JPH04230398A - α−サイクロデキストリンとの複合化による出発原料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離精製方法および関連の中間体化合物 - Google Patents
α−サイクロデキストリンとの複合化による出発原料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離精製方法および関連の中間体化合物Info
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- JPH04230398A JPH04230398A JP3174194A JP17419491A JPH04230398A JP H04230398 A JPH04230398 A JP H04230398A JP 3174194 A JP3174194 A JP 3174194A JP 17419491 A JP17419491 A JP 17419491A JP H04230398 A JPH04230398 A JP H04230398A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モノシアロガングリオ
シド、即ち神経化学会誌１０巻、第６１３頁、１９６３
年のエル．スヴェンナホルム（Ｌ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏ
ｌｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １０ ６１３
１９６３）により採用された命名法に従うＧＭ１を、神
経系の組織あるいは器官から前もって抽出した脂質混合
物から得る方法に関する。上記の脂質混合物は、ＧＭ１
が、単独のガングリオシドとして含有されているか、さ
もなくばそのファミリー（ＧＤ，ＧＴ，ＧＱなど）の他
のスフィンゴ糖脂質類よりも多い量で存在している状態
を特徴とするものである。
シド、即ち神経化学会誌１０巻、第６１３頁、１９６３
年のエル．スヴェンナホルム（Ｌ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏ
ｌｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １０ ６１３
１９６３）により採用された命名法に従うＧＭ１を、神
経系の組織あるいは器官から前もって抽出した脂質混合
物から得る方法に関する。上記の脂質混合物は、ＧＭ１
が、単独のガングリオシドとして含有されているか、さ
もなくばそのファミリー（ＧＤ，ＧＴ，ＧＱなど）の他
のスフィンゴ糖脂質類よりも多い量で存在している状態
を特徴とするものである。
【０００２】
【従来の技術】この状態は幾つかの公知方法で、例えば
上記の脂質混合物に対して、あるいはその混合物が抽出
される出発器官ホモジェネートに対してさえも化学的あ
るいは酵素的処理を実施する方法で達成され得る。
上記の脂質混合物に対して、あるいはその混合物が抽出
される出発器官ホモジェネートに対してさえも化学的あ
るいは酵素的処理を実施する方法で達成され得る。
【０００３】以前は、ガングリオシド類は、単一の物質
としてもまた当該物質の混合物としても、幾つかの重要
な治療学上の適用例が見出され、近年において興味はモ
ノシアロガングリオシドに特に集中してきた。
としてもまた当該物質の混合物としても、幾つかの重要
な治療学上の適用例が見出され、近年において興味はモ
ノシアロガングリオシドに特に集中してきた。
【０００４】ここで、次に上述した処理について考える
と、それらの処理は次なる（１）および（２）の変法を
通じて未処理の抽出物に対して行うことができる。
と、それらの処理は次なる（１）および（２）の変法を
通じて未処理の抽出物に対して行うことができる。
【０００５】（１）シアリダーゼでの酵素分解：酵素分
解の酵素がすでにホモジェネート自体に存在しているか
ら、酵素を添加する必要がないという事実を利用して、
この処理が出発原料の動物器官ホモジェネートにも適用
可能であることに注目する価値がある。さらに、この場
合においては、ＧＭ１が豊富な未処理の脂質抽出物はそ
の後工程で公知方法によって回収され得る。
解の酵素がすでにホモジェネート自体に存在しているか
ら、酵素を添加する必要がないという事実を利用して、
この処理が出発原料の動物器官ホモジェネートにも適用
可能であることに注目する価値がある。さらに、この場
合においては、ＧＭ１が豊富な未処理の脂質抽出物はそ
の後工程で公知方法によって回収され得る。
【０００６】（２）希釈鉱酸による加水分解。
【０００７】上記の各方法の適当な例は欧州特許出願第
８８１２０２８１．６号明細書および仏国特許出願第２
５８７０７号明細書にそれぞれ紹介されている。
８８１２０２８１．６号明細書および仏国特許出願第２
５８７０７号明細書にそれぞれ紹介されている。
【０００８】次に、ガングリオシド類について考えると
、そのガングリオシドの水溶液中に、これらガングリオ
シドの化合物がミセル凝集状態で存在する。このミセル
凝集体は数百キロダルトンの分子量を有するものである
（Ｄ．Ｂ．Ｇａｍｍａｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８８
３７３ １９６３）。前記の現象により、神経系
の器官または組織によって前もって得られた未処理の抽
出物中に含まれる他の物質からガングリオシドを分離す
るための限外濾過および／または透析などの技術の使用
が妨げられる。それは、明らかにそのような凝集体は単
一の分子が限界濾過膜の孔を通過させないからである。
、そのガングリオシドの水溶液中に、これらガングリオ
シドの化合物がミセル凝集状態で存在する。このミセル
凝集体は数百キロダルトンの分子量を有するものである
（Ｄ．Ｂ．Ｇａｍｍａｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８８
３７３ １９６３）。前記の現象により、神経系
の器官または組織によって前もって得られた未処理の抽
出物中に含まれる他の物質からガングリオシドを分離す
るための限外濾過および／または透析などの技術の使用
が妨げられる。それは、明らかにそのような凝集体は単
一の分子が限界濾過膜の孔を通過させないからである。
【０００９】このため、現在、ガングリオシド類、特に
ＧＭ１を未処理の脂質混合物から単離するのに用いられ
ている方法は、溶離剤として水と２種以上の有機溶媒と
の混合物を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる
分別などの他の技術を利用している。
ＧＭ１を未処理の脂質混合物から単離するのに用いられ
ている方法は、溶離剤として水と２種以上の有機溶媒と
の混合物を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる
分別などの他の技術を利用している。
【００１０】この分別方法は、幾つかの理由のために全
く好ましくない。その主な欠点は、ＧＭ１の単離の特別
な場合において、クロマトグラフィーによる分離を達成
するのに必要とされる時間にある。そのうえ、実際に回
収されたＧＭ１の量は予想された量と比較してバッチ毎
に一層幅広く変動し得ることが実証されている。
く好ましくない。その主な欠点は、ＧＭ１の単離の特別
な場合において、クロマトグラフィーによる分離を達成
するのに必要とされる時間にある。そのうえ、実際に回
収されたＧＭ１の量は予想された量と比較してバッチ毎
に一層幅広く変動し得ることが実証されている。
【００１１】実際に、２つの因子によって影響されるカ
ラム効率に対する顕著な依存性が見出された。すなわち
、２つの因子とは、クロマトグラフィーによるそれぞれ
の分離操作後になされなければならない樹脂ベッドの再
生と、次のクロマトグラフィーに用いる溶媒の再平衡化
である。
ラム効率に対する顕著な依存性が見出された。すなわち
、２つの因子とは、クロマトグラフィーによるそれぞれ
の分離操作後になされなければならない樹脂ベッドの再
生と、次のクロマトグラフィーに用いる溶媒の再平衡化
である。
【００１２】前記分別方法の他の重要な欠点は、前記し
