AT397250B

AT397250B - Verfahren zur herstellung von heparinsalzen

Info

Publication number: AT397250B
Application number: AT0144386A
Authority: AT
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1985-06-04
Filing date: 1986-05-28
Publication date: 1994-02-25
Also published as: HU193769B; IT1190124B; IT8620676A0; GB2176200A; GB8613593D0; FR2582657B1; BE904867A; IT8620676A1; GB2176200B; FR2582657A1; ATA144386A

Description

AT 397 250 B

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Heparinsalzen, die den Vorschriften der Arzneibücher entsprechen.

In dieser Patentanmeldung weiden unter dem Ausdruck „den Vorschriften der Arzneibücher entsprechenden Heparinsalze“ Heparinsalze einer solchenReinheit gemeint, die den Qualitätsvorschriften vonUSPXXI (TheUnited States Pharmacopoea XXI) entsprechen. "Heparinsalze“ ("Heparinate“) bedeuten die therapeutisch verwendbaren Salze, z. B. das Magnesium, Kalium, Lithium-, und Ammoniumsalz, überall aber das Calciumsalz (-Heparinat). In der Beschreibungsindalso“Heparinsalz“ und „Heparinat“ synonyme Ausdrücke (Heparin-Natriumsalz ist also mit Natriumheparinat identisch).

Die Verwendung des im Jahre 1913 entdeckten Heparins ist in der klinischen Therapie und Prophylaxe weit verbreitet. Das seit Jahrzehnten in industriellem Maßstabe hergestellte, therapeutisch reine Heparin wurde beinahe ausschließlich in der Form des Natriumsalzes verwendet. Bis zu den letzten Jahren beschäftigten sich die Arzneibücher nur mit den Qualitätiskriterien des Natriumheparinates. Die jahrzehntelangen Erfahrungen der Verwendung von Natriumheparinat sowie die Ergebnisse der in den letzten Jahren ausgefuhrten klinischen Untersuchungen sprechen ab» dafür, daß die ein von Natrium abweichendes Kation enthaltenden Heparinsalze auf einigen Anwendungsgebieten üb» vorteilhaftere Eigenschaften verfügen. Calciumheparinat hat z. B. eine längere Wirkungsdauer als Natriumheparinat, wodurch das Beibehalten der therapeutischen Dosis bei den einer Heparinbehandlung bedürfenden Kranken durch seltenere Dosierungen gelöst werden kann und die bei dem Natriumheparinat auftretenden Suffusionen durch die Verabreichung des Heparins in der Form seines Calciumsalzes ausgewichen werden können. [Kakkar, V. V.: Clinical Usage of Heparin. Present and Future Trends, Edit, M. Verstraete, S. J. Machin; Munsgaard, Copenhagen 1980. Seite 158; Kakkar V. V. Heparin Chemistry and Chemical Usage, Academic Press 19761. Für klinische und diagnostische Zwecke beschäftigen sich deshalb mehr und mehr Hersteller mit der Herstellung von Heparinaten, die anstatt Natrium ein anderes Kation enthalten. (Solche Haeparinate sind z. B. das Calcium-, Magnesium-, Lithium-, Kalium- und Ammoniumheparinat.)

Den bisher bekannten Verfahren gemäß wurde der Austausch des Natriumkations von Heparin in der Weise gelöst, daßdie wäßrige Lösung desNatriumheparinatesmiteinem wasserlöslichen Salz des zum Einsatzkommenden Kations unmittelbar in Berührung gebracht wurde (im weiteren wird dieses Verfahren als „reversibel“ genannt), oder in der Weise, daß das Heparin durch die Anwendung eines sauren Ionenaustauscherharzes in der Form der freien Säure isoliert und dann das gewünschte Salz gebildet wurde (im weiteren wird dieses Verfahren als „irreversibel“ genannt).

Im dem"reversiblen“ Verfahren kann der Austausch des Natriumkations bis zur Erreichung eines Natriumkation-Gehaltes von 1 Masse% in einem Schritte auch dann nicht gelöst werden wenn das Salzdes zum Einsatz kommenden Kations in einem größeren Überschuß anwesend ist, nämlich kann das Gleichgewicht des reversiblen Prozesses durch Steigerung der Konzentration des neuen Kations in die Richtung der Entstehung des neuen Heparinsalzes nur in einem gewissen Maße verschoben werden. Zur weiteren Verschiebung des Gleichgewichtes sind die Isolierung durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel des noch Natriumkation enthaltenden „gemischten“ Heparinsalzes und mehrmalige Wiederholung dieser Operation nötig. Es ist klar, daß der Anspruch dieser mehrstufigen Umwandlung an Zeit, Arbeitskraft und Lösungsmittel hoch ist und die Ausbeute wegen der großen Anzahl der Stufen bedeutsam erniedrigt wird.

Gemäß dem "irreversiblen“ Verfahren wir der Kationenaustausch durch die Anwendung eines sauren Kationenaustauschers durchgeführt. Im ersten Schritt dieses Verfahrens wird das Heparin in der Form der instabilen freien Säure gebildet, wodurch die Wirksamkeit des antikoagulanten Stoffes um etwa 20 bis 30 % vermindert wird.

