FI83962C - Isolering av icke-reducerade oligosackarider. - Google Patents
Isolering av icke-reducerade oligosackarider. Download PDFInfo
- Publication number
- FI83962C FI83962C FI863592A FI863592A FI83962C FI 83962 C FI83962 C FI 83962C FI 863592 A FI863592 A FI 863592A FI 863592 A FI863592 A FI 863592A FI 83962 C FI83962 C FI 83962C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- column
- process according
- oligosaccharides
- cellulose
- cellulose column
- Prior art date
Links
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 81
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 75
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 39
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000007171 acid catalysis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical group CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 38
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 25
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 10
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 9
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 claims description 8
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 claims description 7
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012345 acetylating agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000010549 co-Evaporation Methods 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 4
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 4
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 4
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 3
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010064983 Ovomucin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N diphosphonate Chemical compound O=P(=O)OP(=O)=O YWEUIGNSBFLMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000004192 high performance gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000717 hydrazino group Chemical group [H]N([*])N([H])[H] 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentoxide Inorganic materials O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 2-pyridinylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=N1 BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- -1 amino acid hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- SIIVGPQREKVCOP-UHFFFAOYSA-N but-1-en-1-ol Chemical compound CCC=CO SIIVGPQREKVCOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- LFOZSVIYDPNSOL-UHFFFAOYSA-N hydrazine toluene Chemical compound NN.NN.CC1=CC=CC=C1 LFOZSVIYDPNSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005597 hydrazone group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000002032 methanolic fraction Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GASFVSRUEBGMDI-UHFFFAOYSA-N n-aminohydroxylamine Chemical compound NNO GASFVSRUEBGMDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- OENLEHTYJXMVBG-UHFFFAOYSA-N pyridine;hydrate Chemical compound [OH-].C1=CC=[NH+]C=C1 OENLEHTYJXMVBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
- C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C13—SUGAR INDUSTRY
- C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
- C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Respiratory Apparatuses And Protective Means (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Spark Plugs (AREA)
- Noodles (AREA)
Description
1 83962
Ei-pelkistyneiden oligosakkaridien eristäminen Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla eristetään ei-pelkistyneet oligosakkaridit glykoproteiineista ja glyko-5 hormoneista, joissa on N-sitoutunut oligosakkaridirakenne.
Oligosakkaridien eristäminen glykoproteiineista ja glykohormoneista on hyvin kiinnostavaa monista syistä. Ensinnäkin se on ensisijaisen tärkeää alkuperäisten glykoproteii-nien ja glykohormonien hiilihydraattiosien rakenneanalyy-10 sissä. Näiden aineiden tiedetään sisältävän useita sokeri- ketjuja molekyylissä tai mikroheterogeenisyyttä yksinkertaisissa sokeriketjuissa. Siksi on välttämätöntä fraktioida nämä ketjut, ennen kuin rakenneanalyysi voidaan toteuttaa.
Eristetyt oligosakkaridit ovat myös käyttökelpoisia 15 sinänsä valmistettaessa neoglykoproteiineja liittämällä yksittäisiä oligosakkarideja erilaisiin peptidi- tai proteiini-ketjuihin.
Hydrolyyttinen hajottaminen entsyymeillä, esimerkiksi bakteeriproteaasilla kuten Pronaasilla ® , on kauan ollut 20 glykoproteiinien pilkkomismenetelmä glykopeptidien valmistamiseksi, mutta se on yleensä epätyydyttävä eri syistä, joihin sisältyy epätäydellinen hajottaminen ja tuloksena saatujen seosten fraktiointivaikeudet.
Kemiallisia menetelmiä on myös käytetty vapauttamaan 25 vapaita oligosakkarideja glykoproteiineista. Edullinen kemiallinen menetelmä käsittää hydratsinolyysin, jonka alunperin kuvasivat Matsushima ja Fujii julkaisussa Bull. Chem. Soc. Jpn. 30, 48 (1959) ja jonka myöhemmin kehittivät Bayard ja Montreuil: "Methodologie de la Structure et du 30 MÖtabolisme des Glycokonjugfies", ss. 208-18, CNRS, Paris, 1974. Jälkimmäisen julkaisun menetelmän mukaan glykoproteii-nia kuumennettiin vedettömän hydratsiinin kanssa 30 tunnin ajan, mitä seurasi typpihappokäsittely oligosakkaridien pilkkomiseksi. Muuttumattomia oligosakkarideja ei yritetty 35 ottaa talteen.
2 83962
Hydratsinolyysimenetelmää selvittivät edelleen Takasaki, Mizuochi ja Kobata julkaisussa Meth. Enzymol. 83, Academic Press, 1982, ss. 263-268. Nämä tutkijat asettivat hydratsinolyysituotteen N-asetyloinnin kohteeksi käyttämällä 5 etikkahapon anhydridiä, joka oli kyllästetyssä NaHCO-j-liuoksessa, mitä seurasi Na+ -ionien vaihto H+ -ioneilla (S)
Dowex ^ 50-kationinvaihtohartsilla. Sitten N-asetyyli-glukoosiamiinijäännökset tutkittiin paperikromatografisesti käyttäen butanolia, etanolia ja vettä suhteessa 4:1:1 ja 10 kun jäännökset oli pelkistetty NaOH:ssa olleella natrium- 3 borotritidillä (NaB H4), ne tutkittiin toistamiseen paperi-gromatografisesti käyttäen etyyliasetaattia, pyridiiniä, etikkahappoa ja vettä suhteessa 5:5:1:3. Vapautuneet sokerit tutkittiin lopulta korkeaerottelugeeliläpäisykromatografiällä 15 käyttäen Bio-Gel ® P-4:ä oligosakkaridiprofiilin saamiseksi, kuten Yamashita, Mizuochi ja Kobata edelleen samassa julkaisussa sivuilla 105-126 esittivät. Takasakin ym. menetelmä tuottaa kuitenkin hajonneiden aineosien seoksen, joka sisältää pelkistyneitä alditoleja. Pelkistyminen aiheuttaa radio-20 aktiivisesti merkittyjen alditolien, esimerkiksi tritiumilla merkityn N-asetyyliglukoosiaminitolin tai N-asetyylimannoo-siaminitolin tuotannon. Mellisin ja Baenzigerin julkaisun Anal. Biochem. 114, 276-280 (1981) mukaan jälkimmäiset tuotteet saa aikaan emäksen aiheuttama epimerisaatio amino-25 sokerin C-2-asemassa pelkistyvässä terminaaliryhmässä. Sellaiset pelkistyneet alditolit eivät ole sopivia lisäreak-tioihin.
Vaikka Takasakin ym. menetelmä on käyttökelpoinen glykoproteiinien rakenneanalyysiin, julkaistu menetelmä ei 30 ole käyttökelpoinen ei-pelkistyneiden oligosakkaridien eristämiseen valmistusmittakaavassa. Se johtaa myös siaali-happojäännösten huomattavaan häviöön.
