DE69100588T2

DE69100588T2 - Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Monosialogangliosid durch Komplexierung mit Alpha-Cyclodextrin und Zwischenprodukte.

Info

Publication number: DE69100588T2
Application number: DE91111469T
Authority: DE
Inventors: Benito Casu; Armando Cedro; Ennio Lanzarotti; Annamaria Naggi; Giangiacomo Torri
Original assignee: Crinos Industria Farmacobiologica SpA
Current assignee: Crinos Industria Farmacobiologica SpA
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2011-07-11
Also published as: EP0469352B1; EP0469352A1; DK0469352T3; IT9020942A1; IT1243340B; IT9020942A0; ATE96804T1; PT98270A; ES2060257T3; US5108613A; DE69100588D1; JPH04230398A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um Monosialogangliosid oder, gemäß der von L. Svennerholm, J. Neurochem. Bd. 10 (1963), S. 613 eingeführten Nomenklatur, GM1 aus einem Gemisch von Lipiden, die zuvor aus Geweben oder Organen des Nervensystems extrahiert wurden, zu erhalten, wobei das Lipidgemisch dadurch charakterisiert ist, daß es GM1 entweder als einziges Gangliosid enthält oder das GM1 andernfalls in einer vorherrschenden Menge im Vergleich zu anderen Glycosphingolipiden der Familie (GD, GT, GQ und dergl.) vorhanden ist.
Diesee Zustand kann auf mehreren bekannten Wegen erreicht werden, z.B. durch chemische oder enzymatische Behandlung des vorstehend genannten Lipidgemisches oder auch des Ausgangsorganhomogenisats, aus dem das Gemisch stammt.
Seit vielen Jahren haben Ganglioside sowohl als Einzelsubstanzen als auch in Form der entsprechenden Gemische eine Reihe wichtiger therapeutischer Anwendungen gefunden, und in den letzten Jahren hat sich das Interesse insbesondere auf Monosialogangliosid konzentriert. Die vorstehend genannten Behandlungen können mit am Rohextrakt gemäß den folgenden alternativen Methoden durchgeführt werden.
- Enzymolyse mit Sialidase. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Behandlung gut mit dem Ausgangstierorganhomogenisat durchführbar ist, wobei man sich die Tatsache zunutze macht, daß das Enzym bereits im Homogenisat selbst vorhanden ist und daher nicht zugegeben werden braucht. Ferner kann im letztgenannten Fall der an GM1 angereicherte rohe Lipidextrakt anschließend gemäß bekannten Methoden gewonnen werden.
- Hydrolyse mittels verdünnter Mineralsäuren.
Geeignete Beispiele jedes der vorstehend genannten Verfahren werden in der europäischen Patentanmeldung Nr. 88120281.6 (EP-A-319 890) bzw. in der franzosischen Patentanmeldung Nr. 258 707 vorgelegt.
Im Hinblick auf die Ganglioside ist darauf hinzuweisen, daß in den entsprechenden wäßrigen Lösungen diese Verbindungen in Form von Mizellaggregaten mit einem Molekulargewicht von mehreren 100 Kilodalton vorliegen (D.B. Gammack, Biochem., J., Bd. 88 (1963), S. 373). Dieses Phänomen hat bisher die Anwendung von Techniken, wie der Ultrafiltration und/oder der Dialyse zur Trennung der Ganglioside von den anderen Substanzen im Rohextrakt, der zuvor aus den Organen oder Geweben des Nervensystems erhalten wurde, verhindert, da derartige Aggregate es einzelnen Molekülen offensichtlich nicht ermöglichen, durch die Membranporen zu treten.
Daher bedienen sich Methoden, die heutzutage zur Isolierung von Gangliosiden und insbesondere von GM1 aus rohen Lipidgemischen angewandt werden, anderer Techniken, wie der Fraktionierung durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Gemisches von Wasser mit zwei oder mehr organischen Lösungsmitteln als Elutionsmittel.
Diese Fraktionierungsmethoden sind aus mehreren Gründen nicht wünschenswert. Der hauptsächliche Nachteil besteht im speziellen Fall der GM1-Isolierung in der zur Erzielung der chromatographischen Trennung erforderlichen Zeit. Daneben ist festgestellt worden, daß die Menge an GM1, die tatsächlich gewonnen wird, von Charge zu Charge im Vergleich zur erwarteten Menge stark variieren kann.
Tatsächlich ist eine starke Abhängigkeit vom Wirkungsgrad der Säule festgestellt worden, der von zwei Faktoren beeinflußt wird, nämlich der Regenerierung der Harzfüllung, die nach jeder chromatographischen Trennung durchgeführt werden muß und von der anschließenden erneuten Lösungsmitteläquilibrierung.