Die Nachteile des "reversiblen“ Verfahrens versuchte man durch die in der DE-PS Nr.2417 859bekanntgemachte Methode zu eliminieren. Gemäß dieser Patentschrift sollte der Kationenaustausch ohne die Anwendung eines ionaustauschenden Harzes aufgrund des "reversiblen“ Verfahrens mit der Modifizierung gelöst werden, daß die Verschiebung des Gleichgewichtes nicht nur durch die Isolierung des gebildeten gemischten Heparinsalzes, sondern auch durch Entfernung des Kations des Ausgangs-Natriumheparinates durch Dialyse gesteigert wurde. Dieses Verfahren wird z. B. zur Herstellung von Calciumheparinat, von einem Natriumheparinat mit Arzneibuchs-Qualität ausgehend, auf die folgende Weise ausgeführt; einer wäßrigen Lösung von Natriumheparinat gibt man Calciumchlorid in kleinen Portionen zu, dann rührt man das Gemisch 16 Stunden lang, wonach die Lösung 6 Stunden lang in einem kleinen Volumen (300 ml) gegenüber ion- und pyrogenfreiem Wasser dialysiert wird, um die in dem Reaktionsgemisch anwesenden Natriumionen zu entfernen. Aus der dialy sierten, zum etwa Doppelten verdünnten Lösung fällt man das "gemischte“ Heparinsalz (das Gemisch von Calcium- und Natriumheparinat) mittels eines organischen Lösungsmittels aus. Die so isolierte Substanz wird in destilliertem Wasser gelöst und dann wird die ganze Operationsreihe wiederholt Der Natriumionen-Gehalt des isolierten Calciumheparinates ist niedriger als 0,1 Vol.%, seine spezifische Aktivität ist mit dem Ausgangsstoff fast identisch.

Ein zweifelloser Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß der mehrstufige Kationenaustausch durch die Anwendung der Dialyse in einer zweistufigen Operation verwirklicht wird. Die Dialyse birgt aber zahlreiche -2-

AT 397 250 B

Nachteile in sich: die Operationszeiten werden bedeutsam verlängert; die Gefahr der Pyrogenität und der Infektion werden gesteigert; die VorbereitungderDialysieihülsen und dieinkleinenVoluminaausgefiihrtenDialysenoperationen sind arbeitsintensiv, wodurch die Anzahl der Verlustquellen gesteigert wird. Durch Anwendung dieses Verfahrens kann die Reinigung von Heparin, beziehungsweise die Eihöhung seiner spezifischen Wirksamkeitnicht verwirklicht 5 werden, da schon selbst der Ausgangsstoff ein Natriumheparinat von Arzneibuchs-Qualität werden soll.

Gemäß den bekannten Verfahren wird daher der Austausch des Heparinat-Kations durch die Anwendung eines kationenaustauschenden Harzes in einem"iireversiblen“ Prozeß oder durch nacheinander folgende Gleichgewichtsschritte erreicht, in welch letzterem Falle das Gleichgewicht der einzelnen Schritte durch die Abscheidung des "gemischten“ Salzes von Heparin fixiert wird und der Gleichgewichtszustand von diesem Zustande ausgehend 10 mittels eines neuen reversiblen Prozesses in dem gewünschten Maße verschoben wird.

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zu entwickeln, wodurch der Austausch des Heparin-Kations - ohne die zersetzliche Heparinsäure zu bilden - durch die Herstellung eines wasserunlöslichen Zwischenproduktes "irreversibel“ gemacht wird und der Kationenaustausch aus dem gebildeten Zwischenprodukt in einem Schritte quantitativ ausgeführt werden kann; 15 - wodurch die Operation des Kationenaustausches nicht nur aus einem Heparinat von Arzneibuchs-Qualität, sondern aus irgendeiner wäßrigen Lösung die dem pyrogenbefreienden Schritte der Heparinproduktion folgt, durchgeführt werden kann; und - die nebst dem Kationenaustausch geeignet ist, das Heparin weiter zu reinigen und seine spezifische 20 Wirksamkeit zu erhöhen.

Die Erfindung gründet sich auf der Erkenntnis, daß die quaternären Ammoniumkatione der quaternären Ammoniumhalogenide, die in der Heparinproduktion zu anderen Zwecken verwendet werden, unter entsprechenden Bedingungen zum Austausch der Heparinat-Kationen geeignet sind und der Prozeß wegen des wasserunlöslichen 25 Charakters des Komplexes des Heparins mit dem quaternären Amin irreversibel ist, wodurch der Kationenaustausch quantitativ gemacht werden kann. Aus dem gebildeten Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin kann man das gewünschte Kationsalz des Heparins durch einen irreversiblen Kationenaustausch unter Umständen, die später beschrieben werden, in einer solchen Weise hersteilen, daß das so gewonnene Heparinat praktisch nur das gewünschte Kation enthält 30 ln dem erfindungsgemäßen Verfahren wird daher der Kationenaustausch durch zwei aufeinanderfolgende irreversible Prozesse verwirklicht.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein neues Verfahren zur Herstellung von den Vorschriften der Arzneibücher entsprechenden Heparinaten, insbesondere von Calciumheparinat, das darin besteht daß man 35 40 45 50 a) eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumhalogenids, das mit dem Heparin einen quaternären Ammonium-Komplex bildet zu einer wäßrigen Lösung eines die Arzneibuch-Vorschriften befriedigenden oder pyrogenfreien, gegebenenfalls Schwermetallsalz und unwirksame Heparinoid-Fraktionen enthaltenden Heparinates gibt b) den ausgeschiedenen Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin abtrennt und mit ionen- und pyrogenfreiem Wasser reinigt; c) den gereinigten Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin i) in der wäßrigen Lösung des Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht löst oder ii) in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel auflöst, und dann eine wäßrige Lösung eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, dieser Lösung zugibt oder iü) in einem mit Wasser unmischbaren oder nur begrenzt mischbaren, organischen Lösungsmittel löst und dann eine wäßrige Lösung eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht dieser Lösung zugibt beide Phasen sich trennen läßt und dann trennt; und gewünschtenfalls eine wäßrige Lösung eines weiteren Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, zu der im Schritt üi) erhaltenen organischen Phase gibt, beide Phasen sich trennen läßt dann trennt und die wäßrigen Phasen vereinigt gewünschtenfalls die Lösung reinigt und das entstandene Heparinat durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ausfällt und zuletzt das ausgefällte Heparinat in einer bekannten Weise gewinnt

