IT9020942A1 - Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio - Google Patents
Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio Download PDFInfo
- Publication number
- IT9020942A1 IT9020942A1 IT020942A IT2094290A IT9020942A1 IT 9020942 A1 IT9020942 A1 IT 9020942A1 IT 020942 A IT020942 A IT 020942A IT 2094290 A IT2094290 A IT 2094290A IT 9020942 A1 IT9020942 A1 IT 9020942A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- monosialoganglioside
- process according
- equal
- cyclodextrin
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 24
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 16
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 14
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 claims description 13
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 claims description 13
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 3
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- -1 cyclic oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
- C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof
- C08B37/0015—Inclusion compounds, i.e. host-guest compounds, e.g. polyrotaxanes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Description
Descrizione dell’invenzione industriale
DESCRIZIONE
La presente invenzione concerne un metodo per ottenere il monosialoganglioside o GMI (L. Swennerholm, J. Neurochem. 613 1963), da una miscela di lipidi estratta da tessuti od organi del sistema nervoso, la quale è caratterizzata dal fatto di contenere detto ganglioside in quantità prevalente rispetto agli altri glicosfingolipidi della stessa famiglia (GD, GT, GQ, etc.) a seguito di precedenti trattamenti di cui è stata fatta oggetto la miscela medesima, oppure l’omogenato dell’organo da cui essa proviene. Da molti anni i sialogangliosidi, sia singolarmente che in miscela hanno trovato svariate ed importanti applicazioni terapeutiche ed in anni recenti l’interesse si è appuntato sul monosialoganglioside.
Tornando ora ai trattamenti dei quali più sopra si è fatta menzione, va nel merito osservato che essi sono noti nella tecnica del ramo e si realizzano essenzialmente attraverso le seguenti metodiche alternative:
- enzimolisi con sialidasi, che nel caso particolare dell’omogenato di cervello bovino può essere effettuato sfruttando l’enzima che è già presente nell'organo.
- idrolisi con acidi diluiti.
Esempi applicativi di ciascuno di questi metodi vengono descritti nella domanda di brevetto francese No. 2585707 e nella domanda di brevetto europeo No. 88120281.6.
Giova qui osservare il fatto che nelle soluzioni acquose contenenti gangliosidi si ha la formazione di aggregati micellari, aventi peso molecolare di diverse centinaia di Kilodaltons (D. Dammock, Biochem. J. 88 373 1963), i quali impediscono l'impiego dell’ultrafiltrazione e della dialisi, per separare i gangliosidi dalle altre impurezze che sono contenute nell'estratto grezzo. I metodi che vengono attualmente usati per isolare il monosialoganglioside da una miscela lipidica grezza si basano essenzialmente sul frazionamento dei lipidi per cromatografia a scambio ionico, utilizzando come eluente una miscela di acqua con diversi solventi organici.
Detti metodi risultano onerosi per diversi aspetti. In primo luogo, è necessario un notevole impiego di tempo per compiere la separazione cromatografica. Inoltre, la variabilità riscontrabile da un lotto all’altro della miscela lipidica grezza che viene purificata in colonna, può influenzare negativamente i risultati qualitativi della separazione.
Altri importanti inconvenienti dei suddetti metodi risiedono nell’impiego di miscele di diversi solventi organici come eluenti della colonna e nel fatto di dover provvedere, al termine di ogni lavorazione, al parziale rinnovo del letto della resina.
Si rimanda per maggiori dettagli all’esempio 4, che riguarda un procedimento di separazione cromatografica su colonna e che viene riportato a titolo di confronto con il metodo oggetto della presente invenzione.
Scopo principale della presente invenzione è quello di fornire un metodo per l’isolamento e la purificazione di monosialoganglioside da miscele lipidiche che lo contengono che sia industrialmente vantaggioso.