たように、カラムを溶出するために必要とされる数種の
有機混合溶媒の量が多いためにかかる関連コストである
。
たように、カラムを溶出するために必要とされる数種の
有機混合溶媒の量が多いためにかかる関連コストである
。
【００１３】さらに、分離の終了時においては、樹脂ベ
ッドの上部が完全に除去され、同量の新しい樹脂と交換
されなければならない。それは、樹脂ベッドの上部はそ
の部分の樹脂自体に固着した分画済みの脂質混合物の不
純物によって不可逆的に変えられるからである。
ッドの上部が完全に除去され、同量の新しい樹脂と交換
されなければならない。それは、樹脂ベッドの上部はそ
の部分の樹脂自体に固着した分画済みの脂質混合物の不
純物によって不可逆的に変えられるからである。
【００１４】さらに、この手順の詳細は後述する実施例
６に紹介されている。この実施例６には、イオン交換カ
ラムクロマトグラフィーにより脂質抽出物からＧＭ１を
回収する方法が記載されている。この方法は本発明方法
と直接比較するのに役立つ。
６に紹介されている。この実施例６には、イオン交換カ
ラムクロマトグラフィーにより脂質抽出物からＧＭ１を
回収する方法が記載されている。この方法は本発明方法
と直接比較するのに役立つ。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の主な
目的は、単独のガングリオシドとしてか、あるいは同じ
ファミリーの他の関連性の深いガングリオシド類と比較
して多量のモノシアロガングリオシドとして含む出発原
料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離
精製方法を提供することにある。
目的は、単独のガングリオシドとしてか、あるいは同じ
ファミリーの他の関連性の深いガングリオシド類と比較
して多量のモノシアロガングリオシドとして含む出発原
料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離
精製方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明方法はいかなるイ
オン交換クロマグラフィー工程をも含まないから、これ
まで行われてきた手順が顕著に単純化される。
オン交換クロマグラフィー工程をも含まないから、これ
まで行われてきた手順が顕著に単純化される。
【００１７】前記方法は、溶質として神経系の組織また
は器官の抽出物に由来する上記の未処理の脂質混合物と
α−サイクロデキストリンとを決められた重量比で含む
水溶液を限外濾過することによってモノシアロガングリ
オシドを得ることを特徴とする。
は器官の抽出物に由来する上記の未処理の脂質混合物と
α−サイクロデキストリンとを決められた重量比で含む
水溶液を限外濾過することによってモノシアロガングリ
オシドを得ることを特徴とする。
【００１８】知られているように、α−サイクロデキス
トリンは６個のグルコピラノシル繰り返し単位から構成
された環状オリゴサッカライド類である。
トリンは６個のグルコピラノシル繰り返し単位から構成
された環状オリゴサッカライド類である。
【００１９】本発明に従うと、上記の特性を有する脂質
混合物を含む溶液に、先の溶質である脂質混合物に対し
て決められた重量比で一定量のα−サイクロデキストリ
ンを添加することによって、ミセル凝集体が破壊され、
限外濾過に採用される条件で、可溶性の複合体がα−サ
イクロデキストリンとの間に形成される。
混合物を含む溶液に、先の溶質である脂質混合物に対し
て決められた重量比で一定量のα−サイクロデキストリ
ンを添加することによって、ミセル凝集体が破壊され、
限外濾過に採用される条件で、可溶性の複合体がα−サ
イクロデキストリンとの間に形成される。
【００２０】その結果、モノシアロガングリオシドは限
外濾過膜の孔を通過できる。ここで、限外濾過膜は、他
の脂質が同条件で透析されないように選択されるのが有
利である。
外濾過膜の孔を通過できる。ここで、限外濾過膜は、他
の脂質が同条件で透析されないように選択されるのが有
利である。
【００２１】本発明方法は興味深いことにα−サイクロ
デキストリンとだけ起こり、β−サイクロデキストリン
、すなわち７個のグルコピラノース単位から構成される
環状オリゴサッカライドは、実施例１０に示されるよう
にそのような結果をいささかも与えない。
デキストリンとだけ起こり、β−サイクロデキストリン
、すなわち７個のグルコピラノース単位から構成される
環状オリゴサッカライドは、実施例１０に示されるよう
にそのような結果をいささかも与えない。
【００２２】さらに詳細には、本発明に従うＧＭ１を得
る方法は次の各工程からなる。
る方法は次の各工程からなる。
【００２３】（１）溶液の限外濾過：この溶液には、脂
質混合物が０．５ｗ／ｖ％と３．５ｗ／ｖ％との間の濃
度で溶解され、５０，０００ダルトンまたはそれ以上、
好ましくは１００，０００ダルトンの孔サイズを有する
透析膜を通して限外濾過が行われる。ここで、α−サイ
クロデキストリンは重量比で抽出物の少なくとも２倍量
である。
質混合物が０．５ｗ／ｖ％と３．５ｗ／ｖ％との間の濃
度で溶解され、５０，０００ダルトンまたはそれ以上、
好ましくは１００，０００ダルトンの孔サイズを有する
透析膜を通して限外濾過が行われる。ここで、α−サイ
クロデキストリンは重量比で抽出物の少なくとも２倍量
である。
【００２４】（２）１，０００ダルトンの孔サイズを有
する透析膜を通じた限外濾過による透析液（透過液）の
濃縮。
する透析膜を通じた限外濾過による透析液（透過液）の
濃縮。
【００２５】（３）ＧＭ１のα−サイクロデキストリン
との複合体を含む溶質の回収。
との複合体を含む溶質の回収。
【００２６】（４）上記複合体からのＧＭ１の回収。
【００２７】ガングリオシドに対するα−サイクロデキ
ストリンの比は、脂質混合物中のＧＭ１の滴定濃度に依
存せずにＧＭ１の完全な複合化を供するように設定され
ている。
ストリンの比は、脂質混合物中のＧＭ１の滴定濃度に依
存せずにＧＭ１の完全な複合化を供するように設定され
ている。
【００２８】限外濾過では透析チャンバ内の溶液（すな
わち、透析膜内溶液）を一定体積に維持する。この透析
膜内溶液量の維持は好ましくはα−サイクロデキストリ
ンの２ｗ／ｖ％溶液を添加することによって行われる。
わち、透析膜内溶液）を一定体積に維持する。この透析
膜内溶液量の維持は好ましくはα−サイクロデキストリ
ンの２ｗ／ｖ％溶液を添加することによって行われる。
【００２９】実際には、上記溶液の代わりに普通の水も
用いられ得る。この場合、限外濾過の終了時に回収され
たＧＭ１の量は、従来技術に従うカラムクロマトグラフ
ィー方法によって与えられた量と比較すると有利である
とはいえ、前記の限外濾過技術を用いることによって得
られた量よりも少ない。
用いられ得る。この場合、限外濾過の終了時に回収され
たＧＭ１の量は、従来技術に従うカラムクロマトグラフ
ィー方法によって与えられた量と比較すると有利である
とはいえ、前記の限外濾過技術を用いることによって得
られた量よりも少ない。
【００３０】透析された溶液（すなわち、透過液）の最
終量は透析膜内溶液量の少なくとも２倍であるべきであ
る。好ましくは、浸透量は透析膜内溶液量の５倍である
。
終量は透析膜内溶液量の少なくとも２倍であるべきであ
る。好ましくは、浸透量は透析膜内溶液量の５倍である
。
【００３１】限外濾過の終了時において、透過液は、そ
の最終量が出発透過液の約１／１０になるまで、１，０
００ダルトンの孔サイズを有する膜を用いる限外濾過に
よって都合よく濃縮される。
の最終量が出発透過液の約１／１０になるまで、１，０
００ダルトンの孔サイズを有する膜を用いる限外濾過に
よって都合よく濃縮される。
【００３２】濃縮された透過液はその後好ましくは凍結
融解されるが、溶質はアセトンで沈殿させて回収するこ
ともできる。
融解されるが、溶質はアセトンで沈殿させて回収するこ
ともできる。
【００３３】また、溶質は、濃縮された透過液を＋４℃
に保つことによって、その溶質が含まれた水溶液から沈
殿させられ得るということが見いだされた。ここで、Ｇ
Ｍ１の濃度（ｗ／ｖ）は少なくとも０．１ｗ／ｖ％であ
るべきである。とにかく、この方法によるＧＭ１の収量
は前記の手順で提供された収量より低い。
