용하였다. 반응혼합물은 30℃에서 30분간 반응한 후 10N NaOH를 이용하여 반응을 정지하였다. 생산된 ρ-nitrophenol의 농도는 Microplate Reader (Epoch, BioTek, USA)룰 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 DMSO, 양성대조구는 50 ug/ml의 ursolic acid (U6753, Sigma, USA)를 이용하였다. IC50는 아래의 식을 이용하여 결정하였다.
Inhibition(%) 계산법 = {(negative control 흡광도-blank 흡광도)의 평균값-(sample 흡광도-blank 흡광도)}*100 (negative control 흡광도-blank 흡광도)의 평균값
6. Alginate 분해 세균의 분류동정
분리균주로부터 genomic DNA를 분리하기 위하여 분리한 세균을 50 ㎖ Zobell 2216e 액체배지에 접종하여 25℃, 150 rpm에서 2일간 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 10 min)하여 세포를 얻은 후 genomic DNA Prep Kit (Solgent., Korea)을 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA를 주형으로 16S rRNA 유전자 분석을 수행하였다. PCR을 수행하기 위해 16S rRNA 유전자 분석에 필요한 primer는 27F (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3'; Escherichia coli nucleotide 8∼27)와 1492R (5'-GGYTACCTTGTTACGACTT - 3'; Escherichia coli nucleotide 1515∼1496)을 사용하였으며, HiPi PCR PreMIx (HiPi Thermostable DNA polymerase in 250 mM Tris-HCl (pH 9.0), 80 mM (NH4)2SO4, 10% DMSO, 8.75 mM MgCl2, 0.05% bromophenol blue, 12% glycerol)를 사용하여 최종 반응량을 40 ㎕로 하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR product는 Gel/PCR purification kit (RBC Co., Korea)를 사용하여 정제한 뒤 Macrogen사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열은 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)에 등록 되어 있는 database를 이용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기 서열을 기초로 하여 group 별로 정리한 후, PHYDIT (version 3.2) 운영 프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 alignment를 수행하였다. PHYLIP package (Felsenstein, 1993)을 이용한 neighbour-joining와 maximum-likelihood 방법에 의해 계통분석을 수행하였다. Neighbour -joining tree topology는 1000 resampling에 기초한 bootstrap 분석에 의해 평가되었다.
7. Alginate 분해 효소의 분리정제 및 특성
가. 조효소액 제조
Zobell 2216e 고체배지에서 배양한 균주를 50㎖ 액체배지에 접종하여 25℃, 150 rpm에서 2일 배양한다. 전 배양된 균주는 500 ㎖의 AMM 액체배지에 2% (v/v)로 접종하여 24시간 배양한다. 이 배양액을 원심분리(12,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 균체를 제거하고 얻어진 상층액은 0.2 ㎛ membrane을 사용하여 여과한다. 여과된 용액을 조효소액으로 하였으며, 모든 실험은 4℃에서 이루어졌다.
나. Alginate 분해효소의 DNA서열 및 아미노산 서열 분석
1) N-terminal sequence
정제된 효소를 Edman method (Pulsed liquid PVDF protein (ABI, USA))에 의해 아미노산 단위로 분해시킨 후, LC 492 Protein sequencing system (Applied Biosystems Instruments, USA)를 이용하여 N-terminal sequence 분석을 하였다. 최종적으로 정제된 효소를 SDS-PAGE 내린 후 electro-blotting 직전에 Sequi-Blot PVDF membrane (BIO RAD, USA)을 100% (v/v) MeOH에 30초∼1분간 soaking 하였다. soaking이 끝난 후 membrane이 건조되지 않게 transfer buffer (25 mM Tris, 142 mM glycine, 10% (v/v) methanol에 보관하여 사용하였다.
Electro-blotting의 조건은 transfer buffer에서 30 V, 45 mA로 blotting 하였다. 5) membrane 상에 남아 있는 glycine, tris를 제거하기 위해 Blotting이 끝난 membrane을 3차 증류수에 5분간 soaking 한 후 staining buffer (0.02% (w/v) Coomassie brilliant blue R-250, 50% (v/v) methanol)를 이용하여 5분 이내로 staining 하였다. Staining buffer를 버린 후 destaining buffer (50% (v/v) methanol, 1% (v/v) glacial acetic acid)를 바로 첨가하여 staining이 끝난 membrane을 수차례 destaining buffer로 30초∼1분 주기로 교환해 가면서 destaining을 수행하였다. Band가 명확히 보이는 시점에서 destaining buffer를 버린 후 3차 증류수로 초산 냄새가 나지 않을 때까지 washing 하였다. Rinse가 끝난 membrane은 air-dry를 하여 membrane을 충분히 dry한 후 염색된 단백질 band를 잘라서 N-terminal sequence 분석에 사용하였다. N-terminal sequence 분석은 eMass 분석센터에 의뢰하여 단백질의 서열을 결정하였다.