II metodo di purificazione che costituisce l'oggetto principale della presente invenzione, si caratterizza per il fatto che il monosialoganglioside viene ottenuto sottoponendo a ultrafiltrazione una soluzione contenente la miscela lipidica, di cui sopra si è detto , e alfa-ciclodestrina in determinati rapporti ponderali. Le alfa-ciclodestrine, come noto , sono oligosaccaridi ciclici costituiti da 6 unità ripetenti glucopiranosidiche. Secondo l'invenzione si è quindi trovato che aggiungendo a una soluzione contenente una miscela lipidica con le caratteristiche sopra menzionate, una quantità di alfa ciclodestrina in determinati rapporti ponderali con il soluto, ha luogo la rottura dei predetti aggregati micellari e di conseguenza il monosialoganglioside può passare attraverso i pori della membrana.
Detta membrana può quindi venir opportunamente scelta in modo tale che gli altri lipidi non dializzino nelle medesime condizioni.
Il metodo per ottenere il GM1 che viene qui di seguito descritto, viene realizzato sottoponendo a ultrafiltrazione su membrana, avente porosità uguale o maggiore di 50.000 Daltons e preferibilmente uguale a 100.000 Daltons, una soluzione contenente l'estratto lipidico a concentrazione compresa tra 0,5 e 4% p/v ed alfa-ciclodestrina, quest’ultima in rapporto ponderale almeno doppio rispetto alla quantità di estratto.
Detta ultrafiltrazione viene eseguita mantenendo costante il volume della soluzione in dialisi, o retenato, mediante aggiunta di una soluzione 2% p/v di alfa-ciclodestrina. Alternativamente, può essere impiegata anche acqua tal quale al posto della soluzione di ciclodestrina. Occorre tuttavia osservare che i recuperi di GM1 risultano inferiori che nel caso precedente anche se comunque confrontabili con le rese ottenibili con gli usuali metodi cromatografici.
Il volume del liquido dializzato, o permeato, deve essere uguale ad almeno 2 o 3 volte quello del retenato. Preferibilmente, il volume raccolto è uguale a 5 volte quello della soluzione di partenza.
Al termine della ultrafiltrazione, il permeato viene concentrato per ultrafiltrazione impiegando una membrana avente cut-off di 1.000 Daltons, fino a quando il volume della soluzione non si sia ridotto ad almeno 1/10 di quello iniziale.
Si procede quindi alla scomplessazione del monosialoganglioside dal complesso con alfa-ciclodestrina ed al suo recupero mediante uno dei seguenti, alternativi procedimenti:
- liofilizzazione del permeato, o precipitazione del soluto mediante aggiunta di acetone, ed estrazione del solido mediante una soluzione organica cloroformio/metanolo in rapporto di almeno 2:1 v/v. La quantità del solvente deve essere di almeno 5 volte quella del peso del residuo secco.
- estrazione con metanolo, in quantità in volume pari almeno a 5 volte il peso del solido.
Occorre qui osservare che con entrambi i suddetti metodi è possibile separare allo stato solido l'agente complessante, che quindi può venir direttamente impiegato in un nuovo ciclo di lavorazione.
Giova inoltre menzionare il fatto che risulta pure possibile, come verrà illustrato negli esempi , usare in successione, in un medesimo procedimento di scomplessazione, entrambi i suddetti metodi.
Per quanto concerne il secondo oggetto della presente invenzione, vale a dire il complesso tra monosialoganglioside e alfa-ciclodestrina, va rilevato che la sua formazione in soluzione è dimostrata dal fatto che alcuni segnali dello spettro NMR del GM1, in presenza di quantità crescenti di ciclodestrina, si spostano verso campi magnetici inferiori. Detti spettri sono riportati in fig. 1.
Va precisato che si tratta di spettri 'HNMR relativi a soluzioni in D O di GM1 a concentrazione 1 mg/ml, alle quali vengono aggiunte quantità crescenti di alfa-ciclodestrina come specificato nella Tabella 1.
Per quanto riguarda lo spostamento anzidetto relativo ad alcuni segnali dello spettro, dalla fig. 1 si nota che il picco corrispondente ai gruppi -CH -alifatici che costituiscono le catene alchiliche della porzione ceramidica del GM1, inizialmente a 1,25 ppm (grafico A di fig. 1) si scompone poi in diversi componenti alcuni dei quali presentano il massimo corrispondente a ppm inferiori.
