DE602004004215T2

DE602004004215T2 - Verfahren zur Herstellung von hochreinen, niedrigmolekularen Heparinen

Info

Publication number: DE602004004215T2
Application number: DE602004004215T
Authority: DE
Inventors: Pietro Bianchini; Lino Liverani; Giuseppe Mascellani; Stefania Tiddia
Original assignee: Opocrin SpA
Current assignee: Opocrin SpA
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2024-08-27
Also published as: ITMI20031679A1; EP1510528A1; EP1510528B1; US20050049222A1; DE602004004215D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von hochreinen, niedrig molekulargewichtigen Heparinen.
Stand der Technik
Niedrig molekulargewichtige (LMW) Heparine mit dem Namen (internationaler markenfreier Name, INN) Enoxaparin, Dalteparin, Nadroparin, Parnaparin, Tinzaparin sind bekannt und deren Herstellungsverfahren sind ebenfalls bekannt.
In der EP 40144 werden niedrig molekulargewichte Heparine mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000 Daltons sowie ein Verfahren zum Herstellen niedrig molekulargewichter Heparine mittels eines wasserlöslichen Heparinesters, beispielsweise eines benzylierten Natriumsalzes, hergestellt aus einem Benzethoniumheparinatzwischenprodukt, wobei der Ester einer Depolymerisation mit Basen, beispielsweise mit Natriumhydroxid, unterworfen wird, um die gewünschten Heparinfraktionen durch Hydrolyse zu ergeben, beschrieben.
In der WO 80/01383 korrespondierend zu der US 4,303,651 werden aus 14 bis 18 Saccharideinheiten bestehende und durch eine sehr präzise Sequenz gekennzeichnete Fragmente von Heparin beschrieben. Die sich auf Dalteparin (der INN des in der US 4,303,651 erhaltenen Produkts) beziehenden Arzneibuchspezifikationen definieren die nachfolgenden Molekulargewichtsverteilungsprofile: durchschnittliches Molekulargewicht zwi schen 5.600 und 6.400 Daltons, Fraktionen mit Molekulargewichten von weniger als 300 < 13,0 %, Fraktionen mit einem Molekulargewicht von mehr als 8.000 zwischen 15,0 % und 25,0 %.
Die IT 1,248,557 sowie die dazu korrespondierende US 5,389,618 beanspruchen ein Enoxaparin, das durch ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 3.500 und 5.500 Daltons und durch Molekulargewichtsfraktionen von weniger als 2.000 zwischen 9 % und 20 % sowie durch Molekulargewichtsfraktionen von mehr als 8.000 zwischen 5 % und 20 % gekennzeichnet ist. Das Herstellungsverfahren hiervon ist im Wesentlichen das aus der EP 40144 bekannte und umfasst eine Depolymerisation des Heparinbenzylesters durch Hydrolyse. Verglichen mit diesem bekannten Verfahren deutet die IT 1,248,557 an, dass ein Veresterungsgrad des Heparinesters zwischen 9,5 % und 14 % die wesentliche Bedingung dafür ist, um die erwartete Depolymerisationskonformität zu erreichen.
In der EP 40144 und der IT 1,248,557 wird das Heparinbenzethoniumsalzzwischenprodukt, welches lediglich in organischem Lösemittel löslich ist, eingesetzt, um den Heparinbenzylester zu erhalten. Das Zwischenprodukt wird durch Präzipitation mit Wasser hergestellt und ist mit einer gelatinösen pechartigen Konsistenz nicht leicht waschbar. Daher liegt bei diesem Verfahren bis zu dem Endprodukt selbst immer eine beträchtliche Benzethoniumkontamination vor mit einem daraus folgenden Verlust an Reinheit, mit daraus folgenden Beeinträchtigungen der Farbe des Produktes und dessen Stabilität und vermutlich dessen Toxizität.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist im Wesentlichen die Verbesse rung des Herstellungsverfahrens der EP 40144 , um Endprodukte von höherer Reinheit und ohne Farbe zu erhalten.