Menetelmä, jolla eristetään ei-pelkistyneitä oligosakkarideja glykoproteiineista ja glykohormoneista, käsittää 35 tämän keksinnön mukaisesti: 3 83962 a) glykoproteiinin tai glykohormonin hydratsinolyy-sin kuumentamalla pääasiallisesti vedetöntä, pääasiallisesti suolatonta glykoproteiinia tai glykohormonia pääasiallisesti vedettömän hydratsiinin läsnäollessa reaktio-olosuhteissa, 5 jotka riittävät aiheuttamaan pilkkoutumisen N-sidospaikoissa tuloksena seos, jossa on pääasiallisena komponenttina oligosakkaridien de-N-asetylaatiohydratsonijohdannainen.
b) (a)-kohdan hydratsonijohdannaisen N-asetylointi halutulla asetyloivalla aineella oligosakkaridin N-asetyloi- 10 dun hydratsonijohdannaisen muodostamiseksi.
c) (b)-kohdan hydratsonijohdannaisen asettaminen happokatalyysin kohteeksi kyseessä olevien ei-pelkistyneiden oligosakkaridien tuottamiseksi.
d) (c)-kohdan ei-pelkistyneiden oligosakkaridien 15 asettaminen selluloosapylväskromatografiän kohteeksi epäpuhtauksien poistamiseksi ja kyseessä olevien ei-pelkistyneiden oligosakkaridien talteenottamiseksi.
Tämän keksinnön menetelmä on käyttökelpoinen suurelle määrälle glykoproteiineja ja glykohormoneja, jotka ovat 20 luonnossa kaikkialla läsnä olevia komponentteja, joita on solun ulkoisissa ja sisäisissä nesteissä, sidekudoksissa ja solumembraaneissa.
Puhdistettuja glykoproteiineja ja glykohormoneja voidaan käyttää yhtä hyvin kuin oligosakkarideja sisältävän 25 lähdeaineen karkeita uutteita ja fraktioita. Täten hyd-ratsinolyysin lähtöaineet voivat olla peräisin aineista kuten esimerkiksi: 1) puhdistetuista glykoproteiineista ja glyko-hormoneista 30 2) jakamattomasta seerumista ja sen fraktioista 3) biologisista eritteistä kuten virtsasta, maidosta, lapsenpihkasta, limasta ja edellisten kaltaisista aineista 4) kokonaisista elimistä, kuten esimerkiksi munuaisista, maksasta, sydämestä, pernasta, haimasta, keuhkoista 35 5) kasvin varren tai lehden uutteista 4 83962 6) siemenaineesta 7) lektiineistä 8) emulsiineista
Kiinteät aineet, kuten kokonaiset elimet ja soluaines, 5 on edullista hienontaa hiukkaskooltaan jauhamalla, pulve-roimalla tai homogenoimalla ennen keksinnön menetelmän käyttöä sellaisiin aineisiin.
Vaikka selitys päättyy patenttivaatimuksiin, jotka erityisesti osoittavat ja selvästi esittävät vaatimukset 10 asian suhteen, jonka katsotaan muodostavan tämän keksinnön, uskotaan, että keksintö ymmärretään paremmin seuraavasta edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtaisesta kuvauksesta, jonka yhteydessä esitetään oheiset piirrokset:
Kuvio 1 esittää osittaiset kemialliset rakenteet, 15 jotka valaisevat hydratsinolyysireaktiota, jossa glykopro-teiini, jolla on N-glykosyylisidos oligosakkaridin ja asparagiinin (asn) välillä, reagoi hydratsiinin kanssa muodostaen oligosakkaridien de-N-asetyloidun hydratsoni-johdannaisen ja aminohappohydratsideja.
20 Kuvio 2 kuvaa N-asetylaatioreaktion, jossa kuvion 1 oligosakkaridin hydratsonijohdannainen N-asetyloidaan etik-kahapon anhydridillä oligosakkaridin N-asetyloidun hydratso-nin muodostamiseksi.
Kuvio 3 kuvaa happokatalyysimenetelmän vaiheen, jossa 25 kuvion 2 oligosakkaridin N-asetyloitu hydratsonijohdannainen on kosketuksessa vaihtohartsien (Dowex AG 50 x 12, H+) kanssa Na+ -ionien korvaamiseksi H+ -ioneilla ja asetyyli-hydratsoniryhmien pilkkomiseksi, jolloin tuotetaan ei-pelkistyneitä olikosakkarideja.
30 Kuvio 4 esittää oligosakkaridien H 500 MHz NMR-spektrin; oligosakkaridit ovat vapautuneet trypsiini-inhibiittorista tyyppi III-Q: kananmunan valkuaisen puhdistettu ovomukoidi keksinnön yhdessä suoritusmuodossa.
Kuvio 5 esittää vasikan sikiön seerumin fetuiinityyppi 35 Ulista vapautuneiden oligosakkaridien H 500 MHz NMR-spektrin toisessa keksinnön suoritusmuodossa.
5 83962
Kuvio 6 esittää ihmisen seerumin transferriinistä vapautuneiden oligosakkaridien H 500 MHz NMR-spektrin edelleen yhdessä keksinnön suoritusmuodossa.
Kuvio 7 esittää fraktioimattomasta ihmiskorvansylki-5 rauhasesta vapautuneiden oligosakkaridien ^H 500 MHz NMR-spektrin edelleenkin yhdessä keksinnön suoritusmuodossa.
Kuviossa 1 esitetyt aminohappohydratsidit ovat hydratsiinin ja aminohapon yhdisteitä, joissa aminohapon ^-karboksyyliryhmän -OH-ryhmä on korvattu hydratsinoryhmällä 10 -NHNH2. Näiden yhdisteiden aminohappo-osassa on osallisena glykoproteiinin peptidiosa. Hydratsidit ovat epäpuhtauksia, jotka keksinnön tärkeän näkökohdan mukaisesti poistetaan selluloosapylväskromatografisesti.
Ennen lähtöaineena olevien glykoproteiinin ja glyko-15 hormonin hydratsinolyysin toteuttamista lähtöaine tehdään pääasiallisesti suolattomaksi. Suolan läsnäolo ei ole toivottua, koska suola mahdollisesti reagoi hydratsiinin kanssa muodostaen hydratsiinisuoloja. Glykoproteiinin tai glykohormonin käsittely toteutetaan edullisesti perusteel-20 lisella dialyysillä tislattua vettä vastaan noin 4°C:ssa typen avulla.
Hydratsinolyysireaktiossa on tärkeätä, että reaktio toteutetaan pääasiallisesti vedettömissä olosuhteissa; veden pienempienkin määrien läsnäolo on haitallista halutulle reak-25 tiolle de-N-asetyloidun hydratsonijohdannaisen tuottamiseksi ja vähentää saantoa. Vedettömät reaktio-olosuhteet voidaan saavuttaa käyttämällä vedettömiä reagoivia aineita ja toteuttamalla reaktio suljetun reaktioastian kosteudesta vapaassa kaasukehässä. Lasisen reaktioastian liekkitiivistys happi-30 vapaassa, kuivassa argonissa ilmakehän paineessa on edullinen tiivistysmenetelmä. Pääasiallisesti vedetöntä hydratsiinia voidaan valmistaa tislaamalla käytön edellä hydratsiini-tolueeni-sekoitus CaO:sta argonkehässä.
6 83962
Vesi voidaan poistaa glykoproteiinista tai glyko-hormonista miedolla kuivausmenetelmällä, kuten pakaste-kuivauksella, lyofilisaatiolla, altistamalla aine kuivaaville ja vettä poistaville aineille, kuten esimerkiksi fosfori-5 pentoksidille, tai kuivaamalla kryogeenisesti aktiivihiilellä alennetussa paineessa.
Hydratsinolyysireaktio toteutetaan kuumentamalla reaktioseos, joka sisältää glykoproteiinia tai glykohormonia, huoneen lämpötilasta (esim. noin 20-25°C) nostaen vähitellen 10 lämpötilaa esi-inkubaatiovaiheen aikana noin 65°C:een ja sitten pitämällä lämpötilaa noin 65-100°C:ssa. Mahdollista hajoamista voi tapahtua korkeammissa lämpötiloissa, edullinen lämpötila on noin 85°C, vaikkakin noin 100°C:n lämpötila on sopiva.