Ein weiterer wichtiger Nachteil dieser Methoden besteht in den hohen Kosten, die aufgrund der Tatsache entstehen, daß, wie erwähnt, große Mengen an Gemischen mehrerer organischer Lösungsmittel erforderlich sind, um die Säule zu eluieren.
Ferner muß am Ende der Trennung der obere Teil der Harzfüllung vollständig entfernt werden, und es muß für einen Ersatz durch ein gleiches Volumen an frischem Harz gesorgt werden, da das Harz irreversibel durch Verunreinigungen des fraktionierten Lipidgemisches, die im Harz verbleiben, verändert wird.
Weitere Einzelheiten dieses Verfahrens werden in Beispiel 6 angegeben, wo ein Verfahren zur Gewinnung von GM1 aus dem Lipidextrakt durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie beschrieben wird, wobei dieses Verfahren einen direkten Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht. Die hauptsächliche Aufgabe der Erfindung besteht also darin, ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Monosialogangliosids aus einem Ausgangslipidgemisch bereitzustellen, das die Substanz entweder als einziges Gangliosid, oder in einer vorherrschenden Menge im Vergleich mit einziges Gangliosid, oder in einer vorherrschenden Menge im Vergleich mit anderen assoziierten Gangliosiden der gleichen Familie enthält, wobei das Verfahren keinerlei Ionenaustauschchromatographiestufe umfaßt und auf diese Weise zu einer bemerkenswerten Vereinfachung der bisher angewandten Verfahren führt.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das Monosialogangliosid durch Ultrafiltration einer wäßrigen Lösung erhalten wird, die als gelöste Stoffe das vorstehend genannte rohe Lipidgemisch, das aus der Ex traktion von Geweben oder Organen des Nervensystems stammt und α-Cyclodextrin in einem festgelegten Gewichtsverhältnis enthält.
α-Cyclodextrine sind als cyclische Oligosaccharide, die aus 6-Glycopyranosid-Struktureinheiten bestehen, bekannt.
Erfindungsgemäß ist festgestellt worden, daß durch Zugabe zu einer Lösung, die das Lipidgemisch mit den vorstehend genannten Merkmalen enthält, einer Menge an α-Cyclodextrin in einem festgelegten Gewichtsverhältnis, bezogen auf den zuerst genannten gelösten Stoff, die Mizellaggregate aufgebrochen werden und unter den bei der Ultrafiltration angewandten Bedingungen ein löslicher Komplex mit dem α-Cyclodexrin gebildet wird.
Als Folge davon kann das Monosialogangliosid dann durch die Membranporen treten, wobei die Membran vorteilhafterweise so gewahlt wird, daß die anderen Lipide unter den gleichen Bedingungen nicht dialysieren können.
Es ist interessant, darauf hinzuweisen, daß das Verfahren nur mit αCyclodextrin durchgeführt werden kann, während ß-Cyclodextrin, das ein cyclisches Oligosaccharid ist, das aus sieben Glycopyranose-Einheiten besteht, zu keinem vergleichbaren Ergebnis führt, wie in Beispiel 10 gezeigt wird.
Ausführlicher gesagt, besteht das erfindungsgemäße Verfahren, um GM1 zu erhalten, aus folgenden Stufen:
- Ultrafiltration einer Lösung, in der das Lipidgemisch mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 3,5 % (Gew./Vol.) gelöst worden ist, wobei die Ultrafiltration durch eine Dialysemembran mit einer Porengröße von 50 000 Dalton oder höher und vorzugsweise von 100 000 Dalton durchgeführt wird, wobei α-Cyclodextrin in der Lösung in einem Gewicht vorliegt, das mindestens dem zweifachen Gewicht des Extraktes entspricht.
- Einengen des Dialysats (Permeats) durch Ultrafiltration durch eine Dialysemembran mit einer Porengröße von 1000 Dalton.
- Gewinnung des gelösten Stoffs, der den Komplex von GM1 mit α-Cyclodextrin enthält.
- Gewinnung von GM1 aus dem vorstehend genannten Komplex.
Es ist darauf hinzuweisen, daß das vorstehend angegebene Verhältnis von α-Cyclodextrin zu Gangliosid so gewählt ist, daß eine vollständige Komplexierung von GM1 unabhängig vom Gehalt des Lipidgemisches an GM1 erzielt wird.
