PT92133B

PT92133B - Processo para a separacao de glicolipidos de uma mistura lipidica e utilizando as fraccoes obtidas

Info

Publication number: PT92133B
Application number: PT92133A
Authority: PT
Inventors: Ladislas Colarow
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1989-10-27
Publication date: 1995-06-30
Also published as: AU621407B2; EP0365868B1; IE893155A1; EP0365868A3; JP3012259B2; ATE81469T1; PT92133A; CH677494A5; DK536489A; DK536489D0; US5284941A; IE62791B1; FI93123C; DE68903209D1; MY104676A; NO170635C; FI93123B; NO894294L; IE893155L; FI895081A0

Description

À presente invenção refere-se a um proces so para a separação de glicolipidos de uma mistura lipídica contendo lípidos complexos (CL).

Os lípidos complexos são estruturas quími cas largamente disseminadas nos tecidos biológicos onde ocu pam um lugar fundamental no metabolismo intermediário e nas células de alguns orgãos tais como o cérebro e o fígado.

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Subdividem-se em duas classes principais: os fosfolípidos (PD) que por hidrólise originam os fosfatos minerais, por exemplo, a fosfatidilcolina (PC), a fosfatidil-etanol-amina (PE) , o fosfatidil-inositol (PI), os glicolípidos (GL) cujas bases estruturais esfingosina, por exemplo, os cerebrosidos, os hematosidos, os gangliosidos, o glicerol, por exemplo, os mono e digalactosil-diglicéridos, ou os esterois por exemplo, os esteril-glucosidos e seus esteres, contêm pelo menos um radical açúcar. A quantidade dos GL nos CL é geralmente entre 3 e 10 vezes menor que a dos PL.

Os GL animais, em concentração elevada no cérebro, constituem componentes funcionais importantes das

membranas e estão implicados no transporte intramembranar, no reconhecimento celular, na transmissão sinaptica, no cres cimento celular, na fixação das hormonas, nas enzimas, nas bactérias, nas toxinas bacterianas, nas transformações malignas e em muitas outras funções biológicas. Deste modo os GL encontram aplicações, por exemplo, em medicina, em farmacologia, em geriatria e em cosmética.

Sabe-se extrair parcial ou totalmente os GD dos tecidos biológicos com o auxílio de diferentes misturas de solventes orgânicos polares, por exemplo, clorofórmio /metanol, hexano/isopropanol, tetra-hidrofurano/água. De acordo com estes procedimentos são obtidos apenas em mistura com lípidos neutros (NL) e com os PL, designando-se estes extratos como lípidos totais (TL). Como variante, é possível extrair primeiro os tecidos biológicos utilizando acetona para eliminar uma grande parte dos NL, por exemplo, os triglicéridos, os esterois, os ácidos gordos livres, e depois faz-se a extracção dos lípidos membranares residuais por meio dos solventes orgânicos polares anteriormente referidos É possível continuar a fazer a separação dos IL por métodos diversos. 0 método mais conhecido é o processo de Folch segundo o qual, num sistema solvente de duas fases clorofórmio /metanol/água, se faz a recolha de uma fase superior contendo a maior dos gangliosidos, dos GL com mais de 4-5 radicais açúcar e vestígios de PL ácidos (APL), e ben assim uma fase inferior contendo a maior parte dos PL, os ceramidas, os esterilglucósidos, os ceramidas mono^-, di^- e tri-hexosidas e todos os lípidos não polares, por exemplo, os triglicéridos. No entanto a separação dos lípidos não é nítida, por exemplo e possível encontrar hematósidos nas duas fases.

Conhece-se um método de separação em grande escala dos hl e dos CL baseado na utilização de uma mistura hexano/etanol. Existem outros métodos que utilizam a cromatografia líquida, mas apresentam o inconveniente de uma muito fraca capacidade, por exemplo, 30 mg de lípidos por 1 g de gel de silica. Existe um processo bastante atractivo descrito no Pedido de Patente DE 2 915 614, o qual consiste em fazer a separação dos 1'L e dos PL dos TL sotre gel de silica, sem contudo referir os outros CL tais como os gangliósidos ou os GL. De acordo com este processo, os NI são definidos como a parte dos TL solúvel nos hidrocarbonetos por oposição aos PL que formam micélios nos referidos solventes. Apenas os lípidos que formam micélios são eluídos livremente a partir do gel de silica ao passo que os NI per manecem adsorvidos.

Contudo este processo apresente inconvenientes. Na realidade, muitos dos GL não formam espontaneamente micélios em presença de hidrocarbonetos. Sm consequência formam-se partículas sólidas insolúveis nos hodrocarbonetos que originam a obstrução da coluna de gel de silica cue assim adsorve os NL. Em consequência, apenas os PL são eluídos quantitativamente a partir da coluna.

A recuperação completa dos GL a partir de misturas CL é possível mas exige um tempo extraorcinariamen te longo. De acordo com o método corrente, procece-se primeiro à secagem completa dos lípidos durante 24 a 48 horas, sobre pentóxido de fósforo e depois procede-se à sua acetilação utilizando anidrido acético em piridina. A seguir separa-se dos outros lípidos os GL acetiladcs, por cromatografia líquida em coluna de Florisil, segue-se a desacetilação dos GL, fas-se a sua neutralização, procede-se à eliminação dos sais e finalmente faz-se a secagem por liofilização. 0 método é destrutivo para todos os PL e também para alguns Gl que contenham ligações sensíveis às bases, por exemplo, os gangliósidos com ácido N-C-diacetil-neuranínico Além disso a operação necessita de vários dias, normalmente uma semana.

Com o objectivo de resolver as dificuldades anteriores propos-se um método de cromatografia líquida simples, consistindo em preparar uma resina reutilizável contendo grupos de ácido fenil-borónico (P3A) fixados por ligação covalente sobre uma matriz de polistireno reticulado. A resina retem selectivamente todos os GL por formação

de complexo entre os grupos ΓΒΑ e os grupos cis-diol da parte açúcar dos GL , permitindo assim uma eluição completa dos LL e dos cl. Gegue-se uma descomplexação dos GL utilizando um solvente orgânico acuoso. Todavia a capacidade de carga da resina é relativamente fraca, tipicamente entre 0,7 e 7 mg de TL por 1 g ou entre 0,18 e 1,8 mg por 1 ml de resina (volume aparente). 0 volume de solvente de eluição necessário para 1 mg de TL é da ordem dos 2,5 a 25 ml. Verificou-se que os cartuchos de resina disponíveis no comércio e contendo 100 mg de resina se revelaram ineficazes para separar os ί'η e os Gl.

Verificou-se, de acordo com a presente invenção, que é possível separar prática e quantitativamente o GL de uma mistura lipídica contendo os CL utilizando um método cromatografico simples não destrutivo dos Pl.

processo de acordo com a presente invenção caracteriza-se pelo facto de se fazer passar a mistura em solução num solvente apropriado através de um gel de ácido bórico de modo a adsorver selectivamente os glicolípidos, fazendo-se depois a dessorção dos glicolípidos do gel por meio de um solvente de eluição.

De acordo com a presente invenção a mistura lipídica utilizada pode ser de origem animal ou vegetal. Como lípidos de origem animal é possível referir os que provêm da extração por solventes dos tecidos animais disponíveis nos matadouros, tais como por exemplo os intestinos, os pulmões, o timo, a medula, e de preferência o cérebro de bovino. Existe outra matéria prima interessante constituída pe la placenta de origem humana ou de origem animal. Estes tecidos podem estar no seu estado natural, congelados ou desidratados. Existe outra matéria prima interessante disponível em grandes quantidades que é constituída pelo soro de leite descaseinado e deslactosado. Como lípidos de origem veg;etal é possível referir, por exemplo, as lecitinas naturais de soja.

