PT98270A - Metodo para o isolamento e purificacao de monosialogangliosido a partir de uma mistura lipidica de partida por complexacao com alfa-ciclodextrina e processo para a preparacao de um composto intermediario relacionado - Google Patents

Description

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Ο presente invento refere-se a um método para a obtenção de monogang lios ido, ou GM1 de acordo com a nomenclatura adopatada por L. Svennerholm, J. Neurochem 10. 613 1963, a partir de uma mistura de lipidos anteriormente extraida de tecidos ou orgãos do sistema nervoso, mistura lipídica essa que é caracteri-zada pelo facto de GM1 ser o único gangliosido a estar contido, ou de um modo diferente estando presente numa quantidade prevalecente em relação a outros glicosfingolípidos da família (GD, GT, GQ, etc.).

Esta condição pode ser conseguida de várias maneiras conhecidas, por exemplo efectuando tratamentos químicos ou enzimáticos quer na mesma mistura lipídica referida anteriormente, ou mesmo no produto homogeneizado de orgão de partida de que a referida mistura deriva.

Desde há muitos anos se verificou que os gangliosidos, quer como substancias singulares quer como as misturas correspondentes, têm várias aplicações terapêuticas importantes e nos anos mais recentes o interesse foi focado particularmente sobre o monosialogangliosido.

Voltando agora aos tratamentos que foram aqui anteriormente mencionados, eles podem ser implementados no extracto crú através dos métodos alternativos que se seguem: - Enzimólise com sialidase. Deve aqui referir-se que o tratamento é também aplicável ao produto homogeneizado de orgãos de partida, com a vantagem do enzima já estar presente no próprio porduto homogeneizado não necessitando assim de ser adicionado. Além disso, no último caso, o extracto lipídico crú enriquecido com GM1 pode então ser recuperado por métodos conhecidos.

Hidrólise por meio de ácidos minerais diluídos.

Exemplos apropriados de cada um dos processos anterior-mente referidos são apresentados no Requerimento da Patente Europeia No. 88 120 281,6 e no Requerimento da Patente Francesa No. 258 707 respectivamente.

Voltando agora aos gangliosidos, é aqui digno de nota que nas soluções aquosas correspondentes estes compostos estão presentes em agregados de micelas, tendo um peso molecular de várias centenas de quilodaltons (D.G. Gammack, Biochem. J. 88 373 1963). O referido fenómeno impediu até agora a utilização de técnicas tais como as de ultrafiltração e/ou diálise, para separar os gangliosidos de outras substâncias contidas no extrac-to crú anteriormente obtido a partir dos orgãos ou tecidos do sistema nervoso, visto esses agregados não poderem óbviamente permitir a passagem de moléculas simples através dos poros das membranas.

Assim os métodos que são hoje em dia utilizados para isolar gangliosidos e em particular GM1 a partir de mistura lipídica crua, utilizam vantajosamente outras técnicas, tais como fraccionamento por cromatografia de permuta iónica, usando como eluente uma mistura de água com dois ou mais solventes orgânicos.

Os referidos métodos de fraccionamento são bastante incómodos sobre vários aspectos. A principal desvantagem, no caso especifico do isolamento de GM1, é representada pelo tempo requerido para se conseguir a separação cromatografica. Além disso, foi evidenciado qua a quantidade de GM1 realmente &

recuperada pode variar muito amplamente de um lote para outro em comparação com a quantidade esperada.

Com efeito, verificou-se uma notável dependencia da eficiência da coluna que é afectada por dois factores, isto é, regeneração da resina da camada, que deve ser feita após cada separação cromatográfica, e seguinte reequilíbrio do solvente.

Outras desvantagens importantes dos referidos métodos relacionam-se com os custos, devido ao facto de, como foi referido, serem necessárias gandes quantidades de misturas de vários solventes orgânicos para eluir a coluna.

Além disso, no fim da separação a parte superior da camada de resina deve ser completamente removida, e substituída por um volume igual de resina fresca, visto ser irreversivelmente alterada pelas impurezas da mistura lipídica fraccionada agarradas à própria resina.