Die Ultrafiltration wird durchgeführt, indem ein konstantes Volumen an Lösung innerhalb der Dialysekammer (d.h. Retentat) gehalten wird, vorzugsweise unter Zugabe einer 2 %-igen (Gew./Vol.) Lösung von α-Cyclodextrin.
Tatsächlich ist festgestellt worden, daß reines Wasser anstelle der vorstehend genannten Lösung verwendet werden kann. In diesem Fall ist die am Ende gewonnene Menge an GM1 zwar geringer als die Menge, die unter Verwendung der vorstehend genannten Ultrafiltrationstechnik erhalten wird, sie ist jedoch immer noch größer als die bei säulenchromatographischen Methoden nach dem Stand der Technik erhaltene Menge.
Das Endvolumen der dialysierten Lösung (d.h. das Permeat) sollte mindestens dem zweifachen Volumen des Retentats entsprechen. Vorzugsweise entspricht das Permeatvolumen dem fünffachen Volumen des Retentats.
Am Ende der Ultrafiltration wird das Permeat vorteilhafterweise durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße von 1000 Dalton eingeengt, bis das Endvolumen der Lösung etwa 1/10 des Volumens des Ausgangspermeats entspricht.
Das eingeengte Permeat wird dann vorzugsweise lyophilisiert, aber der gelöste Stoff kann auch durch Ausfällen mit Aceton gewonnen werden.
Es ist auch festgestellt worden, daß der gelöste Stoff aus der entsprechenden wäßrigen Lösung ausgefällt werden kann, indem das eingeengte Permeat bei 4ºC gehalten wird, wobei die Konzentration an GM1 (Gew./Vol.) mindestens 0,1 % (Gew./Vol.) betragen sollte. In jedem Fall ist jedoch die Ausbeute an GM1 auf diesem Wege geringer als die Ausbeute, die bei dem vorstehend genannten Verfahren erzielt wird.
GM1 kann anschließend aus dem Komplex durch Extraktion mit Methanol oder mit einem entsprechenden Gemisch mit einem anderen organischen Lösungsmittel gewonnen werden.
Ein geeignetes Beispiel für das letztgenannte Gemisch ist eine Lösung von Chloroform/Methanol in einem Verhältnis von 2:1 (Vol./Vol.).
Das Verhältnis des Volumens an organischem Lösungsmittel, d.h. an Methanol oder dem entsprechenden Gemisch mit einem anderen organischen Lösungsmittel zum Gewicht des Feststoffs muß bei jeder Extraktion mindestens 5 (Vol./Gew.) betragen.
Die Extraktionsstufe mit den Lösungsmitteln sollte mindestens dreimal und vorteilhafterweise mindestens fünfmal wiederholt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, daß es auch möglich ist, die beiden vorstehend genannten Dekomplexierungsmethoden zu kombinieren, d.h. den aus dem Dialysat stammenden Feststoff zuerst mit Methanol zu extrahieren und dann nach Einengen der Lösung bis zur Trockene den Rückstand mit Chloroform:Methanol (2:1) zu extrahieren.
Weiter ist darauf hinzuweisen, daß bei den vorstehend beschriebenen Methoden zur Gewinnung von GM1 aus dem Komplex mit α-Cyclodextrin ein unlöslicher Rückstand verbleibt, der aus reinem Komplexierungsmittel besteht, das gewonnen und in einem anderen Betriebszyklus eingesetzt werden kann.
Was die zweite Aufgabe der Erfindung, d.h. den Komplex zwischen GM1 und α-Cyclodextrin, betrifft, so ist Fig. 1 ein Beleg für die Bildung des Produkts in Lösung.
Fig. 1 betrifft ¹H-NMR-Spektren (300 Mhz) in D&sub2;O-Lösungen mit einer Konzentration an GM1 von 1 mg/ml. Zu dieser Lösung werden dann steigende Mengen an α-Cyclodextrin gegeben. Die entsprechenden molaren Verhältnisse von α-Cyclodextrin zu GM1 sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Interpretation der Spektren gemäß der Erkenntnisse auf diesem Gebiet (vgl. z.B. die Arbeit von T.A.W. Koerner et al., "High resolution proton NMR studies of gangliosides. I. Use of homonuclear two dimensional spin-echo J-correlated spectroscopy for determination of residue composition in anomeric configurations", Biochemistry, Bd. 22 (1983), S. 2676- 2687) hat zu folgenden Ergebnissen geführt: Signale bei 0,82 ppm werden den endständigen aliphatischen Methylgruppen des Ceramidanteils zugeordnet, Signale bei etwa 1,23 ppm werden Methylenprotonen des Ceramidanteils zugeordnet, Signale bei etwa 1,85 ppm werden Acetamidomethylprotonen (N- Acetylgruppen von Glucosamin und Sialsäure) zugeordnet und Signale bei 1,9-2,1 ppm werden Allyl- und α-Carbonylmethylenprotonen des Ceramidanteils zugeordnet.