に保つことによって、その溶質が含まれた水溶液から沈
殿させられ得るということが見いだされた。ここで、Ｇ
Ｍ１の濃度（ｗ／ｖ）は少なくとも０．１ｗ／ｖ％であ
るべきである。とにかく、この方法によるＧＭ１の収量
は前記の手順で提供された収量より低い。
【００３４】ＧＭ１はその後のメタノールまたはメタノ
ールと他の有機溶媒との混合溶媒による抽出により得ら
れる複合体により回収することができる。
ールと他の有機溶媒との混合溶媒による抽出により得ら
れる複合体により回収することができる。
【００３５】後者、すなわち混合溶媒の適当な例はクロ
ロホルム／メタノール（体積比２：１）溶液である。
ロホルム／メタノール（体積比２：１）溶液である。
【００３６】有機溶媒、即ちメタノールまたはメタノー
ルと他の有機溶媒との混合溶媒（体積）と固形物（重量
）との比は、各抽出ごとに少なくとも５（ｖ／ｗ）でな
ければならない。
ルと他の有機溶媒との混合溶媒（体積）と固形物（重量
）との比は、各抽出ごとに少なくとも５（ｖ／ｗ）でな
ければならない。
【００３７】前記溶媒を用いた抽出工程は少なくとも３
回、より有利には５回繰り返されるべきである。
回、より有利には５回繰り返されるべきである。
【００３８】前記２つの脱複合化方法の組み合わせもま
た可能である。すなわち、この方法はまず透析液から得
た固形物をメタノールを用いて抽出し、その溶液を乾燥
し、次いで残渣をクロロホルム：メタノール（２：１）
溶液で抽出する工程を含む。さらに、α−サイクロデキ
ストリンを含む複合体からＧＭ１を回収する上記方法で
は、純粋な複合化剤からなる不溶性残渣が残り、この残
渣は集められ、そのまま他の作業工程に用いることがで
きる。
た可能である。すなわち、この方法はまず透析液から得
た固形物をメタノールを用いて抽出し、その溶液を乾燥
し、次いで残渣をクロロホルム：メタノール（２：１）
溶液で抽出する工程を含む。さらに、α−サイクロデキ
ストリンを含む複合体からＧＭ１を回収する上記方法で
は、純粋な複合化剤からなる不溶性残渣が残り、この残
渣は集められ、そのまま他の作業工程に用いることがで
きる。
【００３９】本発明の第２の目的、すなわちＧＭ１とα
−サイクロデキストリンとの複合体に関して、図１は溶
液中の生成物の形成の証拠を提供するものである。図１
は、ＧＭ１の濃度が１ｍｇ／ｍｌであるときの重水（Ｄ
２ Ｏ）溶液中における１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３
００ＭＨｚ）に関するものである。溶液には、その後、
α−サイクロデキストリンを増量しつつ添加してゆく。
−サイクロデキストリンとの複合体に関して、図１は溶
液中の生成物の形成の証拠を提供するものである。図１
は、ＧＭ１の濃度が１ｍｇ／ｍｌであるときの重水（Ｄ
２ Ｏ）溶液中における１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３
００ＭＨｚ）に関するものである。溶液には、その後、
α−サイクロデキストリンを増量しつつ添加してゆく。
【００４０】α−サイクロデキストリンのＧＭ１に対す
る相対的なモル比を表１に示す。
る相対的なモル比を表１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】この分野における知識（例えばＴ．Ａ．Ｗ
．Ｋｏｅｒｎｅｒらによる『ガングリオシド類の高解像
プロトンＮＭＲ研究。１．異形配置における残渣物の組
成の決定のための同一の核からなる分子の二次元スピン
エコーＪ相関スペクトロスコピーの使用』、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、１９８３年第２２巻第２６７６〜２６
８７頁参照）に従い、スペクトルの解析は次のようにな
された。
．Ｋｏｅｒｎｅｒらによる『ガングリオシド類の高解像
プロトンＮＭＲ研究。１．異形配置における残渣物の組
成の決定のための同一の核からなる分子の二次元スピン
エコーＪ相関スペクトロスコピーの使用』、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、１９８３年第２２巻第２６７６〜２６
８７頁参照）に従い、スペクトルの解析は次のようにな
された。
【００４３】０．８２ｐｐｍでのシグナルはセラミド部
分の末端脂肪族メチル基に帰属し、約１．２３ｐｐｍで
のシグナルはセラミドのメチレンプロトンに帰属し、約
１．８５ｐｐｍでのシグナルはアセトアミドメチルプロ
トン（グルコサミンおよびシアル酸のＮ−アセチル基）
に帰属し、１．９〜２．１ｐｐｍでのシグナルはセラミ
ドのアリル基のプロトンおよびα−カルボニルメチレン
プロトンにそれぞれ帰属する。
分の末端脂肪族メチル基に帰属し、約１．２３ｐｐｍで
のシグナルはセラミドのメチレンプロトンに帰属し、約
１．８５ｐｐｍでのシグナルはアセトアミドメチルプロ
トン（グルコサミンおよびシアル酸のＮ−アセチル基）
に帰属し、１．９〜２．１ｐｐｍでのシグナルはセラミ
ドのアリル基のプロトンおよびα−カルボニルメチレン
プロトンにそれぞれ帰属する。
【００４４】複合体の形成を評価するために重要なのは
、０．８２ｐｐｍ（セラミド部分の末端メチル基）およ
び１．８５ｐｐｍ（アセトアミドメチルプロトン）のシ
グナルである。それは、空間充填モデルによって示され
るように、括弧内に述べた関連の基は当該分子を外側に
突き出すから、これらのシグナルは原則として分子中の
原子の立体配置に関する環境の変化に対して、感受性を
有する。
、０．８２ｐｐｍ（セラミド部分の末端メチル基）およ
び１．８５ｐｐｍ（アセトアミドメチルプロトン）のシ
グナルである。それは、空間充填モデルによって示され
るように、括弧内に述べた関連の基は当該分子を外側に
突き出すから、これらのシグナルは原則として分子中の
原子の立体配置に関する環境の変化に対して、感受性を
有する。
【００４５】前記両シグナルがα−サイクロデキストリ
ンの増量という条件の存在で、より高解像度でシャープ
となることや、上記立体配置環境がＧＭ１のミセル凝集
体中に先に存在していた環境に比較して次第に変化して
いることを意味することも図１から理解できる。
ンの増量という条件の存在で、より高解像度でシャープ
となることや、上記立体配置環境がＧＭ１のミセル凝集
体中に先に存在していた環境に比較して次第に変化して
いることを意味することも図１から理解できる。
【００４６】さらに、複合体の形成についての証拠はそ
の物質の相対的な固相スペクトルを出発原料のモノシア
ロガングリオシドの固相スペクトルと直接比較すること
によって与えられる。ここで、これらのスペクトルはＣ
Ｐ−ＭＡＳ−１３ＣＮＭＲ（Ｃｒｏｓｓ ｐｏｌａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｎｇｌｅ
ｓｐｉｎｃａｒｂｏｎ １３ＮＭＲ）スペクトロス
コピーによって得られ、図２のグラフにその特徴が描か
れている。
の物質の相対的な固相スペクトルを出発原料のモノシア
ロガングリオシドの固相スペクトルと直接比較すること
によって与えられる。ここで、これらのスペクトルはＣ
Ｐ−ＭＡＳ−１３ＣＮＭＲ（Ｃｒｏｓｓ ｐｏｌａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｎｇｌｅ
ｓｐｉｎｃａｒｂｏｎ １３ＮＭＲ）スペクトロス
コピーによって得られ、図２のグラフにその特徴が描か
れている。
【００４７】そのスペクトルの意味を説明する前に、そ
の技術はサイクロデキストリン類の複合体の構造解明に
広く用いられることは記憶するに値する（Ｙ．ｉｎｏｕ
ｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．１５９ １ １
９８７）。
の技術はサイクロデキストリン類の複合体の構造解明に
広く用いられることは記憶するに値する（Ｙ．ｉｎｏｕ
ｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．１５９ １ １
９８７）。
【００４８】図２における（Ａ）および（Ｂ）はそれぞ
れ実験開始からマイクロ秒で計測された所定時間に試験
サンプルに順次磁気パルスを与えることによって複合体
およびＧＭ１の各スペクトル（横座標はｐｐｍ）がいか