2) Alginate 분해효소의 DNA서열 분석
Pseudoalteromonas atlantica AR06 균주의 alginate lyase gene (AB505895)을 기초로하여 primer를 제작하였다. PCR을 수행하기 위해 forward prime인 FAF1 (5'-ATGCTGCAACAATTAATA - 3'; Pseudoalteromonas atlantica AR06 alginate lyasegene nucleotide 1 ∼ 18)와 reverse prime인 FAR (5' - TTAATTA GTTTCGCGCGTATAAC - 3'; Pseudoalteromonas atlantica AR06 alginate lyase gene nucleotide 1093 ∼ 1115)를 사용하였으며, SB-1493 균주와 표준균주인 P. atlantica (KACC 14376)로부터 분리한 genomic DNA를 주형 DNA로 PCR을 수행하였다.
8. 효소의 특성
가. 온도 안정성
0.1% (w/v) alginate가 첨가된 20mM Tris-HCl (pH 7.4) 0.9㎖과 조효소액 0.1㎖을 첨가한다. 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60℃에서 10분간 반응 시킨 후 환원당을 정량하였다.
나. pH 안정성
pH 4, 5, 6 (0.1 M sodium acetate-acetate buffer), pH 7, 8, 9 (0.1 M Tris-HCl buffer), pH 10, 11 (0.1 M sodium carbonate-sodium hydroxide carbonate buffer)로 조정된 완충 용액에 0.1% (w/v) alginate를 용해한 기질용액 0.9 ㎖과 조효소액 0.1 ㎖을 첨가한다. 45℃에서 10분간 반응 시킨 후 환원당을 정량하였다.
다. 염도 안정성
0.1% (w/v) alginate가 첨가된 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)에 NaCl 농도를 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 1.5, 2 M로 조정된 기질용액 0.9 ㎖과 조효소액 0.1 ㎖을 첨가한다. 45℃에서 10분간 반응 시킨 후 환원당을 정량하였다.
라. 금속 이온의 영향
0.1% (w/v) alginate가 첨가된 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)에 금속이온(MnCl2, CuCl2, CaCl2, CoCl2, MgCl2, ZnCl2, KCl, FeCl3,)의 농도를 1mM로 첨가한다. 45℃에서 10분간 반응 시킨 후 환원당을 정량하였다.
. GABA 생성 유산균의 분리 및 탐색
가. 시료
유산균분리를 위해 해양생물(전복, 완도), 청국장 및 젓갈(황석어젓, 신안어당; 새우젓, 신안어당; 멸치젓, 신안어당)을 전라남도 신안지역에서 구입하여 사용하였다. 또한 발효식품인 막걸리는 시중에서 판매되는 12종 (금정, 기찰, 덕산, 불로, 생탁, 옥천, 우국생, 이동, 장수, 제주, 참살이, 천년)을 제조사로부터 직접 구입하였다.
나. 유산균 분리
시료 1 mL를 취하여 멸균생리식염수 (0.85% NaCl) 9 mL와 혼합하여 균질화 한 후 연속 희석법에 의해 희석하였다. 희석액은 BCP 고체배지 (Yeast extract 2.5 g, peptone 5.0 g, glucose 1.0 g, tween 80 1.0 g, L-cystein 0.1 g, bromocresol purple 0.1%(w/v), agar 15.- g, distilled water 1 L)에 도말하여 30℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 배지의 색이 보라색에서 노란색으로 변화되어 형성된 집락을 무작위로 선발하여 Lactobacilli MRS 배지 (Difco Co.)를 이용하여 계대배양 후 10% (v/v) glycerol 용액에 부유하여 -80℃에 보존하였다.
다. GABA 생성능 탐색
GABA 생산 능력을 가진 균주를 선별하기 위한 배지는 1% (w/v) monosodium glutamic acid (MSG, sigma, Co. USA)가 첨가된 Lactobacilli MRS broth (Difco Co.)배지를 사용하였다. 균주는 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 1% (w/v) MSG가 첨가된 Lactobacillus MRS broth에 1 loop 접종하여 37℃에서 24시간 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 본 배양은 전배양된 배양액을 1% (w/v) MSG가 첨가된 Lactobacillus MRS broth에 OD 0.1로 조절하여 접종하여 37℃, 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 시료는 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 시간째에 채취하여 660nm에서 흡광도를 측정하였다. GABA 생성 여부는 TLC 방법을 이용하여 분석하였다.