Von besonderem Interesse zum Nachweis der Komplexbildung sind die Signale bei 0,82 ppm (endständige Methylgruppen des Ceramidanteils) und bei 1,85 ppm (Acetamidomethylprotonen), da, wie durch ein raumfüllendes Modell gezeigt wird, die betreffenden, in Klammern angegebenen Gruppen aus dem Molekül herausragen und diese Signale daher im Prinzip recht empfindlich gegenüber Anderungen der sterischen Umgebung des Moleküls sind.
Es ist aus Fig. 1 ersichtlich, daß die beiden vorstehend genannten Signale in Gegenwart steigender Mengen an α-Cyclodextrin eine höhere Auflösung zeigen und schärfer sind, was bedeutet, daß die sterische Umgebung sich zunehmend im Vergleich zu der zuvor vorhandenen sterischen Umgebung in den Mizellaggregaten von GM1 ändert.
Einen weiteren Beleg für die Komplexbildung erhält man durch direkten Vergleich der entsprechenden Festkörperspektren der Substanz mit denen des Ausgangsmonosialogangliosids, wobei diese Spektren durch CP- MAS-¹³CNMR-Spektroskopie (Kohlenstoff-13-NMR-Spektroskopie mit Kreuzpolarisation und Rotation um den magischen Winkel) erhalten wurden und in Fig. 2 gezeigt sind.
Vor einer Erläuterung der Bedeutung der Spektren ist darauf hinzuweisen, daß diese Technik zur Strukturaufklärung von Komplexen mit Cyclodextrinen allgemein angewandt wird (Y. Inoue et al., Carbohyd. Res., Bd. 159 (1987), S. 1)
Die Figuren 2A und 2B zeigen also, wie die Spektren (die Werte an der Abszisse sind in ppm angegeben) des Komplexes bzw. von GM1 variieren, wenn aufeinanderfolgende magnetische Pulse zu festgelegten Zeitpunkten, die in Mikrosekunden (us) angegeben und vom Beginn des Experiments an gezählt werden, auf die Probe angewandt werden. Tabelle 1 Mengen (bezogen auf das Gewicht) und entstprechende molare Verhältnisse von α-Cyclodextrin zu GM1 für die NMR-Spektren mit den Nr. (GM1), 2, 4, 7 und 10 von Fig. 1 NMR-Spektrum Nr. α-Cyclodextrin (mg) α-Cyclodextrin/GM1 (molares Verhältnis)
Mittleres Molekulargewicht von GM1 (Natriumsalz) : 1570,74 Molekulargewicht von α-Cyclodextrin: 972 (J. Szeitli "Cyclodextrin Technology" Kluwer Academic Press Publishers 1988, insbesondere Seite 12).
Auf diese Weise wird die Relaxation des Magnetfeldes der Probe mehr und mehr verhindert, so daß am Ende die Signale vollständig aus dem Spektrum verschwinden. Es wird also beobachtet, daß die Zeit, die erforderlich ist, um diese Situation zu erreichen, bei reinem GM1 etwa 90 us beträgt, während sie bei dern entsprechenden Komplex mit α-Cyclodextrin nur etwa 50 us beträgt. Das bedeutet, daß im Komplex die Beweglichkeit von GM1 (vgl. z.B. das entsprechende Signal bei etwa 30 ppm, das auf an aliphatische Kohlenstoffatome von GM1 gebundene Protonen zurückzuführen ist) im Vergleich zu der Beweglichkeit der reinen Substanz stark eingeschränkt ist.
Diese Technik ergibt also einen weiteren unabhängigen Beleg für die Komplexbildung.
Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß die Bildung des Komplexes auch durch die Tatsache gezeigt wird, daß die Substanz aus der entsprechenden wäßrigen Lösung ausfällt, in der zuvor α-Cyclodextrin und GM1 gelöst worden sind, wobei letzteres in einer Konzentration von mindestens 0,1 % vorliegt, falls die im nachstehenden Beispiel 3 angegebenen Bedingungen erfüllt werden.
Die Stöchiometrie des Komplexes ist durch Analyse der in den folgenden Beispielen 3 und 7 bis 9 erhaltenen Proben mittels ¹HNMR-Spektroskopie aufgeklärt worden. Insbesondere wurden die Flächen des Signals bei 5,359 ppm, das dem anomeren Proton des Cyclodextrins entspricht, und des Signals bei 1,409 ppm, das den Protonen der endständigen Methylgruppen des Ceramidanteils von GM1 entspricht, berücksichtigt.
Jede der entsprechenden Flächen wurde berechnet, und das Verhältnis wurde gebildet. Auf diese Weise wurde festgestellt, daß das molare Verhältnis von α-Cyclodextrin zu GM1 im Komplex von 4,0 bis 6,0 variiert.
In den nachstehend vorgelegten Beispielen werden alle analytischen Daten in Bezug zum Trockengewicht angegeben,

