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Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Heparin Es ist bereits
bekannt, Heparin durch Zusatz einer Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid oder
Cetylpyridiniumchlorid als quaternäres Ammoniumsalz zu fällen. Dieses Verfahren
eignet sich jedoch nicht zur Reinigung von Heparin, da hierdurch andere Polysaccharide
mit ausgefällt werden. Außerdem besitzen die erhaltenen Niederschläge noch eine
nicht unbeträchtliche Löslichkeit in Wasser und Salzlösungen. Nach einem weiteren
bekannten Verfahren wird Heparin mit Äthylendiaminderivaten gefällt.
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Diese Fällung ist völlig unspezifisch, da die meisten organischen
Säuren des biologischen Mediums unter diesen Bedingungen mit ausfallen. Außerdem
muß der erhaltene Niederschlag mit Natronlauge und Salzsäure unter Bedingungen behandelt
werden, die eine teilweise Desulfatierung oder Depolymerisierung des Heparins zur
Folge haben.
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Keines dieser erwähnten Verfahren ermöglicht eine rasche und schonende
Reinigung und Anreicherung von Heparin. Diese wird durch das erfindungsgemäße Verfahren
erreicht, wobei in guter Ausbeute eine selektive Fällung von unverändertem Heparin
erhalten wird, aus der sich rasch ein reines kristallisiertes Heparinsalz erhalten
läßt. Es gelingt damit, aus biologischen Medien Heparin sofort selektiv abzutrennen
und in einer Form zu erhalten, aus der ohne Zersetzung dieses empfindlichen Naturprodukts
die reine Substanz sehr rasch erhalten werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Heparin
durch Umsetzen von Heparin mit quaternären Ammoniumverbindungen mit einer langen
Kette ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit Benzyl-dimethyl-2-[2
- (p - 1, 1,3,3 - tetramethylbutylphenoxy) - äthoxy] -äthyl-ammoniumchlorid (im
folgenden als »Benzethoniumchlorid« bezeichnet) oder einem Gemisch aus Alkyltolymethyl
-trimethyl-ammoniumchloriden mit Alkylgruppen von CgHjg bis Cj5H32 mit einem mittleren
Molekulargewicht von 331 als quaternäre Ammoniumverbindung durchgeführt und daß
man das gebildete Heparinsalz durch doppelte Umsetzung mit einem Alkalisalz in ein
Alkaliheparinat überführt, vorzugsweise, indem man das Heparinsalz mit einem Kaliumsalz
in das Kaliumheparinat überführt und dieses in kristallisierter Form isoliert, sodann
die wäßrige Lösung des Kaliumheparinats durch eine Kationenaustauscherkolonne leitet
und die im Filtrat befindliche Heparinsäure in bekannter Weise in das Natriumsalz
überführt und dieses isoliert.
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Das Benzethoniumchlorid besitzt die Bruttoformel C27H27ClNO2 H2O
und folgende Konstitution:
Vorzugsweise fällt man das quaternäre Ammoniumheparinat in stark saurem Medium,
um die Bildung von Salzen der quaternären Ammoniumverbindungen mit weniger starken
Säuren als das Heparin, die in den durch Fermentation von Lunge erhaltenen Organextrakten
vorkommen, zu vermeiden und-um eine Ausflockung des Niederschlags zu ermöglichen,
die das Filtrieren erleichtert, da das quaternäre Annnoniumheparinat die Neigung
besitzt, sich in neutralem Medium in kolloidaler Form abzutrennen.
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Die erfindungsgemäß verwendbaren quaternären Ammoniumsalze haben
die Eigenschaft, mit Heparin in Wasser unlösliche und in niedermolekularen Alko-
holen
lösliche Salze zu bilden. Sie fällen das Heparin in Verdünnungen von 1 : 5000 bis.
1:12000 in Wasser leicht aus.
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So ist das Benzethoniumsalz des Heparins in Methanol, Äthanol, Propanol,
Isopropanol, Butanol, Isoamylalkohol, aber auch in Aceton, Methyläfhylketon, Methylisobutylketon,
Benzol,-Pyridin, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Chloroform, Dimethoxymethan,
Essigsäure und Dimethylformamid löslich. Unlöslich ist es in Wasser, Essigsäureäthylester,
Essigsäureamylester, Äthyläther, Isopropyläther, Cyclohexan, Petroläther und Tetrachlorkohlenstoff.
Diese letzteren Lösungsmittel lösen auch nicht die anderen Heparinsalze der obenerwähnten
quaternären Ammoniumverbindungen.
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Diese Löslichkeitseigenschaften ermöglichen die Reinigung des quaternären
Ammoniumheparinats, indem man es durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, in dem
es unlöslich ist, von den Verunreinigungen, die es mitführen kann, befreit oder
indem man es in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel löst und diese Lösung
mit Wasser oder mit Lösungsmitteln, in denen das quaternäre Ammoniumheparinat unlöslich
ist, wäscht.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
löst man das quaternäre Ammoniumheparinat in Butanol und extrahiert diese Lösung
mit einer wäßrigen Lösung eines Kaliumsalzes einer organischen Säure, beispielsweise
Natriumacetat oder Kaliumacetat, oder einer Mineralsäure, beispielsweise Di- oder
Trikaliumphosphat.