Outros detalhes deste processo são indicados no exemplo 6, em que é descrito um processo para a recuperação de GM1 a partir do extracto lipídico por cromatografia de permuta iónica em coluna, processo esse que se presta ele próprio a uma comparação directa com o método do presente invento. A principal finalidade do invento consiste assim em proporcionar um processo para o isolamento e purificação de monosialogangliosido a partir de uma mistura lipídica de partida que contem a substancia ou como o único gangliosido, ou numa quantidade prevalecente era confronto com outros gangliosidos associados da mesma familia, processo esse que não compreende qualquer passo cromatográfico de permuta iónica simplificando assim notávelmente o processo que tem sido seguido até agora.

I

0 referido processo é caracterizado pelo facto do monosialogangliosido ser obtido por ultrafiltração de uma solução aquosa contendo como solutos a mistura lipídica crua referida anteriormente, proveniente da extracção de tecidos ou orgãos do sistema nervoso, e alfa-ciclodextrina numa determinada relação de pesos.

As alfa-ciclodextrinas, como é sabido, são oligossaca-rideos cíclicos constituídos por seis unidades de repetição de glucopiranosido.

De acordo com o invento verificou-se que adicionando a uma solução contendo a mistura lipídica com as caracteristicas anteriormente referidas, uma quantidade de alfa-ciclodextrina numa determinada relação de pesos com o soluto anterior, os agregados de micelas são desfeitos e nas condições adopatadas para a ultrafiltração forma-se um complexo solúvel com a ciclo-dextrina.

Consequentemente, o monosialogangliosido pode então passar através dos poros da membrana, em que a membrana é vantajosamente escolhida de um modo tal que os outros lípidos não possam ser dialisados nas mesmas condições. É interessante notar aqui que o processo ocorre apenas com alfa-ciclodextrina em que beta-ciclodextrina, que é um oligossacarídeo constituído por sete unidades de glucopiranose, não proporciona qualquer resultado semelhante tal como será indicado no exemplo 10.

Mais detalhadamente, o processo para obter GM1 de acordo com o invento consiste nos passos que se seguem: } ΐ

- Ultrafiltração da solução, em que a mistura lipídica foi dissolvida numa concentração compreendida entre 0,5 e 3,5% p/v, realizada através de uma membrana de diálise com um tamanho de poro de 50.000 daltons ou maior, e de preferência de 100.000 daltons, e em que alfa-ciclodextrina se apresenta numa relação em peso de pelo menos duas vezes a do extracto.

- Concentração do dialisado (o permeado) por ultrafiltração através de uma membrana de diálise com um tamanho de poro de 1.000 daltons.

Recuperação do soluto que contem o complexo de GM1 com alfa -ciclodextrina. - Recuperação de GM1 a partir do complexo referido anteriormen-te.

Deve aqui notar-se que a relação aqui anteriormente referida entre a alfa-ciclodextrina e o gangliosido é tal que proporciona uma formação completa de complexo de GM1 independentemente do título de GM1 na mistura lipídica.

I A ultrafiltração é realizada mantendo a um volume constante a solução no interior da câmara de diálise (isto é o retido), adicionando de preferência uma solução a 2% p/v de alfa-ciclodextrina.

Com efeito verificou-se também que se pode usar água simples, em vez da solução aqui referida anteriormente. Neste caso a quantidade de GM1 recuperada no fim, embora de qualquer modo favorávelmente comparável com a obtida pelos métodos de cromatografia de coluna de acordo com as técnicas anteriores, é de qualquer modo inferior à obtida utilizando a técnica de ultrafiltração aqui anteriormente referida. 0 volume final da solução dialisada (isto é o permeado) deve ser pelo menos duas vezes superior ao do retido. De preferência, o volume do permeado é cinco vezes superior ao do retido.

No fim da ultrafiltração, o permeado é vantajosamente concentrado por ultrafiltração usando uma membrana com um tamanho de poro de 1.000 daltons, até o volume final da solução ter um valor de uma décima parte do volume do permeado de partida. 0 permeado concentrado é então de preferência liofili-zado mas o soluto pode também ser recuperado por precipitação com acetona.

Verificou-se também que o soluto pode ser precipitado a partir da solução aquosa correspondente deixando o permeado concentrado a +4°C, em que a concentração de GM1 (p/v) deve ser de pelo menos 0,1% (p/v). De qualquer modo o rendimento de GM1 por este método é inferior ao proporcionado com o processo anteriormente referido. O GM1 pode então ser recuperado do referido complexo por extracção com metanol ou com uma mistura correspondente com outro solvente orgânico.