に変化するかを示すグラフである。
れ実験開始からマイクロ秒で計測された所定時間に試験
サンプルに順次磁気パルスを与えることによって複合体
およびＧＭ１の各スペクトル（横座標はｐｐｍ）がいか
に変化するかを示すグラフである。
【００４９】このようにして、サンプルの磁場の緩和は
ますますその発生を防止され、その結果、磁場の端部に
おいてシグナルが完全にスペクトルから消失する。
ますますその発生を防止され、その結果、磁場の端部に
おいてシグナルが完全にスペクトルから消失する。
【００５０】純度の高いＧＭ１では、このような状態に
到達するのにかかる時間は約９０マイクロ秒であり、Ｇ
Ｍ１とα−サイクロデキストリンとの複合体では約５０
マイクロ秒後に起こる。これは上記複合体ではＧＭ１の
移動度（例えばＧＭ１中の脂肪族炭素原子に結合したプ
ロトンによって与えられた約３０ｐｐｍにおける関連シ
グナルを参照のこと）が純度の高いＧＭ１の移動度との
比較において非常に妨げられることを意味する。従って
、この技術はさらに複合体の形成の独立の証拠を提供す
るものである。また、この複合体の形成の他の実証は、
α−サイクロデキストリンと少なくとも０．１％の濃度
であるＧＭ１とが溶解し、次の実施例３で述べられる条
件が満たされるならば、複合体を含む水溶液から複合体
が沈殿するという事実によっても与えられる。
到達するのにかかる時間は約９０マイクロ秒であり、Ｇ
Ｍ１とα−サイクロデキストリンとの複合体では約５０
マイクロ秒後に起こる。これは上記複合体ではＧＭ１の
移動度（例えばＧＭ１中の脂肪族炭素原子に結合したプ
ロトンによって与えられた約３０ｐｐｍにおける関連シ
グナルを参照のこと）が純度の高いＧＭ１の移動度との
比較において非常に妨げられることを意味する。従って
、この技術はさらに複合体の形成の独立の証拠を提供す
るものである。また、この複合体の形成の他の実証は、
α−サイクロデキストリンと少なくとも０．１％の濃度
であるＧＭ１とが溶解し、次の実施例３で述べられる条
件が満たされるならば、複合体を含む水溶液から複合体
が沈殿するという事実によっても与えられる。
【００５１】複合体の化学量論は、次の実施例３、およ
び７〜９に従うサンプルの１ ＨＮＭＲスペクトロスコ
ピーによる分析によって解明された。特に、サイクロデ
キストリンのアノマープロトンに対応する５．３５９ｐ
ｐｍと、ＧＭ１のセラミド部分の末端メチル基のプロト
ンに対応する１．４０９ｐｐｍとにそれぞれ入るシグナ
ルの面積が考察された。
び７〜９に従うサンプルの１ ＨＮＭＲスペクトロスコ
ピーによる分析によって解明された。特に、サイクロデ
キストリンのアノマープロトンに対応する５．３５９ｐ
ｐｍと、ＧＭ１のセラミド部分の末端メチル基のプロト
ンに対応する１．４０９ｐｐｍとにそれぞれ入るシグナ
ルの面積が考察された。
【００５２】次いで、関連した各面積が算出され、それ
らの比がとられた。従って、複合体におけるα−サイク
ロデキストリンのＧＭ１に対するモル比は４．０から６
．０まで変化したことが見出された。
らの比がとられた。従って、複合体におけるα−サイク
ロデキストリンのＧＭ１に対するモル比は４．０から６
．０まで変化したことが見出された。
【００５３】
【実施例】以下に報告される実施例においては、全ての
分析データは乾燥重量ベースで与えられる。
分析データは乾燥重量ベースで与えられる。
【００５４】実施例１
「５７ｗ／ｗ％のＧＭ１の滴定濃度を有する脂質抽出物
からのモノシアロガングリオシドの単離」全ての先のガ
ングリオシド類をＧＭ１に変換するために予め処理され
た結果、このＧＭ１の最終的な量が５００ｍｇ［Ｌ．Ｓ
ｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ，Ａｃｔａ ２４ ６０４ （１９５７））の
方法に従うシアル基の相対量によって決められ、Ｒ．Ｋ
ｕｈｎら（Ｃｅｈｍ．Ｂｅｒ．８６ ８６６ （１
９６３））に従ってその２０％の百分率をＧＭ１中のガ
ングリオシド量として取り扱う］まで増加された脂質抽
出物８８０ｍｇを蒸留水８０ｍｌ中に溶解した。
からのモノシアロガングリオシドの単離」全ての先のガ
ングリオシド類をＧＭ１に変換するために予め処理され
た結果、このＧＭ１の最終的な量が５００ｍｇ［Ｌ．Ｓ
ｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ，Ａｃｔａ ２４ ６０４ （１９５７））の
方法に従うシアル基の相対量によって決められ、Ｒ．Ｋ
ｕｈｎら（Ｃｅｈｍ．Ｂｅｒ．８６ ８６６ （１
９６３））に従ってその２０％の百分率をＧＭ１中のガ
ングリオシド量として取り扱う］まで増加された脂質抽
出物８８０ｍｇを蒸留水８０ｍｌ中に溶解した。
【００５５】α−サイクロデキストリンの１０ｗ／ｖ％
水溶液を調製した。
水溶液を調製した。
【００５６】重量で上記抽出物の量の２倍のサイクロデ
キストリン量と一致する、この水溶液２０ｍｌを先の水
溶液に加え、最終量を１００ｍｌとした。この水溶液の
うち５０ｍｌを、１００，０００ダルトンの分子量の分
子を通過させない透析膜（ディスク膜 ＹＭ−１００
ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））を備えた限外濾過装置
に移した。
キストリン量と一致する、この水溶液２０ｍｌを先の水
溶液に加え、最終量を１００ｍｌとした。この水溶液の
うち５０ｍｌを、１００，０００ダルトンの分子量の分
子を通過させない透析膜（ディスク膜 ＹＭ−１００
ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））を備えた限外濾過装置
に移した。
【００５７】その後、透析は、α−サイクロデキストリ
ン２ｗ／ｖ％溶液を添加することによって透析膜内溶液
の液量を一定に保って成し遂げられた。
ン２ｗ／ｖ％溶液を添加することによって透析膜内溶液
の液量を一定に保って成し遂げられた。
【００５８】各透析工程では、それぞれ５０ｍｌの透過
液を採取した。透析工程は全部で５回行った。
液を採取した。透析工程は全部で５回行った。
【００５９】透過液を採取し、その溶液の最終量が２０
ｍｌとなるまで、１０００ダルトンの分子量の分子を通
過させない膜（ディスク膜 ＹＭ１ ＡＭＩＣＯＮ
（登録商標））を介する限外濾過によって濃縮した。
ｍｌとなるまで、１０００ダルトンの分子量の分子を通
過させない膜（ディスク膜 ＹＭ１ ＡＭＩＣＯＮ
（登録商標））を介する限外濾過によって濃縮した。
【００６０】凍結融解工程では、１５３ｍｇのＧＭ１（
Ｒ．Ｋｕｈｎらの参考資料に従い分子中のシアル酸の百
分率を考慮に入れながら、シアル酸アッセイを通じて決
められた）を含む固形物を１０５０ｍｇ回収した。
Ｒ．Ｋｕｈｎらの参考資料に従い分子中のシアル酸の百
分率を考慮に入れながら、シアル酸アッセイを通じて決
められた）を含む固形物を１０５０ｍｇ回収した。
【００６１】その後、先の工程の固形物を１回当たり１
０ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）溶液で抽
出し、この抽出を５回繰り返してＧＭ１を単離した。
０ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）溶液で抽
出し、この抽出を５回繰り返してＧＭ１を単離した。
【００６２】減圧下で乾燥して有機溶剤を取り除いて１
３８ｍｇのＧＭ１（理論量の５５％）を得た。ＧＭ１の
純度は実施例５で報告されるＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）法に従って分析したところ９５％以上であった
。シアル酸アッセイによるＧＭ１の滴定濃度は９７％で
あった。
３８ｍｇのＧＭ１（理論量の５５％）を得た。ＧＭ１の
純度は実施例５で報告されるＴＬＣ（薄層クロマトグラ
フィー）法に従って分析したところ９５％以上であった
。シアル酸アッセイによるＧＭ１の滴定濃度は９７％で
あった。
【００６３】実施例２
「水を加えることによって透析膜内溶液を一定量としつ
つ行う、脂質抽出物とα−サイクロデキストリンの双方
を含む溶液の限外濾過」 実施例１で調製し、脂質抽出物とα−サイクロデキスト
リンを含む１００ｍｌ溶液の一部５０ｍｌを限外濾過に