Queste alterazioni che hanno luogo negli spettri NMR delle sostanze in presenza di ciclodestrine, in base a quanto noto nella tecnica del ramo (ad es. J. Szeitli "Cyclodextrin Technology" Kluver Academic Publishers 1988, in particolare le pagine 130-134), sono dovute alla formazione di complessi con detti oligosaccaridi ciclici.
Una ulteriore dimostrazione indiretta dell’avvenuta complessazione risiede nel fatto che il GM1 in soluzione acquosa non permea attraverso membrano con cut-off di 100.000 daltons, a differenza di quanto avviene in presenza di ciclodestrine.
Tornando ora agli spettri di fig. 1, deve essere menzionato il fatto che lo spostamento anzidetto relativo ad alcuni segnali risulta limitato all’intervallo di rapporti molari tra ciclodestrina e monosialoganglioside compreso tra 1:1 e 10:1, in quanto aggiunte di agente complessante in quantità superiore al suddetto rapporto non provocano modifiche sostanziali dello spettro.
Il fatto che la stechiometria del complesso possa oscillare entro i limiti suddetti, trova d’altronde una sua giustificazione di natura teorica nelle eterogeneità delle catene a! i fatiche del radicale ceramidico le quali, come sopra sì è osservato, costituiscono la porzione della molecola del GM1 coinvolta nel complesso con ciclodestrine.
TABELLA I
* Il peso molecolare del GMl che è stato preso in considerazione per il calcolo è quello del corrispondente sale sodico (p.m. 1570,74)
ESEMPIO 1
Isolamento del monosialoganglioside da un'estratto lipidico in cui è contenuto (titolo in GM1:57%).
880 mg di estratto lipidico grezzo da cervello bovino, in precedenza trattato in maniera da convertire i gangliosidi inizialmente presenti a GMI, e contenente 500 mg di detta sostanza (determinata attraverso il contenuto di acido sialico secondo L. Svennerholm, Biochim. Biophys. Acta 24 604 1957, attribuendo allo standard di riferimento un contenuto di acido sialico di 20% secondo R. Kuhn, Chem. Ber. 86 866 1963) , vengono sciolti in 80 mi di acqua. A parte si prepara una soluzione 10% p/v di alfa-ciclodestrina, nel medesimo solvente.
20 ml di quest'ultima soluzione, corrispondenti a una quantità di ciclodestrine doppia di quella dell'estratto, vengono aggiunti alla precedente, portando poi il volume a 100 mi.
50 ml della soluzione così ottenuta vengono caricati in apparecchiatura per ultrafiltrazione equipaggiata con membrana avente cut-off di 100.000 Daltons.
Si effettua la dialisi effettuando rabbocchi del retenato con una soluzione 2% p/v di ciclodestrina, in maniera da mantenere costante il volume della soluzione.Si effettuano complessivamente n. 5 cicli di dialisi raccogliendo ogni volto 50 mi di permeato.
La soluzione raccolta viene poi concentrata mediante ultrafiltrazione utilizzando una membrana con cut-off di 1000 Daltons, fino al volume di 20 mi.
Si liofilizza ottenendo un solido del peso di 1050 mg contenente una quantità di monosialoganglioside, determinata con il metodo di cui sopra si è detto pari a 153 mg.
Si procede quindi al recupero del GMI dal complesso con alfa-ciclodestrina estraendo il residuo secco con 10 mi di una soluzione cloroformio/metanolo 2:1 (v/v).
L'estrazione viene ripetuta per 5 volte in totale.
Il solvente organico viene alla fine evaporato a pressione ridotta ottenendo 138 mg di residuo secco di monosialoganglioside, pari al 55% rispetto al teorico.
ESEMPIO 2
Esempio di ultrafiltrazione della soluzione contenente la miscela lipidica e alfa-ciclodestrina impiegando acqua per mantenere costante il volume del retenato.
La seconda aliquota di 50 mi della soluzione iniziale contenente la miscela lipidica ed alfa-ciclodestrina, di cui all’esempio 1 viene sottoposta ad ultrafiltrazione nelle medesime condizioni descritte al suddetto esempio, con l’unica differenza che i rabbocchi nel retenato vengono eseguiti con acqua distillata.