15 Tarvittava aika hydratsinolyysireaktion toteuttami seksi voi olla 2-10 tuntia. Nämä reaktioajat eivät ole kriittisiä, halutun tuotteen mahdollista hajoamista voi tapahtua pitkän reaktioajan jälkeen.
Edullisessa suoritusmuodossa lämpötilaa nostetaan 20 hitaasti reaktioajan kuluessa yllä mainitulla aikavälillä. Esimerkiksi reaktiolämpötilaa voidaan nostaa huoneen lämpötilasta noin 85°C:een lisäämällä noin 10°C:tta tunnissa. Uskotaan, että vähittäinen lämpötilan nousu auttaa stabilisoimaan oligosakkaridit ja tuottaa suuremman saannon toi-25 vottua hydratsonijohdannaista. Alalla ammattitaitoinen henkilö voi helposti määrittää kyseessä olevalle glykoproteii-nille tai glykohormonille ajan ja lämmön suhteen optimaaliset reaktio-olosuhteet, jotka tuottavat seoksen, jossa on pääasiallisena komponenttina de-N-asetyloitu hydratsoni-30 johdannainen.
Hydratsinolyysireaktiossa käytetään edullisesti noin 10-50 mg glykoproteiini- tai glykohormoniainetta (kuiva-paino) ml:a kohden hydratsiinia.
7 83962
Kun hydratsinolyysireaktio on saatettu loppuun, mikä voidaan analyyttisesti määrittää, reagoimaton hydratsiini poistetaan esimerkiksi haihduttamalla alennetussa paineessa. Edullinen hydratsiinin poistomenetelmä on haihduttaminen 5 alennetussa paineessa 25°C:ssa käyttäen nestemäistä typpeä ja aktiivihiilipidätystä, mitä seuraa toistuva yhteishaih-dutus vedettömällä tolueenilla.
Hydratsinolyysireaktio pilkkoo glykoproteiinin tai glykohormonin N-sidoksen sisältävän oligosakkaridirakenteen, 10 deasetyloi oligosakkaridin ja luovuttaa -NH2-ryhmän vapautuneelle oligosakkaridille. Lisäksi hydratsiini reagoi myös peptidisidoksen karbonyyliryhmän kanssa muodostaen tuotteita, joihin sisältyy aminohappohydratsidit.
Glykoproteiinin tai glykohormonin hydratsinolyysiä 15 seuraten oligosakkaridin de-N-asetyloidun hydratsinojohdan-naisen vapaat aminoryhmät N-asetyloidaan luovutetun ryhmän muuttamiseksi toivotuksi N-asyyliryhmäksi ja glukoo-siamiinijäännösten muuttamiseksi N-asyyliglukoosiamiinijään-nöksiksi. Tämä N-asetylointi suojaa oligosakkaridien pelkis-20 tyviä terminaaliryhmiä hajoamiselta seuraavien prosessien aikana. Jos halutaan tuottaa pelkistyneitä oligosakkarideja, joilla on ainakin yksi N-asyyliosa, kuten luonnossa esiintyvässä tuotteessa, N-asetylointi toteutetaan asetyloivalla aineella. Edullinen asetyloiva aine on etikkahapon anhydridi. 25 Edullisessa suoritusmuodossa oligosakkaridit asety- loidaan reaktiolla, jossa käytetään ylimääriä etikkahapon anhydridiä kyllästetyssä NaHCO^m vesiliuoksessa. Etikka-hapon anhydridin moninkertaisen molaarisen ylimäärän käyttö hydratsinolaatin aminoryhmien kokonaismäärään nähden on 30 edullista. Viisinkertainen molaarinen ylimäärä on edullisinta. Perättäinen asetyloiminen noin 4°C:ssa ja sitten noin 20-25°C:ssa on edullinen N-asetyloimismenetelmä. Muiden sopivien asetyloimisreagenssien tulisi olla reagensseja, jotka sallivat asetyyliosan esiintyvän poistuvana ryhmänä.
8 83962
Kun asetyloimisvaihe N-asetyloidun hydratsonijohdannaisen tuottamiseksi on saatettu loppuun, seos, joka sisältää tätä johdannaista, saatetaan happokatalyysiin asyylihydrat-sonin pilkkomiseksi ja ei-pelkistyneiden oligosakkaridien 5 tuottamiseksi. Happokatalyysi voidaan toteuttaa saattamalla seos kosketukseen hapon kanssa, kuten rikkihapon. Kuitenkin siaalihapon pilkkoutumisen välttämiseksi edullinen menetelmä happokatalyysin toteuttamiseksi käsittää voimakkaasti happaman kationinvaihtohartsin käytön. Kationinvaihtohartsin käyttö 10 H+ -kierrossa poistaa myös NaHCO,:n tuottamat Na+ -ionit.
^ (r)
Edullinen kationinvaihtohartsi on Dowex ^ AG 50W X 12. Tämä on analysointitarkoitukseen sopiva, voimakkaasti hapan kationinvaihtohartsi, joka koostuu styreenin ja divinyyli-bentseenin sekapolymeerihilaan (12 % ristiliittyminen) kiin-15 nittyneistä sulfonihapon funktionaalisista ryhmistä. Muita voimakkaasti happamia kationinvaihtohartseja voidaan käyttää samalla tavoin.
Läsnäolevat epäpuhtaudet ei-pelkistyneitä oligosakkarideja sisältävässä seoksessa koostuvat aminohappohydratsi-20 deista, jotka ovat muodostuneet alkuperäisessä hydratsino-lyysireaktiossa. Nämä epäpuhtaudet poistetaan keksinnön mukaisesti selluloosapylväskromatografisesti. Edullisesti selluloosapylväs on hienojakoisella tai kolloidisella selluloosalla täytetty pylväs. Kuituinen selluloosa on yleensä 25 sopimatonta. Mikrokiteiset selluloosat valmistetaan yleensä puhtausasteeltaan korkealuokkaisesta puuvillasta, jolla on korkea alfaselluloosapitoisuus tai muusta sellaisesta puhtausasteeltaan korkealuokkaisesta kasviaineesta. Valmistusmenetelmät selostetaan Battistan julkaisussa Ind. Eng. Chem.
30 42, 502 (1950) ja US-patenteissa 2 978 446 ja 3 141 875.
Edulliset hiukkaskoot voivat vaihdella noin <1 mikronista 100 mikroniin. Tyypillistä mikrokiteistä selluloosaa on kaupallisesti saatavissa oleva Avicel ® , jota valmistaa FMC Corp., New York ja E. Merck A. G., Darmstadt, Länsi-35 Saksa.
9 83962
Selluloosapylväskromatografia toteutetaan edullisesti pesemällä hienojakoista selluloosaa sisältävä pylväs peräkkäin vedellä, metanolitransitioliuoksella ja sitten butanolin, etanolin ja veden tasapainoliuoksella, sitten 5 lisäämällä N-asetyloitu oligosakkaridinäyte ja sitten uuttamalla tasapainoliuoksella, ja sitten eluoimalla peräkkäin metanolitransitioliuoksella ja vedellä, jolloin jälkimmäiset metanoli- ja vesipesuliuokset otetaan talteen toivottuina N-asetyloituina oligosakkaridifraktioina.