Para se fazer a extração dos lípidos da

matéria prima procede-se à desagregação e a homogeneização desta, por exemplo, nua moinho de grande velocidade, utilizando um solvente ou uma mistura solvente liofílica mas mis cível com a água. E possível utilizar, por exemplo, o tetra -hidrofurano, uma mistura de tetra-hidrofurano/água na proporção em volume variável desde 4:1 até 10:1, uma mistura de éter di-isopropílico/isopropanol na proporção em volume de 3:2, os solventes clorados, por exemplo, o clorofórmio, o dicloro-metano, uma mistura de clorofórmio/metanol na pro porção em volume de 2:1. Como é evidente é possível utilizar solventes liofílicos idênticos e suas misturas, fe preferência a operação efectua-se a quente, a uma temperatura inferior a 100°C, por exemplo, compreendida entre 5b e 60°C Depois filtra-se a dispersão e seguidamente faz-se a eliminação dos solventes, por exemplo, por destilação no vácuo até á secura e procede-se à recolha dos TL brutos. No caso vertente é possível purificar os TL brutos dissolvendo-os novamente num solvente e fazendo depois a decantação e a se paração das partículas sólidas depositadas.

De acordo com uma variante de extracção dos lípidos, é possível utilizar um solvente hidrocarboneto não polar, por exemplo, o hexano, o qual é preferido no caso de se tratar de uma matéria prima constituída por tecidos animais secos por liofilização ou por pulverização. Nes te caso faz-se a homogeneização completa nos tecidos num moinho desintegrador, por exemplo, em presença de hexano à temperatura ambiente e depois continua-se a extração dos por exemplo, a uma temperatura compreendida entre 6u e 62^UC sob agitação num reactor fechado provido de meios de agitação. A seguir deixa-se a suspensão em repouso â temperatura ambiente durante 1-2 horas. Forma-se um sedimento que se se para do sobrenadante e depois retira-se o sedimento que se retira com um hidrocarboneto não polar, por exemplo, o hexano tal como referido anteriormente. A seguir pode fazer-se a secagem ao ar dos sobrenadantes combinados numa centrifugadora ou, de acordo com uma variante, é possível deixa-los

em repouso durante um período compreendido entre 24 e 48 horas a temperatura ambiente. Separa-se o sedimento formado e depois concentra-se a solução límpida até cerca de 12-15% dc seu peso inicial, por exemplo, por evaporação no vácuo. É possível tratar o concentrado de TL fazendo a diluição com 1 volume igual de água destilada e depois elimina-se o hexano residual, por exemplo, por evaporação em atmosfera de azoto a uma temperatura de 68-7O°C e secando a emulsão aquosa, por exeplo, por liofilização. Como variante é possível utilizar o concentrado de TL em solução no hexano directamente como produto intermediário para a preparação dos Cl por cromatografia, conforme referido adiante. Neste caso faz-se a concentração do eluato contendo os Cl até cerca de 5-10% do seu volume inicial após eliminação do solvente e depois faz-se a diluição com um volume igual de água destilada e procede-se à secagem da emulsão, por exemplo, por liofilização.

A mistura lipídica pode conter o conjunto dos lípidos, tanto os Ni como os Cl ou, de preferência, pode ser constituída apenas pelos CL. Neste caso faz-se a separação prévia dos Cl sobre gel de silica num solvente hidrocarboneto não polar, não miscível com a água, por exemplo, o éter do petróleo que serve de solvente de eluição para os Cl, permanecendo os NL na coluna. Ao fazer-se a preparação da solução dos lípidos, é preferível utilizar o processo de sonificação de modo a dissolvê-los oompletamente. Os Cl recolhidos são constituídos essencialmente pelos 11, pelos plasmalogenos, pelos ceramida-hexosidos, pelos glicero-glicolipidos e pelos gangliosidos. A dessorção dos NL a partir da coluna processa-se utilizando uma mistura solvente liofílica polar, por exemplo, uma mistura de clorofórmio/metanol, Os NL recuperados são constituídos essencialmente pelos mo^ηθ , di e tri-glicéridos, pelos ácidos gordos, pelos tocoferois, pelas vitaminas liposolúveis, pelos estrogéneos e pelos fito-estrogéneos. Verifica-se que os NL não contêm os Cri, o que e vantajoso no caso de se desejar recuperar os

ácidos gordos e os triglicéridos que contêm estes ácidos gordos isentos dos GL, designadamente os ácidos araquidónico di-homo-gama-1inolénico, icosapentanóico e docosa-hexanóico presentes na placenta humana. Após a separação procede-se à eliminação dos solventes até à secura, por exemplo, por evaporação no vácuo.

De acordo com uma variante de preparação damistura lipídica contendo apenas os Ul, mais particularmente aplicável ao tratamento dos lípidos da coalhada, é pos sível tratar a coalhada doce (não ácida; descaseinada e deslactosada, por exemplo, por diafiltração (ultrafiltração com lavagem; utilizando um solvente polar, por exemplo a acetona, de modo a separar os Nl que passam em solução, e depois procede-se ao tratamento do resíduo do qual se eliminou a acetona utilizando um solvente fracamente polar, por exemplo o metanol e a seguir concentra-se a solução, por exemplo, por evaporação do metanol. Depois o concentrado obtido pode ser tratado sobre gel de silica conforme anteriormente referido.

De acordo com uma variante preferida para o tratamento dos lípidos da coalhada, procede-se à extracção do TL da coalhada deslactosada e descaseinada, por exemplo, utilizando uma mistura, de hexano/nietanol e depois, após separação do resíduo, recorre-se por exemplo à microfiltração ou à centrifugação, e a seguir elimina-se a mistura, solvente por exemplo, por evaporação. Depois trata-se o concentrado de TL utilizando um solvente polar, por exemplo, a acetona, numa quantidade bastante inferior à utilizada na variante precedente em que a coalhada e tratada directamente. p.ecoIhe-se a fracção insolúvel e depois elimina-se a acetona. Ista variante de pré-separação apresenta diversas vantagens relativamente a precedente: a quantidade de acetona necessária e aproximadamente 10 a 12 vezes menor; a matéria insolúvel na acetona contem cerca de 75-80% em peso d.e CL e aproximadamente apenas 20-25% em peso de Nl, constituídos ror triglicerid os de alto ponto de fusão, o que faz com que seja necessária uma quantidade 15 vezes menor de gel de silica do

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realizar a separação posterior éria solúvel na acetona, reprepeso da coalhada utilizada, é triglicéricos, pelos ácidos gore pela maior parte dos compostos que no caso precedente parei dos Cl; e finalmente, a mat sentado cerca de 40-45% em constituida, para além dos dos livres, pelos esteróis aromatizantes cue deste modo podem ser eliminados mais facilmente· Após esta pré-separação procede-se ao tratamento da mistura lipídica obtida por cromatografia sobre gel de silica, tal como referido anteriormente.

Para se efectuar a separação dos PI aos GL utiliza-se uma coluna, carregada de gel de ácido bórico.

adsorvente é um polímero reticulado insolúvel em água e nos solventes orgânicos, á obtido por copolimerização e reticulação do ácido di-hidrõxi-boril-anilinometacrílico e do 1,4-butano-diol-dimetacrilato, Sem pretender ficar limitados a uma teoria, admite-se que a separação praticamente quantitativa dos PI e dos C-1 seja devida â faculdade do adsorvente de proporcionar complexos com os glicolípidos por comple xação dos cis—diois dos Gl com os grupos di-hidroxi-burilo do gel e por descomplexação em presença de água. Coloca-se o gel de ácido bórico em suspensão num solvente liofílico anidro medianamente polar.á possível utilizar por exeplo uma mistura de clorofórmio/metanol na. proporção em volume variável desde 5:1 até 2:1, ou uma mistura de éter di-isoprop ílico/ isopropanol numa, proporção em volume variável des de 4:2 até 2:1.