Um diese Aufgabe zu lösen, und um andere Vorteile, welche nachfolgend beschrieben werden, zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von hochreinen, niedrig molekulargewichtigen Heparinen mit einem Durchschnittsmolekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000 Daltons durch die Schritte des Bildens eines Heparinbenzethoniumsalzzwischenproduktes, ausgehend von diesem danach eines wasserlöslichen Heparinesters sowie des Unterwerfens des Esters einer Depolymerisation mit Basen, um die niedrig molekulargewichtigen Heparine zu bilden, bereit, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest der Schritt der Heparinbenzethoniumsalzbildung auf einer Feststoffmatrix aus inertem Adsorptionsmittel aus Filtermaterial oder aus Filterhilfe durchgeführt wird, wobei die niedrig molekulargewichtigen Heparine am Ende durch Reduzieren der vorliegenden Verunreinigungen mit Borhydrid einem Aufreinigungsschritt unterworfen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jeder Schritt des Verfahrens auf der aus Filterhilfe bestehenden Matrix durchgeführt, welche vorzugsweise durch Zentrifugation lediglich während dem Schritt der Bildung der niedrig molekulargewichtigen Heparinen und vor der Reduktion mit Borhydrid entfernt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise herausgefunden, dass das auf der aus Filterhilfe bestehenden Matrix adsorbierte Benzethoniumsalz, welches als ein Feststoffsubstrat wirkt, mit NaCl-Lösungen, vorzugsweise mit einer Molarität von ≤ 1,0 M, gewaschen werden kann, um die selektive Entfernung von Verunreinigungen, wie beispielsweise von Nukleinsäuren und Polysacchariden, wie beispielsweise in dem Heparin vorliegendes Dermatansulfat, Chondroitinsulfaten und Heparinsulfat, zu erreichen, sowie mit Wasser gewaschen werden kann, um das Reagenz Benzethoniumchlorid vollständig zu entfernen. Vorzugsweise müssen die endgültigen Waschwasser ein UV-Absorptionsvermögen bei 270 nm von weniger als 0,5 Einheiten aufweisen.
Des Weiteren ist herausgefunden worden, dass die Filterhilfe-Benzethoniumsalz-Mischung wirksam alle in dem Verfahren der EP 40144 vorgeschlagenen nachfolgenden chemischen Reaktionen stattfinden lässt einschließlich der Veresterung sowie der Hydrolyse, und dass das Feststoffsubstrat des Weiteren das Einfangen von Chromophoren, welche sich bei der zweiten Spaltungsreaktion gebildet haben, welche ebenfalls bei der Depolymerisation stattfindet, ermöglicht, was im Hinblick auf die Reinheit des erhaltenen Heparins von großem Vorteil ist. Das Filtermaterial oder die Filterhilfe wird aus allen bei der Polymerfiltration eingesetzten Cohilfsmitteln, insbesondere Kieselgur, Perlit (beispielsweise Europerl 500) sowie Diacel CF/S, ausgewählt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch herausgefunden worden, dass durch das Unterwerfen des endgültigen niedrig molekulargewichtigen Heparins einer Reduktion mit Borhydrid, beispielsweise mit NaBH₄ in Wasser bei einem pH von 8,2 bis 8,6, beispielsweise in einer Menge zwischen 16 und 30 mg/g Rohenoxaparin, die gewünschte Fraktion erhalten wird, beispielsweise Enoxaparin mit einem höheren Grad an Reinheit und mit der Eigenschaft, über die Zeit in wässriger Lösung stabil zu bleiben, ohne gefärbt zu werden und ohne Kontaminanten vom Benzyltyp, deren Signale häufig in derzeitig bekannten Produkten durch ¹³C-NMR-Spektren bei ungefähr 132 ppm oder durch ¹H- NMR-Spektren mit chemischen Verschiebungen von ungefähr 7,5 ppm detektierbar sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist herausgefunden worden, dass in Abwesenheit des letzten Reinigungsschrittes durch Reduktion Enoxaparin oft gefärbt ist und dessen wässrige Lösungen außerhalb der Spezifikation liegen.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erweist sich insbesondere für die Herstellung von Enoxaparin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3.500 und 5.500 Daltons und mit 12 % bis 20 % Fraktionen mit einem Molekulargewicht von weniger als 2.000 Daltons und mit zwischen 68 % und 88 % Fraktionen mit einem Molekulargewicht innerhalb eines Bereiches zwischen 2.000 und 8.000 Daltons geeignet.