Beispiel 1

Isolierung von Monosialogangliosid aus einem Lipidextrakt mit einem Gehalt an GM1 von 57 % (Gew./Gew.).

880 mg Lipidextrakt, der zuvor behandelt worden war, um alle vorherigen Ganglioside in GM1 umzuwandeln, so daß am Ende die Menge dieser Substanz auf 500 mg (bestimmt durch den entsprechenden Gehalt an Sialsäure gemäß der Methode von L-. Svennerholm, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 24 (1957), S. 604, wobei dann als Gehalt dieses Zuckers in GM1 ein Prozentsatz von 20 % gemäß R. Kuhn et al., Chem. Ber., Bd. 86 (1963), s. 866 angenommen wurde) erhöht worden war, wurden in 80 ml destilliertem Wasser gelöst.
Es wurde eine 10 %-ige (Gew./Vol.) Lösung von α-Cyclodextrin in Wasser hergestellt.
20 ml der Lösung, was bezogen auf das Gewicht, der zweifachen Menge Cyclodextrin im Verhältnis zur Menge des Extrakts entsprach, wurden zu der erstgenannten Lösung gegeben, wodurch ein Endvolumen von 100 ml erreicht wurde.
50 ml wurden dann in eine Ultrafiltrationsvorrichtung übergeführt, die mit einer Dialysemembran mit einem Grenzmolekulargewicht von 100 000 Dalton (Scheibenmembran YM - 100 AMICON ) ausgestattet war.
Die Dialyse wurde dann durchgeführt, indem das Retentatvolumen unter Zugabe einer 2 %-igen (Gew./Vol.) Lösung von α-Cyclodextrin konstant gehalten wurde.
Bei jedem Dialysezyklus wurden 50 ml Permeat gesammelt. Die entsprechende Gesamtzahl der Zyklen betrug 5.
Die Lösungen des Permeats wurden gesammelt und auf ein Endvolumen von 20 ml durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einem Grenzmolekulargewicht von 1000 Dalton (Scheibenmembran YM1 AMICON ) eingeengt.
Durch Lyophylisieren wurden 1050 mg eines Feststoffes mit einem Gehalt an 153 mg GM1 (bestimmt durch den Sialsäureassay unter Berücksichtigung des prozentualen Anteils Sialsäure im Molekül gemäß der vorstehend angegebenen Arbeit von R. Kuhn et al.) gewonnen.
GM1 wurde anschließend durch 5-malige Extraktion des Feststoffs der vorhergehenden Stufe mit jeweils 10 ml einer Lösung von Chloroform/Methanol im Verhältnis von 2:1 (Vol./Vol.) isoliert.
Die organische Lösung wurde dann unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt wobei man 138 mg GM1 (55 % der theoretischen Menge) erhielt, wobei gemäß der in Beispiel 5 angegebenen TLC-Methode festgestellt wurde, daß die Reinheit mehr als 95 % betrug. Der Gehalt an GM1 nach dem Sialsäure-Assay betrug 97 %.

Beispiel 2

Ultrafiltration einer Lösung, die sowohl den Lipidextrakt als auch α-Cyclodextrin enthält, wobei das Retentat durch Zugabe von Wasser auf einem konstanten Volumen gehalten wird.

Eine Probe von 50 ml der in Beispiel 1 hergestellten 100 ml Lösung mit den vorstehend angegebenen Bestandteilen, wurde, wie vorstehend beschrieben, ultrafiltriert, wobei das Retentat durch Zugabe von Wasser bei einem konstanten Volumen gehalten wurde. Nach Einengen auf 1/10 (25 ml) des Ausgangsvolumens wurde das Permeat zur Fällung mit 10 Volumenteilen Aceton versetzt, und man erhielt einen Festkörper mit einem Gewicht von 1070 mg und einem Gehalt an GM1 von 128 mg. Der Feststoff wurde mit Methanol extrahiert, das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck bis zur Trockene abgezogen, und zwar gemäß dem in der gleichen Stufe von Beispiel 1 angegebenen Verfahren. Am Ende wurden 113 mg GM1 (45 % der theoretischen Menge) gewonnen, und zwar mit einem gemäß dem Sialsäureassay bestimmten Gehalt von 96 % und einer Reinheit (TLC) aus Beispiel 5 von mehr als 95 %.

Beispiel 3

Fällung des Komplexes vom GM1 mit α-Cyclodextrin aus dem eingeengten Permeat.

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Lipidgemisch in einer Menge von 1,5 g (GM1-Gehalt: 0,645 g, d.h. 43 % (Gew./Gew.) in 15 ml destilliertem Wasser gelöst wurde. Dazu wurden 30 ml einer 10%-igen (Gew./Vol.) Lösung von α-Cyclodextrin gegeben.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde dann wiederholt, bis die eingeengte Permeatlösung erhalten wurde.
Die eingeengte Permeatlösung (20 ml) wurde 1 Tag bei 4ºC belassen, und der gebildete Niederschlag wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 15 000 U/min gesammelt und 1 Tag bei 45ºC und einem Druck von 0,03 mm Hg getrocknet.
Der schließlich gewonnene Feststoff wies ein Gewicht von 91 mg und einen GM1-Gehalt von 25,9 mg auf der Grundlage des Sialsäuregehalts der Verbindung auf. Eine ¹H-NMR-spektroskopische Untersuchung, die wie vorstehend beschrieben, durchgeführt wurde, ergab ein molares Verhältnis von α-Cyclodextrin zu GM1 von 4,0.
Der Feststoff unterlag einer Dekomplexierung bei 5-maliger Extraktion mit jeweils 2 ml Methanol und anschließendem Einengen zur Trockene. Der Rückstand wurde anschließend 5 mal mit 2 ml Chloroform:Methanol (2:1) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zur Trockene eingeengt. Es wurden 20 mg GM1 mit einem Gehalt an 98 % auf der Grundlage des Sialsäuregehalts und einer Reinheit (Beispiel 5) von mehr als 95 % gewonnen.

Beispiel 4

Isolierung von GM1 aus einem Lipidgemisch mit einem GM1-Gehalt von 48 %.