かける。この限外濾過は水を加えることによって透析膜
内溶液を一定量に保って行われる。
つ行う、脂質抽出物とα−サイクロデキストリンの双方
を含む溶液の限外濾過」 実施例１で調製し、脂質抽出物とα−サイクロデキスト
リンを含む１００ｍｌ溶液の一部５０ｍｌを限外濾過に
かける。この限外濾過は水を加えることによって透析膜
内溶液を一定量に保って行われる。
【００６４】スタート時の量の１／１０（２５ｍｌ）に
濃縮した後、その透過液に１０倍量のアセトンを加える
ことによって沈殿物を生じさせ、１０７０ｍｇの固形物
を得た。この固形物は１２８ｍｇのＧＭ１を含んでいた
。
濃縮した後、その透過液に１０倍量のアセトンを加える
ことによって沈殿物を生じさせ、１０７０ｍｇの固形物
を得た。この固形物は１２８ｍｇのＧＭ１を含んでいた
。
【００６５】この固形物をメタノールで抽出したのち、
実施例１における同工程での手順に従って減圧下で乾燥
して溶剤を取り除いた。最後に、１１３ｍｇのＧＭ１（
理論量の４５％）を回収した。このＧＭ１の滴定濃度は
シアル酸アッセイにより９６％と決定され、純度（実施
例５のＴＬＣ法による測定結果として）は９５％以上で
あった。
実施例１における同工程での手順に従って減圧下で乾燥
して溶剤を取り除いた。最後に、１１３ｍｇのＧＭ１（
理論量の４５％）を回収した。このＧＭ１の滴定濃度は
シアル酸アッセイにより９６％と決定され、純度（実施
例５のＴＬＣ法による測定結果として）は９５％以上で
あった。
【００６６】実施例３
「濃縮した浸透液からのＧＭ１とα−サイクロデキスト
リンとの複合体の沈殿」 １．５ｇの脂質混合物（ＧＭ１含量：０．６４５ｇ、即
ち４３ｗ／ｗ％）を１５ｍｌの蒸留水に溶解し、この溶
液に１０ｗ／ｖ％のα−サイクロデキストリン３０ｍｌ
を加えた以外は、実施例１の手順と同様にした。
リンとの複合体の沈殿」 １．５ｇの脂質混合物（ＧＭ１含量：０．６４５ｇ、即
ち４３ｗ／ｗ％）を１５ｍｌの蒸留水に溶解し、この溶
液に１０ｗ／ｖ％のα−サイクロデキストリン３０ｍｌ
を加えた以外は、実施例１の手順と同様にした。
【００６７】実施例１での方法は、濃縮した透過液が得
られるまで続けられた。
られるまで続けられた。
【００６８】濃縮した透過液（２０ｍｌ）を約１日間、
４℃に放置した後、その溶液を１５，０００回転／分、
１５分間の条件で遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿
物を４５℃、０．０３ｍｍＨｇの残圧下で１日間乾燥し
た。
４℃に放置した後、その溶液を１５，０００回転／分、
１５分間の条件で遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿
物を４５℃、０．０３ｍｍＨｇの残圧下で１日間乾燥し
た。
【００６９】最後に、９１ｍｇの固形物を回収した。こ
の固形物には、ＧＭ１中のシアル酸含量に基づいて算出
すると、２５．９ｍｇのＧＭ１が含まれていた。既述し
たように、 １ＨＮＭＲスペクトロスコピーを行ってα
−サイクロデキストリン／ＧＭ１のモル比が４．０であ
るというデータを得た。
の固形物には、ＧＭ１中のシアル酸含量に基づいて算出
すると、２５．９ｍｇのＧＭ１が含まれていた。既述し
たように、 １ＨＮＭＲスペクトロスコピーを行ってα
−サイクロデキストリン／ＧＭ１のモル比が４．０であ
るというデータを得た。
【００７０】上記固形物に対して１回につき２ｍｌのメ
タノールで計５回抽出を行うことによって固形物の脱複
合化を行い、その後乾燥した。その残渣に対して１回に
つき２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）で計
５回抽出を行った。溜めた抽出液を乾燥して２０ｍｌの
ＧＭ１を回収した。シアル酸含量に基づいた滴定濃度は
９８％であり、純度（実施例５のＴＬＣ法による測定結
果として）は９５％以．上であった。
タノールで計５回抽出を行うことによって固形物の脱複
合化を行い、その後乾燥した。その残渣に対して１回に
つき２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）で計
５回抽出を行った。溜めた抽出液を乾燥して２０ｍｌの
ＧＭ１を回収した。シアル酸含量に基づいた滴定濃度は
９８％であり、純度（実施例５のＴＬＣ法による測定結
果として）は９５％以．上であった。
【００７１】実施例４
「４８％のＧＭ１の滴定濃度を有する脂質混合物からの
ＧＭ１の単離」 ＧＭ１を４８％含む脂質混合物１．２５０ｇを蒸留水３
５ｍｌに溶解し、この溶液を１０ｗ／ｖ％のα−サイク
ロデキストリン水溶液２５ｍｌに加えた。
ＧＭ１の単離」 ＧＭ１を４８％含む脂質混合物１．２５０ｇを蒸留水３
５ｍｌに溶解し、この溶液を１０ｗ／ｖ％のα−サイク
ロデキストリン水溶液２５ｍｌに加えた。
【００７２】次いで、実施例１に従った手順を行った。
最終的に、３１８ｍｇ（理論量の５３％）のＧＭ１を単
離した。
離した。
【００７３】シアル酸アッセイに従って測定した滴定濃
度は９７．５％であった。ＴＬＣ法による純度は９５％
以上であった。
度は９７．５％であった。ＴＬＣ法による純度は９５％
以上であった。
【００７４】実施例５
「本発明に従って得られた調整品の純度検定」純度は薄
層クロマトグラフィー法によって検定された。 この方法はＧＭ１を含むスポットの強度と関連性のある
標準試料のスポットの強度とを直接視覚的に比較するこ
とによって行うものである。
層クロマトグラフィー法によって検定された。 この方法はＧＭ１を含むスポットの強度と関連性のある
標準試料のスポットの強度とを直接視覚的に比較するこ
とによって行うものである。
【００７５】以下に説明するように、薄層クロマトグラ
フィー法の感度は前もって調べて置いた。
フィー法の感度は前もって調べて置いた。
【００７６】用いられるプレートはＨＰＴＬＣプレート
（シリカゲル積層プレート）であり、展開溶媒は水中に
クロロホルムとメタノールと０．３％ＣａＣｌ２ を６
０：３５：８の比で混合した混合溶媒であった。
（シリカゲル積層プレート）であり、展開溶媒は水中に
クロロホルムとメタノールと０．３％ＣａＣｌ２ を６
０：３５：８の比で混合した混合溶媒であった。
【００７７】試験用の薄層クロマトグラフィーでの各物
質は同時に２枚のプレートに対して展開された。これは
、以下に説明する各試薬でのスポットの形跡を同時に調
べるためである。
質は同時に２枚のプレートに対して展開された。これは
、以下に説明する各試薬でのスポットの形跡を同時に調
べるためである。
【００７８】溶媒で飽和させたチャンバー内でプレート
に溶媒を展開させ、オーブン内で乾燥させたプレートに
、次の溶液をそれぞれ噴霧した。
に溶媒を展開させ、オーブン内で乾燥させたプレートに
、次の溶液をそれぞれ噴霧した。
【００７９】Ａ．エールリッヒ試薬
Ｂ．アニスアルデヒド溶液：この試薬は氷酢酸中に１ｍ
ｌのアニスアルデヒドを溶解して１００ｍｌとすること
によって得た。この溶液には８６ｗ／ｖ％硫酸２ｍｌが
加えられた。
ｌのアニスアルデヒドを溶解して１００ｍｌとすること
によって得た。この溶液には８６ｗ／ｖ％硫酸２ｍｌが
加えられた。
【００８０】噴霧後、プレートをオーブン内で１００℃
で１０分間乾燥した。
で１０分間乾燥した。
【００８１】初回の一連の実験においては、プレート上
に、実施例１で言及した脂質混合物（ＧＭ１滴定濃度：
５７重量％）のスポット量を、１５０，５０，３０，１
２．５ｍｃｇ（マイクログラム）のように順次減らして
積層した。
に、実施例１で言及した脂質混合物（ＧＭ１滴定濃度：
５７重量％）のスポット量を、１５０，５０，３０，１
２．５ｍｃｇ（マイクログラム）のように順次減らして
積層した。
【００８２】プレートに上記試薬Ａを噴霧した。このよ
うにして、１１スポットの形跡が確かめられた。このう
ち、最も大きなスポットはＧＭ１のものと一致していた
。ほとんど同じ色強度を有する９個のスポットはＧＭ１
の移動率Ｒｆ値よりも高いＲｆ値を有していた。
うにして、１１スポットの形跡が確かめられた。このう
ち、最も大きなスポットはＧＭ１のものと一致していた
。ほとんど同じ色強度を有する９個のスポットはＧＭ１
の移動率Ｒｆ値よりも高いＲｆ値を有していた。
【００８３】適当な標準試料と直接比較することによっ