Il permeato, dopo concentrazione, viene liofilizzato ottenendo un residuo secco di 1070 mg con un contenuto di monosialoganglioside pari a mg 128. Il solido viene quindi estratto con cloroformio/metanolo 2:1 ed il solvente evaporato a pressione ridotta.
Tutte le suddette operazioni, dalla concentrazione del permeato al trattamento con cloroformio/metanolo, vengono eseguite secondo le modalità di cui al precedente esempio .
Vengono alla fine recuperati mg 113 di monosialoganglioside, pari al 45% del teorico.
ESEMPIO 3
Controllo della purezza delle preparazioni di GMI ottenute secondo gli esempi 1 e 2.
La purezza viene determinata per saggio limite su strato sottile, mediante confronto diretto delle intensità delle macchie di quantità note di impurezze, e collateralmente mediante il titolo di acido sialico di cui si è detto al precedente esempio 1.
E' stata preliminarmente accertata, in base agli esperimenti che vengono qui di seguito riferiti, la sensibilità del metodo che è staro scelto per determinare per saggio limite le impurezze eventuali del monosialoganglioside.
Le analisi sono state eseguite mediante cromatografia su lastre di gel di silice (HPTLC) impiegando come solvente di eluizione una miscela composta da cloroformio/metanolo/ 0,3% CaCl2 in H2O nei rapporti 60:35:8.
Dopo lo sviluppo in camera satura, le lastre vengono asciugate e spruzzate con uno dei seguenti reattivi:
A- Reattivo di Ehrlich
B- Soluzione di anisaldeide, ottenuta sciogliendo 1 mi di anisaldeide in acido acetico glaciale, portando al volume di 100 mi con il medesimo solvente ed aggiungendo alla fine 2 mi di acido solforico 86% p/v.
Le lastre vengono quindi essiccate in stufa a 10°C per 10 minuti.
In una prima serie di esperimenti, su una lastra vengono seminate quantità descrescenti della miscela lipidica di partenza pari rispettivamente a 150, 50, 30 e 12,5 mcg. La lastra, dopo lo sviluppo in camera umida, viene spruzzata con il reattivo A. Vengono così evidenziate 11 macchie complessivamente, di cui la più evidente con Rf 0,25 , corrispondente a quella del GMI. Si osserva che 9 macchie hanno Rf maggiore e presentano tutte, all’incirca, la medesima intensità.
Dette macchie corrispondono ai fosfolipidi, ed altre impurezze minori, che accompagnano il GMI.
Si osserva infine una leggera macchia con Rf inferiore a 0,25 che corrisponde al disialoganglioside.
La lastra evidenzia inoltre che diminuendo la quantità di semina a 12,5 mcg., diverse macchie risultando al limite della rivelabilità.
In base a questo fatto e tenendo presente che nella semina di 30 mcg il 43% della quantità depositata sullo strato sottile, vale a dire 13 mcg, è dovuto alle 10 impurezze di cui più sopra si è detto, si conclude che il limite certo di rilevabilità delle stesse è di 1 mcg.
Allo scopo di valutare l’eventuale presenza di ciclodestrina nel prodotto finale, su una seconda lastra vengono seminate quantità descrescenti di ciclodestrina, da 10 a 0,5 mcg. Si sviluppa la lastra e le macchie vengono evidenziate con il reattivo B.
La ciclodestrina appare come una macchia sul punto di semina. Detta macchia risulta chiaramente identificabile anche alla quantità più bassa seminata, vale a dire 0,5 mcg.
Campioni di GMI ottenuti secondo gli esempi 1 e 2 vengono seminati sulla lastra in quantità pari a 200 mcg. Sulla stessa lastra vengono seminati 30 mcg dell’estratto lipidico di partenza e 0,5 mcg di ciclodestrina.
Le medesime semine vengono ripetute anche su una seconda lastra.
Dopo lo sviluppo con l’eluente di cui sopra si è detto le lastre vengono spruzzate, rispettivamente, con il reattivo A e B.
Sulla lastra trattata con il reattivo A, in corrispondenza della semina dei due campioni, non si evidenza altra macchia al di fuori di quella del GM1.
Sulla seconda lastra, appare invece una macchia in corrispondenza della ciclodestrina, la cui intensità è comunque inferiore a quella del campione di riferimento.