Conforme referido anteriormente, os PI sãc eluidos da coluna ao passo que os Gl são adsorvidos. Procede-se a recolha dos PI utilizando o mesmo solvente de eluição, por exemplo, a mistura de clorofórmio/metanol na proporção em volume de 2:1, a seguir faz-se a eliminação dos solventes por evaporação no vácuo, até à secura. Para efectuar a dessorção dos Gl da coluna, utiliza-se uma mistura solvente constituida por um solvente orgânico polar miscível com a água e por 1-25% em volume de água desionisada. È possível referir por exemplo uma mistura de tetra-hidrofurano/ água na proporção em volume variável desde 10:1 até 4:1, uma

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mistura de tetra-hidrofurano/metanol/água, uma mistura de clorofórmio/metanol/água, uma mistura de dicloro-metano/metanol ou de etanol/água. De preferência utiliza-se uma mistura de tetra-hidrofurano/água, u possível fazer variar as proporções da mistura de acordo com a eluição, por exemplo, começar com uma mistura rica em solvente orgânico, tipicamente na proporção de 1C;1 em volume e terminar com uma mistura de 4:1 em volume. 0 tetra-hidrofurano apresenta a vantagem de poder ser eliminado facilmente ao mesmo tempo que se elimina a água, por exemplo, durante a liofilização subsequente. No caso de se utilizar uma mistura que contenha um álcool apenas serão obtidos os C-l solúveis numa mistura álcool/água e além disso será necessário lavar a coluna com uma mistura de tetra-hidrofurano/água quando se fizer a regeneração .

Em alguns casos é desejável efectuar uma separação fina dos C-l. Para se conseguir esse objectivo colocam-se os GL em solução numa mistura solvente de clorofórmio/metanol, por exemplo, numa ampola de decantar de parede dupla munida de meios de agitação a quente, por exemplo â temperatura de 50°C, â qual se adiciona uma solução aquosa de EC1. Agita-se primeiro rapidamente e depois mantem-se a agitação com suavidade. Eormam-se assim duas fases, uma fase aquosa contendo os gangliósidos e uma fase orgânica contendo os outros Gl. Após separação da fase inferior, por exemplo, por trasfega por gravidade, procede-se à eliminação dos solventes, por exemplo, por evaporação no vácuo.

Ce acordo com uma realização particular do processo da presente invenção é possível separar os PI em PI não ácidos (NPL) e PI ácidos (APL) por um lado, e por outro é possível separar os GL em GL não ácidos (NGL) e ácidos (AGL), por cromatografia de permuta iónica. 0 interesse destas separações posteriores reside no facto de os métodos habituais de análise tais como a cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC), a cromatografia de alto rendimento em nelícula fina (HP11C) e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (KKP) não permitirem a detecção e a determina9

ção quantitativa das diversas fracções do GL, umavez que o número de classes de lípidos presentes nos extratos biológicos é demasiadamente elevado para que estes métodos sejam eficazes. Lão é possível efectuar uma eluição por HPLC de todas as classes de lípidos presentes sem utilizar fases móveis diferentes ou sem sintetizar os derivados de alguns lípidos. A pré-separação utilizando resina de permuta iónica de agarose reticulada, em particular sobre gel de dietil-amino-etil-sefarose com débito rápido sob a forma de acetato permite a separação quantitativa dos GL e dos PL proporcionando as suas diferentes fracções ácidas e não ácidas com débitos variáveis até IC volumes de leito/hora. Graças a esta separação é possível identificar e quantificar depois as diferentes fracções por HPTI-C combinada com a detecção por fluo rescência.

De acordo com outra realização particular do processo da presente invenção, é possível tratar as lecitinas naturais de soja, por exemplo, sem separação prévia dos NL, eliminando praticamente os GL e os açucares livres fazendo-os passar através de gel de ácido bórico. Uma diálise subsequente da fracção que contem o GL, utilizando agua desionisada, permite eliminar os açucares livres. Obtem-se deste modo os fito-glicolípidos. De acorco com uma variante deste modo de realização, efectua-se a separação prévia dos LL e dos CL sobre gel de silica, depois efectua-se a separação dos GL e dos PL sobre gel de ácido bórico a partir dos CL. Os PL obtidos encontram-se desprovidos de glicolípidos θ de açucares livres. Em consequência não apresentam os riscos dos PL habituais, por exemplo, nas emulsões parenterais, e neste contexto a sua composição é comparável â da lecitina do ovo.

A presente invenção diz igualmente respeito à utilização das fracções provenientes de separações.

De acordo com um primeiro modo de realização, é possivel utilizar os PL, os GL e os gangliósidos de tecidos animais e os PL da coalhada para a preparação de com posições cosméticas.

Be acordo com um segundo modo de realização, é possível utilizar os FL, os GL e os gangliósidos cuja composição seja específica para cada tecido do qual essas fraeções são extraídas, para a formulação de composições dietéticas destinadas designadamente à nutrição infantil.

Be acordo com um terceiro modo de realização, é possível utilizar as fraeções que contenham os g.angliósidos para a preparação de lipossomas utilizáveis em cos mética, ou para a preparação de medicamentos para a terapêutica do sistema nervoso.

Be acordo com um quarto modo de realização é possível utilizar as lecitinas de soja isentas de fit-o-glicolípidos para a preparação de emulsões parenterais.

Be acordo com um último modo de realização é possível utilizar os Ni de placenta humana para a obtenção de triglicéridos de ácidos gordos isentos de GL, contendo designadamente os ácidos araquidóniccD, di-homo-gama-linolénico, icosapentanóico e docosa-hexanóico. Estes triglicéridos podem servir, em conjunto com outras fraeções obtidas de acordo com a presente invenção, designadamente os PL, os GL e os gangliósidos, para preparar composições dietéticas destinadas especialmente à nutrição infantil.

Os exemplos seguintes, nos quais as partes e as percentagens são calculadas em peso salvo indicação em contrário, ilustram a presente invenção.

bestes exemplos verificou-se a eficácia da separação dos NL e dos CL por HETLC de amostras sobre placas de vidro de 10 x 10 cm recobertas de gel de silica. Fez-se a detecção dos diferentes constituintes das fraeções por fluorescência por comparação com compostos normalizados bem definidos.

Lstabeleceu-se a separação quantitativa dos GL a partis do CL por diversos métodos: HPliC, colorimetria e cromatografia em fase gasosa (C-LC). Lm particular, a separação dos glicolípidos por HPTLC foi determinada por detecção em orcinol que colora especificamente os grupos açúcar dos glicolípidos, por comparação com Gl puros normaliza11

dos .

Iara se analisar a fracção PL, recorreu-se â pré-separação dos PL en PPL e en APL por cromatografia de permuta iónica, seguindo-se a detecção posterior dos diferentes componentes por HPTLC de cada fracção por comparação com PL puros normalizados.

Paralelamente verificou-se o conteúdo da fracção GL efectuado uma cromatografia de permuta iónica prévia, seguindo-se a análise dos diferentes componentes não ácidos (KGL) e ácidos (AGL) por HPTLC, por comparação com amostras normalizadas.

Exemplo 1

1.1. Extracção dos TL do Cérebro de Bovinos

Pez-se a homogeneização de 5 Kg de cérebro de bovino em pó seco por pulverização, em 50 litros de uma mistura solvente constituída por tetra-hidrofurano/água na proporção de 4:1 em volume à temperatura de 2C°G, num misturador rotativo a 10 COO r.p.m..

Decorridos 3-5 minutos, continua-se a fazer a extracção dos lípidos do cérebro num reactor fechado de 100 litros com agitação por rotação a 160-250 r.p.m., a uma temperatura compreendida entre 5O-6O°C durante 2U minutos. Paz-se passar a suspensão obtida através de uma cuba de filtrção de camisa dupla a uma temperatura entre 40 e 5G°C, munida de um filtro de papel num dos seus andares. Procede-se a recolha das partículas sólidas retidas na cuba de filtração utilizando 35 litros de uma. mistura de tetra-hidrofurano/água na proporção de 4:1 em volume, mantendo-se o solvente a uma temperatura compreendida entre 40 e 5C°C. Sm seguida procede-se à concentração dos filtrados combinados que contêm o extrato lipídico cerebral bruto até se obter peso constante num evaporador de vácuo, a uma temperatura compreendida entre 65 e 75°C, e depois elimina-se a água residual do concentrado lipídico por adições sucessivas de 5 litros de isopropanol, seguidas por evaporações

azeotrópicas.