2. 우수균주의 GABA 생산 최적 배양 조건
가. 온도, pH, 염도에 따른 GABA 생성조건
분리균주의 배양을 위해 사용된 배지는 Lactobacilli MRS broth (Difco Co.)를 사용하였으며, GABA생산을 위한 배양에는 MRS broth에 monosodium glutamic acid (MSG)를 1% (w/v) 첨가하여 사용하였다. GABA 생산을 위한 최적 온도를 알아보기 위하여 25℃, 30℃, 37℃, 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 최적 pH를 알아보기 위하여 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10으로 조정하여 실험 하였다. 또, 염(NaCl)농도에 따른 GABA 생산능을 알아보기 위하여 초기 염(NaCl)농도는 0, 1, 2, 3, 5, 7% (w/v)로 조정하여 실험하였다. 시료는 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 시간째에 채취하였으며, 세포의 성장은 660nm에서 흡광도를 측정하였고 GABA 생성 여부는 TLC 방법을 이용하여 분석하였다.
나. MSG 농도에 따른 GABA 생성조건
MSG 농도가 GABA 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MSG가 0, 1, 2, 3, 5, 10% (w/v) 첨가된 MRS 배지에 균주를 접종한 후 37℃, 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 시료는 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 시간째에 채취하였으며, 세포의 성장은 660nm에서 흡광도를 측정하였고 GABA 생성 여부는 TLC 방법을 이용하여 분석하였다.
다. 최적 조건에서 GABA 생성
최적조건에 따른 균주 성장 및 pH 변화를 조사하기 위하여 MSG가 1% (v/v) 첨가된 MRS 배지 (pH 9.0, NaCl 0%)에 균주를 접종한 후 37℃, rpm 150 조건에서 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 시간 배양하면서 660nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장과 pH변화를 모니터링 하였다. GABA 생성 여부는 TLC 방법을 이용하여 분석하였다.
3. 이화학적 분석
가. TLC (Thin Layer Chromatography) 분석
생성된 GABA는 Thin Layer Chromatography (TLC ; Silica gel 60 F254, Merck co.)분석을 실시하여 확인하였다. 채취한 세포 배양액을 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 분석용 시료로 하였다. 배양액에 함유된 GABA의 TLC분석에 사용한 전개용매는 n-butanol : acetic acid : water (4:1:1, v/v/v)를 사용하였고, 발색시약으로 0.2% ninhydrin을 분무하여 105℃에서 5분간 발색시켜 확인하였다. 표준품으로는 GABA (1 mg/mL), MSG (1 mg/mL)를 이용하였다.
기존 확인된 분해균주로 보고된 균주를 조사하였으며, 본 대학에서 분리보존중인 23균주를 선발하였고, 이후 후보균주를 대상으로 알긴산분해능을 알아보기 위해 알기산이 첨가된 최소배지에서 2일간 배양한 후 상층액을 대상으로 환원당과 전환생산능력을 분석한 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 1493균주를 후보균주로 선발하였다.
기질용액인 알긴산농도를 달리하여 1493균주의 조효소액을 첨가한 후 반응시간에 따른 효소반응과 TLC 분석을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 그 결과 기질인 알긴산의 농도는 1%에서 환원당전환능력이 가장 높았으며, 반응시간은 증가할수록 즉 60분에서 가장 높은 환원당 값을 보였으며, 상기 반응액을 이용한 TLC 분석 결과에서, 반응시간이 경과함에 따라 분해산물이 전개되어 3종의 oligomer가 생성됨을 확인하였다.
또한, 다시마 추출물의 농도에 따른 1493균주 조효소액의 알긴산 분해효소 활성을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타내 바와 같이, 1493균주의 효소활성은 24시간동안 관찰하였을 때 2시간째에 가장 높은 활성을 보였으며 농도에 따른 차이는 뚜렷하게 나타나지 않았으며, TLC 분석에서도 알긴산만을 이용하였을 때와 같이 뚜렷한 산물은 관찰되지 않았다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (8)
- 다시마 용매 추출물을 제조하는 다시마 추출물 제조단계;
상기 다시마 추출물에 알긴산 분해균주를 처리하여, 알긴산 올리고당을 제조하는 단계; 및
상기 알긴산 올리고당에 발효균주를 접종시키고, 발효시켜 알긴산 올리고당 발효물을 제조하는 단계
를 포함하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 다시마 추출물 제조단계는 30% 에탄올 수용액으로 용매 추출하는 것을 특징으로 하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 알긴산 올리고당 제조단계의 알긴산 분해균주는 슈도알터로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 균주인 것을 특징으로 하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 알긴산 올리고당 발효물 제조단계의 알긴산 발효균주는 유산균 인 것을 특징으로 하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주인 것을 특징으로 하는 항비만 활성을 갖는 알긴산 올리고당 제조방법. - 제1항의 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 의약 조성물.
- 제1항의 제조방법에 의해 제조된 알긴산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물.
- 제7항의 식품 조성물은 비만 개선 또는 예방용 건강기능식품인 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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