10 Uuttoliuosten komponenttien suhteet ovat edulli sesti butanoli:etanoli:vesi 4:1:1 (tässä järjestyksessä, tilavuuden mukaan).
Ennen uuttoliuoksen lisäämistä selluloosapylväs esi-käsitellään pesemällä peräkkäin vedellä ja sitten metano-15 lilla. Edullisesti selluloosapylväs pestään perusteellisesti tislatulla vedellä ja sitten yhdellä tai kahdella pylvään tilavuudella metanolia transitioliuoksena.
Ennen ei-pelkistyneen oligosakkaridinäytteen lisäämistä selluloosapylväs tasapainotetaan uuttoliuoksella. Noin 20 5-10 pylvään tilavuutta uuttoliuosta käytetään uuttamaan aminohappohydratsidit.
Eluointiliuoksia käytetään siten, että metanoli on transitioliuos, jota seuraa vesipesu. Edullisesti noin yksi pylvään tilavuus metanolia ja noin 5 pylvään tilavuutta 25 tislattua vettä käytetään eluointiin.
Edullinen selluloosatäytteen tilavuus voidaan laskea seuraavasta kaavasta:
Selluloosatäytteen tilavuus (mis) = £10+(10 x käsitelty aine 30 (gms)J7.
Talteenotetut metanoli- ja vesifraktiot voidaan väke- vöidä pakastekuivauksella tai haihduttamalla liuotin pois.
Jäljelle jääneestä oligosakkaridivalmisteesta voidaan tar- 35 kistaa peptidikontaminaatio käyttäen H ydinmagneettista 83962 resonanssispektroskopiaa ja puhdistaa se uudelleen, mikäli tarpeellista, toistamalla edellä kuvattu selluloosapylväs- kromatografinen menetelmä. H ydinmagneettisen resonanssi-spektroskopian käytön yleiseksi katsaukseksi katso R.A. Dwek, 5 Nuclear Magnetic Resonance (N.M.R) in Biochemistry:
Application to Enzyme Systems, Clarendon Press, Oxford, 1973 ja Vliegenthart ym., Adv. Carbohydr. Chem. & Biochem.
41, Academic Press, 1983, s. 209.
Ei-pelkistyneitä oligosakkarideja voidaan myös ana-10 lysoida korkearesoluutiogeeliläpäisykromatografisesti käyttäen Bio-Gel® P-4 -helmipylvästä. Bio-Gel P:tä saadaan akryyliamidin ja N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidin sekapoly-merisaation tuloksena. P-4:llä on rajoitettu fraktioinnin käyttöalue 800-4000 daltonia. Se on valinnanvaraisesti geeli-15 suodatusaine johtuen sen polyakryyliamidirakenteesta. Oligosakkaridien geelisuodatusanalyysin yleiseksi katsaukseksi katso Yamashita ym., Meth. Enzymol. 83, Academic Press, 1982, ss. 105-126.
Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit kuvaavat edel-20 leen keksintöä, vaikka onkin ymmärrettävä, että keksintöä ei rajoiteta vain näihin erityisiin esimerkkeihin.
Esimerkki 1
Ovalbumiinioligosakkaridien eristäminen Aineisto ja menetelmät 25 Trypsiini-inhibiittorityyppi III-O (ovalbumiini) kanan munan valkuaisesta saatiin Sigma Chemical Co:lta, St. Louis, Mo., eränumero 128c - 8045. 2,5 g proteiinia dialysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan 4°C:ssa. Liuos kuivattiin pakastamalla, minkä jälkeen se liuotettiin tis-30 lattuun veteen ja pantiin hapolla pestyyn 150 ml:n hydrat- sinolyysiputkeen ja kuivattiin pakastamalla. Pakastekuivattua ainetta kuivattiin edelleen fosforipentoksidilla alennetussa paineessa huoneen lämpötilassa 7 päivän ajan, minkä jälkeen kuivausta jatkettiin kryogeenisesti alennetussa paineessa 35 (<10^ bar) aktiivihiilellä (-196°C) edelleen 7 päivän ajan.
11 83962
Hydratsinolyysi Näytteeseen lisättiin 20 ml ennen käyttöä tislattua vedetöntä hydratsiinia. Putki tiivistettiin vedettömällä, hapettomalla argonilla ilmakehän paineessa ja huoneen lämpö-5 tilassa (noin 20-25°C) ja kuumennettiin sitten vähitellen noin 100°C:een lisäten lämpötilaa noin 10°C:tta tunnissa.
Kun seosta oli lämmitetty noin 8,5 tuntia, reagoimaton hydratsiini poistettiin pyörivällä haihduttimella alennetussa paineessa ja jäljelle jäänyt hydratsiini poistettiin 10 toistuvalla yhteishaihdutuksella vedettömän tolueenin kanssa (5 x 3 ml) .
Re-N-asetylpinti
Re-N-asetylointi saatiin aikaan käyttämällä viisinkertaista ylimäärää etikkahapon anhydridiä vapaiden amino-15 ryhmien moolien lukumäärään nähden. Jäännös liuotetiin 254 mlraan kylmää (4°C), 0,5 molaarista etikkahapon anhydridi-liuosta, joka oli kyllästetyssä natriumbikarbonaatin vesi-liuoksessa, sitä inkuboitiin 10 minuutin ajan ja siihen lisättiin edelleen 13 ml etikkahapon anhydridiä, mitä seu-20 rasi 50 minuuttia kestänyt inkubaatio 20°C:ssa oligosakkaridin N-asetyloidun hydratsonijohdannaisen tuottamiseksi. Happokatalyysi
Yllä selostettu seos saatettiin sitten happokatalyy-siin lisäämällä 50 ml:a Dowex AG 50 x 12:ta (H+ -muoto) ja 25 lisäämällä näyte 500 ml:a Dowex 50 x 12:ta (200-400 mesh) (H+) sisältävään pylvääseen läsnäolevien Na+ -ionien poistamiseksi ja ei-pelkistyneiden oligosakkaridien tuottamiseksi.
Pylväs pestiin neljällä pylvään tilavuudella tislattua vettä ja pesunesteet yhdistettiin ja pakastekuivattiin.
30 Pylvään puhdistaminen
Epäpuhtaudet poistettiin selluloosapylväästä seuraavasti: Mikrokiteinen selluloosa (E. Merck) lajiteltiin koon mukaan sedimentoimalla tislatussa vedessä ja hienot hiukkaset erotettiin pois. Selluloosa kaadettiin 2,5 x 15 cm:n 35 suuruiseen kromatografiapylvääseen ja pestiin perusteellisesti tislatulla vedellä. Seuraavaksi pylväs pestiin i2 83962 kahdella pylvään tilavuudella metanolia ja sitten kahdella pylvään tilavuudessa butanolia, etanolia ja vettä suhteessa 4:1:1 tilavuuden mukaan (liuotin I). Pakastekuivattu näyte liuotettiin 25 ml:aan vettä ja siihen lisättiin 25 ml eta-5 nolia. Selluloosapylvään yläosaan lisättiin 100 ml butanolia ja tähän lisättiin sokerin, veden ja etanolin seos. Pylvään yläosaan lisätyt aineet sekoitettiin perusteellisesti ja niiden annettiin seistä kymmenen minuuttia ennen kuin nesteen annettiin virrata läpi. Pylväs pestiin viidellä 10 pylvään tilavuudella liuosta I, nämä pesunesteet kaadettiin pois. Pylväs pestiin seuraavaksi yhdellä pylvään tilavuudella metanolia ja sen jälkeen viidellä pylvään tilavuudella tislattua vettä. Nämä pesunesteet (vesi ja metanoli) kerättiin, väkevöitiin pyörivällä haihduttimella, suodatettiin (0,2 μΜ 15 Teflon® -membraani) ja lyofilisoitiin.