Im ersten Schritte des Verfahrens wird eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumhalogenids - das in dem wäßrigen Medium gut dissoziiert und dessen quaternäres Ammonium-Kation mit dem Heparinat-Anion einen -3- 55

AT 397 250 B wasserunlöslichen Komplex bildet - der pyrogenfreien wäßrigen Lösung des Heparinates zugegeben, die - von den vorherigen technologischen Schritten abhängig - gewöhnlich Natrium-Kation, aber auch andere Kationen und Anionen außerhalb des Heparinat-Anions enthalten kann. Der oben geschilderte Prozeß kann durch die folgende, vereinfachte Reaktionsgleichung veranschaulicht werden: [Hep"'] + n[Ki+] + n[K2+] + n[A']-} Hep/K2/n + n[Ki+] + n[A'].

In dieser Gleichung bedeuten: [Hep0 ]: das Heparinat-Anion; [Ki+] : das ursprüngliche Kation des Heparins (gewöhnlich Natriumion); IK2+] : ein quaternäres Amin-Kation, das mit dem Heparinat-Anion ein wasserunlösliches Salz bildet; [A~] : Halogenidion (gewöhnlich Chlorid-oder Bromidion); und n : die Anzahl der negativen Ladungen des Heparinat-Anions.

Da der Komplex vorn Heparin mit dem quaternären Amin wasserunlöslich ist, geht die Reaktion in der Richtung des Pfeiles quantitativ vonstatten. Die in dem Medium eventuell anwesenden anderen Kationen und Anionen beeinflussen den Ablauf des Prozesses nicht Der ausgeschiedene Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin wird getrennt und mit ion- und pyrogenfreiem Wasser gereinigt.

Im Gegensatz zu langsamen Gleichgewichtsprozessen spielt sich der oben geschilderte Ionenaustausch augenblicklich ab. Die Entfernung der anderen Kationen kann anstatt der langdauemden und schwierigen Dialyse durch Separations- und Waschtechnik einfach gelöst werden.

Unter den mit dem Heparinat wasserunlöslichen komplexbildenden Salzen wurden solche quaternäre Ammonium-Halogenide besonders bevorzugt gefunden, die im Laufe der Heparinproduktion auch auf andere Zwecke (zur. Abscheidung von Heparin aus verdünnten, wäßrigen, heparinhaltigen Lösungen der tierischen Organe und Gewebe sowie zur Isolierung des rohen Heparins) anwendbar sind. Solche quaternäre Ammoniumhalogenide sind z. B. Cetyl-pyridinium-chlorid, Cetyl-trimethyl-ammonium-bromid, Hyamin^ 1622 (chemisch: Benzyl-dimethyl-(2[2-(p-l,13,3-tetramethyl-butyl-phenoxy)-ethoxy]-ethyl)-ammonium-chlorid) und Derivate (siehe die Patentschriften US-PS Nr. 2 989 438,3 058 884,3 160 563 und 3 342 683) sowie die in der ungarischen Patentschrift Nr. 188 537 bekanntgemachten weiteren quaternären Ammoniumhalogenide, z. B. das Carbotetradecyloxymethyl-trimethyl-ammonium-chlorid und verwandte Verbindungen.

Bevorzugt wird ein quaternäres Ammoniumhalogenid der allgemeinen Formel (I) R, X® Ί I1 R - A - <^m - H® - R2 R,

(D oder(H) (CH«)^ 7 \ R - B - (CH2)m - II® -(CH2)2 - N®(CH2)n - J> - Rn \ (CH2)2 / 91 Jc-2Tc * ai) verwendet, worin R für eine geradkettige oder verzweigte C8-18 Alkylgruppe, Phenyl- oder Phenyl-(Ci-3-Alkyl)-Gruppe steht; -4-

AT 397 250 B

Rl, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und eine geradkettige oder verzweigte Ci-4 Alkylgruppe bedeuten; oder

Rl und R2 zusammen auch eine Pentamethylen-Gruppe bedeuten können, wobei R3 für Wasserstoff steht;

Rn für Wasserstoff oder eine Gruppe steht, dessen Bedeutung mit R gleich ist; A eine Gruppierung der Formel -O-C- oder -C-O- bedeutet;

II II 0 0

BundD gleich oder verschieden sind und für eine Valenzbindung oder für eine Gruppierung, dessen Bedeutung mit A gleich ist, stehen; N+ ein quaternäres Stickstoffatom bedeutet; X” für ein einwertiges anorganisches Amon steht; m 1,2,3 oder 4 bedeutet; n 0,1,2,3 oder 4 bedeutet; k 1,2 oder 3 bedeutet;

Ein weiterer Vorteil der Verwendung von quaternären Ammoniumhalogeniden besteht darin, daß die meisten auch eine bakterizide Wirkung aufweisen, wodurch - im Vergleich mit anderen Herstellungstechnologien von Calciumheparinat · die Gefahr der Rückinfektion und die davon entstammende Pyrogenität zu einem Minimum erniedrigt werden.

