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Verfahren zur Herstellung von N-Acylderivaten des N-Desulfoheparins
Es war bereits durch K a n t o r (J. of Am. Chem.
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Soc., 79, S. 152 [1957D bekannt, Polysaccharide, wie Chondroitinschwefelsäure,
durch Methanol und Salzsäure zu desulfatieren. Diese Desulfatierung, die an den
Schwefelsäureestergruppen angreift, ist vollständig und fuhrt zu den Zersetzungsprodukten.
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Nach »Advances« in Carbohydrate Chemistry, 10. Band (1955), S. 352
unten, und »Abstracts of Papers 126. Meeting Am. Chem. Soc. 6 D 81954)« hat Fos
t e r versucht, die Hydrolyse der N-Sulfat-und Sulfatestergruppen zu bewirken. Hierbei
stellt der Autor fest, daß die Hydrolyse der N-Sulfatgruppen viel schneller als
diejenige der Schwefelsäureestergruppen verläuft, aber es war nicht gelungen, die
Hydrolyse der N-Sulfatgruppen zu be wirken, ohne gleichzeitig die Schwefelsäureestergruppen
zu hydrolysieren.
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Im Journal of American Chemical Soczety 72 (1950) S.2861, beschreiben
Wolfromm und Mitarbeiter ein Verfahren zur gleichzeitigen Desulfatierung und Acetylierung
von Natriumheparinat.
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Das dort erhaltene Produkt ist jedoch völlig verschieden von dem N-Acetyl-N-DesuIfoheparin,
wie es gemäß der Erfindung hergestellt wird. In dieser Veröffentlichung wird insbesondere
angegeben (s. Seite 2861, linke Spalte, dritte Zeile von unten), daß die erhaltenen
Verbindungen keinen Schwefel mehr enthalten. Es ist daher sicher, daß hierbei die
Zersetzung viel weitgehender ist.
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In einer folgenden Veröffentlichung (J. of Am.
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Chem. Soc., 72, S. 5796 [1950l) berichten die gleichen Autoren, daß
das acetylierte und desulfatierte Heparin teilweise zersetzt ist.
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Keines der vorbeschriebenen Produkte entspricht somit einem hinreichend
reinen N-Desulfoheparin.
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Dessen Herstellung gelang erstmals im Verlauf des Verfahrens der Erfindung.
Wie die Elementar analyse, die die Reinheit beweist, zeigt, ist das Heparamin damit
eine neue Substanz. Auch die aus dem reinen Heparamin erhaltenen N-Acylderivate
sind neu. Es war überraschend und stellt einen sehr großen Fortschritt dar, daß
sie neben einer ausgezeichneten antipilämischen Wirksamkeit eine sehr geringe antikoagulierende
Wirkung aufweisen. Wie die Versuche beweisen, ist die anticoagulierende Wirkung
der erfindungsgemäß erhältlichen Heparide 10- bis 40mal geringer als die des Heparins.
Die antipilämische Wirksamkeit entspricht dagegen bei gleicher Dosierung etwa der
des Heparins. Außerdem besitzen die erfindungsgemäß erhältlichen Heparide auch eine
längere Wirkungsdauer als das Heparin selbst. Somit ermöglicht das erfindungsgemäße
Ver
fahren erstmals die Trennung der beiden Wirkungsrichtungen des Heparins, was
therapeutisch von außerordentlicher Bedeutung ist.
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Erfindungsgemäß erreicht man dieses Ziel, indem man in der ersten
Stufe die Sulfamingruppen des Heparinmoleküls, das nachstehende Strukturformel besitzt:
einer alkoholytischen Spaltung mit einem niederen Alkohol unterwirft, wobei gleichzeitig
Veresterung der Carboxylgruppen des Heparins mit dem betreffenden Alkohol eintritt.