NMRilla osoitettiin, että ei-pelkistyneiden oligosakkaridien fraktio oli pääasiallisesti vapaa epäpuhtauksista ja sisälsi puhtausasteeltaan korkealuokkaisia ei-pelkistyneitä oligosakkarideja. Oligosakkaridinäytettä säi-20 lytettiin -20°C:n lämpötilassa.
Esimerkki 2
Fetuiinioligosakkaridien eristäminen Aineisto ja menetelmät
Fetuiini, joka on peräisin vasikan sikiön seerumi-25 tyyppi Ulista saatiin Sigma Chemical Co ilta, St. Louis,
Mo., F-2379, eränumero 53F-9630. 5 grammaa proteiinia dia-lysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan 4°Cissa. Liuos kuivattiin pakastamalla, minkä jälkeen se liuotettiin tislattuun veteen, pantiin hapolla pestyyn 150 mlin hydrat-30 sinolyysiputkeen ja pakastekuivattiin. Näytettä kuivattiin kryogeenisesti aktiivihiilellä (-196°C) 14 päivän ajan alennetussa paineessa (<10^ bar).
13 83962
Hydratsinolyysi Näytteeseen lisättiin 35 ml vedetöntä hydratsiinia. Putki tiivistettiin vedettömällä, hapettomalla argonilla ilmakehän paineessa ja sitä inkuboitiin 7,5 tunnin ajan 5 100°C:ssa. Inkubaation jälkeen reagoimaton hydratsiini poistettiin pyörivällä haihduttimella alennetussa paineessa ja jäljelle jäänyt hydratsiini poistettiin toistuvalla yhteishaihdutuksella vedettömän tolueenin kanssa (7x5 ml). Re-N-asetylointi 10 Re-N-asetylointi saatiin aikaan käyttämällä viisin kertaista ylimäärää etikkahapon anhydridiä vapaiden amino-ryhmien moolien lukumäärään nähden. Jäännös liuotettiin 500 mitan kylmää 0,5 molaarista etikkahapon anhydridiliuosta (4°C), joka oli kyllästetyssä natriumbikarbonaatin vesi-15 liuoksessa, sitä inkuboitiin 10 minuutin ajan ja siihen lisättiin edelleen 26 mitä etikkahapon anhydridiä, minkä jälkeen sitä inkuboitiin 50 minuutin ajan 20°C:ssa. Happokatalyysi
Yllä selostettu seos saatettiin sitten happokatalyy-20 siin lisäämällä 100 mitä Dowex AG 50 x 12:ta (H+ -muoto) ja lisäämällä näyte yhden litran Dowex AG 50 x 12:ta (200-400 mesh) (H+) sisältävään pylvääseen läsnäolevien Na+ -ionien poistamiseksi ja ei-pelkistyneen oligosakkaridin tuottamiseksi .
25 Pylväs pestiin kolmella pylvään tilavuudella tislat tua vettä ja pesunesteet yhdistettiin ja pakastekuivattiin. Pylvään puhdistaminen
Epäpuhtaudet poistettiin selluloosapylväästä seuraavasti: Mikrokiteinen selluloosa lajiteltiin koon mukaan 30 sedimentoimalla tislatussa vedessä ja hienot hiukkaset erotettiin pois. Selluloosa kaadettiin 2,5 x 15 cm:n suuruiseen kromatografiapylvääseen ja pestiin perusteellisesti tislatulla vedellä. Seuraavaksi pylväs pestiin kahdella pylvään tilavuudella metanolia ja sitten kahdella pylvään tilavuu-35 della butanolia, etanolia ja vettä suhteessa 4:1:1 tilavuuden mukaan (liuotin I). Pakastekuivattu näyte liuotettiin 14 83962 50 ml:aan vettä ja siihen lisättiin 50 ml etanolia. Sellu-loosapylvään yläosaan lisättiin 200 ml butanolia ja tähän lisättiin sokerin, veden ja etanolin seos. Pylvään yläosaan lisätyt aineet sekoitettiin perusteellisesti ja niiden an-5 nettiin seistä kymmenen minuutin ajan, ennen kuin nesteen annettiin virrata läpi. Pylväs pestiin kymmenellä pylvään tilavuudella liuotinta I, nämä pesunesteet kaadettiin pois. Seuraavaksi pylväs pestiin yhdellä pylvään tilavuudella metanolia ja sen jälkeen neljällä pylvään tilavuudella tis-10 lattua vettä. Nämä pesunesteet (vesi ja metanoli) kerättiin, väkevöitiin pyörivällä haihduttimella, suodatettiin (0,2 μΜ Teflon-membraani) ja lyofilisoitiin.
H NMR:lla (kuvio 5) osoitettiin, että ei-pelkisty-neiden oligosakkaridien fraktio oli pääasiallisesti vapaa 15 epäpuhtauksista ja sisälsi puhtausasteeltaan korkealuokkaisia ei-pelkistyneitä oligosakkarideja. Oligosakkaridifrak-tiota säilytettiin -20°C:ssa lämpötilassa.
Esimerkki 3
Transferriinioligosakkaridien eristäminen 20 Aineisto ja menetelmät
Ihmisen seerumin transferriini saatiin Sigma Chemical Co:lta, St. Louis, Mo., eränumero 93F-0195.
5 grammaa proteiinia dialysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan 4°C:ssa. Liuos pakastekuivattiin, liuotettiin 25 tislattuun veteen, pantiin hapolla pestyyn 150 ml:n hydrat-sinolyysiputkeen ja pakastekuivattiin.
Näytettä kuivattiin fosforipentoksidilla alennetussa paineessa huoneen lämpötilassa 2 päivän ajan, minkä jälkeen kuivausta jatkettiin kryogeenisesti alennetussa paineessa 30 (<106 bar) aktiivihiilellä (-196°C) edelleen 14 päivän ajan.
Hydratsinolyysi Näytteeseen lisättiin 35 ml ennen käyttöä tislattua, vedetöntä hydratsiinia. Putki tiivistettiin vedettömällä, hapettomalla argonilla ilmakehän paineessa ja sitä inkuboi-35 tiin 7,5 tunnin ajan 100°C:ssa. Inkubaation jälkeen 15 83962 reagoimaton hydratsiini poistettiin pyörivällä haihdutti-mella alennetussa paineessa ja toistuvalla yhteishaihdutuk-sella vedettömän tolueenin kanssa (8 x 5 ml).
Re-N-asetylpinti 5 Re-N-asetylointi saatiin aikaan käyttämällä viisin kertaista ylimäärää etikkahapon anhydridiä vapaiden amino-ryhmien moolien lukumäärään nähden. Jäännös liuotettiin 500 ml:aan kylmää 0,5 molaarista etikkahapon anhydridi-liuosta (4°C), joka oli kyllästetyssä natriumbikarbonaatin 10 vesiliuoksessa, sitä inkuboitiin 10 minuutin ajan ja siihen lisättiin edelleen 26 ml etikkahapon anhydridiä ja jatkettiin inkubointia 50 minuutin ajan 25°C:ssa.
Happokatalyysi
Yllä selostettu seos saatettiin sitten happokatalyy-15 siin lisäämällä 100 ml Dowex AG 50 x 12:ta (H+ -muoto) ja laittamalla näyte yhden litran Dowex AG 50 x 12:ta (H+) (200-400 mesh) sisältävään pylvääseen.