1.2. Purificação dos lípidos Brutos

Dissolve-se novamente o extrato bruto anterior representando 2,68 Kg em 10 litros de tetra-hidrofurano, e depois faz-se a centrifugação a 1 500 - 1 7C0 g durante 10 minutos em garrafas fechadas por cápsulas. Como variante, deixa-se em repouso o extrato bruto em solução a temperatura ambiente durante 24 horas e depois faz-se a separação dos sólidos depositados. Efectua-se a concentração da solução clarifacada até â secura a uma temperatura compreendida entre 75 e 70°C, utilizando um evaporador rotativo no vácuo. Ubtem-se 2,52 Kg de TL cerebrais e 0,56 Kg de impurezas não lipídicas.

1.5» Isolamento dos CL de Cérebro de Bovino

Carrega-se uma coluna de vidro de 100 cm de comprimento de 21,5 cm de diâmetro interior, contendo 15 litros de éter do petróleo a uma temperatura compreendida entre 60 e 80°C, com 4Kg de partículas de gel de silica de dimensões compreendidas entre 0,21 e 0,062 mm (.malha 70-250) dispersas em 20’ litros de éter do petróleo. Previamente tinha-se feito a activação do gel de silica por tratamento a uma temperatura compreendida entre 160 e 165°C durante pelo menos 16 horas, A coluna de vidro possui um filtro de vidro frito de porosidade compreendida entre 100 e 160 micra, de modo a reter as partículas de gel de silica. Faz-se a dissolução do TL cerebrais anteriores, isto é, os 2,52 Kg por agitação em 10 litros de éter do petróleo e depois sonifica-se durante 2-5 minutos (250 - 500 W/Kg de lípidosJ até que a solução turva se torne clara. Mantem-se entre 45 e 50°C a temperatura da amostra sonificada. A seguir faz-se atravessar a coluna de gel de silica e procede-se à eluição completa dos Cl com o auxílio de 15-50 litros de éter do petróleo (eluato lj. Faz-se a dessorção dos Kl (eluato 2) a partir do gel de silica utilizando 15 litros de uma mistura de clorofórmio/metanol na proporção volumétrica de 1:1.

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1.4. Regeneração do Gel de Silica Adsorvente

Introduz-se 15 litros de metanol e depois 15-20 litros de água desionisada através do adsorvente. A seguir procede-se à sua secagem numa estufa à temperatura de 105°C durante 6 horas e depois a uma temperatura compreendida entre 16o e 165°C durante 18 horas. Fara finalizar faz-se a dispersão do adsorvente reactivado em 15 litros de éter do petróleo para evitar qualquer contacto com a humidade atmosférica.

1.5. liofilização dos CL de Cérebro de Bovino

Concentra-se o eluato 1 precedente utilizando um evaporador rotativdi no vácuo, com a capacidade de 50-100 litros, a uma temperatura compreendida entre 50 e 75°C até à dessecação completa. Depois expõe-se os CL a uma corrente de azoto à temperatura ambiente durante 12-24 horas de modo a eliminar qualquer vestígio residual do solven te. A seguir faz-se a homogeneização dos lípidos libertados do seu solvente, utilizando água destilada (na proporção de 5 Kg de água por 1 Kg de CL), a uma temperatura compreendida entre 40 e 45°C, e depois espalha-se a emulsão obtida em camadas de 1-1,5 cm sobre placas de aço inoxidável. A sefuir conçela-se a emulsão à temperatura de -4U°C e faz-se a liofilização. Obtem-se deste modo 1,45 Kg de CL.

1.6. Recuperação dos KL

Concentra-se o eluato 2 até à sua dessecação tal como no parágrafo 1.5. Após eliminação co solvente tal como no parágrafo 1.5 obtem-se 0,48 Kg de ML.

1.7. Seoaração dos PL e dos GL de Cérebro de Bovino

Faz-se a dissolução dos CL de cérebro de bovino preparados conforme indicado no parágrafo 1.5 anterior, utilizando uma mistura de clorofórmio/metanol na razão de 4:1 em volume e na proporção de 1 g de lípidos para 5 g de mistura solvente. Acelera-se a dissolução dos lípido: por sonificação a uma temperatura compreendida entre 40 e

,-^5u°C e depois elimina-se qualquer partícula fazendo passar a solução através de um filtro de BUchner.

A coluna de adsorção utilizada, em vidro, de 30 cm de comprimento e de 5 cm de diâmetro interior, e constituido por dois suportes de leito em vidro frito com uma porosidade de luO-lóU micra e por um adaptador de débito que permite regular a altura do leito para valores entre 15 e 30 cm. Liga-se a coluna a uma bomba de baixa pressão (1-2 bar; cue pode fornecer três soluções de eluição diferentes através de uma torneira de três saídas com débitos variáveis desde U até 6u ml/minuto. Prepara-se uma suspensão de 15b g de gel de ácido bórico em 1OCC ml de tetra-hidrofurano e verte-se a suspensão na coluna por cargas sucessivas deixando qualquer excesso de solvente escorrer por gravidade. Ajusta-se 0 adaptador de débito para a altura de leito de 2b-22 cm. Antes da utilização lava-se a coluna com 3 volumes de leito (12u0 - 13b0 ml; de água desionisada com débito de 3b-5O ml/minuto e depois com 1 volume de leito de ácido clorídico C,5N, e em seguida com 3 volumes de leito, ou mais, de água desionisada até se obter um valor de pH neutro, com 3 volumes de leito de metanol e finalmente com 3 volumes de leito de mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volumes.

LcVa-ss previamente a coluna com 2u ml de mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 4:1 em volume com um débito de 20 ml/minuto. Seguidamente carrega-se a coluna com a amostra de CL de cérebro de bovino, isto é, com 30 g de lípidos para cada lOOg de mistura de clorofórnio/metanol na proporção de 4:1 em volume, com 0 mesmo débito, e depois com 20 ml de mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 4:1 em volume. Paz-se a eluição dos Pl e dos plasmalogenos da coluna, utilizando 3 volumes de leito (1200 - 1300 ml) de mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume com um débito de 50 ml/minuto. Para se fazer a eluição de todos os Gl, englobando por exemplo os ceramida-hexósicos, os gangliósidos e os sulfatidos, utiliza-se 3 volumes de leito de mistura de tetra-hidrofu15

rano/água na proporção de 4:1 em volume com o mesmo débito utilizado para os Pl.

l.S. Regeneração em Linha da Coluna de Gel de ácido Bórico

Regenera-se a coluna de gel de ácido bórico após cada ciclo de eluição utilizando 3 volumes de leito de mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume com um débito de 60 ml/minuto de modo a desidratar o gel.

1.9. Isolamento dos PL e dos GL de Cérebro de Bovino

Concentra-se a fracção que contem os RL até á secura no vácuo a uma temperatura compreendida entre 65 e 75°C e depois procede-se à liofilização conforme referido anteriormente (parágrafo 1.5). Gbtem-se deste modo 95C-97C g de um pó branco higroscópico livre de qualquer odor.

Concentra-se a fracção que contem o GL n O VâCUO 2 LI Γπ 2 temperatura compreendida entre 70 e 75°C até â eliminação completa do tetra-hidrofurano e renove-se o resíduo utilizando água, desionisada até ε 1 volume de 2 500 ml. Após a homogeneização procede-se à liofilização da emulsão que contem os glicolípidos conforme anteriormente descrito. Obtem-se 480-490 g de um pó branco inodoro.

