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Verfahren zur Reinigung von Heparin Bei der Anreicherung des die Blutgerinnung
verzögernden Heparins aus organischen Materialien wird üblicherweise so vorgegangen,
daß das Säuregruppen tragende Heparin aus einem organischen Rohextrakt mit Schwermetallsalzen
in Form eines in Wasser mehr oder weniger schwerlöslichen Salzes gefällt und nach
dem Abtrennen von der Mutterlauge in das in Wasser leicht lösliche Natriumheparinat
übergeführt wird. Man verwendet für diesen Zweck vorzugsweise in Wasser lösliche
Bariumsalze, wobei man das in Wasser ziemlich schwerlösliche Bariumheparinat erhält,
das anschließend mit Natriumsulfat oder Schwefelsäure unter Bildung von in Wasser
schwerlöslichem Bariumsulfat wieder zerlegt wird. Abgesehen davon, daß es Schwierigkeiten
bereitet, das stark toxische Barium aus den so erhaltenen heparinhaltigen Lösungen
quantitativ zu entfernen, geht eine nicht unbeträchtliche Menge Heparin durch Einschluß
in die Bariumsulfatfällung verloren.
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Weiterhin wurden bereits Brucin- und Narcotinsalze zur Anreicherung
des Heparins verwendet. Der hohe Preis und die stark toxischen Wirkungen dieser
Basen, die eine sehr sorgfältige Abtrennung derselben aus den pharmazeutischen Heparinzubereitungen
erforderlich machen, lassen dies Verfahren nicht als technisch und wirtschaftlich
reizvoll erscheinen.
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Es wurde nun gefunden, daß man Heparin in technisch und wirtschaftlich
vorteilhafter Weise dadurch reinigen kann, daß man ein wasserlösliches Salz des
Heparins mit einem wasserlöslichen Salz einer Base der allgemeinen Formel
worin R1 für einen Aryl- oder einen Cycloalkylrest steht, R2 ein Wasserstoffatom
oder einen niederen Alkylrest bedeutet und die beiden R3 entweder gemeinsam für
den zweiwertigen Rest -CH,-CH,-, der die beiden Stickstoffatome zu einem Piperazinring
verknüpft, stehen oder jedes für sich ein Wasserstoffatom bedeuten und n die Zahlen
von 0 bis 10 bedeuten, in wäßrigem Medium umsetzt, das gebildete schwerlösliche
Salz des Heparins mit der Base abtrennt, gegebenenfalls wäscht und durch Einbringen
in die wäßrige Lösung eines Alkalibicarbonats, Alkalicarbonats, Alkalihydroxyds
oder einer entsprechenden Ammoniumverbindung zerlegt, die ausgeschiedenen organischen
Basen entfernt und die gebildete Alkali-oder Ammoniumsalze des Heparins aus den
erhaltenen wäßrigen Lösungen nach an sich bekannten Verfahren isoliert.
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Die praktische Durchführung des Verfahrens erfolgt in der Weise,
daß man eine wäßrige Lösung eines Salzes des Heparins, deren p-Wert zwischen 4 und
7 liegen soll, unter Rühren mit der wäßrigen Lösung eines Salzes einer
organischen
Base der gekennzeichneten Art, vorzugsweise einem Hydrohalogenid oder Acetat, versetzt.
Es tritt sofort Bildung des schwerlöslichen Salzes des Heparins mit der verwendeten
Base ein. Das Salz setzt sich als weißer, flockiger Niederschlag sehr bald zu Boden
und läßt sich durch Filtrieren oder vorzugsweise durch Zentrifugieren isolieren.
Durch mehrmaliges Waschen des Niederschlages mit Wasser oder organischen Lösungsmitteln
kann das schwerlösliche Heparin-Basen-Salz gewünschtenfalls gereinigt werden. Die
Fällung des Heparins ist auf diesem Wege quantitativ.
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Zur Fällung des Heparins aus seinen wäßrigen Lösungen sind besonders
die Salze aus den Basen der gekennzeichneten Art mit solchen Säuren geeignet, die
mit den Basen wasserlösliche Salze zu bilden vermögen, wie die Halogenwasserstoff-,
Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Oxal-und Bernsteinsäuren.