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Es findet eine doppelte Umsetzung statt, und das ge bildete Alkaliheparinat
geht in die wäßrige Phase, aus der man nach Abziehen der Butanolphase Kaliumheparinat
in reinem Zustand durch Zugabe von etwa 30 bis 50°/o Kaliumacetat aussalzt oder
durch Zugabe eines in Wasser löslichen Lösungsmiftels, in dem es wenig löslich ist,
wie beispielsweise Aceton, Dioxan oder Äthanol, auskristallisieren läßt.
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Das Kaliumheparinat kristallisiert bald und wird durch Leiten durch
eine Kolonne mit Kationenaustauscher in Heparinsäure übergeführt. Diese wird dann
in bekannter Weise durch Neutralisieren mit Natronlauge, gegebenenfalls nach Zerstörung
von Pyrogenen, in Natriumheparinat übergeführt.
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Man kann auch auf die zusätzliche Reinigung, die durch die Überführung
in das Kaliumsalz bewirkt wird, verzichten und die doppelte Umsetzung direkt mit
Hilfe eines geeigneten Natriumsalzes, wie Natriumacetat oder Dinatriumphosphat,
durchführen.
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In der Praxis fällt man das quaternäre Ammoniumheparinat bei einem
pH-Wert von 1 bis 3 aus, der durch Zugabe einer Mineralsäure wie Salzsäure oder
Schwefelsäure vor, während oder nach der Zugabe des quaternären Ammoniumsalzes zu
dem Substrat eingestellt wird. Die optimalen Mengen an Benzethoniumchlorid liegen
für verdünnte Natriumheparinatlösung iwischen 2 und 3 g Benzethoniumchlotid je Gramm
Natriumheparinat und für Extrakte, die durch Fermentation von Lunge erhalten wurden,
zwischen 2,85 und 4,3 g Benzethoniumchlorid je 100 000 Internationalen Einheiten.
Der Gehalt an Heparin, einer unreinen Lösung oder eines Organextrakts kann leicht
durch biologische Titration bestimmt werden.
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Größere Mengen an Benzethoniumchlorid liefern ein weniger reines
Produkt und schlechtere Ausbeuten. Diese Ausbeutenverringerung tritt auch ein,
ween
. man Benzethoniumchloridmengen unterhalb der genannten Grenzen verwendet. Für das
weiter erwähnte Gemisch quaternärer Ammoniumverbindungen kann man mit Hilfe biologischer
Teste in einem Vorversuch die optimale Menge des Reagenz ebenfalls leicht bestimmen.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Ein Organextrakt, der in bekannter, hier nicht beanspruchter
Weise durch Fermentation von 2 kg frischer zerkleinerter Lunge in 1 1 Wasser mit
insgesamt etwa 9 g im Handel erhältlichem Papain unter Zusatz von 100 ml Toluol
als Antiseptikum, anschließendes Erhitzen zum Sieden, Filtrieren von gebildeten
unlöslichen Bestandteilen und Abkühlen erhalten wurde, wird mit 4 g im Handel erhältlichem
Benzethoniumchlorid unter Rühren versetzt. Ohne das Rühren zu unterbrechen, stellt
man den pH-Wert durch Zugabe von n-10-Schwefelsäure auf 2 ein und gibt dann zur
Erleichterung des Filtrierens 8 g Filterhilfe zu. Man filtriert und erhält nach
Absaugen etwa 22 g feuchtes, mit Filterhilfe vermischtes Benzethoniumheparinat.
Dieser Niederschlag wird in 60 ccm Butanol aufgenommen und zur Entfernung der Filterhilfe
von der butanolischen Lösung des Benzethoniumheparinats filtriert. Die Butanollösung
wird zuerst einmal mit 2 ccm einer wäßrigen gesättigten Natriumacetatlösung und
dann zweimal mit je 6 ccm einer 200/oigen Natriumacetatlösung extrahiert.
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Den vereinigten wäßrigen Extrakten setzt man Kaliumacetat bis zu einer
Konzentration von 30 °/o dieses Salzes zu. Das Kaliumheparinat kristallisiert aus.