Exemplo 2

2.1. Extracção dos Lípidos de Coalhada Deslactosada

Procede-se à deslactosação da. coalhada fresca por diafiltração e depois seca-se por pulverização. 0 pó de coalhada obtido possui a composição segninte;

Humidade (medida após 2 horas em estufa a 102°C) %

2. 5 matéria gorda 52.9 (método Eojonnier)

Proteínas (N x 6,78)

29.7 lactose 8·1 (determinado enzimaticamente)

Cinzas 6.8

A seguir faz-se a dispersão de SC Kg de pó de coalhada em 450 litros de acetona à temperatura de 20-22°C com o auxílio de um homogeneizador. Extrai-se a matéria gorda num reactor fechado dotado com um agitador com uma pá giratória a 120-250 r.p.m.. Kantem-se a temperatura de extração entre 20 e 22°C durante aproximadamente 20 minutos e depois filtra-se a dispersão numa cuba munida de um filtro de papel num andar. Depois procede-se à lavagem das pari ículas retidas, utilizando 300 litros suplementares de * o G acetona a temperatura de 20-22 . A seguir faz-se a secagem dos filtrados combinados por evaporação no vácuo e recolhe-se 26 Kg de lípidos neutros de coalhada. Depois faz-se passar azoto através do resíduo da coalhada desprovida de gordura retida na cuba de filtração e mantida a uma tempera tura entre 35 e 40°C durante 2 horas para se eliminar o s olvente.

Em seguida faz-se a dispersão dos 53-55 Kg de sólidos de coalhada desprovida de gordura e isenta de solvente utilizando 560 litros de metanol num homogeneizador rotativo a 10 000 r.p.m. e depois continua-se a extracção dos lípidos num reactor de parede dupla à temperatura de 60-62°C durante 20-30 minutos. A seguir faz-se passar a dispersão através de um filtro de papel colocado numa cuba de parede dupla, fechada e à temperatura de 6O-62°C, sob uma pressão de 1,5-2,5 bar, e depois faz-se a remoção das partículas sólidas que permanecem sobre o filtro utilizando 80 litros de metanol quente. Seguidamente concentra-se o filtrado metanólico até se obter um volume entre 40 e 45 litros e evapora-se o metanol residual por destilação azeo17

trópica com o metanol a uma temperatura entre 60 e 90°C.

2.2 Isolamento dos Cl· da Coalhada

Ajusta-se o volume do concentrado anterio rmente obtido em 2.1. até 100 litros utilizando éter do petróleo e depois deixa-se a solução repousar durante 48 horas à temperatura ambiente. Elimina-se por filtração os eventuais depósitos sólidos e depois faz-se passar a fase éter do petróleo clarificada através de uma coluna de ICO cm de comprimento e de 35 cm de diâmetro interior contendo 26 Kg (correspondente a um volume de leito de aproximadamente 65 litros) de gel de silica, tal como anteriormente descrito no Exemplo 1, parágrafo 3. Eaz-se a eluição de todos os CL utilizando 65-70 litros de éter do petróleo (eluato 1), ao mesmo tempo que se faz a dessorção dos lípidos adsorvidos, utilizando uma mistura de clorofórmio/metanol na proporção de 1:1 em volume (eluato 2). Concentra-se o eluato 1 no vazio até â dessecação e depois procede-se à dispersão em água desionisada e faz-se a liofilização conforme indicado no parágrafo 5 do Exemplo 1.. Cbtem-se deste modo 10,2 Kg de CL. 0 eluato 2 concentrado até a dssecação proporciona 5,1 Kg de Kl residuais.

2.3· benaração dos PL e dos C-L da Coalhada

Faz-se passar através de uma coluna de gel de ácido bórico uma amostra de 600 g de CL de coalhada obtidos no parágrafo 2.2 anterior e procede-se à separação dos PL e dos GL utilizando o procedimento indicado no parágrafo 7 do Exemplo 1. Após concentração até à dessecação e depois da liofilização conforme indicado no parágrafo 1.9 do Exemplo 1, obtem-se 365 g de PL de coalhada sob a forma de um pó inodoro esbranquiçado.

2.4. Purificação dos GL da Coalhada

Concentra-se a fracção que contem os C-L no vácuo afim de se eliminar completamente o tetra-hidrofu18

I ETii i Tng^fig·

rano conforme indicado no parágrafo 1.9 do Exemplo 1 e depois remove-se o resíduo com água desionisada. até ao volume de SCO ml. Em seguida faz-se a diálise da solução aquosa de GL utilizando água desionisada a 4°C durante 24 horas e uti lizando uma membrana de diálise que possui um limite de corte para pesos moleculares de 5500 daltons. Liofiliza-se então a solução de GL e obtem-se 160 g de um pó branco de GL purificados contendo menos do que 1% de lactose livre. Uma vez seco, o dislisato representa 75 g.

Exemplo 5

5.1. Isolamento dos CL da Medula de Bovino

Liofiliza-se 10 Xg de medula de bovino recentemente homogeneizada e dispersa-se por homogeneização a. quantidade de 1,6-1,7 Kg de matéria seca obtida, utilizando 50 litros de mistura solvente constituída por dicloro-metano/metanol na proporção de 2:1 em volume a uma temperatura compreendida entre 2o e 22°C. Faz-se a extracção dos TL de medula de bovino num reactor fechado idêntico ao Exemplo 1, parágrafo 1. Após a filtração e a eliminação da mistura solvente conforme indicado no Exemplo 1, parágrafo que se dissolvem novamente em 2,5 faz-se passar tudo através de uma coluna em vidro possuindo 4u cm de comprimento e 10 cm de diâmetro interior, carregada com 7g de gel de silica, conforme indicado no Exemplo 1.

Irocessa-se a eluição dos CL com 2 litros de hexano, ao mesmo tempo que se faz a dessorção dos EL da coluna utilizando 2 litros de uma mistura de clorofórmio/me tanol na proporção de 2:1 em volume. Faz-se a liofilização dos CL conforme indicado no Exemplo 1, parágrafo 5 obtendo-se 450 g de um pó branco higroscópico e inodoro.

2, obtem-se C,65 Kg de T litros de hexano e depoi

5.2. Separação e Isolamento dos GL e dos EL de Medula de

Bovino

Dissolve-se os 45o g dos CL de medula de

bovino nor clorofórmio/metanol na proporção de 4:1 em volume tal como no Exemplo 1, parágrafo 7. Faz-se a separaçao dos Cn nas suas fracções de 30 g de lípidos para cada 130 g de solvente e e Cl conforme referido em 1.7 a partir olvente e faz-se a regeneração da coluna de gel de ácido bórico apos cada ciclo utilizando 3 volumes de leito de mistura de clorofórmio /metanol na proporção de 2:1 em volume conforme referido em 1.8. A seguir concentra-se no vácuo as fracções eluidas e já submetidas a dessorção e prodece-se à liofilização conforme indicado em 1.9. Obtem-se deste modo 274 g de FL e 150 g de GL na forma de pós brancos inodoros.

Exemulo 4

4.1. Separação cor Solvente dos GL de Cérebro de Bovino

Faz-se a dispersão de 60 g ce GL de cérebro de bovino preparados conforme o Exemplo 1, parágrafo 9, numa mistura solvente composta por 3 2uC ml de cloroformio e por 1 600 ml de metanol numa ampola de decantar de parede dupla de 10 litros de capacidade dotada com um agitador cujo veio está monta.do na sua parte superior. 0 veio do agite dor está equipado com duas pás afcstadas uma da outra de 'todo que apenas a pá inferior fica imersa no solvente. Aumenta-se progressivamente a temperatura da solução dos C-L até 50°C e depois adiciona-se 1 2C0 ml de uma solução aquosa de KC1 a 88%, o que provoca a imersão da pá superior do agitador. Partindo de uma velocidade de agitação inicial de 3UO-6OO r.p.m., reduz-se posteriormente a velocidade do agitador para 5-10 r.p.m. e interrompe-se o aquecimento da ampola de decantar ao fim de 15 minutos. Formam-se duas fases que continuam a ser agitadas, cada uma delas através de uma das pás. Decorridas 8-12 horas observa-se uma separação completa dos gangliósidos relativamente aos outros GL no momento em que a fase aquosa superior contendo os gangliósidos e a fase inferior contendo os outros C-L se tornam claras. Deixa-se escorrer a fase inferior da ampola de decantar por

gravidade e recolhe-se separadamente a fase superior. Os outros GL da fase inferior são constituídos por mono-galactosil-ceramidas e por sulfatidos.