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Das isolierte Heparin-Basen-Salz wird in der Weise in die freie Base
und ein wasserlösliches Alkali- oder Ammoniumsalz zerlegt, daß die schwerlösliche
Heparin-Basen-Verbindung bei normaler oder erhöhter Temperatur in eine wäßrige Lösung
eines Alkalibicarbonats, Alkalicarbonats, Alkalihydroxyds oder einer entsprechenden
Ammoniumverbindung eingebracht und so lange verrührt wird, bis die schwerlösliche
Heparin-Basen-Verbindung völlig gelöst oder zerlegt ist. Durch Zufügen eines mit
Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, in dem die freie Base leicht
löslich, das Heparinalkali- oder -ammoniumsalz jedoch unlöslich ist, wie Äther,
Methylenchlorid oder Benzol, kann die Zerlegung der Heparin-Basen-Verbindung wesentlich
erleichtert werden. Nach Trennung der beiden klaren Phasen wird
die
wäßrige Lösung noch mehrmals mit dem organischen Lösungsmittel ausgeschüttelt, bis
auch: die- letzten- Reste der Base entfernt sind. Nach Abdestillieren des Lösungtmittels
aus den vereinigten Extrakten kann die Base wiedergewonnen und nach Überführung
in ein geeignetes Salz zur Abscheidung des Heparins als schwerlösliches Salz wiederverwendet
werden. Aus der wäßrigen Lösung, die das gesamte Heparin als Alkali- oder Ammoniumsalz
in hoher Reinheit enthält, kann das Heparin in bekannter Weise als Heparinalkali-
oder -ammoniumsalz abgetrennt werden.
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Bei der Zerlegung der schwerlöslichen Heparin-Basen-Verbindung kann
man auch so vorgehen, daß man die wäßrig-alkalische Lösung, in der die Heparin-Basen
Verbindung gespalten wurde, einige Zeit stehen läßt, wobei in manchen Fällen die
Base als feste Substanz auskristallisiert und mechanisch abgetrennt werden kann.
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Bei Verwendung von Alkalibicarbonatlösungen erhält man meist das in
Wasser wenig lösliche Bicarbonatsalz der verwendeten Base als gut kristallisierte
Verbindung.
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Nach Abtrennen der Bicarbonatsalze, die auch in Äther oder Methylenchlorid
löslich sind, kann die das Heparinalkali- oder -ammoniumsalz enthaltende wäßrige
Lösung in der beschriebenen Weise weiter aufgearbeitet werden.
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Durch die Wiederholung der beschriebenen Reinigungsoperation an dem
erhaltenen gereinigten Heparinalkalisalz kommt man zu Heparinalkalisalzen, deren
therapeutische Wirksamkeit - gemessen an dem Gehalt an
blutgerinnungshemmenden Einheiten
- hohen Ansprechen genügt.
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Das beanspruchte Verfahren ist den bisher beschriebenen Reinigungsmethoden
für Heparin in der Einfachheit der Durchführung wesentlich überlegen. Die zur Fällung
des Heparins benötigten zweiwertigen Basen sind leicht und billig herzustellen und
werden während der Reinigungsoperation für das Heparin nahezu verlustlos wiedergewonnen.
Da die erfindungsgemäße Arbeitsweise darüber hinaus keine Heparinverluste verursacht,
ist das beanspruchte Verfahren auch bedeutend wirtschaftlicher. Von erheblicher
Bedeutung ist ferner die Tatsache, daß die zur Heparinfällung erfindungsgemäß verwendeten
zweiwertigen Basen pharmakologisch indifferente Substanzen sind. Dieser Befund ist
im Verein mit der leichten und quantitativen Entfernbarkeit selbst kleiner Basenanteile
aus den verfahrensgemäß erhaltenen gereinigten Alkali- oder Ammoniumheparinaten
von wesentlicher Bedeutung im Hinblick auf die Verwendbarkeit der so erhaltenen
Heparinsalze als Therapeutika.
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Eine durch Extraktion aus tierischem Organmaterial in
bekannter Weise gewonnene wäßrige Rohheparinlösung wird bei Normaltemperatur unter
Rühren mit einer etwa 5- bis 100/,eigen wäßrigen Lösung von N, N'-Di-(ß - methyl-
phenäthyl) - äthyIendiamin - dihydrochlorid
in kleinen Anteilen versetzt. Den sich bald bildenden flockigen, weißen Niederschlag
läßt man von Zeit zu Zeit unter Abstellen des Rührers absitzen und überzeugt sich
durch Zugabe kleiner Mengen der Basensalzlösung, ob noch weitere Fällung eintritt.