Für die Zwecke des weiteren Verstehens der Eigenschaften und der Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend nicht beschränkende Beispiele der praktischen Durchführung beschrieben.
Die Messungen der Molekulargewichtsverteilungsprofile wurden durch SE.HLPC mit den Standards und unter den Bedingungen, welche in dem europäischen Arzneibuch (Monograph 01/2002:0828) beschrieben worden sind, durchgeführt. Aktivitätsmessungen, Reinheitsevaluierungen, Identifikationsuntersuchungen und alle anderen Untersuchungen wurden im Einklang mit dem europäischen Arzneibuch 2002 durchgeführt.
Beispiel 1
Herstellung von Enoxaparin mittels: Isolieren von Heparinbenzethonium salz auf Filterhilfe, Bildung von Heparinbenzylesternatriumsalz auf Filterhefe, Hydrolyse des auf der Filterhilfe getragenen Benzylesters und Isolierung von Enoxaparin.
Beispiel 1a
Heparinbenzethoniumsalz
44 kg Wasser und 8,8 kg Benzethoniumchlorid werden in einen geeigneten Reaktor A eingeführt und auf 50 °C bis 56 °C erhitzt und gerührt, bis dieses aufgelöst ist.
33 kg Wasser und 3,3 kg Heparin werden in einen anderen Reaktor B eingeführt, auf 30 °C bis 36 °C erhitzt und für wenigstens 60 Minuten bis zur Auflösung gerührt.
Die Lösung in dem Reaktor B wird mit Natriumhydroxidlösung auf einen pH von ~ 8,5 eingestellt. Zu der Lösung A werden 3,3 kg der Filterhilfe Europerl 500^® zugefügt. Die Lösung B wird dann unter Rühren tropfenweise über eine Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden in den Reaktor A bei 55 °C bis 65 °C zugegeben.
Am Ende der Zugabe wird für 0,5 Stunden weitergerührt und erhitzt.
Die Masse wird zentrifugiert und der erhaltene Kuchen wird mit 130 Litern Wasser, welches vorher auf 50 bis 56 °C erhitzt worden ist, gewaschen.
Der Kuchen wird dann in einen Reaktor überführt, in dem dieser durch heftiges Schütteln mit 200 Litern einer 1 M Lösung von NaCl für 6 Stunden bei einer Temperatur von 50 bis 56 °C gemahlen wird.
Das Präzipitat wird in einer Zentrifuge gesammelt, das Filtrat wird verworfen und das Waschverfahren wird dreimal jeweils mit 180 Litern heißem Wasser wiederholt. Das Waschen wird wiederholt, bis die endgültige Waschlösung (1 bis 10-fach verdünnt) ein Absorptionsvermögen bei 270 nm von < 0,5 aufweist.
Der Kuchen wird aus der Zentrifuge entfernt und unter Vakuum bei 60 °C für 26 Stunden bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von 1,51 % gemäß K.F. getrocknet.
Es werden 12,44 kg von auf Filterhilfe getragenem Heparinbenzethoniumsalz erhalten.
Beispiel 1b
Reinigung von Rohheparin durch Wiedergewinnen aus Benzethoniumsalz
100 g Rohheparin enthaltend ungefähr 3,5 % Dermatansulfat (bestimmt durch sterische Ausschlussflüssigkeitschromatographie auf zwei in Reihe geschalteten Säulen TSK 2000 SW (60 × 0,75) sowie TSK 3000 SW (60 × 0,75) sowie einen UV-Detektor bei 205 nm) und kontaminiert mit Nukleinsäuren (von denen im Einklang mit dem europäischen Arzneibuchtest eine Lösung von 40 mg in 10 ml Wasser ein Absorptionsvermögen bei 260 und 280 nm von größer als 0,750 bzw. 0,540 aufweist) werden mit 267 g Benzethoniumchlorid auf 100 g Filterhilfe (Diacel CF/S^®) unter den in dem Beispiel 1a beschriebenen Bedingungen einer Salzbildung unterworfen.