In der zweiten Stufe gelangt man durch Verseifung dieses Esters zum N-Desulfoheparin,
welches sich frei von antikoagulierender Wirkung erweist, jedoch eine geringere
antilipämische Wirksamkeit besitzt. Durch Acylierung des N-Desulfoheparins in an
sich bekannter Weise mit den erfindungsgemäß zu verwendenden Acylierungsmitteln
gelangt man in der dritten Stufe zu den N-Acylderivaten des N-Desulfoheparamins,
deren antilipämische Wirksamkeit in gewissen Fällen sogar gleich groß wie die des
Heparins ist, ohne aber dessen antikoagulierende Wirksamkeit zu besitzen.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N-Acylderivaten
des N-Desulfoheparins, welches darin besteht, daß man Heparin bei Temperaturen von
Raumtemperatur bis zur Siedetemperatur des Reaktionsmediums, vorzugsweise bei gewöhnlicher
Temperatur, mit einem niederen Alkohol in Gegenwart einer kleinen Menge Natronlauge
umsetzt, den gebildeten Carbonsäureester des N-Desulfoheparins bei 0°C bis Raumtemperatur,
vorzugsweise bei gewöhnlicher Temperatur, in wäßriger Lösung mit einer Alkalibase
verseift, das gebildete N-Desulfoheparin mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel
ausfällt und in an sich bekannter Weise mit einem acylierenden Derivat einer gegebenenfalls
im Ring durch niedrige Alkylreste, verätherte oder veresterte Hydroxylgruppen, Halogenatome
oder Nitro gruppen substituierten Benzoesäure, Naphthoesäure, Benzolsulfonsäure
oder niedrigen Phenylalkan- oder Phenoxyalkansäure, oder einer niedrigen Alkansäure
in wäßrigem, schwach basischem Medium in die entsprechenden N-Acylderivate überführt.
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Als besonders wertvoll hat sich das N-(3,5-Dimethylbenzoyl)-N-desulfoheparin
auf Grund seiner bemerkenswerten antilipämischen Wirksamkeit er wiesen.
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Ferner zeichnet sich das N-,B-Naphthoyl-N-de sulfoheparin. das überhaupt
keiner Substituenten im Ring des Acyls trägt, durch eine beträchtliche antilipämische
Wirksamkeit aus, wobei das Verhältnis von antilipämischer Wirksamkeit zu antikoagulieren
der Wirksamkeit besonders günstig ist.
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Die erste Stufe des Verfahrens der Erfindung, die Einwirkung eines
niederen Alkohols auf das Heparin, kann unter Rückflußbedingungen erfolgen. Hierbei
tritt
in gewissem Maße ein partieller Abbau ein, so daß nach der alkalischen Verseifung
des gebildeten Esters des hauptsächlich N-Desulfoheparins gemäß der zweiten Stufe
des Verfahrens der Erfindung die Isolierung des reinen N-Desulfoheparins schwierig
ist.
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Gemäß einer bevorzugten Durchführungsweise des erfindungsgemäßen
Verfahrens läßt sich dieser Abbau vermeiden, wenn man diesen Arbeitsgang bei etwa
Zimmertemperatur durchführt und anschließend die alkalische Verseifung des Alkoholyseprodukts
bei Zimmertemperatur durchführt. Das N-Desulfoheparin läßt sich dann in reiner Form
als leicht kristallisierendes Salz isolieren.
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Vorzugsweise führt man die zweite Stufe, die alkalische Spaltung,
mittels Natronlauge durch und isoliert nach einer doppelten Umsetzung mit einem
Kaliumsalz das N-Desulfoheparin in Form des Kaliumsalzes.
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Die Alkoholyse wird vorzugsweise bei Normaltemperatur durchgeführt,
indem man zu einer wäßrigen Heparinlösung (in Form der Säure), die im Vakuum konzentriert
wurde, einen großen Uberschuß eines aliphatischen Alkohols zugibt, der eine kleine
Menge Wasser und eine kleine Menge Natronlauge enthält. Die Reaktionsmischung wird
vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 50 C unter Rühren gehalten. Die Reaktion
kann jedoch in gleicher Weise auch in der Wärme durchgeführt werden. In zunehmendem
Maße tritt ein Niederschlag auf, der die Suspension trübt. Der Grad der erreichten
Desulfatierung am Stickstoff wird durch periodische Entnahmen und Messung der freien
NH2-Funktion bestimmt. Gleichzeitig kann auch der Schwefelgehalt in dieser Probe
bestimmt werden. Die Reaktion wird als beendet angesehen, wenn der Gehalt an freiem
NH2, der entweder colorimetrisch, potentiometrisch oder nach Van Slyke bestimmt
wurde, annähernd 100% der Theorie beträgt. Außerdem beträgt der Schwefelgehalt nach
Beendigung der Reaktion annähernd l00/o. Das desulfatierte Produkt wird nach dem
Abkühlen des Reaktionsmediums durch Filtration oder Zentrifugieren isoliert.
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Die bei der Alkoholysereaktion zugesetzte Natronlaugemenge entspricht
90/0 der ursprünglich im Heparin vorhandenen Natriummenge. Die Gegenwart dieser
kleinen Menge hat den Zweck, das Methylsulfat des quaternären Ammoniums im Maße
seiner Bildung zu beseitigen, was durch die nachstehende Reaktionsgleichung erläutert
werden soll:
Außerdem überführt diese kleine Menge Natron lauge die Carboxyl- oder Sulfonsäuregruppen
teilweise ins Salz und trägt dazu bei, daß eine Desulfatierung des Sauerstoffs vollkommen
vermieden wird.