Um exemplo apropriado deste último é dado por uma solução de clorofórmio/metanol numa relação de 2:1 v/v. A relação entre o volume do solvente orgânico, isto é, metanol ou a mistura correspondente com outro solvente orgânico, e o peso do sólido, deve ser de pelo menos 5 (v/p) para cada extracção. O passo de extracção com os referidos solventes deve ser repetido pelo menos três vezes, mais vantajosamente cinco vezes.

Deve ser referido que também é possível a combinação dos dois métodos de descomplexação referidos anteriormente, isto é, extracção do sólido proveniente do produto dialisado primeiro com metanol, levando a solução à secura, e extraindo então o resíduo com clorofórmio:metanol 2:1.

Além disso, deve ser aqui ainda referido que com os métodos anteriormente descritos para a recuperação de GM1 a partir do complexo com alfa-ciclodextrina, se obtem um resíduo insolúvel constituido por agente de formação do complexo puro, que pode assim ser recolhido e utilizado como tal num outro ciclo de operações.

No que se refere ao segundo objectivo do invento, isto é o complexo entre GM1 e alfa-ciclodextrina, a fig. 1 proporciona a evidência da formação do produto em solução. A Fig. 1 relaciona-se com os espectros de l-H RMN (300 MHz) em soluções de D2O, numa concentração de GM1 de 1 mg/ml. Adicionam-se então à solução quantidades crescentes de alfa-ciclodextrina. As relações molares relacionadas com GM1 são indicadas no Quadro I. A interpretação dos espectros, de acordo com os conhecimentos neste campo (ver, por exemplo, o trabalho de T.A.W. Koerner et Alii "High resolution proton NMR studies of 9

I gangliosides. 1. Use of homonuclear two dimensional spin-echo J-correlated spectroscopy for determination of residue composi-tion in anomeric configurations" Biochemistry, 1983 22 2676-2687) foi feita como se segue: sinais a 0,82 ppm são atribuídos aos grupos metilo alifáticos terminais da porção ceramida, os a cerca de 1,23 ppm a protões metileno de ceramida, os a cerca de 1,85 ppm a protões metilo de acetamido (grupos N-acetilo de glucosami-na e de ácido siálico), os a 1,9-2,1 ppm a protões metileno alílicos e alfa-carbonílicos de ceramida.

De particular interesse, para avaliar a formação de complexo, são os sinais a 0,82 ppm (grupos metilo terminais da porção ceramida) e a 1,85 ppm (protões metilo de acetamido) visto que, como é demonstrado por um modelo de preenchimento espacial, os grupos afins mencionados entre parenteses fazem saliência para fora da molécula e assim estes sinais são bastante sensíveis a alterações no ambiente estérico da molécula.

Pode assim observar-se na fig. 1 que ambos os sinais referidos anteriormente se tornam mais bem separados e agudos na presença de quantidades crescentes de alfa-ciclodextrinas, o que significa que o meio estérico se vai alterando progressivamente em comparação com o anteriormente existente nos agregados de micelas de 6M1.

Mais evidências da formação de complexo são proporcionadas por uma comparação directa entre os espectros de estado sólido afim da substancia e os do monosialogangliosido de partida, em que os referidos espectros foram obtidos por espectrosco-pia CP-MAS-13 CRMN (Cross polarization magic angle spin carbon 13 NMR) e são representados nos gráficos da fig. 2.

Antes de explicar o significado dos espectros deve relembrar-se aqui que a técnica é amplamente usada na elucidação da estrutura dos complexos de ciclodextrinas (Y. Inoue et Al., Carbohyd. Res. 159 1 1987).

As figuras 2A e 2B indicam assim como é que os espectros (em abcissas ppm), do complexo e de GM1 respectivamente, variam transmitindo à amostra do teste subsequentes impulsos magnéticos em tempos fixados, calculados em microsegundos (gs) e contados a partir do início das experimentações.