1,250 g Lipidgemisch mit dem vorstehend angegebenen GM1-Gehalt wurden in 35 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden dann 25 ml einer 10 %-igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von α-Cyclodextrin gegeben.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde dann wiederholt. Das schließlich isolierte GM1 wies ein Gewicht von 318 mg (53 % der theoretischen Menge) auf.
Der Gehalt gemäß dem Sialsäureassay betrug 97,5 %, die Reinheit gemäß der TLC-Untersuchung betrug mehr als 95 %.

Beispiel 5

Assay auf die Reinheit von erfindungsgemäß erhaltenen Zubereitungen.

Die Reinheit wurde durch dünnschichtchromatographische Methoden bestimmt und zwar durch direkten visuellen Vergleich der Intensitäten der Flecken von Verunreinigungen von GM1 mit denen entsprechender Standards.
Die Empfindlichkeit des dünnschichtchromatographischen Assays wurde zuvor überprüft, wie nachstehend beschrieben wird.
Bei den eingesetzten Platten handelte es sich um HPTLC-Platten (Silicagel), und beim Elutionsmittel handelte es sich um ein Gemisch von Chloroform:Methanol:0,3 % CaCl&sub2; in Wasser im Verhältnis von 60:35:8.
Für jede untersuchte Substanz wurde gleichzeitig eine Dünnschichtchromatographie auf zwei Platten durchgeführt, um eine simultane Untersuchung der Flecken mit jedem der nachstehend angegebenen Reagenzien zu ermöglichen.
Nach Entwicklung der Platten in einer gesättigten Kammer und anschließendem Trocknen in einem Trockenschrank wurden die Platten mit einer der nachstehenden Lösungen besprüht:
- A. Ehrlich-Reagenz.
- B. Anisaldehydlösung. Das Reagenz wurde durch Auflösen von 1 ml Anisaldehyd in Eisessig, der dann auf ein Volumen von 100 ml aufgefüllt wurde, erhalten. Die Lösung wurde dann zu 2 ml 86 %-iger (Gew./Vol.) Schwefelsäure gegeben.
Nach dem Besprühen wurden die Platten 10 Minuten in einem Trockenschrank bei 100ºC getrocknet.
In einer ersten Versuchsreihe wurden auf die Platten die nachstehend angegebenen abnehmenden Mengen des in Beispiel 1 beschriebenen Lipidgemisches (GM1-Gehalt: 57 Gew.-%) aufgetragen: 150, 50, 30 und 12,5 ug.
Die Platte wurde mit Reagenz A besprüht. Auf diese Weise wurden 11 Flecken sichtbar gemacht, wobei der größte GM1 entsprach. 9 Flecken mit fast der gleichen Farbintensität wiesen größere RF-Werte als GM1 auf.
Diese Flecken entsprachen, wie durch direkten Vergleich mit geeigneten Standards ermittelt wurde, Phospholipiden und anderen Verunreinigungen, die in dem Lipidextrakt enthalten waren.
Es wurde deutlich ein Fleck mit einer sehr schwachen Farbintensität und mit einem geringeren Rf-Wert als GM1 wahrgenommen, der als Disialogangliosid identifiziert wurde.
Durch Verringerung der Menge an Lipidextrakt auf der Platte auf 12,5 ug wurden die meisten zuvor sichtbaren Flecken kaum unterscheidbar. Berücksichtigt man, daß bei einer Menge von 30 ug Lipidextrakt die Flecken auf dem Dühnschichtchromatogramm nachgewiesen werden konnten und daß die Gesamtmenge der Substanzen außer GM1 43 Gew.-% des Ausgangsgemisches, d.h. 13 ug, ausmachten, so kann geschlossen werden, daß die Nachweisgrenze der Verbindungen durch Dünhschichtchromatographie etwa 1 ug betrug.
Um das Vorhandensein von restlichem α-Cyclodextrin in GM1 zu untersuchen, wurden abnehmende Mengen des Komplexierungsmittels im Bereich zwischen 10 bis 0,5 ug auf eine zweite Platte aufgetragen. Nach Entwicklung der Platten wurden die Flecken mit Reagenz B sichtbar gemacht.
Das α-Cyclodextrin erschien als dunkelroter Fleck am Ausgangspunkt. Unter den gewählten Bedingungen war die Intensität des entsprechenden Flecks selbst bis zur niedrigsten auf die Platte aufgetragenen Menge, d.h. 0,5 ug, nachweisbar.
Die dünnschichtchromatographische Untersuchung von GM1-Proben, die gemäß der Beispiele 1 bis 4 erhalten worden waren, wurde durch Auftragen von 200 ug isoliertes GM1, 30 ug Ausgangslipidgemisch und 0,5 ug Cyclodextrin in dieser Reihenfolge auf einer Platte durchgeführt.
Das gleiche Verfahren wurde dann auf einer zweiten Platte wiederholt.
Bei den Versuchen, die mit Zubereitungen, die nach der vorstehend angegebenen Methode erhalten wurden, durchgeführt wurden, waren auf der Platte nach Besprühen mit Reagenz A keine anderen Flecken als der von GM1 sichtbar.
Auf der mit Reagenz 33 besprühten Platte war gelegentlich am Ursprung der Cyclodextrinfleck sichtbar, wobei die Intensität jedoch in jedem Fall wesentlich geringer war als die des Standards (0,5 ug).