Am Ende der Reaktion wird das Präzipitat mit einem Buckner-Trichter gesammelt und unter Vakuum verpresst. Der Kuchen wird in 2,5 Litern einer 0,5 M NaCl-Lösung resuspendiert und für 1 Stunde bei 50 °C gerührt, erneut filtriert und in einem Buckner-Trichter verpresst. Der Kuchen wird erneut in 2,5 Litern einer 1 M NaCl-Lösung resuspendiert und für 1 Stunde bei 50 °C gerührt, dann wieder filtriert und in 2,5 Litern Wasser durch Rühren bei 50 °C resuspendiert.
Das Waschen mit Wasser wird wiederholt. Der Kuchen wird letztlich in 1,5 Litern einer 2 M NaCl-Lösung suspendiert und für 1 Stunde bei ungefähr 45 °C unter Schütteln inkubiert. Die Diacel CF/S^®-Filterhilfe wird abfiltriert und der Kuchen wird auf dem Filter mit 0,5 Litern einer 1 M NaOAc-Lösung gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt. Die Lösung wird auf einen pH von 6,2 eingestellt und 1,8 Volumen Methanol werden zugegeben. Reines Heparin wird präzipitiert, welches durch Filtration gesammelt wird, und getrocknet.
Es werden 94 g Heparin erhalten, welches 0,02 % Dermatansulfat mit einem UV Absorptionsvermögen bei 260 und 280 nm von 0,095 bzw. 0,045 enthält.
Nukleinsäuren und Dermatansulfat wurden dekomplexiert und selektiv von dem Benzethoniumsalz mit 0,5 M bzw. 1,0 M Lösungen entfernt.
Beispiel 1c
Heparinbenzylesternatriumsalz getragen auf Filterhilfe
132 g einer in Beispiel 1a hergestellten Heparinbenzethoniumsalz-Filterhilfe und 935 g N,N-Dimethylformamid werden in einem geeigneten Reaktor eingeführt und für 2 Stunden bei 40 bis 46 °C gerührt. Die Wasserbadtemperatur wird auf 20 °C verringert und über eine Zeitspanne von 30 Minuten werden 110 g Benzylchlorid zugegeben; die Masse wird dann für 7 Stunden bei 33 °C ± 3 °C gerührt. Nachdem die Reaktionsmischung auf 20 °C ± 6 °C abgekühlt worden ist, werden 1600 g einer Lösung von Methanol enthaltend 210 g wasserfreies Natriumacetat über einen Zeitraum von 2 Stunden zugegeben. Die Masse wird für weitere 12 Stunden bei 20 °C ± 6°C gerührt. Die Reaktionsmasse wird durch einen Buckner-Trichter unter Vakuum filtriert und wiederholt über dem Filter und in dem Reaktor durch Längsschütteln für 8 Stunden mit einer Gesamtmenge von 3200 g Methanol enthaltend 320 g wasserfreies Natriumacetat in Lösung gewaschen.
Nach den Methanol/Natriumacetat-Wäschen wird das Präzipitat in 2000 g Aceton suspendiert und für weitere 6 Stunden bei ungefähr 20 °C gerührt. Das Präzipitat wird auf dem Filter gesammelt, unter Vakuum mit Druck beaufschlagt und unter Vakuum in einem Trockner bei 50 °C für 24 Stunden getrocknet. Es werden 74 g Heparinnatriumbenzylester getragen auf Filterhilfe (LE2711) erhalten. Gemäß einer Untersuchung beträgt der Filterhilfengehalt dieses Esters 37,3 % und der Natriumacetatgehalt 16,1 %.
Die durch HPLC evaluierte Reinheit des Esters beträgt 44,5 %.
Veresterungsgrad:

– gemessen durch Entfernen des Benzylalkohols aus der Hydrolyse = 8,83 %;
– gemessen in Bezug zu der veresterten Molarfraktion durch Integrierren der ¹H-NMR-Signale = 57 %.

Dermatansulfatgehalt < 0,02 %

Beispiel 1d
Alkalische Hydrolyse des Esters und nachfolgende Depolymerisation durch Spaltung durch β-Elimination auf veresterter Uronsäure und Isolierung von Enoxaparin
Die Heparinbenzylester-/Filterhilfe-Mischung, welche wie in Beispiel 1c erhalten worden ist, enthält ~ 40 % Filterhilfe, ungefähr 16 % Natriumacetat als Kontaminante und ungefähr 44 % Hepaxinnatriumester. Diese Prozentzahlen sind wie in dem nächsten Beispiel 1.2 angegeben abgeschätzt.