Pylväs pestiin kolmella pylvään tilavuudella tislattua vettä ja pesunesteet yhdistettiin ja pakastekuivattiin.
20 Pylvään puhdistaminen
Epäpuhtaudet poistettiin selluloosapylväästä seuraavasti: Mikrokiteinen selluloosa lajiteltiin koon mukaan sedimentoimalla tislatussa vedessä ja hienot hiukkaset erotettiin pois. Selluloosa kaadettiin 2,5 x 15 cm:n suuruiseen 25 kromatografiapylvääseen ja pestiin perusteellisesti tislatulla vedellä. Seuraavaksi pylväs pestiin kahdella pylvään tilavuudella metanolia ja sitten kahdella pylvään tilavuudella butenolia, etanolia ja vettä suhteessa 4:1:1 tilavuuden mukaan (liuotin I). Pakastekuivattu näyte liuotettiin 30 50 ml:aan vettä ja siihen lisättiin 50 ml etanolia. Sellu- loosapylvään yläosaan lisättiin 200 ml butanolia ja tähän lisättiin sokerin, veden ja etanolin seos. Pylvään yläosaan lisätyt aineet sekoitettiin perusteellisesti ja niiden annettiin seistä kymmenen minuutin ajan, ennen kuin nesteen annet-35 tiin virrata läpi. Pylväs pestiin kymmenellä pylvään 16 83962 tilavuudella liuotinta I, nämä pesunesteet kaadettiin pois. Seuraavaksi pylväs pestiin yhdellä pylvään tilavuudella metanolia ja sitten viidellä pylvään tilavuudella tislattua vettä. Nämä pesunesteet (vesi ja metanoli) kerättiin 5 ja väkevöitiin pyörivällä haihduttimella, suodatettiin (0,2 μΜ Teflon-membraani) ja lyofilisoitiin.
H NMR:lla osoitettiin, että ei-pelkistyneiden oligosakkaridien fraktio oli pääasiallisesti vapaa epäpuhtauksista, ja sitä säilytettiin -20°C:ssa.
10 Kokeiden 1-3 saantojen yhteenveto
Esimerkki Proteiinin Talteenotettujen Talteenotetut kokonais- oligosakkaridien hiilihydraatit % _määrä_kuivapaino_painon mukaan__ 1) Ovomukoidi 2,5 g 670 mg 26 % (25-30 %)* 2) Fetuiini 5,0 g 663 mg 13,3 % (16 %)* 15 3) Transferriini 5,0 g 287 mg 5,7 % (5,6 %)* * Teoreettinen talteenotto Esimerkki 4
Laajamittainen ei-pelkistyneiden oligosakkaridien 20 eristäminen fraktioimattomasta ihmiskorvan sylkirauhasesta 1) Ihmiskorvan sylkirauhaset leikattiin vasta kuolleilta vainajilta ja jäädytettiin (-20°C).
2) 100 g jäätynyttä kudosta viipaloitiin ohuesti, jäädytettiin nestemäisessä typessä, pulveroitiin käyttämällä 25 huhmaretta ja survinta ja lyofilisoitiin.
3) Sitten aines pestiin perusteellisesti vedettömällä asetonilla -10°C:ssa.
4) Glykoproteiini uutettiin homogenisoimalla näyte 1 litrassa 0,01 M Tris-HCl:a ja 0,1 M NaCl:a (pH 7,7) 30 4°C:ssa.
5) Homogenisoitu aine sentrifugoitiin 600 x g:ssä 15 minuutin ajan, sitten emäliuos kerättiin ja dialysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan 4°C:ssa.
6) Näyte kuivattiin pakastamalla, minkä jälkeen se 35 pantiin 150 ml:n hydratsinolyysiputkeen ja sitä kuivattiin kryogeenisesti 14 päivän ajan.
17 83962 7) Kuivattu näyte liuotettiin 20 ml:aan ennen käyttöä tislattua, vedetöntä hydratsiinia ja putki tiivistettiin kuivalla hapettomalla argonilla 1 ilmakehän paineessa.
8) Näytettä inkuboitiin 100°C:ssa 7 tunnin ajan.
5 9) Kun putki oli uudelleen avattu kuivassa argonilma- kehässä, reagoimaton hydratsiini poistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa 30°C:ssa. Loput hydratsiinijäännökset poistettiin yhteishaihdutuksella vedettömän tolueenin kanssa (7 x 5 ml tolueenia) .
10 10) Näyte re-N-asetyloitiin seuraavasti: a) Kuivattu näyte liuotettiin 250 ml:aan 0,5 M etikkahapon anhydridiä kyllästetyssä NaHCO^n vesiliuoksessa (4°C). 10 minuutin inkubaation jälkeen 4°C:ssa siihen lisättiin edelleen 10 ml 10 M etikkahapon anhydridiä ja 15 inkubointia jatkettiin 60 minuutin ajan 20°C:ssa.
+ , b) Na -ionit poistettiin ja tuotettiin ei-pelkisty-neitä oligosakkarideja ioninvaihtokromatografiällä käyttämällä 1000 ml:n Dowex AG 50W x 12 (H+) -pylvästä ja eluoi-malla näyte viidellä pylvään tilavuudella vettä.
20 11) Pakastekuivaamisen jälkeen ei-hiilihydraattiepä- puhtaudet poistettiin selluloosapylväskromatografiällä.
Näyte laitettiin 30 mitään mikrokiteistä selluloosaa sisältävään pylvääseen, joka oli ennen sitä tasapainotettu butanolilla, etanolilla ja vedellä suhteessa 4:1:1 tilavuuden 25 mukaan ja pesty 10 pylvään tilavuudella butanolia, etanolia ja vettä suhteessa 4:1:1 tilavuuden mukaan. Hiilihydraatti eluoitiin viidellä pylvään tilavuudella vettä käyttäen yhden pylvään tilavuutta metanolia transitioliuoksena.
12) Kun aine oli kuivattu pyörivällä haihduttimella 30 ja lyofilisoitu, se (160 g) tutkittiin 300 MHz 1H ydin- magneettisella resonanssispektroskopialla (kuvio 7) ja sen osoitettiin sisältävän puhtausasteeltaan korkealuokkaisia, peptidiepäpuhtauksista vapaita ei-pelkistyneitä oligosakkarideja.
ie 83962
Lukuisat muut esimerkit ovat ilmeisiä alalle koulutetulle henkilölle tämän julkaisun lukemisen jälkeen ilman, että poiketaan keksinnön hengestä ja alasta ja tarkoitus on, että kaikki muut sellaiset esimerkit sisällytetään oheisten 5 patenttivaatimusten piiriin.