Weiter wurde erkannt, daß die Operation der Abscheidung des Heparin-Komplexes mit dem quaternären Amin instrumental kontrollierbar ist, wodurch es möglich wird, die spezifische Wirksamkeit des Heparins beim lonenaus-tausch zu steigern. Durch Messen des Elektrodenpotentials der wäßrigen Heparin-Lösung mit einer beliebigen kombinierten Glaselektrode kann der Prozeß der Ausfüllung potentiometrisch verfolgt und die Menge der wäßrigen Lösung des quaternären Ammoniumhalogenids zum Optimum eingestellt werden. Nämlich scheiden sich die Fraktionen mit einer hohen antikoagulanten Wirksamkeit am Anfang und die unwirksamen Fraktionen zum Ende der Zugabe der wäßrigen Lösung des quaternären Ammoniumhalogenids aus einem zahlreiche Fraktionen enthaltenden Heparingemisch ab. Durch Verfolgung der potentiometrischen Kurve kann das optimale Verhältnis festgesetzt werden, bei dem die unwirksamen Fraktionen nach dem Abstellen des Prozesses nicht in den Niederschlag gelangen. In dieser Weise kann eine Steigerung der Wirksamkeit um 10 bis 15 % erreicht werden, wenn man von Natriumheparinat der Arzneibuchs-Qualität ausgeht.

Aus den Komplexen des Heparins mit einem quaternären Amin kann ein beliebiges Salz desHeparins durch einen weiteren irreversiblen Kationenaustausch einfach hergestellt werden. So ist es bekannt, daß die Komplexe des Heparins mit einem quaternären Amin mit wäßrigen Salzlösungen, z. B. mit einer Natriumchlorid-Lösung, deren Konzentration höher als 2 M ist, in Lösung gebracht werden können, und das Natriumheparinat aus dieser Lösung durch Ausfüllung mit einem Lösungsmittel isoliert werden kann, da die quaternären Ammoniumhalogenide sich in den zur Ausfällung verwendeten organischen Lösungsmitteln lösen. Infolge der Ausscheidung der Heparinate geht auch der Ionenaustausch irreversibel hervor.

Bisher wurde diese Methode ausschließlich zur Isolierung eines rohen Natriumheparinates aus Natriumheparinat enthaltenden Lösungen verwendet. Nun wurde erkannt, daß dieses Verfahren nicht nur zur Herstellung rohen Heparins und nicht nur im Falle des Natrium-Kations, sondern zur Herstellung eines Heparinsalzes von Arzneibuchs-Qualität und mit einem beliebigen Kation verwendbar ist, wodurch der Ionenaustausch mit einem günstigen Wirkungsgrad durchgeführt werden kann. Im Laufe der Versuche wurde beobachtet, daß diese Methode wirklich zur Herstellung von Heparinsalzen mit Arzneibuchs-Qualität geeignet gemacht werden kann, es sollen aber jene Nachteile eliminiert werden, die keine Probleme bei der Herstellung eines rohen Natriumheparinates bedeuten, da die Qualitätsanforderungen verschieden sind. So ist es z. B. nötig, das abgeschiedene Heparinsalz wegen der hohen Salzkonzentrationen im Wasser wieder zu lösen und mit einem Lösungsmittel auszufällen, um den gewünschten Aschengehaltzu erreichen, femerein gründliches Waschen miteinemLösungsmittelauszuführen, um diequatemäre Ammoniumverbindung völlig zu entfernen.

Wegen der obigen Nachteile wurde ein günstigere Ausführungsform gesucht und es wurde gefunden, daß, wenn der Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin in erstem Schritte anstatt einer wäßrigen Lösung mit hoher Salzkonzentration in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird, welches bei der Ausfüllung des Heparins gewöhnlich verwendet wird (z. B. Methanol, Ethanol, Aceton), der Ionenaustausch des in Lösung gebrachten Komplexes des Heparins mit dem quaternären Amin durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von bedeutend geringeren Konzentrationen durchgeführt werden kann und daß das gewünschte Heparinsalz durchEinstellen desLösungsmittel- -5-

AT 397 250 B

Verhältnisses mit einem geeigneten Aschengehalt, praktisch frei von anorganischen Salzen abgeschieden werden kann. Es ist aber auch hier nötig, mit einem Lösungsmittel gründlich zu waschen, um das quaternäre Ammoniumhalogenid zu entfernen.

Als vorteilhafteste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde gefunden, den Komplex des Heparins mit dem quaternären Ammoniumhalogenid im ersten Schritt in einem mit Wasser unmischbaren oder nur begrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel (z. 6. in Isopropanol, n-Butanol, Chloroform) zu lösen, dann den Ionenaustausch durch die portionsweise Zugabe der wäßrigen Lösung des das gewünschte Kation enthaltenden Salzes durchzuführen, zuletzt das abgeschiedene Salz des Heparins nach Trennung der Phasen aus der wäßrigen Phase durch die portionsweise Zugabe eines organischen Lösungsmittels (z. B. Aceton, Ethanol, Methanol) abzuscheiden. Bei dieser Ausführungsform wird die Ineversibilitätdes Ionenaustausches durch die Anwesenheitder unmischbaren Flüssigkeitsphasen gesichert; es bleibt nämlich das quaternäre Ammoniumhalogenid in der organischen Phase, das Heparin gelangt aber in die wäßrige Phase in der Form seines mit dem neuen Kation gebildeten Salzes. Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß die Entfernung der quaternären Ammoniumverbindung in dieser Weise bei der Trennung der Phasen stattfindet.