Beschreibung der Hydrolyse
2,40 kg der Benzylester-/Filterhilfe-Mischung wird in 8 Litern gereinigtem Wasser suspendiert und unter Schütteln bei 60 °C erhitzt, um die Entfernung des Esters von dem festen Träger zu fördern und dessen Solubilisierung zu fördern.
800 ml 1 N Natriumhydroxid und Wasser werden zu der Lösung zugegeben, um die Esterkonzentration auf ungefähr 10 % zu bringen und die Normalität des Natriumhydroxids auf ungefähr ≤ 0,1 N zu bringen. Die Mischung wird auf 60 °C erhitzt.
Die Reaktion findet für 45 Minuten statt, wobei während dieser Zeit der pH-Wert überprüft wird, um sicherzustellen, dass dieser bei ≥ 11,0 verbleibt. Sofern erforderlich, wird Natriumhydroxid zugegeben, wird die Lösung abgekühlt und mit 0,1 N Salzsäure neutralisiert. Die Lösung wird filtriert. Natriumacetat wird zu dem Filtrat in einer ausreichenden Menge zugegeben, um 12 % (Gew.-%) zu erhalten, und der pH-Wert wird auf 6,0 ± 0,2 eingestellt, wonach dieses mit drei Volumen Methanol präzipitiert wird. Das Präzipitat wird gesammelt und getrocknet. Es werden 0,73 kg depolymerisiertes Rohheparin in der Form des Natriumsalzes erhalten.
Beispiel 1.2
Untersuchung des Hydrolyseverfahrens in Verbindung mit dem Veresterungsgrad
Aus drei unterschiedlichen injizierbaren Heparinen mit den Batchnummern 15652, 16517, 16546, welche durch die Salzbildung mit dem Benzethoniumverfahren des Beispiels 1a sowie durch die Veresterung gemäß Beispiel 1c erhalten worden sind, wurden industrielle Chargen erhalten, von denen die Proben HL 2709, HL 2710, HL 2711 entfernt wurden, und zwar entweder für die analytische Charakterisierung oder für die Untersuchung des Hydrolyseverfahrens in Verbindung mit deren Veresterungsgrad.
Die Reinheit der Proben wurde nach der Extraktion des gesamten wasserlöslichen Materials aus der Filterhilfe und Messung der resultierenden Lösung durch HP.SEC durch Vergleichen der Fläche unter der Kurve der Probe unter Untersuchen mit einer aus Heparin bestehenden internen Referenz vermessen.
Die Menge der Filterhilfe wurde nach der Extraktion der löslichen Stoffe, nach dem Waschen der Filterhilfe, nach dem Trocknen und nach dem Wiegen bestimmt.
Der Gehalt an NaOAc-Kontaminante wurde durch HP.SEC oder durch ionische HPLC auf Anionenaustauschsäulen und einen Leitfähigkeitsdetektor (DXCOO Dionex) bestimmt.
Der Veresterungsgrad wurde durch Messen des aus der Verseifung des Esters bei 0 °C (Arzneibuch) stammenden Benzylalkohols mit HPLC bestimmt. Alternativ dazu wurde die veresterte molare Fraktion IdoA-COO-CH₂-C₆H₅/(IdoA-COOH + IdoACOO-CH₂-C₆H₅) mittels einer Berechnung basierend auf dem Integrieren der Signale der 5 aromatischen Protonen bei ungefähr 7,5 ppm sowie der 2 Benzylprotonen des reduzierenden Anomers von Uronsäuren und Glucosamin bestimmt und die H₅ der IdoA2SO₃ liegen in dem ¹H-NMR-Spektrum der aus der Filterhilfe extrahierten Esterlösung zwischen 4,5 und 5,7 ppm.
Für die NMR spektroskopischen Untersuchungen war es dienlich, die löslichen Substanzen aus der Filterhilfe zu extrahieren und die Lösung zu lyophilisieren. Mit dem lyophilisierten Produkt wurden NMR-Tests durchgeführt.