QUADRO I

Quantidades GMl usadas ] em peso e taxa nos gráficos dos 7, 10, molar afim espectros da fig. l entre alfa-ciclodextrina e de RMN n. (GMl), 1, 2, 4, Gráfico RMN GMl Alfa-ciclodextr. Alafa-cicl./GMl n. (mg) (mg) (relação molar) (GMl) 1 0 0 1 1 0,6 1 2 1 1,2 2 4 1 2,4 4 7 1 4,3 7 10 1 6,2 10 M.PM de GMl (sal de sódio) : 1570,74 P.M. de alfa-ciclodextrina : 972 (J. Szeitli "Cyclodextrin Technology "Kluwer Academic : Press Publishers 1988- em particular página 12)

Deste modo o relaxamento do campo magnético é cada vez mais evitado, de tal modo que no fim os sinais desaparecem completamente do espectro.

Pode assim observar-se que enquanto em GM1 puro o tempo gasto para atingir esta situação é de cerca de 90 us, no complexo correspondente com alfa-ciclodextrina isso acontece logo aos 50 us. Isso significa que no complexo a mobilidade de GM1 (ver por exemplo o sinal afim a cerca de 30 ppm proporcionado pela ligação de protão aos átomos de carbono alifãticos de GM1) é bastante evitada em confronto com a da substancia pura.

Assim esta técnica proporciona uma outra evidência independente da formação de complexo.

Deve também ser mencionado que uma outra demonstração da formação deste complexo é feita pelo facto da substancia precipitar a partir da correspondente solução aquosa em que se tinha anteriormente dissolvido alfa-ciclodextrina e GM1, apresen-tando-se este numa concentração de pelo menos 0,1%, e contanto que se obedeça às condições indicadas no exemplo 3 que se segue. A estoiquiometria do complexo foi elucidada pela análise por espectroscopia RMN das amostras obtidas de acordo com os exemplos 3 e 7-9 que se seguem.

Em particular, foram consideradas zonas de sinais correspondendo a 5,359 ppm, correspondendo ao protão anomérico da ciclodextrina, e a 1,409 ppm, correspondendo aos protões dos grupos metilo terminais da porção ceramida de GM1.

Foi então calculada cada uma das zonas afins sendo calculada a sua relação. Verificou-se assim que a relação entre a alfa-ciclodextrina e GM1 no complexo variava entre 4,0 e 6,0.

Nos exemplos aqui a seguir referidos todos os dados analíticos são indicados numa base de peso a seco.

Exemplo 1

Isolamento de monosialogangliosido a partir de um extracto lipídico tendo um título de GM1 de 57% (p/p). 880 mg de extracto lipídico, que tinha sido tratado préviamente a fim de converter todos os gangliosidos anteriores em GM1 a fim de que no fim a quantidade desta substancia tivesse aumentado para 500 mg (determinados pelo conteúdo afim de ácido siálico de acordo com o método de L. Svennerholm, Biochim. Biophys. acta 24 604 1957 e então considerando como o conteúdo deste açúcar em GM1 a percentagem de 20% de acordo com R. Kuhn et al., Chem. Ber. 86, 866 1963), foram dissolvidos em 80 ml de água destilada.

Foi preparada uma solução de 10% p/v de alfa-ciclodex-trina em água. 20 ml da solução, correspondendo a uma quantidade em peso de ciclodextrina duas vezes maior do que a do extracto, foram adicionados à solução anterior, levando o volume final para 100 ml. 50 ml foram então transferidos para um aparelho de ultrafiltração equipado com uma membrana de diálise tendo um grau de admissão de peso molecular de 100.000 daltons (membrana do disco YM - 100 AMICONr).

Foi então efectuada a diálise mantendo constante o volume de retido adicionando uma solução a 25% de alfa-ciclodex-trina.

Para cada diálise foram recolhidos 50 ml de permeado. O número afim total de ciclos foi de cinco.

As soluções de permeado foram recolhidas e concentradas até um volume final de 20 ml por ultrafiltração através de uma membrana com um grau de admissão de peso molecular de 1.000 daltons (Membrana de disco YM1 AMIC0NR),

Apôs liofilização, foram recuperados 1.050 mg de um sólido contendo 153 mg de GM1 (determinados por meio de um ansaio com ácido siálico e tomando em consideração a % de ácido siálico na molécula de acordo com a referência anterior de R. Kuhn et alii). GM1 foi então isolado por extracção do sólido do passo precedente com 10 ml de uma solução clorofórmio/metanol 2:1 (v/v) de uma só vez por 5 vezes. A solução orgânica foi então levada até à secura sob pressão reduzida dando origem a 138 mg de GM1 (55% da quantidade teórica), cuja pureza tinha sido avaliada, de acordo com o método de cromatografia de placa delgada referido no exemplo 5, como sendo superior a 95%. 0 título de GM1 pelo ensaio com ácido siálico foi de 97%.