Zur wäßrigen Lösung eines Natriumheparinates von Arzneibuchs-Qualität oder eines von Pyrogenen befreiten Natriumheparinates, welche gegebenenfalls Schwermetallsalze und unwirksame Heparinoid-Fraktionen enthält, dessen Heparinkonzentration 500 bis 10000 IE/ml, zweckmäßig 1000 bis 5000 IE/ml beträgt, dessen pH-Wert2 bis 10, zweckmäßig 4 bis 8 ist, wird eine wäßrige Lösung einer quaternären Ammonium verbindung, zweckmäßig von Hyamin^ 1622oderCarbotetradecyl-oxymethyl-trimethyl-ammonium-chloridvon 1 bis 20 Gew./Vol. %, zweckmäßig von 5 bis 15 Gew./Vol.% portionsweise unter Rühren gegeben. Die Menge des zugegebenen quaternären Ammoniumsalzes beträgt 1,5 bis 3,5 g/10^ IE von Heparin. Im Falle, wenn auch die Steigerung der spezifischen Wirksamkeit bestrebt wird, führt man die Bestimmung des optimalen Verhältnisses vorteilhaft wie folgt aus:

Ein genau gewogenes Aliquot der auszufällenden wäßrigen Natriumheparinat-Lösung wird entnommen und es wird unter Rühren und Messung des Elektrodenpotentials durch eine kombinierte Glaselektrode eine wäßrige Lösung von 10 Gew./Vol.% des ausgewählten quaternären Ammoniumsalzes portionsweise zugegeben. Der in mV gemesseneElektrodenpotentialwert wird, von der zugegebenen Menge abhängig, graphisch dargestellt und aufgrund der aufgenommenen potentiometrischen Kurve die Menge des zur Abscheidung der wirksamen Heparinfraktion nötigen quaternären Ammoniumsalzes berechnet. Zur Feststellung des optimalen Verhältnisses ist deshalb nicht nötig, die Heparinkonzentration der wäßrigen Heparinlösung zu kennen, da das Verhältnis der Reagenzien durch das Verhältnis „die Menge in ml der bei der Titrierung verbrauchten quaternären Ammoniumlösung pro ml der Heparinlösung“ ausgedrückt werden kann.

Nach Abscheidung des quaternären Ammoniumsalzes des Heparins wird die Mutterlauge mittels Zentrifugieren entfernt Der zentrifugierte Niederschlag wird in einem ionen- und pyrogenfreien Wasser suspendiert und wieder zentrifugiert

Der so gewonnene Niederschlag wird in einem 4- bis 10-fachen, zweckmäßig in einem 6- bis 8-fachen Volumen eines organischen Lösungsmittels, zweckmäßig eines mit Wasser unmischbaren oder nur begrenzt mischbaren Lösungsmittels - z. B. in Chloroform, Isopropanol, Ethylacetat, am vorteilhaftesten in n-Butanol - gelöst Nach der Auflösung wird eine Lösung von 1 bis 10 Ges./Vol.%, vorzugsweise 2 bis 5 Gew./Vol.% eines das gewünschte Kation enthaltenden, wasserlöslichen Salzes zweckmäßig eines chloridhaltigen Salzes bevorzugt zur butanolischen Lösung des quaternären Ammoniumsalzes des Heparins in einer Menge von 20 bis 50 Vol./Vol.%, zweckmäßig 30 bis 40 Vol./Vol.% zugegeben. Das Gemisch wird 5 bis 15, zweckmäßig 15 Minuten lang gerührt, dann werden die Phasen getrennt Die wäßrige Phase wird durch eine Seitz-Filterscheibe oder Membran filtriert und unter Rühren durch Zugabe eines niedrigen aliphatischen Alkanols (z. B. Methanol, Ethanol) oder Alkanons (z. B. Aceton) ausgefällt.

Das ausgefällte Heparinat wird in bekannter Weise isoliert und getrocknet. Der Natriumionen-Gehalt des so gewonnenen Produktes ist unter 0,1 Gew./Gew.% und entspricht den Qualitätsanforderungen von USP XXI.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert, ist jedoch nichtauf diese Beispiele beschränkt. In den Beispielen bedeuten:

Gew./Vol.% : gemischte Prozente;

Vol/Vol.% : Volumsprozente; M% : Masseprozente; M : molare Lösung; IE : internationale Einheit.

Beispiel 1;

AusNatriumheparinatvon Arzneibuch-Qualität, dessen spezifische Wirksamkeit 165 IE/mg beträgt, verfertigt -6-

AT 397 250 B man eine Lösung von 4 Gew./Vol.% mit pyrogenfreiem destilliertem Wasser. Zu 100 ml dieser Lösung gibt man portionsweise 165 ml wäßrige Cetyl-pyridinium-chlorid-Lösung von 10 Gew./Voi.%. Nach der Zugabe trennt man den abgeschiedenen Niederschlag (den Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin) durch Zentrifugieren ab. Die Massedes zentrifugiertennassen Niederschlagesbeträgtlö,5 g. Dieser wird in 40ml pyrogenfreiem destilliertem 5 Wasser suspendiert und die Suspension wird wiederholt zentrifugiert.

Das nach dem zweiten Zentrifugieren erhaltene nasse Cetyl-pyridinium-heparinat wird unter Rühren in 200 ml Calcium-chlorid-Lösung von 2 M gelöst Die Lösung wird durch Filtrieren gereinigt und aus dem Filtrat wird das entstandene Calciumheparinat durch Zugabe von 150 Vol./Vol.% Ethanol ausgefällt. Der durch Zentrifugieren abgesonderte Calciumheparinat-Niederschlag wird in Ethanol suspendiert filtriert und in 200 ml pyrogenfreiem 10 destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung gibt man portionsweise Ethanol in einer Menge von 100 Vol./Vol.%.