Dieser Vorgang wird so oft wiederholt, bis die nach dem Absetzen über dem Niederschlag
stehende klare Flüssigkeit auf Zusatz von etwas Lösung des Basensalzes nicht mehr
getrübt wird.
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Nach einstündigem Stehen wird das Ganze zentrifugiert und die klare
Flüssigkeit vom Bodenkörper dekantiert. Der Niederschlag wird noch mehrmals durch
wechselseitiges Aufrühren in destilliertem Wasser und anschließendes Zentrifugieren
gewaschen und endlich trocken geschleudert. Man erhält so das N, N'-Di-(ft-methyl-phenäthyl)-äthylendiaminsalz
des Heparins als weiße, wachs ähnliche Masse.
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Die erhaltene Heparin-Basen-Verbindung wird nun in relativ wenig
Wasser aufgerührt und mit Äther über-
schichtet. Unter kräftigem Rühren versetzt
man das Ganze so lange mit 2 n-NaOH in kleinen Anteilen, bis der Niederschlag in
Lösung gegangen ist und die wäßrige Phase einen p8Wert von etwa 7,5 anzeigt. Nach
dem Abtrennen der Ätherschicht wird die wäßrige Lösung noch mehrfach mit frischem
Äther bis zur Basenfreiheit extrahiert. Aus der verbleibenden wäßrigen Lösung, die
das gesamte Heparin als Natriumsalz enthält, kann das Natriumheparinat in bekannter
Weise als festes Salz isoliert werden.
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Beispiel 2 Eine Lösung von 1,00 g Natriumheparinat (Wirksamkeit 83
int. Einheiten/mg Trockensubstanz) in 30 ccm Wasser wird unter Rühren mit einer
Lösung von 1,35 g N, N' -Di- 5 - (5-methyl- 1 -phenyl-pentyl) -äthylendiamindihydrobromid
(Schmelzpunkt 275 bis 276°) in 60 ccm Wasser vereinigt; wobei sofort das schwerlösliche
Heparin-Basen-Salz als weißer, flockiger Niederschlag ausfällt. Nach einigem Stehen
wird zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit dekantiert und der Niederschlag
durch zweimaliges Aufrühren mit Wasser und anschließendes Zentrifugieren gewaschen.
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-Das so erhaltene Heparin-Basen-Salz wird nun in 15 ccm Wasser unter
Zugabe von 1,2 ccm 2 n-NaOH und 30 ccm Methylenchlorid gut verrührt, bis der Heparinniederschlag
in Lösung gegangen ist. Nach Abtrennen der Methylenchloridschlcht wird die wäßrige
Phase noch
zweimal mit je 20 ccm Methylenchlorid extrahiert. Die verbleibende wäßrige
Lösung wird mit verdünnter H Cl neutral gestellt und mit 70 ccm Äthanol versetzt,
wobei das Natriumheparinat als amorpher Niederschlag ausfällt und in bekannter Weise
isoliert wird.
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Das so erhaltene Natrinruheparinat besitzt eine Aktivität von 117
int. Einheiten/mg Trockensubstanz.
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Die folgenden Verbindungen bilden ebenfalls schwerlösliche Salze
mit Heparin und können analog den Beispielen 1 und 2 zur Isolierung bzw. Reinigung
von Heparin verwendet werden.
a) N, N'-Di- (a-methyl-benzyl) -äthylendiamindihydrochlorid
b) N, N'-Di- (a-methyl-benzyl) -piperazi ndihydrobromid
c) N, N'-Di-(a-methyl-cyclohexylmethyl) -äthylendiamin-dihydrochlorid
d) N, N'-Di3-[3-äthyl-l- (p-methoxy-phenyl) -propyl]-äthylen-diamin-dihydrobromid
e) N, N'-Di-[a-methyl-menaphthyl-(,B)]-äthylendiamin-dihydrobromid
f) N, N'-Di- (a-n-octyl-benzyl) -äthylendiamin-dihydrobromid