て確かめられた前記スポットは、脂質抽出物中に含まれ
ていたリン脂質類および他の不純物に相当した。
て確かめられた前記スポットは、脂質抽出物中に含まれ
ていたリン脂質類および他の不純物に相当した。
【００８４】なお、非常に弱い色強度でＧＭ１よりも低
いＲｆ値を有する１つのスポットはジシアルガングリオ
シドと同定された。
いＲｆ値を有する１つのスポットはジシアルガングリオ
シドと同定された。
【００８５】脂質抽出物のプレート上へのスポット量を
１２．５マイクログラムまで減らすことによって、先に
形跡が確認された殆どのスポットはほとんど区別できな
いようになった。
１２．５マイクログラムまで減らすことによって、先に
形跡が確認された殆どのスポットはほとんど区別できな
いようになった。
【００８６】脂質抽出物３０マイクログラムでのスポッ
トがＴＬＣ法において検出できること、その全量が当該
物質はなくＧＭ１がその出発原料の混合物の４３重量％
、即ち１３マイクログラムであることを考慮すれば、Ｔ
ＬＣ法による当該化合物の検出限界は約１マイクログラ
ム程度である。
トがＴＬＣ法において検出できること、その全量が当該
物質はなくＧＭ１がその出発原料の混合物の４３重量％
、即ち１３マイクログラムであることを考慮すれば、Ｔ
ＬＣ法による当該化合物の検出限界は約１マイクログラ
ム程度である。
【００８７】ＧＭ１中に残るα−サイクロデキストリン
の存在を評価するために、１０マイクログラムから０．
５マイクログラムまでの範囲に減量した複合化剤を第２
のプレート上に積層した。このプレートに溶媒を展開し
た後、スポットの形跡を試薬Ｂで確認した。α−サイク
ロデキストリンはスポット点に暗赤色スポットとして現
われた。採用された条件において、スポットの相対的な
色強度は、プレート上への積層量が最も少ない０．５マ
イクログラムに下げても検出可能であった。
の存在を評価するために、１０マイクログラムから０．
５マイクログラムまでの範囲に減量した複合化剤を第２
のプレート上に積層した。このプレートに溶媒を展開し
た後、スポットの形跡を試薬Ｂで確認した。α−サイク
ロデキストリンはスポット点に暗赤色スポットとして現
われた。採用された条件において、スポットの相対的な
色強度は、プレート上への積層量が最も少ない０．５マ
イクログラムに下げても検出可能であった。
【００８８】実施例１〜４に従って得られたＧＭ１のサ
ンプルについての薄層クロマトグラフィー分析は、単離
されたＧＭ１（２００マイクログラム）、出発原料の脂
質混合物（３００マイクログラム）およびサイクロデキ
ストリン（０．５マイクログラム）の順にプレート上へ
スポットすることによって行われた。
ンプルについての薄層クロマトグラフィー分析は、単離
されたＧＭ１（２００マイクログラム）、出発原料の脂
質混合物（３００マイクログラム）およびサイクロデキ
ストリン（０．５マイクログラム）の順にプレート上へ
スポットすることによって行われた。
【００８９】同一の手順が第２のプレート上に対しても
繰り返された。
繰り返された。
【００９０】上記説明した方法で得られた調製品で行わ
れた実験では、プレートを試薬Ａで噴霧したところ、Ｇ
Ｍ１のスポット以外のスポットはその形跡を確認できな
かった。
れた実験では、プレートを試薬Ａで噴霧したところ、Ｇ
Ｍ１のスポット以外のスポットはその形跡を確認できな
かった。
【００９１】試薬Ｂで噴霧したプレート上では、サイク
ロデキストリンの形跡はそのオリジン、すなわちスポッ
ト点でしばしば確認された。サイクロデキストリンのス
ポットの強度はいずれにしても標準試料（０．５マイク
ログラム）の強度よりもずっと低かった。
ロデキストリンの形跡はそのオリジン、すなわちスポッ
ト点でしばしば確認された。サイクロデキストリンのス
ポットの強度はいずれにしても標準試料（０．５マイク
ログラム）の強度よりもずっと低かった。
【００９２】実施例６
「イオン交換クロマトグラフィー（Ｍ．Ｉｗａｍｏｒｉ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５
２８ ２５７ １９７８）による未処理の脂質混合
物からのＧＭ１分離方法」 ６００ｇのセファデックス（登録商標）Ａ−２５樹脂を
ｐＨ７の緩衝液で平衡状態とした。緩衝液は、樹脂がリ
トマス試験紙で中性を示すまで繰り返し交換された。樹
脂は集められ、次いで溶出剤（クロロホルム：メタノー
ル：水＝３０：６０：８）で平衡状態とした。この工程
を達成するのに必要な溶出剤の量は９リットルであった
。
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５
２８ ２５７ １９７８）による未処理の脂質混合
物からのＧＭ１分離方法」 ６００ｇのセファデックス（登録商標）Ａ−２５樹脂を
ｐＨ７の緩衝液で平衡状態とした。緩衝液は、樹脂がリ
トマス試験紙で中性を示すまで繰り返し交換された。樹
脂は集められ、次いで溶出剤（クロロホルム：メタノー
ル：水＝３０：６０：８）で平衡状態とした。この工程
を達成するのに必要な溶出剤の量は９リットルであった
。
【００９３】樹脂をカラムに充填し、樹脂のベッドの高
さが一定となるまで溶出剤で溶出した。
さが一定となるまで溶出剤で溶出した。
【００９４】溶出剤中に懸濁させた５００ｍｌの樹脂に
は、その後、５リットルの溶剤（クロロホルム：メタノ
ール＝１：１）中に溶解した未処理の脂質抽出物（ＧＭ
１の滴定濃度：５０％）１８０ｇを含むスラリーを通し
た。流速は毎時８００ｍｌとした。その後、５リットル
と２０リットルの２つの画分を得た。カラムには、その
後、溶出剤（クロロホルム：メタノール：０．１Ｍ酢酸
ナトリウム水溶液＝３０：６０：８）を流した。
は、その後、５リットルの溶剤（クロロホルム：メタノ
ール＝１：１）中に溶解した未処理の脂質抽出物（ＧＭ
１の滴定濃度：５０％）１８０ｇを含むスラリーを通し
た。流速は毎時８００ｍｌとした。その後、５リットル
と２０リットルの２つの画分を得た。カラムには、その
後、溶出剤（クロロホルム：メタノール：０．１Ｍ酢酸
ナトリウム水溶液＝３０：６０：８）を流した。
【００９５】集められた溶出液４０リットルを減圧下で
蒸発させて小量にした。ここで、蒸発時には過剰の泡の
発生を避けることに注意を払わなければならない。その
後、限外濾過を行い残留の塩類を除去（脱塩）し、その
後再び濃縮し、最終的に３００ｍｌとした。アセトンを
水溶液に添加することによってＧＭ１を回収した。最後
に、滴定濃度９０％（シアル酸アッセイによって確定し
た）のＧＭ１を４５ｇ回収した。この滴定濃度９０％の
ＧＭ１は、出発原料の未処理の脂質抽出物中に含まれた
ＧＭ１の含有量５０％に相当するものである。
蒸発させて小量にした。ここで、蒸発時には過剰の泡の
発生を避けることに注意を払わなければならない。その
後、限外濾過を行い残留の塩類を除去（脱塩）し、その
後再び濃縮し、最終的に３００ｍｌとした。アセトンを
水溶液に添加することによってＧＭ１を回収した。最後
に、滴定濃度９０％（シアル酸アッセイによって確定し
た）のＧＭ１を４５ｇ回収した。この滴定濃度９０％の
ＧＭ１は、出発原料の未処理の脂質抽出物中に含まれた
ＧＭ１の含有量５０％に相当するものである。
【００９６】新しい分離サイクルを始める前に、ベッド
樹脂の上部を除去し、新しい同量の樹脂と換える必要が
ある。このベッド樹脂の上部は脂質抽出物の残った不純
物で汚染され、詰まりが発生するからである。
樹脂の上部を除去し、新しい同量の樹脂と換える必要が
ある。このベッド樹脂の上部は脂質抽出物の残った不純
物で汚染され、詰まりが発生するからである。
【００９７】このようにして、初期のカラム分離効率お
よび必要な流速をある範囲内で維持することが可能であ
った。
よび必要な流速をある範囲内で維持することが可能であ
った。
【００９８】実施例７
「純度の高い成分（Ｉ）を含む溶液からのＧＭ１とα−
サイクロデキストリンとの複合体の沈殿」１．５５５ｇ
のα−サイクロデキストリンを３２ｍｌの蒸留水に溶解
した（溶液Ａ）。この溶液Ａの一部３．２ｍｌ（０．１
６０ｍＭ）を分取した。２４．８ｍｇのＧＭ１（０．０
１５８ｍＭ）を４ｍｌの蒸留水に溶解した。これらの溶
液を混合し、４℃に１９時間置いた。沈殿物の回収は実
施例３に記述したように成し遂げられた。固形物は１０