A seguir faz-se cado no Exemolo

4.2. Isolamento das Fases dos Gl·

Concentra-se a fase inferior cue contem todos os sulfatidos e os GL neutros (mono-galactosil-ceramidas; até à dessecação no vácuo a uma temperatura compreen dida entre 65 θ 75°C e depois procede-se à sua liofilização conforme indicado no Exemplo 1, parágrafo 9. 0 produto final é um pó branco imaculado constituido por 49 g de Gl puros (mono-galactosil-ceramidas e sulfatidos;. Concentra-se a fase superior no vácuo a uma temperatura compreendida entre 65 e 70°C até à eliminação completa dos solventes orgânicos reduzindo-se assim o volume inicial de aproximadamente 2 40C ml até cerca de 300-600 ml de uma solução clara.

a diálise da solução aquosa conforme indi2, parágrafo 4 e depois faz-se a liofilização da fase superior concentrada conforme indicado no Exemplo 1, parágrafo 9. U produto final é constituido por 5,1 g de um pó branco imaculado inodoro contendo os gangliósicios típicos do cérebro de bovino adiante indicados, utilizando-se para esse efeito as abreviaturas definidas por Svennerholm e Holmgren:

NeuAca2- 3 GalBl- 3 GalKAcBl- 4 (KeuAca2- 3?GalEl- C-lcCer (GDlaj, NeuAca2- 8 NeuAca2- 3 GalBl- 4C-lc- Cer (GD3) , NeuAca2- 3 GalBl- 3 Gal JMAcBl- 4(LeuAca2- 8 KeuAcaS- 3) GalBl- 4 Glc- Cer (GTlbj e GalBl- 3 Gal NAcBl4 (NeuAca2- 3) GalBl- 4 Glc- Cer (Gl-il).

Bxemulo 5

Separação dos GL da Coalhada

Faz-se a separação dos GL da coalhada isolados de acordo com o Exemplo 2, parágrafo 4, utilizando

o processo de extracção do Exemplo 4. Concentra-se a fase superior contendo os gangliosidos, no vazio e a temperatura óe ô5-7U°C, até à evaporação completa dos solventes orgânicos constituídos por clorofórmio e por metanol, reduzmclo-se o volume inicial de aproximadamente 2 400 ml para cerca de 3UO-6OO ml. Faz-se a dialise do concentrado aquoso â tem peratura de 4°C durante 24 horas, utilizando agua desionisada conforme indicado no Exemplo 2, parágrafo 4. 0 produto final é um pó branco imaculado de 4,8 g constituído essencialmente por gangliosidos típicos da coalhada tais como os Glu (representando cerca de 80%), os C-L^ (explicitados no Exem.plo 4.2) e

NeuAc a 2 - 3 GalB 1-4 CIc - Cer (C-hp segundo Svennerholm e Holmgrenj seu conteúdo em lactose liv or a 1%.

Concentra-se a fase inferior até à dessecação completa e depois faz-se a liofilização conforme indicado no Exemplo 4, parágrafo 2. Obtem-se 46 g de um pó bran co imaculado contendo apenas glicolípidos neutros tais como os di-hexosil- e tri-hexosil-ceramidas, isentos de lactose livre.

Exemolo 6

6.1. Separação dos CE da Placenta Humana

Procede-se â extracção da placenta humana utilizando uma mistura de solvente constituída por éter isopropílico/isopropanol na proporção de 3:2 em volume e de pois sonifica-se em hexano a uma temperatura compreendida entre 55 e 6u°C (400 W/100 g de placenta em 550 ml de hexanoj até que a solução, inicialmente turva, se torne clara. Carrega-se a coluna de vidro de 30 cm de comnrimento e de 5,5 cm de diâmetro interior, dotada de um filtro de vidro frito, com 1U0 g de partículas de gel de silica de dimensões compreendidas entre 0,21 e 0,062 ml (malha 70-230) previamente activadas durante 15 horas a uma temneratura comnreen—

dida entre 16C e 165°C, e depois faz-se a sua dispersão em hexano.

Em seguida, à temperatura de 5C°C, faz-se passar a amostra através da coluna e depois completa-se a eluição dos CL utilizando 400-500 ml de hexano (eluato 1).

Faz-se a dessorção dos LL (elusto 2) da coluna utilizando 500 ml de mistura solvente constituída nor clorcfórmio/metanol na proporção de 1:1 em volume. Após a concentração dos eluatos 1 e 2 até â dessecação no vácuo obtem-se 55,5 g dos CL e 44,7 g dos LL.

A fracção cue contem os CL possui a vanta gem de não incorporar os estrogeneos cue geralmente acompanham os CL quando se utilizam métodos de extracção e de separação clássicos através de misturas solventes.

Para se fazer a regeneração da coluna introduz-se 250 ml de metanol e depois 10CC ml de água desionisada através do adsorvente e a seguir activa-se termicamente conforme descrito anteriormente.

6.2. Isolamento dos PL e dos C-L de Placenta Humana

Carrega-se uma coluna de vidro de 50 cm de comprimento e de 5,5 cm de diâmetro interior com um filtro em vidro frito, com ICO g de gel de ácido bórico. C gel em suspensão na mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume é coberto por uma camada de areia de quartzo com a espessura de cerca de 1 cm. A seguir lava-se o adsorvente sucessivamente com 5 volumes de leito de metanol, 5 volumes de leito de água desionisada, 1 volume de leito de solução de HC1 0,5 L e depois com IC volumes de leito de água desionisada até se obter um vnl or de PH neutro e coloca-se o gel sob a forma lipofílica utilizando 5 volumes de leito de metanol e depois 5 volumes de leito de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume.

Faz-se passar através da coluna 15 g dos CL de placenta humana obtidos conforme indicado em 6.1 dissolvidos em 60 ml de mistura solvente constituída por clo25 -

rofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume. Apos a. concentração do eluato no vácuo até à dessecação obtem-se 14 g dos Pi (eluato lj. Eaz-se a dessorção dos GL (eluato 2) da coluna utilizando SuQ ml de mistura solvente constituida uor tetra-hidrofurano/água na proporção de 4:1 em volume. Após regeneração da coluna utilizando 6u0 ml de mistura constituida por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume, e após a passagem de uma segunda amostra de 15 £ dos CL de placenta humana, e após regeneração da coluna e finalmente depois da passagem de uma terceira amostra de 15 g dos CL de placenta humana, obtem-se as fracçães dos PL (eluato 1), procede-se à eliminação dos solventes até à dessecação completa e efectua-se a recolha de 4c-42 g dos PL de placenta humana. Após concentração até à dessecação dos eluatos 2 conbinados que contêm os cL coloca-se novamente o resíduo em suspensão em agua por sonificação à temperatura de 5u' C e depois, após liofilização, obter-se 5 g dos uL de olacenta humana.

EXemulo 7

Isolamento dos fito-glicolíoidos de soja

	Dissolve-se 25 g	âe	lecitina dê soja	na-
tural disponível	no comércio, em 75		de mistura solve:	nt e
constituida por	clorofórmio/m etanol	na	proporção de 4:1	em
volume e depois	faz-se passar atravé	s	de uma coluna de	áci-

do bórico conforme indicado no Exemplo 6, parágrafo 2. Obtem-se deste modo 22,7 g de uma mistura dos Ai e dos PL e 2,5 g de uma fracção cue contem os fito-glicolípidos e tamoém. os açucares livres. Apos diálise e concentração tal como no Exemplo 2, parágrafo 4, obtem-se 1 g (4/J de fito-glicolípidos de soja isentos de açucares livres.

Exemplo 8

Segaraçao_dos PL e dos fito—glicolípidos de Soja

A partir de 100 g de lecitina de soja natural disponível no comercio faz—se a separação de usa fracção de 40 g contendo os NL e de uma fracção de 60 g con

tendo os CI, conforme indicado no Exemplo 1, parágrafo 5.