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Der so erhaltene aliphatische Ester des N-Desulfoheparins wird nun
durch Einwirkung einer normalen Lösung eines Alkalihydroxyds, wie z. B. Natronlauge
oder Kaliumlauge, verseift. Man wendet vorzugsweise einen sehr großen Uberschuß
der alkalischen Lösung an. Die Reaktion kann in gleicher Weise mit einem kleinen
Volumen einer stärker konzentrierten Alkalihydroxydlösung, beispielsweise mit 5
n-Natronlauge, durchgeführt werden. Die von den Estern gegebene Farbreaktion, eine
Reaktion der Hydroxamsäuren, ermöglicht es, den Verseifungsgrad durch Verschwinden
der Esterfunktionen zu verfolgen. Die Reaktion ist nach 15 bis 30 Minuten bei Normaltemperatur
beendet und wird vorzugsweise unter Stickstoffdruck durchgeführt. Anschließend wird
der pH-Wert des Reaktionsmediums durch Zugabe von Essigsäure oder Natriumacetat
auf 8,8 bis 9 eingestellt und das N-Desulfoheparin in Form des Natriumsalzes durch
Zugabe eines hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmittels, das mit Wasser mischbar ist,
ausgefällt. Die Bestimmung des Molekulargewichts und des Schwefelgehalts sowie die
Feststellung, daß die Farbreaktionen auf Ester negativ ausfallen, ermöglichen es
festzustellen, ob die Reaktion beendet ist.
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Man kann die alkalische Spaltung auch mittels Kaliumhydroxyd durchführen,
wobei man direkt das kristallisierte Kaliumsalz des N-Desulfoheparins erhält.
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Die Acylierung des N-Desulfoheparins wird bewirkt, indem man das
N-Desulfoheparin mit zur Acylierung einer Aminogruppe geeigneten üblichen Acylierungsmitteln,
wie beispielsweise Säurehalogeniden und insbesondere den Chloriden oder einfachen
oder gemischten Säureanhydriden, behandelt. Die Acylierung wird in wäßrigem, gegebenenfalls
auch ein Lösungsmittel enthaltendem, schwach basischem Medium durchgeführt, um die
Veresterung der alkoholischen Gruppen zu verhindern.
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Das als Ausgangsprodukt verwendete Heparin kann aus einem Alkaliheparinat
hergestellt werden, das man der Einwirkung eines sauren Kationenaustauscherharzes
und anschließend einer Konzentrierung des sauren Heparins bei niedriger Temperatur
unterwirft.
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Die folgendeh Beispiele erläutern die Erfindung.
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Die Temperaturen können im Rahmen der im Patentanspruch angegebenen
Bereiche variiert werden. Beispiel 1 a) Herstellung des als Ausgangsmaterial dienenden
Heparins Man bringt 10 g Natriumheparinat (S = 13,2010, Solvatation = 11,6010, antikoagulierende
Wirksamkeit = 150 Einheiten je Milligramm, antilipämische Wirksamkeit 140 Einheiten
je Milligramm) in 60 ccm Wasser ein, rührt, kühlt auf 0°C ab und setzt dann
120 ccm
Dowex 50 (Handelsname), saure Form Kationenaustauscherharz auf der Basis von Polystyrol)
zu.
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Die Zugabe des Harzes wird sehr langsam so durchgeführt, daß die
Temperatur von 0° C nicht überschritten wird. Man rührt hierauf 15 Minuten, filtriert
das Harz und wäscht es mit einigen Kubikzentimetern kaltem Wasser. Das mit den Waschflüssigkeiten
vereinigte Filtrat wird auf einen Gehalt von 10% der theoretischen Natriummenge
eingestellt (durch eine erneute Zugabe von 4 Volumina Dowex 50, falls Natrium im
Uberschuß vorliegt, oder durch Zugabe von einigen Kubikzentimetern Natronlauge im
entgegengesetzten Falle). Dann engt man im Vakuum unter Stickstoff auf 12 bis 150io
des ursprünglichen Volumens ein. b) Stufe 1: Herstellung des N-Desulfoheparin-carboxylmethylesters
Man versetzt mit 250 ccm Methanol, stellt den Wassergehalt der methanolischen Lösung
auf 10% ein und erhitzt unter Rückfluß. Beim Beginn des Siedens tritt eine Fällung
auf. Nach 15minutigem Erhitzen kühlt man auf Zimmertemperatur ab, wäscht mit Methanol,
trocknet im Vakuum und gewinnt so 7 g eines weißen Pulvers, das aus N-Desulfoheparin-carboxylmethylester
in Form des quaternären Salzes mit saurem Methylsulfat besteht. c) Stufe 2: Verseifung
des N-Desulfoheparin-carboxylmethylesters Der Ester wird in 35 ccm Wasser gelöst,
die wäßrige Lösung auf 0" C abgekühlt und tropfenweise mit etwa 5 ccm 5 n-Natronlauge
bis zu einem pH-Wert von 12 versetzt. Nach 1 Sminutigem Rühren gießt man in 500
ccm eisgekühltes Methanol ein. Das N-Desulfoheparin fällt aus. Man saugt es ab,
wäscht mehrere Male durch Anteigen mit Methanol und trocknet über Calciumchlorid.