Man saugt ab und trocknet. Die Ausbeute beträgt 0,6 g Kaliumheparinat mit einem
Gehalt von 110 Internationalen Einheiten Heparin je Milligramm Produkt. Zur Überführung
dieses Produkts in apyrogenes Natriumheparinat löst man es in 18 ccm Wasser, stellt
mit Natronlauge auf pH 8,5 ein, versetzt zur Zerstörung der Pyrogene mit 0,2 g Kaliumpermanganat,
erhitzt 30 Minuten auf 800 C und leitet nach Abkühlen durch eine Kolonne mit Kationenaustauscherharz
(Phenolformaldehydharz mit Schwefelsäuregruppen). Der Abfluß wird mit Natronlauge
neutralisiert und mit 20/0 seines Volumens Natriumacetat und 2 Volumina Äthanol
versetzt. Man erhält nach Filtrieren und Trocknen 0,4 bis 0,5 g reines weißes und
apyrogenes Natrium-. heparinat, das eine Aktivität von 115 Internationalen Einheiten
je Milligramm besitzt.
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Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt mit der Abänderung, daß man
die Butanollösung des Benzethoniumheparinats dreimal mit je 20 ccm einer wäßrigen
2°/Oigen Kaliumacetatlösung extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden
mit Äthanol bis zum Aufhören der Fällung versetzt. Das gebildete Kaliumheparinat
wird abgesaugt und getrocknet. Es werden 1,30 g Kaliumheparinat mit 63 Internationalen
Einheiten je Milligramm erhalten Beispiel 3 500 mg unreines Natriumheparinat mit
einem . Gehalt von 70 Internationalen Einheiten je Milligramm
werden
in 500 ccm Wasser gelöst. Man setzt 1,35 g Benzethoniumchlorid zu und säuert mit
n-10-Schwefelsäure an. Nach Zugabe von Filterhilfe filtriert man und trocknet bei
400 C. Der Niederschlag wird mit Äthanol extrahiert. Nach Abfiltrieren der Filterhilfe
setzt man 5 ccm einer 100/oigen wäßrigen Kaliumacetatlösung zu. Der gebildete Niederschlag
wird abzentrifugiert, mit Alkohol und mit Aceton gewaschen, abgesaugt und getrocknet.
Man erhält so 0,35 g Kaliumheparinat mit einem Gehalt von 98 Internationalen Einheiten
je Milligramm.
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Durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Neutralisation mit
Natronlauge usw., wie im Beispiel 1 beschrieben, erhält man 0,30 g Natriumheparinat
mit einem Gehalt von 111 Internationalen Einheiten je Milligramm.
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Beispiel 4 Man löst 1 g Natriumheparinat mit einem Gehalt von 70
Internationalen Einheiten je Milligramm in 1000 ccm Wasser. Dann setzt man 2,7 g
Benzethoniumchlorid zu und säuert mit n-10-Schwefelsäure an. Nach Stehenlassen über
Nacht trennt man unlösliche Bestandteile durch Zentrifugieren ab, wäscht durch dreimaliges
Anteigen mit je 10 ccm Wasser und trocknet im Vakuum.
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Man erhält 2,640g Benzethoniumsalz des Heparins. Zur Überführung
in das Natriumsalz löst man den Niederschlag des Hyaminheparinats wieder in Butanol
und extrahiert die Lösung dreimal mit einer wäßrigen 20/oigen Natriumacetatlösung.
Die vereinigten wäßrigen Extrakte versetzt man mit 2 Volumina Athanol und erhält
nach Filtrieren und Trocknen 0,6g Natriumheparinat mit einem Gehalt von 115 Internationalen
Einheiten je Milligramm, was einer Ausbeute von 98,5 O/o entspricht.
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Beispiel 5 Man arbeitet wie im Beispiel 3 beschrieben, verwendet
jedoch an Stelle von 1,35 g Benzethoniumchlorid 0,98 g eines im Handel erhältlichen
Gemisches aus Alkyltolylmethyl-trimethyl-ammoniumchloriden mit Alkylgruppen von
C9H19 bis Cl5Hsl mit einem mittleren Molekulargewicht von 331. Die Ausbeute ist
mit der gemäß Beispiel 3 erhaltenen identisch.
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Patentansprüche: 1. Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Heparin
durch Umsetzen von Heparin mit quaternären Ammoniumverbindungen mit einer langen
Kette, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit Benzyl-dimethyl-2-[2- (p-1,1,3,3-tetramethylbutylphenoxy)-äthoxyl]-äthyl-ammoniumchlorid
(= Benzethoniumchlorid) oder einem Gemisch aus Alkyltolylmethyltrimethyl-ammoniumchloriden
mit Alkylgruppen von C9H19 bis Cj5H3 mit einem mittleren Molekulargewicht von 331
als quaternäre Ammoniumverbindung durchführt und daß man das gebildete Heparinsalz
in an sich bekannter Weise durch doppelte Umsetzung mit einem Alkalisalz in ein
Alkaliheparinat überführt, vorzugsweise, indem man das Heparinsalz mit einem Kaliumsalz
in das Kaliumheparinat überführt und dieses in kristallisierter Form isoliert, sodann
die wäßrige Lösung des Kaliumheparinats durch eine Kationenaustauscherkolonne leitet
und die im Filtrat befindliche Heparinsäure in bekannter Weise in das Natriumsalz
überführt und dieses isoliert.