Exemplo 2

Ultrafiltração de uma solução contendo tanto o extracto lipldico como a alfa-ciclodextrina, mantendo o retido com um volume constante adicionando água.

Uma porção aliguota de 50 ml dos 100 ml de solução preparada no exemplo 1 e contendo os componentes referidos anteriormente, é ultrafiltrada tal como é ali descrito, enquanto que o retido foi mantido com um volume constante pela adição de água.

Após concentração até um décimo (25 ml) do volume de partida, o permeado foi precipitado pela adição de dez volumes de acetona, e deu origem a um sólido pesando 1.070 mg e contendo 128 mg de 6M1. O sólido foi extraído com metanol, o solvente foi levado até à secura sob pressão reduzida de acordo com o processo referido a partir do mesmo passo no exemplo 1. No fim foram recuperados 113 mg de GM1 (45% da quantidade teórica), com um título de 96% determinado pelo ensaio com ácido siálico, e com uma pureza (cromatografia de placa delgada do exemplo 5) superior a 95%.

Exemplo 3

Precipitação do complexo de GM1 com alfa-ciclodextrina a partir do permeado concentrado. O processo do exemplo 1 foi seguido, exceptuando o facto da mistura lipídica se apresentar numa quantidade de 1,5 g (conteúdo de GM1 : 0,645 g, isto é, 43% p/p) dissolvida em 15 ml de água destilada, à qual se tinham adicionado 30 ml da solução a 10% p/v de alfa-ciclodextrina. O método descrito no exemplo 1 foi então seguido no que se refere ao processo até à obtenção da solução concentrada do permeado. 16

A solução concentrada do permeado (20 ml) foi deixada a 4 °C durante cerca de 1 dia e o precipitado formado foi recolhido por centrifugação a 15.000 rpm durante 15 minutos e seco a 45°C sob uma pressão residual de 0,03 mm Hg durante 1 dia. ) O sólido recuperado no fim pesava 91 mg e tinha um conteúdo de GM1 de 25,9 mg tendo como base o conteúdo de ácido siálico do composto. Espectroscopia ÍH RMN realizada tal como foi já referido nesta apresentação, deu uma relação molar alfa-ciclo-dextrina/GMl de 4,0. 0 sólido sofreu então descomplexação pela sua extracção com 2 ml de cada vez de metanol por 5 vezes sendo então levado até à secura. 0 resíduo foi então extraido com 2 ml de Clorofór-mio:Metanol 2:1 por 5 vezes. Os extractos reunidos foram levados até â secura sendo recuperados 20 mg de GM1, com o título baseado no conteúdo de ácido siálico: 98%, ensaio de pureza (exemplo 5) : superior a 95%.

Exemolo 4

Isolamento de GM1 a partir de uma mistura lipídica com título em GM1 de 48%. 1,250 g de mistura lipídica com o conteúdo anteriormen-te referido de GM1 foram dissolvidos em 35 ml de água destilada. Foram então adicionados à solução 25 ml de uma solução aquosa de alfa-ciclodextrina a 10% p/v. O processo de acordo com o exemplo 1 foi então seguido. O GM1 que foi isolado no fim pesava 318 mg (53% da quantidade teórica). 0 título de acordo com o ensaio com ácido siálico foi 17

de 97,5%. Pureza por cromatografia de placa delgada : superior a 95%.

Exemplo 5 I Ensaio de pureza das preparações obtidas de acordo com o invento.

A pureza foi ensaiada por um método de cromatografia de placa delgada, por comparação visual directa das intensidades das manchas das impurezas de GM1 com as dos padrões afins. A sensibilidade do ensaio por cromatografia de placa delgada foi avaliada antecipadamente tal como é aqui a seguir referido.

As placas utilizadas eram placas de HPTLC (gel de sílica) e o solvente da eluição era uma mistura de clorofórmio : metanol : 0, 3% CaCl2 em água, nas relações 60:35:8.

Para cada substancia testada foi realizada cromatogra-fia de placa delgada sobre duas placas ao mesmo tempo, a fim de tornar possível uma evidência simultânea das manchas com cada um dos reagentes referidos aqui mais abaixo.