Claims (17)
1. Menetelmä ei-pelkistyneiden oligosakkaridien eristämiseksi N-sitoutuneen oligosakkaridirakenteen omaa- 5 vasta glykoproteiinista tai glykohormonista, tunnet-t u siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) glykoproteiinin tai glykohormonin hydratsinolyy-si kuumentamalla olennaisesti vedetöntä ja olennaisesti suolatonta glykoproteiinia tai glykohormonia olennaisesti 10 vedettömän hydratsiinin läsnäollessa reaktio-olosuhteissa, jotka riittävät aiheuttamaan pilkkoutumisen N-sidospai-koissa seoksen tuottamiseksi, jossa on pääkomponenttina oligosakkaridin de-N-asetyloitu hydratsonijohdannainen, b) kohdan (a) hydratsonijohdannaisen N-asetyloimi-15 nen halutulla asetyloivalla aineella oligosakkaridin N- asetyloidun hydratsonijohdannaisen muodostamiseksi, c) kohdan (b) hydratsonijohdannaisen saattaminen happokatalyysiin ei-pelkistyneiden oligosakkaridien tuottamiseksi , 20 d) kohdan (c) ei-pelkistyneiden oligosakkaridien saattaminen selluloosapylväskromatografiseen käsittelyyn epäpuhtauksien poistamiseksi ja ei-pelkistyneiden oligosakkaridien talteenottamiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-25 n e t t u siitä, että hydratsinolyysi toteutetaan kuumentamalla lähtöaineita vähitellen alkulämpötilasta, joka on noin huoneen lämpötila, lämpötila-alueelle, joka on noin 65-100 °C, noin 2-10 tunnin aikana.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että N-asetyloiva aine on etikkahapon anhydridi.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että happokatälyysi toteutetaan käyttämällä vahvasti hapanta kationinvaihtohartsia.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n- 20 83962 n e t t u siitä, että kationinvaihto-hartsi on silloittu-nut styreeni/divinyylibentseenihartsi, jossa on funktionaalisia sulfonihapporyhmiä.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että selluloosapylväs on täytetty mikro- kiteisellä selluloosalla.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosapylväskromatografia toteutetaan pesemällä selluloosapylväs butanolin, etanolin ja 10 veden muodostamalla uuttoliuoksella epäpuhtauksien poistamiseksi ja sen jälkeen metanolin ja veden muodostamilla eluointiliuoksilla ei-pelkistyneiden oligosakkaridien saamiseksi.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, t u n- 15. e t t u siitä, että butanolin, etanolin ja veden suhde selluloosapylväässä käytettävässä uuttoliuoksessa on noin 4:1:1, tilavuuden mukaan.
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 5-10 pylvään tilavuutta uutto- 20 liuosta käytetään selluloosapylvääseen poistamaan epäpuhtaudet .
10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin yksi pylvään tilavuus metanolia ja sitten noin 5 pylvään tilavuutta tislattua 25 vettä käytetään selluloosapylvääseen eluoimaan ei-pelkis-tyneitä oligosakkarideja.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä ei-pelkistyneiden oligosakkaridien eristämiseksi N-sitoutu-neen oligosakkaridirakenteen omaavasta glykoproteiinista 30 tai glykohormonista, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) glykoproteiinin tai glykohormonin hydratsinolyy-si kuumentamalla olennaisesti vedetöntä ja olennaisesti suolatonta glykoproteiinia tai glykohormonia olennaisesti 35 vedettömän hydratsiinin läsnäollessa lämpötilaan, joka on II 2i 83962 noin 65 - 100 °C, reaktioajan ollessa noin 2-10 tuntia, N-sidospaikkojen pilkkoutumiseksi ja seoksen tuottamiseksi, jonka pääkomponenttina on oligosakkaridin de-N-asetyloitu hydratsonij ohdannainen, 5 b) kohdan (a) hydratsonijohdannaisen N-asetylointi käyttäen etikkahapon anhydridin ylimäärää kyllästetyn NaHC03-liuoksen läsnäollessa reaktiolämpötilan ollessa aluksi noin 4 °C, josta sitä nostetaan noin 20 - 25 °C:een oligosakkaridin N-asetyloidun hydratsonijohdannaisen muo- 10 dostamiseksi, c) kohdan (b) hydratsonijohdannaisen saattaminen happokatalyysiin saattamalla seos kosketukseen happaman kationinvaihtohartsin kanssa, joka muodostuu silloittu-neesta styreeni/divinyylibentseeni-hartsista, jossa on 15 funktionaalisia sulfonihapporyhmiä, Na* -ionien korvaami seksi H* -ioneilla ja ei-pelkistyneiden oligosakkakkaridien tuottamiseksi, d) kohdassa (c) saatujen ei-pelkistyneiden oligosakkaridien saattaminen seiluloosapylväskromatografiseen 20 käsittelyyn pesemällä selluloosapylväs butanolin, etanolin ja veden muodostamalla uuttoliuoksella epäpuhtauksien poistamiseksi, ja sen jälkeen pesemällä metanolin ja veden muodostamilla eluointiliuoksilla ei-pelkistyneiden oligosakkaridien talteenottamiseksi.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydratsinolyysi toteutetaan kuumentamalla lähtöaineita vähitellen alkulämpötilasta, joka on noin huoneen lämpötila, nostamalla lämpötilaa noin 10 °C:lla tuntia kohden.
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosapylväs on täytetty mikrokiteisellä selluloosalla.
14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että butanolin, etanolin ja veden 35 suhde selluloosapylväässä käytettävässä uuttoliuoksessa on 22 83 962 noin 4:1:1 tilavuuden mukaan.
15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että noin 5-10 pylvään tilavuutta uuttoliuosta käytetään selluloosapylvääseen epäpuhtauksien 5 poistamiseksi.
16. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi pylvään tilavuus metano-lia ja sen jälkeen noin 5 pylvään tilavuutta tislattua vettä käytetään selluloosapylvääseen ei-pelkistyneiden 10 oligosakkaridien eluoimiseksi.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi pylvään tilavuus metano-lia ja sen jälkeen noin 5 pylvään tilavuutta tislattua vettä käytetään selluloosapylvääseen ei-pelkistyneiden 15 oligosakkaridien eluoimiseksi. li 23 83962
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77298885 | 1985-09-06 | ||
| US06/772,988 US4719294A (en) | 1985-09-06 | 1985-09-06 | Isolation of unreduced oligosaccharides |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863592A0 FI863592A0 (fi) | 1986-09-05 |
| FI863592A FI863592A (fi) | 1987-03-07 |
| FI83962B FI83962B (fi) | 1991-06-14 |
| FI83962C true FI83962C (fi) | 1991-09-25 |
Family
ID=25096828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863592A FI83962C (fi) | 1985-09-06 | 1986-09-05 | Isolering av icke-reducerade oligosackarider. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4719294A (fi) |
| EP (1) | EP0215766B1 (fi) |
| JP (1) | JPS6263524A (fi) |
| AT (1) | ATE68213T1 (fi) |
| AU (1) | AU580686B2 (fi) |
| CA (1) | CA1266265C (fi) |
| DE (1) | DE3681865D1 (fi) |
| DK (1) | DK425186A (fi) |
| FI (1) | FI83962C (fi) |
| GR (1) | GR862279B (fi) |
| IE (1) | IE59088B1 (fi) |
| IL (1) | IL79953A0 (fi) |
| NO (1) | NO164478C (fi) |
| ZA (1) | ZA866774B (fi) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3528654A1 (de) * | 1985-08-09 | 1987-02-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von alkylierten hydroxylgruppenfreien glycosylfluoriden |
| US4719294A (en) * | 1985-09-06 | 1988-01-12 | Monsanto Company | Isolation of unreduced oligosaccharides |
| DE3752226T2 (de) * | 1986-12-11 | 1999-04-22 | Genzyme Corp | Ein Verfahren zur Herstellung eines 1-Amino-1-Deoxyoligosaccharid-Derivats |
| US5324828A (en) * | 1986-12-11 | 1994-06-28 | Genzyme Corporation | 1-amino-1-deoxyoligosaccharides and derivatives thereof |