Disaolve-se novamente s. fracção que contem os CI por sonmficação à temperatura de 4C°G em 200 ml de mistura solvente constituída por éter di-isopropílico/isopropanol na proporção de 5:2 em volume e depois, em cargas sucessivas de 15 g, faz-se passá-la através de uma coluna de gel de ácido bórico, disperso numa mistura solvente constituída por éter di-isopropílico/isopropanol, possuindo essa coluna 50 cm de comprimento e 5,5 cm de diâmetro interior. Procede-se à eluição das fraeções cue contêm os PL utilizando 2 volumes de leito de mistura solvente constitui da por éter di-isoprcpílico/isopropanol na proporção de 5:2 em volume e utilizando depois um volume de leite de isopropanol .

Faz-se a dessorção das fraeções que contêm os fito-glicolípidos da coluna utilizando 5 volumes de leito de mistura solvente constituída por tetra-hidrofurano/água na. proporção de 4 :1 em volume conforme indicado no Exemplo 6, parágrafo 2. Após cada ciclo proced.e-se à regeneração do adsorvente utilizando um volume de leito de isopropanol e depois 2 volumes de leito de mistura solvente constituída por éter di-isopropílico/isopropanol na proporção de 5:2 em volume.

Eaz-se a recolha separada das fraeções combinadas dos PE por um lado e dos fito-glicolípidos por outro, efectua-se a concentração até à dessecação no vácuo e obtem-se 40 g de PL e 20 g de fito-glicolípidos.

Eaz-se observar que os PI preparados deste modo têm a particularidade notável de estarem isentos de compostos naturalmente presentes nas lecitinas de soja e que podem provocar efeitos secundários indesejáveis.

Faz-se notar também que são comparáveis aos da lecitina da gema de ovo os quais são pobres em glicolípidos e em açucares livres o que os torna atractivos paraa preparação de emulsões parenterais bem toleradas pelo organismo humano.

Exemplo .1. Separação dos il e dos GE do Intestino do Porco da Ingia

Procede-se a lavagem e depois à homogeneização de 7,86 g de intestinos de porco ca india, sucessivamente em duas vezes 80 ml de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 1:2 em volume, efectua-se a centrifugação do homogenato a 2 5C0 g e concentrase o sobrenadante claro no vácuo até à dessecação.

Dissolve-se os 290 mg de lípidos brutos obtidos por sonificação em 10 ml de tetra-hidrofurano, centrifuga-se a solução a 25CO g e concentra-se até ã dessecação para proporcionar 250 mg de TL. Procede-se à eliminação dos 11 e bem assim os esteróis, ácidos gordos livres e trigiicéridos, dissolvendo os Tl por sonificação em 2 x 2,5 ml de hexaho e fazendo passar a solução através de uma coluna de vidro de 10 cm de comprimento e de 1 cm de diâmetro interior carregada com partículas de gel de silica activado cujas dimensões variam entre 0,21 e 0,062 ml (malha 70-250). Deste modo faz-se a eluição quantitativa de 190' mg de CL com 25 ml de hexano. Procede-se à dessorção de 57 mg de 11 da coluna utilizando 5 volumes de leito de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume. A seguir faz-se a separação dos Cl para proporcionar 145 mg de PI e 47mg de GL, conforme anteriormente indicado no Exemplo 1, parágrafo 7. Após a dialise utilizando água desionisada, e após posterior liofilização, obtem-se 16,6 mg de Gl puros sem açucares livres.

9.2. Separação dos PI do Intestino de Porco da índia nara

Iropocionar DPI e AP1 por permuta de iões

Prepara-se uma suspensão de 8,5 ml de gel de dietil-amino-etil-sefarose por débito rápido em etanol e carrega—se uma coluna de vidro de 10 cm de comurimento e de 1,15 cm de diâmetro interior. A seguir lava-se o gel com 50 ml de água desionisada e depois passa-se à forma de acetato

utilizando 20 ml de uma solução aquosa de acetato de sódio 21 e lava—se sucessivamente com 30 ml cie desionisada, com 10 ml de metanol e finalmente com 10 ml de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume. Cobre-se o gel com uma camada de 7-10 mm de areia de cmartzo. Faz—ce passar a amostra de 1^zí 3 mg de Pl de intestino de porco da índia através da coluna e depois faz-se a eluição dos PI não ácidos com porções sucessivas de 2x2 ml e a seguir com 10 ml de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume e finalmente com 5 ml de metanol. Após manten-se uma pressão ligeira de modo a acelerar a eluição. Após a eliminação dos solventes no vácuo, até à dessecação, obtem-se 107 mg de NPL.

Para se proceder â dessorção dos PL ácidos retidos na coluna, faz-se passar através desta 15 ml de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol/solução aquosa de acetato de sódio 0,8 H (30:60:8). Após a concentração da fracção ácida até à dessecação, nova dissolução desta por sonificação em 2 x 1 ml de mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol na proporção de 2:1 em volume, faz-se a eliminação dos sais sobre uma coluna de vi dro de 10 cm de comprimento e de 1,15 cm de diâmetro interior carregada com 4 ml de gel Sepluadex G-25 numa mistura solvente constituída por clorofórmio/metanol/água na proporção de 60: 3θ:4,5, em volume, mantendo-se a coluna sob uma pressão ligeira. Após a eliminação dos solventes no vácuo, até à dessecação, obtem-se 35 mg de API. Após cada cicio procede-se à regeneração da coluna permutadora de iões utilizando 1 volume de leito de metanol e depois 2 volumes de leiuO de mistura solvente constituída por clorofórmio/me tanol na proporção de 2:1 em volume.

k fracção de NPL contem tipicamente a fosfatidil-colina, a fosfatidil—etanol—amina e a esfingomie— lina.

A fracção de APL contem tipicamente o fosfatidil-inositol, a fosfatidil-serina, o ácido fosfatídi—

Â * .

co e a carãiolipina.

9.5. Separação dos Gl ão Intestino de Porco da índia para

Proporcionar NG1 a AGL

Para se fazer a separação das fracções NGL a AGP utiliza-se o método descrito no parágrafo 9.2 anterior. A partir dos 16,6 mg precedentes (parágrafo 9.1J obtem-se 11,9 mg de NGL e 4,5 mg de AGI.

Os NGL obtidos são tipicamente os ceramida-hexosidos e os glicoglicerolípidos.

us AGL são (obtidos; tipicamente os sulfa tidos, os hematósidos e os gangliósidos.

Exemplo 10

10.1. Variante de Extracção dos TL dc Cérebro de Bovino

Procede-se à homogeneização de 8 Kg de cérebro de bovino em po seco por pulverização à temperatura ambiente, em 45 Kg de hexano num moinho coloidal e depois continua-se a fazer a extracção à temperatura de 6u°C num reactor fechado equipado com agitadores de pás giratórias a 250 r.p.m. .

Decorridos 5u minutos de extracção deixa-se a suspensão em repouso durante 1-2 horas num recipiente separado. Recolhe-se 0 sobrenadante por decantação e extrai-se novamente os sólidos que se sedimentaram, utilizando 5u Kg suplementares de hexano.

neixa-se o segundo extracto em repouso durante 1-2 horas, recolhe-se 0 sobrenadante por decantação e combina-se com o sobrenadante precedente. Depois de ter repousado durante 24-48 horas à temperatura ambiente, os sobrenadantes combinados conduzem a uma fase líquida translúcida da qual de separa um resíduo sólido por decantação cuidadosa.