Após a evolução das placas numa câmara saturada e subsequente secagem em forno, as placas foram pulverizadas respectivamente com uma das seguintes soluções: - A. Reagente de Ehrlich. - B. Solução de anisaldeido. 0 reagente foi obtido dissolvendo 1 ml de anisaldeido em ácido acético glacial, o qual foi então levado até ao volume de 100 ml. À solução adicionaram-se então 2 ml de 86% p/v de ácido sulfúrico.

Após pulverização, as placas foram então secas num forno a 100°C durante 10 minutos.

Numa primeira série de experiências, numa placa, foram colocadas em camadas quantidades decrescentes da mistura lipídica referida no exemplo 1 (título GM1 : 57% em peso): 150, 50, 30 e 12,5 mcg. A placa foi pulverizada com reagente A. Deste modo foram evidenciadas 11 manchas, correspondendo a maior à de GM1. 9 manchas, apresentando uma intensidade de cor quase igual, tinham um valor de Rf superior ao de GM1.

As referidas manchas, tal como foi verificado por comparação directa com padrões apropriados, correspondiam a fosfolípidos e a outras impurezas, que estavam contidas no extracto lipídico.

Foi também observada uma mancha com uma intensidade de cor muito fraca e com um valor de Rf inferior ao de GM1, identificada com o disialogangliosido.

Ao diminuir a quantidade de extracto lipídico na placa até 12,5 mcg. a maior parte das manchas anteriormente evidenciadas tornaram-se de difícil distinção.

Tomando em consideração que com uma quantidade de 30 mcg de extracto lipídico as manchas podiam ainda ser detectadas em cromatografia de placa delgada, e que a quantidade total das referidas substancias com excepção de GM1 atingia um valor de 43% em peso da mistura de partida, isto é 13 mcg, concluiu-se que o limite de detecção dos referidos compostos por cromatografia de placa delgada tinha um valor de cerca de 1 mcg. A fim de avaliar a presença de alfa-ciclodextrina residual em GM1, quantidades decrescentes do agente de formação de complexo, variando entre cerca de 10 e 0,5 mcg, foram dispostas em camadas numa segunda placa. Após evolução da placa, as manchas foram evidenciadas com reagente B. A alfa-ciclodextrina apareceu como uma mancha vermelho escuro no ponto de sementeira. Nas condições adopatadas, as intensidades relativas da mancha mostraram-se detectáveis mesmo com quantidades mínimas dispostas em camadas sobre a placa, isto é, 0,5 mcg. A análise cromatográfica de placa delgada em amostras de GM1 obtido de acordo com os exemplos 1-4 foi realizada por formação de manchas na placa, por ordem, 200 mcg de GM1 isolado, 30 mcg da mistura lipídica de partida e 0,5 mcg de ciclodextrina.

Foi então repetido o mesmo processo numa segunda placa.

Nas experimentações realizadas com as preparações obtidas com o método referido anteriormente, após pulverização da placa com reagente A não foram evidenciadas manchas para além da de GM1.

Na placa pulverizada com reagente B foi por vezes evidenciada na origem a mancha de ciclodextrina, cuja intensidade era de qualquer modo muito mais baixa que a do padrão (0,5 mcg).

Exemplo 6 Método para separar GM1 de uma mistura lipídica crua por crornato-grafia de permuta iónica (M. Iwamori et Alii, Biochim. Biophys. Acta 528 257 1978). 600 g de resina SephadexR A-25 foram equilibrados com uma solução de tampão com pH 7. 0 tampão foi mudado repetidamente até a resina apresentar uma reacção neutra com papel de tornesol. A resina foi então recolhida e subsequentemente equilibrada com o solvente de eluição, constituido por uma mistura de clorofórmio: metanol: água 30:60:8. 0 volume requerido para realizar este passo foi de 9 litros. A resina foi então carregada numa coluna e eluida com o solvente até a altura da camada permanecer constante. A resina foi em seguida carregada com uma pasta contendo 180 g de extracto lipídico crú (título em GM1 : 50%) dissolvido em 5 litros de clorofórmio:metanol 1:1 e 500 ml da resina ela própria suspensa no solvente de eluição. A taxa de fluxo foi fixada em 800 ml/hora. Foram então recolhidas duas fracções, com o volume de 5 e 20 litros respecti-vamente. A coluna foi então eluida com clorofórmio:metanol:solução aquosa acetato de sódio 0,1 m 30:60:8.