Die Ausbeute an N-Desulfoheparin (Natriumsalz) beträgt 7 g (85o/o); [a]20 = +67
i 20 (c = 10/o in Wasser). Das Ultraviolettspektrum ist aus der Abbildung ersichtlich.
pH-Wert der 1 00/obigen wäßrigen Lösung: 9,8 Solvatation: lO0to Antikoagulierende
Wirkung: <1 Einheit je Milligramm Antilipämische Wirksamkeit: 5 bis 7 Einheiten
je Milligramm Die Einheit der antilipämischen Wirkung wird durch C. Plotka und R.
Jequier (Arch.Int.
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Pharmacodyn., 1960, 126, S. 143) definiert. Sie entspricht dem 150sten
Teil der klärenden Aktivität einer geeichten Heparinprobe, die hundertfünfzig antikoagulierende
Einheiten in Milligramm enthält.
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Die antikoagulierende Einheit ist durch die antikoagulierende Wirkung
in den Tests definiert, die in sämtlichen pharmakologischen Standardwerken beschrieben
sind.
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Die weiße feste Substanz ist in Wasser löslich und in den üblichen
organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Alkohol, Ather u. dgl., unlöslich.
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Analyse: N 2,70/0, S 9,70/0.
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Das N-Desulfoheparin ist in der Literatur noch nicht beschrieben
worden.
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Zum Nachweis, daß bei der Spaltung der Sulfamingruppen keine Depolymerisation
stattgefunden hat, wurde das N-Desulfoheparin auf folgende Weise wieder in das Heparin
übergeführt.
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Man erhitzt ein Gemisch von 0,45 ccm Chlor sulfonsäure in 4 ccm wasserfreiem
Pyridin unter Rühren auf 70"C und bringt dann 0,25 g N-Desulfoheparin ein. Nach
5 Stunden setzt man 10 ccm Wasser zu und trennt dann das Heparin in üblicher Weise
von der Flüssigkeit. Man erhält so 0,24 g Natriumsalz des Heparins.
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Die antikoagulierende Wirkung ist wieder vorhanden.
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Eine Bestimmung des Molekulargewichts dieses Heparins auf jodometrischem
Wege zeigt, daß keine Depolymerisation im Verlaufe der Herstellung des N-Desulfoheparins
stattgefunden hat.
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Ein besonders reines N-Desulfoheparin wird in kristallisierter Form
auf folgende Weise erhalten: a) Herstellung des als Ausgangsmaterial dienenden Heparins
Man löst 20 g Natriumheparinat (5 1 3,20/o, Solvatation = 11,6°/o) in 200 ccm Wasser
und leitet diese Lösung in 20 Minuten durch eine Säule, die 80 ccm Dowex 50 (Handelsname)
in der sauren Form (Kationenaustauscherharz auf der Basis von Polystyrol) enthält.
Nach Spülen des Harzes mit 50 ccm destilliertem Wasser vereinigt man das Eluat und
das Waschwasser. b) Stufe 1: Herstellung des N-Desulfoheparin-carboxylmethylesters
Dieser Lösung setzt man nacheinander 10 ccm n-Natronlauge und dann 9Volumina Methanol,
bezogen auf das Volumen der wäßrigen Heparinlösung, zu. Das Reaktionsgemisch wird
anschließend 48 Stunden unter Stickstoffatmosphäre bei einer Temperatur von 20°C
gerührt und dann mit 60 ccm einer 20%igen wäßrigen Natriumacetatlösung versetzt.