Il titolo di entrambe le preparazioni di monosialoganglioside, determinato secondo il metodo di cui si è detto nell'esempio 1 , risulta superiore al 95%.
ESEMPIO 4
Procedimento di separazione per cromatografia a scambio ionico del GM1 da un estratto lipidico grezzo (M. Iwamori et alii, Biochim. Biophys. Acta 528 257 1978).
600 g di resina Sephadex A-25 vengono equilibrati in una soluzione tampone a pH neutro, con ripetuti cambi del tampone, fino alla neutralizzazione completa della resina scambiatrice. Si recupera la resina che viene successivamente equilibrata con il solvente di eluizione cloroformio:metanolo:acqua 30:60:8 (quantità richiesta: 9 litri).
La resina viene quindi caricata in colonna e si eluisce con il suddetto solvente fino a quando il letto non raggiunge un'altezza costante.
A questo punto si aggiunge una sospensione contenente 180 g di estratto lipidico grezzo (titolo in GMl:50%) sciolto in 5 litri di una miscela cloroformio:metanolo 1:1 , cui vengono aggiunti 500 mi della sospensione della resina nel solvente di eluizione.
Si regola il flusso a 800 ml/h, raccogliendo due frazioni successive rispettivamente di 5 e 20 litri. A questo punto si cambia l'eluente della colonna, che viene sostituito con una miscela cloroformio:metanolo:acetato sodico 0,1M 30:60:8. Si raccolgono 40 litri di eluato, nei quali si trova il GM1. La soluzione viene quindi concentrata a piccolo volume, badando di evitare l’eccessiva formazione di schiuma. A questo punto la soluzione viene ultrafiltrata per allontanare i sali residui e quindi concentrata. Si recupera il monosialoganglioside mediante precipitazione con acetone. Si recuperano 45 g di GM1 pari a 50%, di quello inizialmente contenuto nell’estratto grezzo, con titolo uguale a 90%.
Prima di iniziare un nuovo ciclo, si provvede a sostituire una aliquota della parte superiore del letto di resina, che rimane impregnata delle impurezze contenute nell’estratto lipidico, allo scopo di ripristinare l’efficienza della colonna e di mantenere il flusso di eluizione iniziale.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per isolare e purificare monosialoganglioside da miscele lipidiche, caratterizzato dal fatto di venir realizzato attraverso le seguenti fasi: a. dissoluzione della miscela lipidica in acqua a concentrazioni comprese tra 0,5 e 4% p/v e successiva aggiunta di alfa-ciclodestrina in quantità ponderale almeno doppia rispetto a quella della miscela lipidica. b. ultrafiltrazione della soluzione ottenuta attraverso una membrana avente cut-off uguale o maggiore di 50.000 Daltons, raccogliendo un volume di permeato uguale ad almeno 2-3 volte quello del retenato. c. concentrazione del dializzato mediante ultrafiltrazione attraverso una membrana avente cut-off di 1.000 Daltons, fino a ridurre il volume della soluzione ad almeno 1/10 di quello iniziale. d. recupero del soluto dalla soluzione concentrata del retenato. e. recupero del monosialoganglioside dal soluto isolato al passaggio precedente.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la concentrazione della miscela lipidica in acqua è preferibilmente 1% p/v.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la ciclodestrina viene preferibilmente sciolta in acqua a concentrazione 10% p/v e quindi aggiunta alla soluzione della miscela lipidica.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che la membrana di detta ultrafiltrazione di cui alla fase (b) ha preferibilmente un cut-off uguale a 100.000 Daltons.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il volume totale del permeato è preferibilmente uguale a 5 volte quello del retenato.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che il soluto viene recuperato mediante liofilizzazione del retenato oppure mediante precipitazione dalla medesima soluzione per aggiunta di acetone.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che il monosialoganglioside viene recuperato dal soluto di cui alla rivendicazione 6 e 1 mediante estrazione con una miscela organica contenente cloroformio/metanolo in rapporto di almeno 2:1 v/v.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione precedente caratterizzato dal fatto che la quantità di miscela organica che viene impiegata deve essere uguale ad almeno 5 volte il peso del residuo che viene trattato.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il monosialoganglioside può venire recuperato dal soluto di cui alla rivendicazione 1 mediante estrazione con metanolo in quantità in volume pari ad almeno 5 volte il peso del residuo secco.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il recupero del monosialoganglioside viene realizzato combinando l’estrazione con cloroformio/metanolo di cui alla rivendicazione 6 con l’estrazione con metanolo di cui alla rivendicazione precedente.