Das abgeschiedene Calciumheparinat wird zentrifugiert mit Ethanol und dann mit Aceton gewaschen und zuletzt getrocknet

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 162 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI. 15

Beispiel 2:

Zu 100 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Natriumheparinat-Lösung werden 160 ml wäßrige Lösung von 10 Gew./Vol.% von Cetyl-trimethyl-ammonium-bromid gegeben. Der abgeschiedene Niederschlag (Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin) wird durch Zentrifugieren getrennt in 40 ml pyrogenfreiem destilliertem 20 Wasser suspendiert und wieder zentrifugiert. Die Masse des so gewonnenen Niederschlages beträgt 15,8 g. Dieser wird in 100 ml Ethanol gelöst dann portionsweise unter Rühren zu 200 ml 0,5 M wäßriger Calciumchlorid-Lösung gegeben. Die so erhaltene Calciumheparinat-Lösung wird durch Filtrieren gereinigt dann werden 120 ml Ethanol dem Filtrat unter Rühren zugegeben. Der abgeschiedene Calciumheparinat-Niederschlag wird in Ethanol zweimal suspendiert, filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. 25 Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 167 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entbricht den Vorschriften der USP XXI.

Beispiel 3;

Man geht, wie im Beispiel 2 beschrieben, mit der Änderung vor, daß Ethanol anstatt Methanol zur Lösung des 30 Komplexes von Heparin mit dem quaternären Amin verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 165 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI.

Beispiel 4: 35 Man geht, wie im Beispiel 2 beschrieben, mit der Änderung vor, daß Aceton zur Lösung des Komplexes von

Heparin mit dem quaternären Amin verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 161 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI. 40 Beispiel 5: 130 ml 10 Gew./Vol.%-ige wäßrige HyaminR 1622Lösung werden portiaisweise zur 100 ml wäßrigen Lösung des gemäß dem Beispiel 1 hergestellten Natriumheparinates zugegeben. Der abgeschiedene Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin wird zentrifugiert, dann in 45 ml Wasser suspendiert und wiederholt zentrifugiert.

Der nasse Niederschlag wird in 110 ml Isopropanol gelöst und dieser Lösung worden 40 ml 10 Gew./Vol.%-ige 45 wäßrige Calciumchlorid-Lösung zugegeben. Nach einem kräftigen Rühren von 5 Minuten läßt man das Gemisch eine halbe Stunde lang stehen. Nach Trennung der Phasen wird die wäßrigeLösung durch ein Membranfilter filtriert, dann wird das Calciumheparinat aus der Lösung durch Zugabe von 100 Vol./Vol.% Ethanol ausgefällt.

Der abgeschiedene Calciumheparinat-Niederschlag wird zentrifugiert, erst mit Ethanol und dann mit Aceton gewaschen und zuletzt getrocknet. 50 Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 163,6 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse%, und entspricht den Vorschriften der USP XXI.

Beispiel 6:

Man geht, wie im Beispiel 5 beschrieben, mit der Änderung vor, daß der Komplex von Heparin mit dem 55 quaternären Amin in n-Butanol anstatt Isopropanol gelöst wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 167,5 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI. -7-

AT397 250 B

Beispiel 7;

Man geht, wie im Beispiel 5 beschrieben, mit der Änderung vor, daß der Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin in Chloroform anstatt Isopropanol gelöst wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 165,6 ΙΕ/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI.

Beispiel 8:

Man geht, wie im Beispiel 5 beschrieben, mit der Änderung vor, daß zur Bildung des Niederschlages Carbotetradecyl-oxy-methyl-trimethyl-ammonium-chlorid anstatt HyaminR 1622 und zur Lösung Isopropanol anstatt n-Butanol verwendet werden.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 169,3 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI.

Beispiel 9:

Eine 1 GewTVol.%-igeLösung wird aus einem Natriumheparinat von Arzneibuchs-Qualität, dessen spezifische Wirksamkeit 158 IE/mg beträgt, mittels pyrogenfreien destillierten Wassers hergestellt. 50 ml dieser Lösung titriert man mittels eines Radiometer-Titrators (Tip TTT 2) und kombinierter Glaselektrode gegen eine 10 Gew./Vol.%-ige wäßrige Lösung von HyaminR 1622. Das Gerät registriert das in mV ausgedriickte Elektrodenpotential als Funktion des zugegebenen Reagens (Abbildung 1).

Aufgrund der aufgenommenen Kurve entspricht der zum Wendepunkt der ersten Titrierungsstufe gehörende Wert 11,45 ml 10 Gew./Vol.%-iger wäßriger Lösung von HyaminR 1622.

Aufgrund der Titrierung gibt man portionsweise 229 ml 10 Gew./Vol%-ige wäßrige HyaminR 1622 Lösung zu 1000 ml Natriumheparinat-Lösung unter Rühren. Der abgeschiedene Niederschlag wird zentrifugiert, dann in 100 ml pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert und wiederholt zentrifugiert.

Der zentrifugennasse Niederschlag wird in 250 ml n-Butanol gelöst, dann werden 95 ml 0,3 M wäßrige Calciumchlorid-Lösung portionsweise zugegeben. Nach kräftigem Rühren während 5 Minuten läßt man das Gemisch stehen. Nach Trennung der Phasen wird das Calciumheparinat aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 100 Vol/Vol.% Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert, erst mit Ethanol und dann mit Aceton gewaschen und getrocknet.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 177 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse% und entspricht den Vorschriften der USP XXI. Die Ausbeute beträgt 98,9 %.