Os 40 litros de produto eluido que foram recolhidos foram então evaporados até um volume pequeno sob pressão reduzida, tomando a precaução de evitar excessiva formação de espuma, ultrafiltrados para remover sais residuais sendo então de novo concentrados até um volume final de 300 ml. O GM1 foi recuperado por adição de acetona à solução aquosa. No fim foram recuperados 45 g de GM1 com um título de 90% (estabelecido por ensaio com ácido siálico), que correspondeu a 50% da quantidade da substancia contida no extracto lipídico crú de partida.

Antes de iniciar um novo ciclo de separação, foi necessário remover, e substituir com igual volume de resina fresca, o topo da camada de resina que aparecia manchada e obstruída com as impurezas do extracto lipídico agarradas.

Deste modo foi possível manter, dentro de certos limites, a eficiência de separação da coluna de partida e a taxa de fluxo requerida.

Exemplo 7

Precipitação do complexo de GMl e de alfa-ciclodextrina a partir de uma solução contendo os componentes puros (I). 1,555 g de alfa-ciclodextrina foram dissolvidos em 32 ml de água destilada (solução A). Uma porção alíquota de 3,2 ml (0,160 mMoles) foi então retirada. 24,8 mg de GMl (0,0158 mMoles) foram dissolvidos em 4 ml de água destilada. As soluções foram misturadas e deixadas a 4°C durante 19 horas, A recuperação do precipitado foi efectuada tal como foi descrito no exemplo 3. 0 sólido pesava 10 mg. Espectroscopia por ÍH RMN deu uma taxa molar de ciclodextrina/GMl de 5,1.

Exemplo 8

Precipitação do complexo a partir de uma solução contendo os componentes puros (II). 49,6 mg de GMl (0,0316 mMoles) foram dissolvidos em 4

ml de ãgua destilada sendo-lhes adicionados 3,2 ml de solução A do exemplo 7. Após mistura, o processo do exemplo 7 foi seguido. o sólido recuperado no fim pesava 45,2 e apresentava uma relação molar alfa-ciclodextrina/GMl de 4,5 (espectroscopia 1h rmn).

Exemplo 9

Precipitação do complexo a partir de uma solução contendo os componentes puros (III). 12,4 mg de GMl (0,0079 mMoles) foram dissolvidos em 4 ml de água destilada sendo-lhes então adicionados 3,2 ml de solução A do exemplo 7. 0 processo foi então o mesmo. 0 sólido recuperado pesando 10,5 mg apresentava uma relação molar de alfa-ciclodextrina/GMl de 5,7.

Exemplo 10

Demonstração de que beta-ciclodextrina no processo do invento não proporciona qualquer resultado semelhante ou comparável ao proporcionado por alfa-ciclodextrina. 440 mg do mesmo lote de extracto lipídico utilizado no exemplo 1 (título em GMl : 57% p/p, correspondendo a uma quantidade de 250 mg) foram dissolvidos em 30 ml de água destilada, sendo-lhes adicionados 1.000 g de beta-ciclodextrina e sendo o 23

volume levado então até 60 ml com o mesmo solvente aqui anterior-mente referido. A solução obtida era perfeitamente transparente e foi submetida a ultrafiltração nas mesmas condições descritas no exemplo 1, exceptuando o facto de ser adicionada água a fim de manter constante o volume de retido, tal como foi referido no exemplo 2. Foram recolhidas 5 porções aliquotas de permeado com 60 ml cada. Cada fracção do permeado e o retido foram então ensaiados pelo método de cromatografia de placa delgada referido no exemplo 5.

Foi assim verificado que a primeira fracção de permeado continha uma grande quantidade de beta-ciclodextrina, em que as outras fracções subsequentes continham apenas quantidades insignificantes da substancia. Por seu lado o retido não continha qualquer porção de ciclodextrina.

Foram detectadas na primeira fracção de permeado quantidades muito pequenas de GM1. 0 ensaio com ácido siálico realizado no retido, evidenciou que a quantidade de GM1 ali presente era de 235 mg. Esta quantidade era muito comparável com a contida no extracto lipídico de partida (250 mg, ver acima).