- 11. Composto intermedio costituito dal complesso tra monosialoganglioside e alfa-ciclodestrina, che è caratterizzato dal fatto di contenere da 1 a 10 moli di ciclodestrina per mole di monosialoganglioside.
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02094290A IT1243340B (it) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio |
| DE91111469T DE69100588T2 (de) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Monosialogangliosid durch Komplexierung mit Alpha-Cyclodextrin und Zwischenprodukte. |
| PT98270A PT98270A (pt) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Metodo para o isolamento e purificacao de monosialogangliosido a partir de uma mistura lipidica de partida por complexacao com alfa-ciclodextrina e processo para a preparacao de um composto intermediario relacionado |
| ES91111469T ES2060257T3 (es) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Procedimiento de aislamiento y purificacion de monosialogangliosido a partir de una mezcla lipidica de partida mediante complejificacion con alfa-ciclodextrina y compuesto intermedio relacionado. |
| EP91111469A EP0469352B1 (en) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Process for the isolation and purification of monosialoganglioside from a starting lipidic mixture by complexation with alpha-cyclodextrin and related intermediate compound |
| DK91111469.2T DK0469352T3 (da) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Fremgangsmåde til isolering og oprensning af monosialgangliosid fra en udgangslipidblanding ved kompleksering med alfa-cyclodextrin og beslægtet mellemforbindelse |
| AT91111469T ATE96804T1 (de) | 1990-07-13 | 1991-07-10 | Verfahren zur abtrennung und reinigung von monosialogangliosid durch komplexierung mit alpha-cyclodextrin und zwischenprodukte. |
| US07/729,728 US5108613A (en) | 1990-07-13 | 1991-07-15 | Process for the isolation and purification of monosialoganglioside from a starting lipidic mixture by complexation with alfa-cyclodextrin and related intermediate compound |
| JP3174194A JPH04230398A (ja) | 1990-07-13 | 1991-07-15 | α−サイクロデキストリンとの複合化による出発原料の脂質混合物からのモノシアロガングリオシドの単離精製方法および関連の中間体化合物 |
| US07/834,454 US5152998A (en) | 1990-07-13 | 1992-02-12 | Process for the isolation and purification of monosialoganglioside from a starting lipidic mixture by complexation with alpha-cyclodextrin and related intermediate compound |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02094290A IT1243340B (it) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT9020942A0 IT9020942A0 (it) | 1990-07-13 |
| IT9020942A1 true IT9020942A1 (it) | 1992-01-13 |
| IT1243340B IT1243340B (it) | 1994-06-10 |
Family
ID=11174397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT02094290A IT1243340B (it) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5108613A (it) |
| EP (1) | EP0469352B1 (it) |
| JP (1) | JPH04230398A (it) |
| AT (1) | ATE96804T1 (it) |
| DE (1) | DE69100588T2 (it) |
| DK (1) | DK0469352T3 (it) |
| ES (1) | ES2060257T3 (it) |
| IT (1) | IT1243340B (it) |
| PT (1) | PT98270A (it) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1747785A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-01-31 | Istituto Clinico Humanitas | Cyclodextrins for blood detoxification |
| US7943750B2 (en) * | 2007-06-18 | 2011-05-17 | Laboratoire Medidom S.A. | Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use |
| CN103087120B (zh) * | 2013-02-26 | 2015-12-02 | 北京四环制药有限公司 | 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS615024A (ja) * | 1984-06-18 | 1986-01-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 生薬製剤の製造法 |
| US4868291A (en) * | 1987-08-20 | 1989-09-19 | Bristol-Myers Company | 4'-deshydroxyepipodophyllotoxin glucosides: synthesis and use |
| IT1223408B (it) * | 1987-12-09 | 1990-09-19 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside |
| CH677494A5 (it) * | 1988-10-28 | 1991-05-31 | Nestle Sa |
-
1990