A seguir faz-se uma pre-concentração da fase líquida a uma temperatura compreendida entre 66 e 70°C até se obter aproximadamente 12-15% do.seu volume inicial

por evaporação no vácuo e depois diluiu-se o pre-concentra dc utilizando um volume igual de água destilada. Elimina-se o solvente por destilação a uma temperatura compreendida entre 68 e 70°C e depois faz-se a homogeneização da emulsão obtida e a seguir congela-se a uma temperatura de -40°C e procede-se à sua liofilização. ubtem-se deste modo 3,32 Kg de TL de cérebro de bovino sob a forma de um pó bege higros cópico e inodoro cuja composição á a seguinte:

Colesterol	25-27
CL dos quais	73-75
PL	5u-53
Gl dos quais	20-23
GL neutros e sullatidos	15-18
Gangliósidos	1

10.2. Variante de Separação dos Cl e dos 11 de Cérebro de bovino

Conforme anteriormente descrito em 1C.1 procede-se ao tratamento de 8 Kg de pó de cérebro de bovino até à pre-concentração da fase líquida. 0 concentrado em hexano contem 3,3 Kg de Tl. Prepara-se uma dispersão fina por sonificação e depois faz-se passar a dispersão através de uma coluna idêntica à descrita no Exemplo 1, parágrafo 3, carregada com 3,3 - 3,5 Kg de gel de silica. Faz-se depois a eluição dos Cl da coluna com 2U-25 litros de hexano e depois faz-se a pre-concentração do elua-to até se obter cerca de 12-15% do seu peso inicial por evaporação do hexano no vácuo. Após diluição cora o mesmo peso em água, trata-se a emulsão conforme anteriormente descrito em 10.1 o que proporciona 2,45 Kg de CL contendo:

PI

GL dos quais

70-73

25-28

GL neutros e s Gangliósidos

2-5

Para se fazer a dessorção dos KL da coluna utiliza-se 2 volumes de leito de mistura constituída por clorofórraio/metanol em proporções de 2:1 em volume e depois concentra-se o eluato até cerca de 5% do seu próprio peso inicial por evaporação no vácuo. Após diluição com 5 litros de hexano faz-se a concentração da solução de NI até a secura e obtem-se 0,88 Kg de um pó amarelo que contem mais de 95% de colesterol.

Sxemnlo 11

11.1 Variante de Separação dos CL da Coalhada

Faz-se a des caseinação e a deslactosação da coalhada doce por diafiltração e depois seca-se por pulveri zação pó de coalhada obtido possui a composi ção seguinte:

humidade (após 2 horas de :ufa a 1(1 sólidos totais, dos quais

Lípidos totais (método hojonnier) Proteínas (N x. 6, 5θ)

Lactose (determinada enzimaticamente) Cinzas

96,78

61,24

52,45

1,24

1,37

Procede-se à homogeneização de ICC g deste pó por duas vezes, de cada vez com 5c0 ml de uma mistura de hexano/metanol na proporção de 94:6 em volume, durante 1 minuto e à temperatura de 5U°C, num moinho coloidal. De cada vez faz-se a centrifugação do homogenato durante 2 minutos a 15^0 g.

Seguidamente concentra-se o sobrenadante até â secura no vácuo à temperatura de 65°C obtendo-se deste

modo 55,2 g de Ti» que se mantém fluidos devido a sua elevada percentagem em óleo de manteiga ( i 0—7>y-)·

Eaz-se o arrefecimento dos TL para 4O°C, procede-se à sua homogeneização com 1,5-2 vezes o seu volume em acetona (,90-130 ml) num moinho coloidal, espera-se que atinjam a temperatura ambiente (22-24°C) e depois faz-se a sua centrifugação durante 1 minuto a 2000 g. Elimma-se o sobrenadante líquido que contem a maior parte dos hi e os compostos odorizantes. O resíduo sólido recolhido contem os CL. Eaz-se nova dissolução em hexano e depois processa-se a concentração por evaporação no vácuo, ubtem-se deste modo 21,7 g de matéria insolúvel na acetona (AIK)

Com esta matéria prepara-se uma suspensão em três vezes o seu volume de hexano e depois procede-se à separação dos Ci (80,6%) dos KL (19,4%), por cromatografia líquida de adsorção utilizando um volume equivalente de gel de silica (10-11 g) .

Eaz-se a homogeneização dos CL de coalhada anteriores (.17,5 g) em 10 vezes o seu volume de água destilada e liofiliza-se a emulsão.

11.2. Segunda Variante de Senaração dos CL de Coalhada

Conforme referido em 11.1 faz-se o tratamento de 7,84 Kg de pó de coalhada, com a composição anteriormente indicada, utilizando 9u litros de mistura solvente constituida por hexano/metanol na proporção de 94:6 em volume, ao refluxo e sob agitação. Decorridos 15 minutos arrefece-se a suspensão obtida até á temperatura de 4U°C e depois faz-se passá-la através de um microfiltro após o que se lava o filtro com 10 litros de mistura de hexano/metanol na proporção de 94:6 em volume.

Á seguir concentra-se o filtrado até à secura a teperatura de 65°C por evaporação no vácuo e obtem· -se 4,57 Kg de TL arrefecendo-se depois para 4O°C, faz-se a homogeneização com 2 vezes o seu volume de acetona (10 litros; e deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente (22-24°C).

Após centrifugação durante 1-3 minutos a 1500 g, coloca-se à parte o sobrenadante límpido que contem a maior parte dos IN e dos compostos odorizanúes, remove-se a matéria insolúvel em acetona (AH) utilizando lu litros de hexano e depois concentra-se ate à secura por evaporação no vacuo. Ubtem-se deste modo 1,52 hg de Alk.

Remove-se a AIK utilizando 3-4 vezes 0 seu volume de hexano (6-7 litros) e depois faz-se a separação dos seus Cl (l,l6)Kg e dos seus 11 (0,36 hg) por cromatogradia de adsorção sobre gel de silica utilizando cerca de 1 Kg de adsorvente. fíecolhe-se 0 eluato que contem os Cl e procede-se à secagem total por evaporação sob uma corrente de azoto. Após homogeneização durante 5 minutos à temperatura de 4U°C com 9 vezes o seu volume em água destilada procede-se à secagem da emulsão por liofilização.

Claims

Processo para a separação de glicolípidos de uma mistura lipídica contendo lípidos complexos, caracte rizado por se fazer passar a mistura em solução num solvente apropriado através de um gel de ácido bórico de forma a adsorver selectivamente os glicolípidos, após 0 que se faz a extração dos glicolípidos do gel por meio de um solvente de eluição.

- 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura lipídica utilizada ser uma mistura de lípidos complexos obtida após separação dos lípidos neiuros sobre gel de silica e contendo glicolípidos e fos — folipidos isentos de estrogénos.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer passar glicolipidos sobre uma resina permutadora de iões de forma a separar os glicolipidos ácidos dos glicolipidos não ácidos.

- 4 δ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer passar os fosfolipidos sobre uma resina permutadora de iões de forma a separar os fosfolipidos ácidos dos fosfolipidos não ácidos.

_ ₅a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura lipidica utilizada ser proveniente da extracção por solvente de tecidos animais, nomeadamente cérebro, timo ou tutano de bovinos.

- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura lipidica utilizada ser proveniente da extracção, por solventes, de soro gordo da coalha da desprovido de lactose.

_ ya _

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se tratar o soro da coalhada com um solvente polar de forma a separar os lípidos neutros que passam em solução, e depois de se ter recuperado o resíduo e de se ter eliminado o solvente polar, faz-se o seu tratame to com um solvente fracamente polar, e depois de se ter el minado este solvente fracamente polar faz-se a separação da mistura lipidica contendo os lípidos complexos por cromatografia de adsorção sobre gel de sílica.

IH- It5

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por âe tratar primeiro o soro da coalhada com um solvente fracamente polar, e depois de se ter separado o resíduo, se recuperar a solução na cual se elimina o solvente de modo a obter-se um concentrado, se tratar seguidamente o concentrado com um solvente fracamente polar, se recolher a fracção insolúvel, se eliminar o solvente polar e se separar a mistura lípidica contendo os lípidos complexos por cromatografia de adsorção sobre gel de sílica.

_ q a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma mistura lípidica proveniente da extracção, por solvente, de placente humana ou animal .

- 105 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma mistura lípidica proveniente da extracção, por solvente, de intestinos de animais

- 11^ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma mistura lípidica constituída por lecitina natural de soja.

- 12ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se separar os gangliósidos dos outros glicolípidos por extracção, por solvente, dos glicolípidos em presença de água, encontrando-se os gangliósidos na fase aquosa.

- 13- Processo para a preparação ce uma composi ção farmacêutica, dietética ou cosmética, caracterizado por se incorporar com o ingrediente activo diversos lípidos quando obtidos de acordo com as reivindicações anteriores.