ｍｇであった。１ ＨＮＭＲスペクトロスコピーはサイ
クロデキストリン／ＧＭ１のモル比５．１を与えた。
サイクロデキストリンとの複合体の沈殿」１．５５５ｇ
のα−サイクロデキストリンを３２ｍｌの蒸留水に溶解
した（溶液Ａ）。この溶液Ａの一部３．２ｍｌ（０．１
６０ｍＭ）を分取した。２４．８ｍｇのＧＭ１（０．０
１５８ｍＭ）を４ｍｌの蒸留水に溶解した。これらの溶
液を混合し、４℃に１９時間置いた。沈殿物の回収は実
施例３に記述したように成し遂げられた。固形物は１０
ｍｇであった。１ ＨＮＭＲスペクトロスコピーはサイ
クロデキストリン／ＧＭ１のモル比５．１を与えた。
【００９９】実施例８
「純度の高い成分（ＩＩ）を含む溶液からの複合体の沈
殿」 ４９．６ｍｇのＧＭ１（０．０３１６ｍＭ）を４ｍｌの
蒸留水に溶解し、これに実施例７の溶液Ａを３．２ｍｌ
添加した。混合した後、実施例７の手順を続行した。最
終的に回収された固形物は４５．２ｍｇであった。また
、α−サイクロデキストリン／ＧＭ１のモル比は４．５
であった（１ ＨＮＭＲスペクトロスコピーによる測定
）。
殿」 ４９．６ｍｇのＧＭ１（０．０３１６ｍＭ）を４ｍｌの
蒸留水に溶解し、これに実施例７の溶液Ａを３．２ｍｌ
添加した。混合した後、実施例７の手順を続行した。最
終的に回収された固形物は４５．２ｍｇであった。また
、α−サイクロデキストリン／ＧＭ１のモル比は４．５
であった（１ ＨＮＭＲスペクトロスコピーによる測定
）。
【０１００】実施例９
「純度の高い成分（ＩＩＩ）を含む溶液からの複合体の
沈殿」 １２．４ｍｇのＧＭ１（０．００７９ｍＭ）を４ｍｌの
蒸留水に溶解し、これに実施例７の溶液Ａを３．２ｍｌ
添加した。その後の手順も実施例７と同様にした。回収
された固形物は１０．５ｍｇであった。また、α−サイ
クロデキストリン／ＧＭ１のモル比は５．７であった。
沈殿」 １２．４ｍｇのＧＭ１（０．００７９ｍＭ）を４ｍｌの
蒸留水に溶解し、これに実施例７の溶液Ａを３．２ｍｌ
添加した。その後の手順も実施例７と同様にした。回収
された固形物は１０．５ｍｇであった。また、α−サイ
クロデキストリン／ＧＭ１のモル比は５．７であった。
【０１０１】実施例１０
「本発明方法におけるβ−サイクロデキストリンがα−
サイクロデキストリンによって与えられる同様あるいは
比較可能ないかなる結果をも提供しない点の実証」実施
例１で用いられたのと同じバッチの脂質抽出物４４０ｍ
ｇ（ＧＭ１の滴定濃度：５７ｗ／ｗ％、その抽出物中の
ＧＭ１含量は２５０ｍｇに相当する。）を３０ｍｌの蒸
留水に溶解し、これに１０００ｍｇのβ−サイクロデキ
ストリンを加え、次いで蒸留水で全量を６０ｍｌとした
。
サイクロデキストリンによって与えられる同様あるいは
比較可能ないかなる結果をも提供しない点の実証」実施
例１で用いられたのと同じバッチの脂質抽出物４４０ｍ
ｇ（ＧＭ１の滴定濃度：５７ｗ／ｗ％、その抽出物中の
ＧＭ１含量は２５０ｍｇに相当する。）を３０ｍｌの蒸
留水に溶解し、これに１０００ｍｇのβ−サイクロデキ
ストリンを加え、次いで蒸留水で全量を６０ｍｌとした
。
【０１０２】得られた溶液は完全に透明であった。この
溶液を限外濾過した。この限外濾過は実施例２で説明し
たように、水を加えて透析膜内溶液を一定に保つこと以
外は実施例１に記述したのと同条件で行った。
溶液を限外濾過した。この限外濾過は実施例２で説明し
たように、水を加えて透析膜内溶液を一定に保つこと以
外は実施例１に記述したのと同条件で行った。
【０１０３】各６０ｍｌの小分けの透過液を５つ集めた
。各透過液の画分および透析膜内溶液は実施例５におい
て説明したＴＬＣ法によって評価した。
。各透過液の画分および透析膜内溶液は実施例５におい
て説明したＴＬＣ法によって評価した。
【０１０４】第１の透過液画分は大量のβ−サイクロデ
キストリンを含んでいた。他の画分は無視できる量のβ
−サイクロデキストリンしか含んでいなかった。それよ
りも、透析膜内溶液は如何なるサイクロデキストリンも
含んでいなかった。
キストリンを含んでいた。他の画分は無視できる量のβ
−サイクロデキストリンしか含んでいなかった。それよ
りも、透析膜内溶液は如何なるサイクロデキストリンも
含んでいなかった。
【０１０５】第１の透過液画分からは非常に少量のＧＭ
１が検出された。
１が検出された。
【０１０６】シアル酸アッセイを透析膜内溶液について
行った。このシアル酸アッセイにより、透析膜内溶液中
に存在するＧＭ１量が２３５ｍｇであることが証明され
た。ここでのＧＭ１量は出発原料の脂質抽出物中の含有
量（２５０ｍｇ）に匹敵するものであった。
行った。このシアル酸アッセイにより、透析膜内溶液中
に存在するＧＭ１量が２３５ｍｇであることが証明され
た。ここでのＧＭ１量は出発原料の脂質抽出物中の含有
量（２５０ｍｇ）に匹敵するものであった。
【図１】ＧＭ１単独の場合とα−サイクロデキストリン
とＧＭ１とのモル比を１：１〜１：１０として溶質量を
増やしたＧＭ１とα−サイクロデキストリンとの混合溶
液の場合において、Ｄ２ Ｏ溶液中のＧＭ１の脂肪族基
部分とアセトアミド基のメチル部分に関して得られた１
Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）を示すグラフ
である。
とＧＭ１とのモル比を１：１〜１：１０として溶質量を
増やしたＧＭ１とα−サイクロデキストリンとの混合溶
液の場合において、Ｄ２ Ｏ溶液中のＧＭ１の脂肪族基
部分とアセトアミド基のメチル部分に関して得られた１
Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）を示すグラフ
である。
【図２】縦軸に説明したマイクロ秒で測定された遅延時
間後におけるＧＭ１とα−サイクロデキストリンとの複
合体を含む固形物（Ａ）とＧＭ１単独（Ｂ）の位相をず
らしたＣ．Ｐ．−ＭＡＳ Ｃ１３ＮＭＲ双極性のスペ
クトルを示すグラフである。
間後におけるＧＭ１とα−サイクロデキストリンとの複
合体を含む固形物（Ａ）とＧＭ１単独（Ｂ）の位相をず
らしたＣ．Ｐ．−ＭＡＳ Ｃ１３ＮＭＲ双極性のスペ
クトルを示すグラフである。
Claims (19)
- 【請求項１】 単独のガングリオシドとして、あるい
は他の結合したガングリオシド類よりも多いガングリオ
シドとしてモノシアロガングリオシドを含む脂質混合物
からのモノシアロガングリオシドの単離精製方法におい
て、 （ａ）前記脂質混合物とα−サイクロデキストリンとが
前もって溶解した水溶液について、５０，０００ダルト
ン以上の孔サイズを有する透析膜を介して限外濾過を行
う工程と、 （ｂ）１，０００ダルトンの孔サイズを有する透析膜を
介する限外濾過によって前工程で得た透過液を濃縮する
工程と、 （ｃ）前工程で得た濃縮された透過液から、モノシアロ
ガングリオシドとα−サイクロデキストリンとの複合体
を含む溶質を回収する工程と、 （ｄ）前記複合体からモノシアロガングリオシドを回収
する工程とを含むことを特徴とするモノシアロガングリ
オシドの単離精製方法。 - 【請求項２】 請求項１に従う方法において、出発原
料溶液中の前記脂質混合物の濃度が０．５％と３．５％
との間に含まれ、α−サイクロデキストリンが前記混合
物の少なくとも２倍量であることを特徴とするモノシア
ロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項３】 請求項１に従う方法において、前記（
ａ）工程の限外濾過の前記膜の孔サイズは好ましくは１
００，０００ダルトンであることを特徴とするモノシア
ロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項４】 請求項１に従う方法において、前記限
外濾過工程は透析膜内溶液を一定量に維持することによ
って行われることを特徴とするモノシアロガングリオシ
ドの単離精製方法。 - 【請求項５】 請求項４に従う方法において、前記透
析膜内溶液は水中に２ｗ／ｖ％のα−サイクロデキスト
リンを添加することによって一定量に維持されることを
特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項６】 請求項４に従う方法において、前記透
析膜内溶液は水の添加によって一定量に維持されること