- 1990-07-13 IT IT02094290A patent/IT1243340B/it active IP Right Grant
-
1991
- 1991-07-10 ES ES91111469T patent/ES2060257T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 EP EP91111469A patent/EP0469352B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 DE DE91111469T patent/DE69100588T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-10 AT AT91111469T patent/ATE96804T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-10 DK DK91111469.2T patent/DK0469352T3/da active
- 1991-07-10 PT PT98270A patent/PT98270A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-07-15 JP JP3174194A patent/JPH04230398A/ja active Pending
- 1991-07-15 US US07/729,728 patent/US5108613A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0469352B1 (en) | 1993-11-03 |
| EP0469352A1 (en) | 1992-02-05 |
| DK0469352T3 (da) | 1994-01-03 |
| DE69100588T2 (de) | 1994-03-31 |
| IT1243340B (it) | 1994-06-10 |
| IT9020942A0 (it) | 1990-07-13 |
| ATE96804T1 (de) | 1993-11-15 |
| PT98270A (pt) | 1992-05-29 |
| ES2060257T3 (es) | 1994-11-16 |
| US5108613A (en) | 1992-04-28 |
| DE69100588D1 (de) | 1993-12-09 |
| JPH04230398A (ja) | 1992-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Finne | Structure of the O-glycosidically linked carbohydrate units of rat brain glycoproteins | |
| Svennerholm et al. | Sphingolipids of human skeletal muscle | |
| JP2510177B2 (ja) | 抗血栓、線維素溶解、抗炎症活性を有する解重合硫酸ヘキソサミノグルカン、それらの製造方法および関連する医薬組成物 | |
| Christiansen et al. | Microvillus membrane vesicles from pig small intestine purity and lipid composition | |
| HUT59828A (en) | Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis | |
| US10870711B2 (en) | Process for the preparation of polysaccharides | |
| MXPA02003945A (es) | Nuevos oligosacaridos, preparacion de los mismos y composiciones farmaceuticas que los contienen. | |
| Svennerholm | Isolation of gangliosides | |
| Nudelman et al. | Plasmalopsychosine, a novel plasmal (fatty aldehyde) conjugate of psychosine with cyclic acetal linkage. Isolation and characterization from human brain white matter. | |
| IT9020942A1 (it) | Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio | |
| Puro | Isolation of bovine kidney gangliosides | |
| CN110592165B (zh) | 燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析 | |
| Sztaricskai et al. | Structural studies of ristocetin A (ristomycin A): carbohydrate-aglycone linkages | |
| Hansson et al. | Characterization of glycosphingolipid mixtures with up to ten sugars by gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry as permethylated oligosaccharides and ceramides released by ceramide glycanase | |
| Graham et al. | The binding of sterols in cellular membranes. | |
| SEKINE et al. | Ganglioside composition of chromaffin granule membrane in bovine adrenal medulla | |
| Javaid et al. | Preparation and properties of concanavalin A-binding glycopeptides derived from rat brain glycoproteins | |
| TADANO‐ARITOMI et al. | Isolation and structural characterization of a mono‐sulfated isoglobotetraosylceramide, the first sulfoglycosphingolipid of the isoglobo‐series, from rat kidney | |
| Gramshaw | Phenolic constituents of beer and brewing materials III. Simple anthocyanogens from beer | |
| Petrušová et al. | A nitro sugar derivative route to 2-thioepisophorose and 2-thiosophorose and their remarkable facile epimerization | |
| JP2003129083A (ja) | 糖脂質の分離方法 | |
| Madson | Mass spectrometry: techniques for structural characterization of glycans | |
| US5152998A (en) | Process for the isolation and purification of monosialoganglioside from a starting lipidic mixture by complexation with alpha-cyclodextrin and related intermediate compound | |
| Aly et al. | Synthesis of globo-and isoglobotriosides bearing a cinnamoylphenyl tag as novel electrophilic thiol-specific carbohydrate reagents | |
| Gibbons | The determination of glycolloyl in substances containing neuraminic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19940727 |