Die LE2709-, LE2710- und LE2711-Proben wurden charakterisiert, analysiert und untersucht, um den Veresterungsgrad entweder durch Messen von Benzylalkohol mit HPLC oder mit ¹H-NMR zu verifizieren. Die Proben wurden durch das Verfahren in Beispiel 1d hydrolysiert und ergaben einen Anstieg des niedrig molekulargewichtigen Heparins der Chargennummern HL2878, HL2879 und HL2880. Die Werte der Veresterungsgrade in den 2 Messeinheiten sind in der Tabelle 1.2 III dargestellt.
Tabelle 1.2 III
Unter Bezugnahme auf diese Tabelle entspricht ein Veresterungsgrad von 11,04 Gew.-% einer Veresterung von 72 % aller erhältlichen Carboxyle mit Heparinmolekülen (es liegen ungefähr 13000/600 ~ 22 vor). Dies bedeutet, dass lediglich 28 % der Carboxyle (gleich ~ 6 Carboxylen mit Heparin) frei verbleiben, d.h. nicht verestert sind.
Es sollte insofern beachtet werden, dass zusätzlich zu wesentlichen Schritten des Herstellungsverfahrens ein partieller Veresterungsgrad, wie beispielsweise der zu der Molarfraktion von 72 % korrespondierende, im Wesentlichen auch in der EP 40144 (Seite 21, Zeilen 31-33 der EP 40144 ) gelehrt wird.
Die vorstehende Tabelle unterstreicht ebenfalls, dass in dem tatsächlichen Fall Enoxaparine mit Molekulargewichtswerten und Oligomerfraktionen von < 2000 Da und > 8000 Da, wie in diesem Patent spezifiziert, mit Veresterungsgraden von 8,69 % und 8,83 %, d.h. niedriger als dem in der IT 1,248,557 als kritisch angegebenen Bereich (9,5 %-14 %), erhalten werden.
Beispiel 1.3
Kritische Parameter der Hydrolyse für denselben Veresterungsgrad Die Hydrolyse wurde mit einer einzelnen Charge von Heparinbenzylesternatriumsalz für denselben Veresterungsgrad unter unterschiedlichen Bedingungen an NaOH-Konzentration und Temperatur durchgeführt.
Die relativen Tests wurden mit der vorstehend als LE2710 identifizierten Charge an Ausgangsester, d.h. mit 8,69 Gew.-% Veresterungsgrad, durchgeführt und sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
HYDROLYSE- UND DEPOLYMERISATIONSTESTS

Ausgangsester: LE2710 Benzylkonzentration: ungefähr 3800 ppm gleich 3,8 %

Anmerkung: In der Spalte "Benzylkonzentration" sind die Werte ausgedrückt in Bezug zu dem die Filterhilfe und das Natriumacetat enthaltenden Rohester in ppm angegeben. Der 8,69 %-Wert wurde in Relation zu der Esterreinheit (44 %) erhalten.
Die Hydrolyseschritte umfassen wenigstens zwei Reaktionen:

– Esterhydrolysereaktion, vorwiegend
– β-Eliminationsreaktion, gleichzeitig.

Die Reaktion, welche zu der Depolymerisation führt, ist im Wesentlichen eine β-Elimination. Um ein MWw von ~ 4500 zu erreichen, ist es ausreichend, dass von ungefähr 15 bis 16 veresterten Carboxylen lediglich ungefähr 3 Carboxyle hydrolysiert werden.
Möglicherweise ist daher der Parameter, welcher diesen Verfahrensschritt steuert, nicht nur der Veresterungsgrad des Benzylesterzwischenproduktes, da bei derselben Charge LE 2710 mit einem Veresterungsgrad von 8,69 % beobachtet wird, dass ein Molekulargewicht von 4141 lediglich mit 0,1 N NaOH (und nicht mit 1N) und lediglich bei einer Temperatur von 60 °C (siehe insbesondere LE2710) erhalten wird.
Mit demselben Ester wird bei 0 °C und bei 85 °C ein MWw von 11.813 (siehe LE2710/0°) bzw. ein MWw von 3628 (siehe LE270/85°) erhalten.
Das MWw von 11.813 zeigt, dass im Wesentlichen keine Depolymerisation stattgefunden hat, wohingegen das Molekulargewicht MWw von 3628 auf eine fortgeschrittene Depolymerisation hinweist.