J

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES: ia. - Processo para o isolamento e purificação de monosialalogangliósido (GM1) a partir de uma mistura lipídica que contem a substância ou como o único gangliósido ou então numa quantidade prevalecente em confronto com outros gangliósidos associados, caracterizado pelo facto de compreender os passos que se seguem: Ultrafiltração da solução aquosa em que se encontravam ante-riormente dissolvidas tanto a mistura lipídica como a alfa-ciclodextrina através de uma membrana de diálise com um tamanho de poro de 50.000 Daltons ou maior. Concentração do produto dialisado (permeado) por ultrafil-tração através de uma membrana de diálise com um tamanho de poro de 1.000 Daltons. Recuperação do soluto compreendendo o complexo entre GM1 e alfa-ciclodextrina a partir do permeado concentrado. - Recuperação de GM1 a partir do complexo correspondente. 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto da concentração da mistura lipídica na solução de partida estar compreendida entre 0,5 e 3,5%, em que a quantidade de alfa-ciclodextrina deve ser pelo menos duas vezes superior à da mistura. 33. - processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto do tamanho do poro da membrana de ultrafiltração ter de preferência um valor de 100.000 daltons.
2. 43. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto da ultrafiltração ser realizada mantendo com um volume constante a solução na câmara de diálise (retido). 5â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto do retido ser de preferência mantido com um volume constante por adição de 2% p/v de alfa-ciclodextrina em água.
3. 63. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto do retido ser mantido com um volume constante por adição de água.
4. 73. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto do volume final da solução diali-sada (permeado) dever ser pelo menos duas vezes superior ao do retido.
5. 83. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto do volume final do permeado ser de preferência cinco vezes superior ao do retido. ga. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da concentração do permeado evoluir até o volume correspondente ser reduzido até cerca de um décimo do da solução de partida.
6. 103. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da recuperação do soluto compreendendo o complexo entre GM1 e alfa-ciclodextrina a partir do permeado concentrado poder ser feita por liofilização, precipitação com acetona ou deixando a solução a +4°C. 26

   11a· - Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo facto de que quando a recuperação do soluto é feita por precipitação com acetona, serem adicionados dez volumes do solvente ao do permeado. 12a. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de, quando a recuperação do soluto é feita por precipitação a +4°C, a concentração de GM1 na solução p/v ser de pelo menos 0,1% p/v. I 13a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-12 caracterizado pelo facto do soluto ser de preferência recuperado a partir de permeado por liofilização. 14a. - processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo facto de GM1 ser recuperado a partir do complexo correspondente com alfa-ciclodextrina por extracção com metanol ou com uma mistura correspondente com outro solvente orgânico. I 15a. - Processo de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado pelo facto da relação volume do solvente de extrac-ção/peso do soluto dever ter um valor de pelo menos 5. 16a. - Processo de acordo com as Reivindicações 14-15, caracterizado pelo facto de cada passo de extracção dever ser repetido pelo menos três, mais vantajosamente cinco vezes. 17a. - Processo de acordo com as reivindicações 14-16, caracterizado pelo facto da mistura de metanol e de outro solvente orgânico ser de preferência constituída por clorofórmio:metanol 2:1. Ξτ 27
7. 183. - Processo de acordo com as reivindicações 14-17, caracterizado pelo facto do GM1 ser recuperado a partir do complexo correspondente com alfa-ciclodextrina por extracção do sólido primeiro com metanol, levando o solvente à secura, e extraindo então o resíduo com a mistura clorofórmio:metanol 2:1. 19a. - Processo para a preparação de um composto entre alfa-ciclodextrina e GM1, caracterizado pelo facto da relação molar entre alfa-ciclodextrina e GM1 variar entre 4,0 e 6,0; caracterizado por compreender os passos que se seguem: Mistura de uma solução aquosa de GM1, numa concentração de pelo menos 0,1%, com uma solução aquosa de alfa-ciclodextrina contendo uma quantidade da substância numa proporção em peso com o primeiro de pelo menos 5. Deixar a solução resultante a +4°C durante 19 horas. - Recolha do precipitado que se formou por centrifugação a 15 000 r.p.m. durante 15 minutos. Em seguida, secagem do sólido a 45°C a uma pressão residual de 0,03 mm Hg durante 1 dia. Lisboa, 10 de Julho de 1991

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