Beispiel 6

Verfahren zur Trennung von GM1 aus einem rohen Lipidgemisch durch Ionenaustauschchromatographie (M. Iwamori et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 528 (1978) S. 257)

600 g Sephadex A-25-Harz wurden mit einer Puf ferlösung bei einem pH-Wert von 7 äquilibriert. Der Puffer wurde wiederholt ausgetauscht, bis das Harz eine neutrale Reaktion auf Lackmuspapier zeigte. Das Harz wurde dann gesammelt und anschließend mit dem Elutionsmittel, das aus einem Gemisch von Chloroform:Methanol:Wasser (30:60:8) bestand, äquilibriert.
Das zur Durchführung dieser Stufe erforderliche Volumen betrug 9 Liter.
Das Harz wurde dann in eine Säule gefüllt und mit dem Lösungsmittel eluiert, bis die Füllhöhe konstant blieb.
Auf das Harz wurden anschließend eine Aufschlämmung mit einem Gehalt an 180 g rohem Lipidextrakt (Gehalt an GM1 50 %), der in 5 Liter Chloroform:Methanol (1:1) gelöst war, und 500 ml des Harzes selbst, das im Elutionsmittel suspendiert war, gegeben.
Die Durchflußgeschwindigkeit wurde auf 800 ml/Stunde eingestellt. Es wurden zwei Fraktionen mit einem Volumen von 5 Liter bzw. 20 Liter aufgefangen. Die Säule wurde anschließend mit Chloroform:Methanol:0,1 m Natriumacetatlösung (30:60:8) eluiert.
40 Liter des Eluats wurden aufgefangen und dann unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt, wobei dafür Sorge getragen wurde, daß eine übermäßige Schaumbildung verhindert wurde. Anschließend wurde eine Ultrafiltration durchgeführt, um restliche Salze zu entfernen und dann wurde erneut auf ein Endvolumen von 300 ml eingeengt. GM1 wurde durch Zugabe von Aceton zu der wäßrigen Lösung gewonnen. Schließlich wurden 45 g GM1 mit einem Gehalt an 90 % (bestimmt durch den Sialsäureassay) gewonnen, was 50 % der Menge der Substanz, die in dem rohen Ausgangslipidextrakt enthalten war, entsprach.
Bevor ein neuer Trennzyklus gestartet wurde, war es erforderlich, den oberen Teil der Harzfüllung, der verunreinigt und mit zurückbleibenden Verunreinigungen aus dem Lipidextrakt verstopft zu sein schien, zu entfernen und durch ein gleiches Volumen an frischem Harz zu ersetzen.
Auf diese Weise war es möglich, innerhalb gewisser Grenzen die Trennwirksamkeit der Säule und die erforderliche Durchflußgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten.

Beispiel 7

Fällung des Komplexes aus GMI und α-Cyclodextrin aus einer Lösung mit einem Gehalt der reinen Komponenten (I).

1,555 g α-Cyclodextrin wurden in 32 ml destilliertem Wasser gelöst (Lösung A). Eine Probe von 3,2 ml (0,160 mMol) wurde dann entnommen. 24,8 mg GM1 (0,0158 mMol) wurden in 4 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösungen wurden gemischt und 19 Stunden bei 4ºC belassen. Der Niederschlag wurde gewonnen, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Der Festkörper betrug 10 mg. Die ¹H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab ein molares Verhältnis Cyclodextrin/GM1 von 5,1.

Beispiel 8

Fällung des Komplexes aus einer Lösung mit einem Gehalt der reinen Komponenten (II).

49,6 mg GM1 (0,0316 mMol) wurden in 4 ml destilliertem Wasser gelöst und zu 3,2 ml Lösung A aus Beispiel 7 gegeben. Nach dem Mischen wurde das Verfahren von Beispiel 7 wiederholt. Der schließlich gewonnene Feststoff wog 45,2 mg und wies ein molares Verhältnis α-Cyclodextrin zu GM1 von 4,5 auf (¹H-NMR-Spektroskopie).

Beispiel 9

Fällung eines Komplexes aus einer Lösung mit einem Gehalt der reinen Komponenten (III).

12,4 mg GM1 (0,0079 mMol) wurden in 4 ml destilliertem Wasser gelöst und anschließend zu 3,2 ml Lösung A aus Beispiel 7 gegeben. Das Verfahren war dann das gleiche.
Der gewonnene Feststoff wog 10,5 mg und wies ein molares Verhältnis von α-Cyclodextrin zu GM1 von 5,7 auf.