Daher zeigen diese Tests, dass bei diesem Schritt für die Depolymerisation nicht so sehr der Veresterungsgrad, welcher, wenn in Molfraktionen ausgedrückt, 58 % beträgt (beispielsweise LE 2710), kritisch ist wie eine geringe Menge an Estern, welche gleichzeitig eine Hydrolyse und eine Spaltung unterläuft. Diese Menge entspricht, wenn in Molfraktionen ausgedrückt, in dem Beispiel LE 2710 ungefähr 12 %. Eine Menge von 12 % in Molfraktionen entspricht, wie in der IT 1,248,557 berichtet, ungefähr 1,8 bis 2,0 %, wenn als Gewichtsprozent (Benzylalkohol/Ester) ausgedrückt.
Beispiel 2
Reinigung von Enoxaparin durch Reduktion mit Borhydriden
Depolymerisiertes rohes Enoxaparin wie in Beispiel 1d erhalten wird wie folgt gereinigt.
Das Produkt wird in Wasser bis zu 10 % gelöst und wird auf einen pH von 8,4 ± 0,2 mit 1 N NaOH eingestellt.
Füge Natriumborhydrid in einer Menge von 17 g/kg Heparin als feste Teilmengen über einen Zeitraum von 40 Minuten zu, lasse dieses für 1 Stunde ruhen, bringe dann den pH-Wert mit HCl (1:3 verdünnt) auf 4,0 bis 4,4, um überschüssiges Borhydrid zu entfernen. Lasse dieses für 30 Minuten ruhen, füge dann 12 % Natriumacetat zu, filtriere dies und präzipitiere das Enoxaparin mit 3 Vol.-% MeOH.
Lasse dies für wenigstens eine Nacht zum Dekantieren stehen, ziehe dann den Überstand ab, gewinne das Präzipitat durch Filtration wieder und wasche dieses mit einer Lösung von Natriumacetat in MeOH.
Um jegliches möglicherweise als Kontaminante in der Form von Boraten verbliebene Bor zu entfernen, verfahre wie folgt:
Löse das Präzipitat in Wasser (14 %), stelle den pH auf 7 ± 0,2 ein, dann überführe dies in eine mit Amberlite IRA 743 gefüllte Säule.
Eluiere bei 5 cm/Min. (für eine gefüllte Säule: ∅ 20 × 85 cm beträgt der vorgeschlagene Fluss 1,6 Liter/Min.), halte den pH-Wert des Eluats bei 6,5 ± 1,0 mit 1:2 verdünnter Essigsäure. Wasche die Säule bis zu einem Refraktionsindex von 0 (ungefähr 0,6 V der Säule), füge dann NaOAc (12 % des Volumens) zu, stelle den pH-Wert auf 6,0 ± 0,2 ein, sterilfiltriere auf sterilen Membranen, präzipitiere dann mit 3 Vol.-% MeOH.
Lasse diese zum Dekantieren für wenigstens eine Nacht stehen, ziehe dann den Überstand ab, filtriere das Präzipitat und wasche dieses mit einer Lösung von Natriumacetat in MeOH.
Die Entfernung von Acetat und restlichen Lösemitteln durch Waschen mit Ethanol, Trocknen und Verpacken folgt den Standardverfahren.
Mittels der zuvor beschriebenen Reinigung wird eine Charge von Enoxaparin 40100/B erhalten, deren 10 %-ige Lösung weniger als die Referenzlösung BY7 im Einklang mit dem europäischen Arzneibuchtest gefärbt ist.