Beispiel 10:

Man geht, wie im Beispiel 9 beschrieben, mit der Änderung vor, daß eine äquivalente Menge einer Lithiumchlorid-Lösung anstatt der Calciumchlorid-Lösung verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 181 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse%. Die Ausbeute beträgt 97,8 %.

Beispiel 11:

Man geht, wie im Beispiel 9 beschrieben, mit der Änderung vor, daß eine äquivalente Menge einer Magnesiumchlorid-Lösung anstatt der Calciumchlorid-Lösung verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 173 IE/mg, sein Natriumgehalt ist weniger als 0,5 Masse%. Die Ausbeute beträgt 99,2 %.

Beispiel 12:

Man geht, wie im Beispiel 9 beschrieben, mit der Änderung vor, daß Ammoniumchlorid anstatt Calciumchlorid verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 183 IE/mg und sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse%. Die Ausbeute beträgt 97,0 %.

Beispiel 13:

Man geht, wie im Beispiel 9 beschrieben, mit der Änderung vor, daß Kaliumchlorid anstatt Calciumchlorid verwendet wird.

Die spezifische Wirksamkeit des so erhaltenen Produktes beträgt 174 IE/mg und sein Natriumgehalt ist weniger als 0,1 Masse%. Die Ausbeute beträgt 96,8 %. -8-