Beispiel 10

Es wird gezeigt, daß β-Cyclodextrin im erfindungsgemäßen Verfahren nicht zu gleichen oder ähnlichen Ergebnissen wie α-Cyclodextrin führt.
440 mg der gleichen Charge des in Beispiel 1 verwendeten Lipidextrakts (Gehalt an GM1: 57 % (Gew./Gew.), entsprechend einer Menge von 250 mg) wurden in 30 ml destilliertem Wasser gelöst. Es wurden 1000 mg β-Cyclodextrin zugegeben, und das Volumen wurde mit dem vorstehend angegebenen Lösungsmittel auf 60 ml gebracht.
Die erhaltene Lösung war völlig klar und wurde einer Ultrafiltration unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 unterzogen, mit der Ausnahme, daß Wasser zugegeben wurde1 um das Volumen des Retentats konstant zu halten, wie in Beispiel 2 angegeben ist.
Permeatproben von jeweils 60 ml wurden gesammelt. Jede Permeatfraktion und das Retentat wurden mittels Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 5 angegeben, untersucht.
Auf diese Weise wurde ermittelt, daß die erste Permeatfraktion eine große Menge an β-Cyclodextrin enthielt, während die anderen nachfolgenden Fraktionen nur vernachlässigbare Mengen der Substanz enthielten. Das Retentat enthielt keinerlei Cyclodextrin.
Sehr kleine Mengen an GM1 wurden in der ersten Permeatfraktion nachgewiesen.
Ein Sialsäureassay, der für das Retentat durchgeführt wurde, zeigte, daß die Menge an GM1 darin 235 mg betrug. Diese Menge ist mit der im Ausgangslipidextrakt enthaltenen Menge (250 mg vgl. oben) gut vergleichbar.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Monisialogangliosid (GM1) aus einem Lipidgemisch, das entweder die Substanz als einziges Gangliosid oder in einer vorherrschenden Menge im Vergleich zu anderen Gangliosiden enthält, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Ultrafiltration einer wäßrigen Lösung, in der zuvor sowohl das Lipidgemisch als auch α-Cyclodextrin gelöst worden sind, durch eine Dialysemembran mit einer Porengröße von 50 000 Dalton oder mehr;

(b) Einengen des Dialysats (Permeats) durch Ultrafiltration durch eine Dialysemembran mit einer Porengröße von 1000 Dalton;

(c) Gewinnung des gelösten Stoffes, der den Komplex zwischen GM1 und α-Cclodextrin umfaßt, aus dem eingeengten Permeat;

(d) Gewinnung des GM1 aus dem entsprechenden Komplex.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Lipidgemisches in der Ausgangslösung im Bereich von 0,5 bis 3,5 % liegt, wobei die Menge an α-Cyclodextrin mindestens der 2-fachen Menge des Gemisches entspricht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der Membran für die Ultrafiltration vorzugsweise 100 000 Dalton beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltration durchgeführt wird, indem das Volumen der Lösung in der Dialysekammer (Retentat) konstant gehalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Retentat durch Zugabe von 2 % (Gew./Vol.) α-Cyclodextrin in Wasser auf einem konstanten Volumen gehalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Retentat durch Zugabe von Wasser auf einem konstanten Volumen gehalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Endvolumen der dialysierten Lösung (Permeat) mindestens dem 2-fachen Volumen des Retentats entspricht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Endvolumen des Permeats mindestens dem 5-fachen Volumen des Retentats entspricht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Einengen des Permeats solange durchgeführt wird, bis das entsprechende Volumen auf etwa 1/10 des Volumens der Ausgangslösung verringert ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung des gelösten Stoffs, der den Komplex zwischen GM1 und α-Cyclodextrin umfaßt, aus dem eingeengten Permeat entweder durch Lyophylisieren oder durch Ausfällen mit Aceton oder durch Belassen der Lösung bei 4ºC durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung des gelösten Stoffs durch Ausfällen mit Aceton durchgeführt wird, wobei 10 Volumenteile des Lösungsmittels zu einem Volumenteil Permeat gegeben werden.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung des gelösten Stoffs durch Ausfällung bei 4ºC durchgeführt wird, wobei die Konzentration an GM1 in der Lösung (Gew./Vol.) mindestens 0,1 % (Gew. /Vol.) beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der gelöste Stoff aus dem Permeat durch Lyophilisieren gewonnen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß GM1 aus dem entsprechenden Komplex mit α-Cyclodextrin durch Extraktion mit Methanol oder mit einem entsprechenden Gemisch aus Methanol mit einem anderen organischen Lösungsmittel gewonnen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Volumens an Extraktionsmittel zum Gewicht des gelösten Stoffes mindestens 5 beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktionsstufe mindestens dreimal wiederholt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Gemisch aus Methanol und dem anderen organischen Lösungsmittel um Chloroform:Methanol (2 :1) handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß GM1 aus dem entsprechenden Komplex mit α-Cyclodextrin durch Extraktion des Feststoffs zuerst mit Methanol, anschließendem Einengen zur Trockene und dann Extraktion des Rückstands mit einem Gemisch aus Chloroform:Methanol (2:1) gewonnen wird.

19. Komplexverbindung zwischen α-Cyclodextrin und GM1, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von α-Cyclodextrin zu GM1 4,0 bis 6,0 beträgt.