Basierend auf den experimentellen, von den vorgenannten Beispielen abgeleiteten Beobachtungen kann ausgeführt werden, dass im Allgemeinen zusätzlich zu den vorgenannten prinzipiellen Vorteilen im Einklang mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls herausgefunden worden ist, dass eine angemessene Depolymerisationseinheitlichkeit, d.h. die ideale Ausgewogenheit zwischen hoch und niedrig molekulargewichtigen Substanzen, um die beste Aktivität zu erzielen, nicht so sehr von dem Veresterungsgrad abhängig ist, sondern für denselben Veresterungsgrad mehr von der Temperatur und der Konzentration der bei der Hydrolyse eingesetzten Base. Es sollte auch beachtet werden, dass die Depolymerisation in Lösung stattfindet, wohingegen die Prozentzahlen der Fraktionen mit einem MW < 2000 = 12 % bis 20 % und der Fraktionen mit einem MW > 8000 = 5 % bis 20 % Spezifikationen des reinen, endgültigen und in dem Festzustand isolierten Produktes betragen. Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass die Spezifikationen für das Produkt bei dem Isolierungsschritt eingestellt werden können, mittels:

– ausreichender Salzkonzentrationen an NaCl oder NaOAc und einem ausreichenden Verhältnis von Wasser und mit Aceton mischbaren Alkoholantilösemitteln, wie beispielsweise
– Einstellen der direkten Korrelation zwischen erhöhter Konzentration an Elektrolyten in Lösung und Antilösemittelvolumen sowie eines größeren Prozentsatzes an präzipitierbaren niedrig molekulargewichtigen Fraktionen.

Claims

Verfahren zum Herstellen von hochreinen, niedrig molekulargewichtigen Heparinen mit einem Durchschnittsmolekulargewicht zwischen 2.000 und 10.000 Daltons durch die Schritte des Bildens eines Heparinbenzethoniumsalzes als Zwischenprodukt, ausgehend von diesem danach eines wasserlöslichen Heparinesters sowie des Unterwerfens des Esters einer Depolymerisation mit Basen, um die niedrig molekulargewichtigen Heparine zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte des Bildens eines Heparinbenzethoniumsalzes als Zwischenprodukt, aus diesem dann eines wasserlöslichen Heparinesters sowie des Unterwerfens des Esters einer Depolymerisation mit Basen, um die niedrig molekulargewichtigen Heparine zu bilden, auf einer Feststoffmatrix aus inertem Adsorptionsmittel aus Filtermaterial oder aus Filterhilfe durchgeführt werden, wobei die niedrig molekulargewichtigen Heparine am Ende durch Reduzieren der vorliegenden Verunreinigungen mit Borhydrid einem Aufreinigungsschritt unterworfen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtermaterial oder die Filterhilfe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bei der Polymerfiltration eingesetzten Cohilfsmitteln, Kieselgur, Perlit, Europerl 500 und Diacel CF/S.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Bildens eines wasserlöslichen Esters von Heparin mit ei nem Veresterungsgrad des Esters von weniger als 9,5 % durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Reduzierens mit Borhydrid mit NaBH₄ in Wasser bei einem pH-Wert zwischen 8,2 und 8,6 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das niedrig molekulargewichtige Heparin Enoxaparin mit einer Dermatansulfatverunreinigung von weniger als 0,04 % ist, wobei die Schritte das Isolieren von Heparinbenzethoniumsalz auf der Filterhilfe, das Bilden von Heparinbenzylesternatriumsalz auf der Filterhilfe, die Hydrolyse des auf der Filterhilfe getragenen Benzylesters, das Isolieren von Enoxaparin durch die Entfernung der Filterhilfe und das Aufreinigen des so erhaltenen Enoxaparins durch Reagieren mit Borhydrid umfassen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das niedrig molekulargewichtige Heparin Enoxaparin mit einer Dermatansulfatverunreinigung von weniger als 0,04 % ist, wobei die Schritte das Isolieren von Heparinbenzethoniumsalz auf der Filterhilfe, das Bilden von Heparinbenzylesternatriumsalz auf der Filterhilfe mit einem Veresterungsgrad des Esters von weniger als 9,5 %, die Hydrolyse des auf der Filterhilfe getragenen Benzylesters, das Isolieren von Enoxaparin durch die Entfernung der Filterhilfe und das Aufreinigen des so erhaltenen Enoxaparins durch Reagieren mit Borhydrid umfassen.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das niedrig molekulargewichtige Heparin Enoxaparin mit einem Durchschnittsmolekulargewicht zwischen 3.500 und 5.500 Daltons ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das niedrig molekulargewichtige Heparin Enoxaparin mit 12 % bis 20 % Fraktionen eines Molekulargewichts von weniger als 2.000 Daltons und mit 68 % bis 88 % Fraktionen eines Molekulargewichts innerhalb eines Bereiches zwischen 2.000 und 8.000 Daltons ist.