を特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法
。 - 【請求項７】 請求項１に従う方法において、前記透
過液が前記透析膜内溶液の少なくとも２倍量であること
を特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法
。 - 【請求項８】 請求項７に従う方法において、前記透
過液の最終体積が前記透析膜内溶液の５倍であることを
特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項９】 請求項１に従う方法において、前記透
過液の濃縮は対応する体積が出発原料液の約１／１０に
減るまで行われることを特徴とするモノシアロガングリ
オシドの単離精製方法。 - 【請求項１０】 請求項１に従う方法において、前記
濃縮された透過液からのモノシアロガングリオシドとα
−サイクロデキストリンとの複合体を含む溶質の回収は
凍結融解かアセトン沈殿のいずれかによるか、あるいは
４℃に溶液を保持することによってなされることを特徴
とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１１】 請求項１０に従う方法において、前
記溶質の回収はアセトン沈殿によりなされ、透過液の１
０倍量の溶剤を加えることを特徴とするモノシアロガン
グリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１２】 請求項１０に従う方法において、前
記溶質の回収は４℃での沈殿によってなされ、溶液中の
モノシアロガングリオシドの濃度（ｗ／ｖ）が少なくと
も０．１ｗ／ｖ％であることを特徴とするモノシアロガ
ングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１３】 請求項１０に従う方法において、前
記溶質が凍結融解によって前記透過液から回収されるこ
とを特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方
法。 - 【請求項１４】 請求項１に従う方法において、前記
モノシアロガングリオシドは、メタノールあるいはメタ
ノールと他の有機溶媒との混合溶媒による抽出によって
前記モノシアロガングリオシドとα−サイクロデキスト
リンとの複合体から回収されることを特徴とするモノシ
アロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１５】 請求項１４に従う方法において、抽
出溶媒体積と溶質重量との比は少なくとも５であること
を特徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法
。 - 【請求項１６】 請求項１４に従う方法において、各
抽出工程は少なくとも３回繰り返し行われることを特徴
とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１７】 請求項１４に従う方法において、メ
タノールと他の有機溶媒との混合溶媒はクロロホルム／
メタノール（２：１）であることを特徴とするモノシア
ロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１８】 請求項１４に従う方法において、前
記モノシアロガングリオシドは、モノシアロガングリオ
シドとα−サイクロデキストリンとの複合体の固形物を
まずメタノールで抽出し、溶媒を乾燥して除去し、残渣
をクロロホルム／メタノール（２：１）の混合溶媒で抽
出することによって前記複合体から回収されることを特
徴とするモノシアロガングリオシドの単離精製方法。 - 【請求項１９】 モノシアロガングリオシドに対する
α−サイクロデキストリンのモル比が４．０と６．０と
の間にあることを特徴とするα−サイクロデキストリン
とモノシアロガングリオシドとの複合化合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT20942A/90 | 1990-07-13 | ||
| IT02094290A IT1243340B (it) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04230398A true JPH04230398A (ja) | 1992-08-19 |
Family
ID=11174397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3174194A Pending JPH04230398A (ja) | 1990-07-13 | 1991-07-15 | α−サイクロデキストリンとの複合化による出発原料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離精製方法および関連の中間体化合物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5108613A (ja) |
| EP (1) | EP0469352B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04230398A (ja) |
| AT (1) | ATE96804T1 (ja) |
| DE (1) | DE69100588T2 (ja) |
| DK (1) | DK0469352T3 (ja) |
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| IT (1) | IT1243340B (ja) |
| PT (1) | PT98270A (ja) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US4868291A (en) * | 1987-08-20 | 1989-09-19 | Bristol-Myers Company | 4'-deshydroxyepipodophyllotoxin glucosides: synthesis and use |
| IT1223408B (it) * | 1987-12-09 | 1990-09-19 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside |
| CH677494A5 (ja) * | 1988-10-28 | 1991-05-31 | Nestle Sa |
-
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- 1990-07-13 IT IT02094290A patent/IT1243340B/it active IP Right Grant
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1991
- 1991-07-10 AT AT91111469T patent/ATE96804T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1991-07-10 DE DE91111469T patent/DE69100588T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1991-07-15 US US07/729,728 patent/US5108613A/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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| IT9020942A0 (it) | 1990-07-13 |
| DE69100588T2 (de) | 1994-03-31 |
| EP0469352B1 (en) | 1993-11-03 |
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| IT1243340B (it) | 1994-06-10 |
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