Claims

AT 397 250 B Beispiel 14: Aus einem 150 γ/g Schwermetallion enthaltenden rohen Natriumhepaiinat (ein eiweißfreies Rohprodukt mit einer spezifischen Wirksamkeit von 130 IE/mg) verfertigt man nach der Pyrogenbefieiung2001 wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 3250 IE Heparin/ml. Zu dieser Lösung gibt man portionsweise 104110 Gew./Vol.%-ige 5 wäßrige Lösung von HyaminR 1622. (Die Menge der Lösung von HyaminR 1622 wurde durch die im Beispiel 9 beschriebene potentiometrische Titrierung bestimmt.) Der abgeschiedene Niederschlag wird in einer Absetzzentrifuge zentrifugiert, dann in 30 1 pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert und wiederholt zentrifugiert. DernasseNiederschlag wird in 90 ln-Butanol gelöst und 3014 Gew./Vol.%-ige wäßrige Calciumchlorid-Lösung 10 werden zugegeben. Man rührt das Gemisch 5 Minuten lang und füllt dann in eine Glasbirne von 1501, die mit einem Rührer und unteren Ablauf hahn versehen ist Nach Trennung der Phasen trennt man die untere wäßrige Phase ab, dann werden 10 1 4 Gew7Vol-%-ige wäßrige Calciumchlorid-Lösung portionsweise zur butalonischen Phase gegeben. Nach einem Rühren von 5 Minuten und Trennung der Phasen sondert man die wäßrige Phase ab und beide wäßrigen Phasen werden vereinigt. 15 Die vereinigte wäßrige Phase wird filtriert und dann wird das gelöste Calciumheparinat durch Zugabe von 100 Vol./Vol.% Ethanol ausgefällt. Der abgeschiedene Niederschlag wird erst mit Ethanol, dann mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Masse des so erhaltenen Calciumheparinates beträgt 3760 g mit einer spezifischen Wirksamkeit von 170 IE/mg und mit einem Natriumgehalt von weniger als 0,1 Masse%. Die Reinheit entspricht den Anforderungen 20 derUSPXXL Falls die Herstellung eines ein von Calcium abweichendes Kation enthaltenden Heparinates gezielt wird, so können sinngemäß andere Salzlösungen der gleichen Molarität anstatt der Calciumchlorid-Lösung verwendet werden. 25 PATENTANSPRÜCHE 30 1. Verfahren zur Herstellung von den Vorschriften der Arzneibücher entsprechenden Heparinaten, insbesondere Calciumheparinat, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumhalogenids, das mit dem Heparin einen quaternären 35 Ammonium-Komplex bildet, zu einer wäßrigen Lösung eines den Arzneibuchs-Vorschriften entsprechenden oder pyrogenfreien, gegebenenfalls Schwermetallsalz und unwirksame Heparinoid-Fraktionen enthaltenden Heparinates gibt; b) den ausgeschiedenen Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin abtrennt und mit ion- und pyrogenfreiem Wasser reinigt; 40 c) den gereinigten Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin i) in der wäßrigen Lösung des Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, löst, oder ii) in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel auflöst, und dann eine wäßrige Lösung eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, dieser Lösung zugibt; oder iii) in einem mit Wasser unmischbaren oder nur begrenzt mischbaren, organischen Lösungsmittel löst, und dann 45 eine wäßrige Lösung eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, dieser Lösung zugibt, beide Phasen sich trennen läßt und dann trennt: und gewünschtenfalls eine wäßrige Lösung eines weiteren Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, zu der im Schritt iii) erhaltenen organischen Phase gibt, beide Phasen sich trennen läßt, dann 50 nennt, und die wäßrigen Phasen vereinigt, gewünschtenfalls die Lösung reinigt und das entstandene Heparinat durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ausfällt und zuletzt das ausgefällte Heparinat in bekannter Weise gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 55 a) eine 1 bis 20 Gew./Vol.%-ige, vorzugsweise 5 bis 15 Gew./Vol.%-ige wäßrige Lösung eines quaternären Ammoniumhalogenids, das den Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin bildet, in einer Menge von -9- AT 397 250 B 1,5 bis 3,5 g/ΐΦ IE von Heparin zu einer wäßrigen Lösung von einer Konzentration von 500 bis 10000 IE/ml, bevorzugt 100 bis 5000 IE/ml eines den Arzneibuchs-Vorschriften entsprechenden oder pyrogenfreien, gegebenenfalls Schwermetallsalz und unwirksame Heparinoid-Fraktionen enthaltenden Heparinates gibt; b) den ausgeschiedenen Komplex von Heparin mit dem quaternären Amin abtrennt undmition- und pyrogenfreiem Wasser reinigt; c) den gereinigten, zentrifugennassen Komplex von Heparin mit dem quaternärem Amin i) in einer wäßrigen Lösung von einer Konzentration von 1,5 bis 2,5 Mol eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, löst; oder ii) in einer 4-bis 10-fachen Menge, bevorzugt in einer 6- bis 8-fachen Menge eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels auf löst, und dann eine wäßrige Lösung von 03 bis 1,0 Mol eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, dieser Lösung zugibt; oder iii) in einer 4- bis 10-fachen Menge, bevorzugt in einer 6- bis 8-fachen Menge eines mit Wasser unmischbaren oder begrenzt mischbaren organischen Lösungsmittels auflöst und dann eine wäßrige Lösung von einer Konzentration γοη 0,3 bis 1,0 Mol eines Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, dieser Lösung zugibt, beide Phasen sich trennen läßt und dann trennt; und gewünschtenfalls eine wäßrige Lösung von einer Konzentration von 0,3 bis 1,0 Mol eines weiteren Salzes, welches dem Kation des herzustellenden Heparinates entspricht, zu der im Schritt iii) erhaltenen organischen Phase gibt, beide Phasen sich trennen läßt, dann trennt, und die wäßrigen Phasen vereinigt, gewünschtenfalls die Lösung reinigt und das entstandene Heparinat durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ausfällt und zuletzt das ausgefällte Heparinat in bekannter Weise isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder(H) R - B - ll R - A - (CIL,),, - r - R2 R, / )\ (ch2)2 (I) X9 \ / (CH2)m - IT® -(CH2)2 - N®(CH2)n - J> - R n (ch2)2 «1 Jc- OD wonn R für eine geradkettige oder verzweigte C8-18 Alkylgruppe, Phenyl- oder Phenyl-(Ci_3-Alkyl)-Gruppe steht; Rl, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und eine geradkettige oder verzweigte C1-4 Alkylgruppe bedeuten; oder Rl und R2 zusammen auch eine Pentamethylen-Gruppe bedeuten können, wobei R3 für Wasserstoff steht; Rn für Wasserstoff oder eine Gruppe steht dessen Bedeutung mit R gleich ist; A eine Gruppierung Formel -O-C- oder -C-O-II II o 0 bedeutet; B und D gleich oder verschieden sind und für eine Valenzbindung oder für eine Gruppierung, dessen Bedeutung mit A gleich ist, stehen; -10- AT 397 250 B N+ ein quaternäres Stickstoffatom bedeutet; X* für ein einwertiges anorganisches Anion steht; m 1,2,3 oder 4 bedeutet; η 0,1,2,3 oder 4 bedeutet; k 1,2 oder 3 bedeutet; als quaternäres Ammoniumhalogenid verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Carbotetradecyl-oxymethyl-trimethyl-ammonium-chlorid in einer dem Wendepunkt der potenüometrischen Titrierungskurve entsprechenden Menge, in einer Menge von 1,0 bis 2,0 g/10^ IE von Heparin als quaternäres Ammoniumhalogenid verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzyl-dimethyl-{2-[2-(p-l,13,3-tetramethyl-butyl-phenoxy)-ethoxy]-ethyl}-ammonium-chlorid(HyaminR 1622) in einerdem Wendepunkt der potenüometrischen Titrierungskurve entsprechenden Menge, in einer Menge von 1,0 bis 2,0 g/10^ IE von Heparin als quaternäres Ammoniumhalogenid verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Cetyl-pyridinium-chlorid oder Cetyl-trimethyl-ammonium-bromid in einer dem Wendepunkt der potenüometrischen Titrierungskurve entsprechenden Menge, in einer Menge von 1,0 bis 2,0 g/10^ IE von Heparin als quaternäres Ammoniumhalogenid verwendet
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte zentrifugennasse Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin in 20 bis 50 ml wäßriger Calciumchlorid-Lösung der Konzentration von 1,5 bis 2,5 Mol berechnet für 10^ IE von Heparin gelöst wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte, zentrifugennasse Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin in einer 4- bis 10-fachen, bevorzugt in einer 6- bis 8-fiachen Menge eines mit Wasser begrenzt mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise in Isopropanol oder n-Butanol gelöst wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß dergereinigte, zentrifugennasse Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin in einer 4- bis 10-fachen, bevorzugt in einer 6- bis 8-fachen Menge eines mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise in Chloroform gelöst wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der gereinigte, zentrifugennasse Komplex des Heparins mit dem quaternären Amin in einer 4- bis 10-fachen, bevorzugt in einer 6- bis 8-fachen Menge von n-Butanol gelöst wird und dann für die Lösung berechnet in 20 bis 50, bevorzugt in 30 bis 40 Masse%, wäßriger Calciumchlorid-Lösung der Konzentration von 0,3 bis 0,5 Mol gelöst wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das entstandene Heparinsalz aus der Lösung mittels eines mit Wasser unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittels, bevorzugt mittels eines Alkanols oder Alkanons ausgefällt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das entstandene Heparinsalz durch Zugabe von Methanol, Ethanol oder Aceton ausgefallt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des zur Bildung des Komplexes von Heparin mit dem quaternären Amin nötigen quaternären Ammoniumhalogenids durch potenüometrische Titrierung bestimmt wird. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -11-