| US5079353A (en) * | 1987-12-02 | 1992-01-07 | Chembiomed, Ltd. | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
| US5344870A (en) * | 1987-12-02 | 1994-09-06 | Alberta Research Council | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
| DE3923365A1 (de) * | 1989-07-14 | 1991-01-24 | Suedzucker Ag | Oligosaccharidalditole mit amidbindung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| EP0462795A3 (en) * | 1990-06-21 | 1993-02-24 | Oxford Glycosystems Limited | Isolation of glycans |
| GB9013830D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'o-linked type'oligosaccharides |
| GB9013831D0 (en) * | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-linked type'oligosaccharides |
| GB9013828D0 (en) | 1990-06-21 | 1990-08-15 | Oxford Glycosystems Ltd | Release and isolation of unreduced'n-and o-linked type'oligosaccharides |
| DE69130136T2 (de) * | 1990-06-21 | 1999-03-11 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | Automatisiertes Verfahren zur Spaltung von Biomolekülen |
| US5422079A (en) * | 1990-06-21 | 1995-06-06 | Oxford Glycosystems Limited | Automated process equipment |
| ATE162794T1 (de) * | 1992-06-01 | 1998-02-15 | Biomembrane Inst | Schrittweise entfernung von monosacchariden vom reduzierenden ende von oligosacchariden und verwendungen davon |
| US5411892A (en) * | 1993-08-13 | 1995-05-02 | University Of Washington | Method and apparatus for carbohydrate analysis |
| US5585473A (en) * | 1994-12-09 | 1996-12-17 | The Biomembrane Institute | Compounds and methods for monosaccharide analysis |
| EP1310503A4 (en) * | 2000-08-02 | 2005-10-05 | Takara Bio Inc | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HYDRAZINOMONOSACCHARIDE DERIVATIVES AND THEIR USE |
| US20040096933A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-05-20 | Yunping Huang | Method of preparation of oligosaccharides |
| US20040096948A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-05-20 | Yunping Huang | Glycoprotein cleavage protocol for oligosaccharide analysis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4362720A (en) * | 1977-04-14 | 1982-12-07 | Chembiomed Ltd. | Synthesis of 2-amino-2-deoxyglycoses and 2-amino-2-deoxyglycosides from glycals |
| US4719294A (en) * | 1985-09-06 | 1988-01-12 | Monsanto Company | Isolation of unreduced oligosaccharides |
-
1985
- 1985-09-06 US US06/772,988 patent/US4719294A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-09-05 DE DE8686870123T patent/DE3681865D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-05 AT AT86870123T patent/ATE68213T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-09-05 CA CA517634A patent/CA1266265C/en not_active Expired
- 1986-09-05 GR GR862279A patent/GR862279B/el unknown
- 1986-09-05 IE IE237186A patent/IE59088B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-09-05 FI FI863592A patent/FI83962C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-09-05 ZA ZA866774A patent/ZA866774B/xx unknown
- 1986-09-05 DK DK425186A patent/DK425186A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-09-05 EP EP86870123A patent/EP0215766B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-05 JP JP61209417A patent/JPS6263524A/ja active Granted
- 1986-09-05 NO NO863564A patent/NO164478C/no unknown
- 1986-09-05 AU AU62358/86A patent/AU580686B2/en not_active Ceased
- 1986-09-05 IL IL79953A patent/IL79953A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-11-12 US US06/929,962 patent/US4736022A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6235886A (en) | 1987-03-12 |
| NO863564L (no) | 1987-03-09 |
| AU580686B2 (en) | 1989-01-27 |
| FI863592A0 (fi) | 1986-09-05 |
| IE59088B1 (en) | 1994-01-12 |
| DK425186D0 (da) | 1986-09-05 |
| ATE68213T1 (de) | 1991-10-15 |
| EP0215766A2 (en) | 1987-03-25 |
| FI863592A (fi) | 1987-03-07 |
| EP0215766B1 (en) | 1991-10-09 |
| CA1266265A (en) | 1990-02-27 |
| NO164478B (no) | 1990-07-02 |
| DE3681865D1 (de) | 1991-11-14 |
| IL79953A0 (en) | 1986-12-31 |
| DK425186A (da) | 1987-03-07 |
| JPH0579079B2 (fi) | 1993-11-01 |
| FI83962B (fi) | 1991-06-14 |
| EP0215766A3 (en) | 1988-07-27 |
| US4719294A (en) | 1988-01-12 |
| NO164478C (no) | 1990-10-10 |
| GR862279B (en) | 1987-01-12 |
| NO863564D0 (no) | 1986-09-05 |
| CA1266265C (en) | 1990-02-27 |
| JPS6263524A (ja) | 1987-03-20 |
| IE862371L (en) | 1987-03-06 |
| ZA866774B (en) | 1987-07-29 |
| US4736022A (en) | 1988-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI83962C (fi) | Isolering av icke-reducerade oligosackarider. | |
| Finne et al. | [18] Preparation and fractionation of glycopeptides | |
| Krusius et al. | Structural features of tissue glycoproteins: Fractionation and methylation analysis of glycopeptides derived from rat brain, kidney and liver | |
| Patel et al. | [5] Release of oligosaccharides from glycoproteins by hydrazinolysis | |
| Arumugham et al. | Structures of the asparagine-linked sugar chains of laminin | |
| CORFIELD et al. | The action of sialidases on substrates containing O-acetylsialic acids | |
| Vretblad | Purification of lectins by biospecific affinity chromatography | |
| Valent et al. | A general and sensitive chemical method for sequencing the glycosyl residues of complex carbohydrates | |
| Fukuda et al. | Studies on the hydrazinolysis of glycoproteins Core structures of oligosaccharides obtained from porcine thyroglobulin and pineapple stem bromelain | |
| Rylatt et al. | Autorosette inhibition factor: isolation and properties of the human plasma protein | |
| Muramatsu et al. | Characterization of glycopeptides isolated from membranes of F9 embryonal carcinoma cells | |
| Matta et al. | Glycosidases of Aspergillus niger: IV. Purification and characterization of α-mannosidase | |
| Rice et al. | Large-scale preparation and characterization of N-linked glycopeptides from bovine fetuin | |
| SHIMIZU et al. | Plant mucilages. XLIII. A representative mucilage with biological activity from the leaves of Hibiscus rosa-sinensis | |
| Yang et al. | Separation and preparation of N-glycans based on ammonia-catalyzed release method | |
| Lisowska | The degradation of M and N blood group glycoproteins and glycopeptides with alkaline borohydride | |
| JPH0687903A (ja) | グリカンの単離 | |
| Damm et al. | Sialic acid patterns in N‐linked carbohydrate chains. Structural analysis of the N‐acetyl‐/N‐glycolyl‐neuraminic‐acid‐containing N‐linked carbohydrate chains of bovine fibrinogen | |
| Neiderhiser et al. | The purification and properties of the glycoproteins of pig gallbladder bile | |
| JPH04148865A (ja) | 糖類の標識方法及び糖類標識用キット | |
| Edge et al. | Characterization of the O-glycosidically linked oligosaccharides of rat erythrocyte membrane sialoglycoproteins | |
| Horton et al. | Characterization of 2-amino-2, 6-dideoxy-D-glucose as a constituent of the lipopolysaccharide antigen of Pseudomonas aeruginosa immunotype 4 | |
| US5108613A (en) | Process for the isolation and purification of monosialoganglioside from a starting lipidic mixture by complexation with alfa-cyclodextrin and related intermediate compound | |
| Krusius et al. | Differences between the carbohydrate units of cell-surface glycoproteins of moust B-and T-lymphocytes | |
| EP0540790B1 (en) | Method of obtaining monosialogangliosides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MONSANTO COMPANY |