Der Carboxylmethylester fällt in Form des Natriumsalzes aus. Man trennt ihn durch
Filtrieren oder Zentrifugieren ab, wäscht mehrere Male mit Methanol, trocknet bei
40°C im Vakuum und gewinnt so 15.5 g (entsprechend etwa 95°/o) dieses zu 10% solvatisierten
Carboxylmethylesters des N-Desulfoheparins. [a]2o0 +640 (c 1 01o in Wasser).
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Analyse für das trockene Produkt: NH (Van Slyke) 2,680/o (berechnet
als N) Sll,l bis 1l,20/o.
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Die partielle Veresterung der Carboxylgruppen läßt sich durch die
Farbreaktion mit Ferrihydroxamat nachweisen. c) Stufe 2: Alkalische Verseifung des
N-Desulfoheparin-carboxylmethylesters Man löst 10 g des gemäß b) erhaltenen Esters
in 100 ccm Wasser und setzt dann unter mäßigem
Rühren l()Occm 2 n-Natronlauge zu.
Nach 15minutigem Stehenlassen unter Stickstoff versetzt man das Reaktionsgemisch
mit 1000 ccm Methanol. Das N-Desulfoheparin zahlt aus. Man filiert, wäscht mehrere
Male mit Methanol, trocknet im Vakuum bei 40°C und erhält so 10 g N-Desulfoheparin
(Natriumsalz). Die Ausbeute dieser Stufe ist praktisch quantitativ.
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Farbreaktion mit Feirihydroxamat: Negativ Um das N-Desulfoheparin
in kristallisierter Form zu erhalten, verfahrt man auf folgende Weise: Man löst
20 g gemäß b) erhaltenes N-Desulfoheparin (Natriumsalz) in 200 ccm Wasser und erwärmt
auf dem Wasserbad auf 50"C. Die Lösung wird unter Rühren nacheinander mit 200 ccm
einer 50%igen wäßrigen Kaliumacetatlösung und mit 20 ccm Methanol versetzt. Man
kühlt ab, wobei das N-Desulfoheparin bei etwa 35°C auszukristallisieren beginnt.
Man läßt über Nacht stehen, filtriert und wäscht den Niederschlag mit einer wäßrigen
Lösung mit einem Gehalt von 25% Kaliumacetat und 200/0 Methanol und dann mit reinem
Methanol.
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Ausbeute: 10,6 g (entsprechend 50%) N-Desulfoheparin (Kaliumsalz)
[aj + 570 (c= 1°/o in Wasser).
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Analyse: (C48H65061PYqS7Kll)n-Berechnet: C 24,75, H 2,8, N 2,3, S
9,6, K 18,5%; gefunden: C 25,2, H 3,1, N2,3, S 9,5, K 18,8e/o.
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Bestimmung des Aminostickstoffs:
| 2,2 (potentiometrisch) |
| 2,1 (Van Slyke) Theorie2,4 |
Die Analyse mit einem viermal unter den gleichen Bedingungen umkristallisierten
Produkt liefert folgende Ergebnisse: C 24,75°lo, H 3,O0/o, N 2,40/0, S 9,90/0.
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Hierbei beträgt die Ausbeute 900/0.
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Durch Leiten einer wäßrigen Lösung des Kaliumsalzes des Heparamins
durch eine Dowex-50-Harz in der sauren Form enthaltenden Säule erhält man das N-Desulfoheparin
in freier Form. d) Stufe 3: Acylierung des N-Desulfoheparins Herstellung von N-Benzoyl-N-desulfoheparin
Man löst 0,5 g gemäß Stufe 2 erhaltenes N-Desulfoheparin in 10 ccm einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung, versetzt in 30 Minuten mit 1,1 ccm Benzoylchlorid und läßt
das Reaktionsgemisch 3 Stunden unter Rühren bei Zimmertemperatur stehen. Dann gießt
man in 100 ccm Athanol, wobei sich ein reichlicher weißer Niederschlag bildet.
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Durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure säuert man auf pH 2 an,
saugt ab, wäscht mit Athanol mit einem Gehalt von 10% Wasser bis zum Verschwinden
der Chloride in dem Waschwasser. Nach Trocknen gewinnt man 0,520 bis 0,590 g N-Benzoyl-N-desulfoheparin
(86,5 bis 980/o), welches eine amorphe weiße, zu 10 bis 1 50/o solvatisierte Festsubstanz
ist. Das Produkt ist in Wasser löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln,
wie Alkohol, Ather, Aceton u. dgl., unlöslich.
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Prüfung auf NH2: Negativ UV-Spektrum: Amaz = 228 mO, Elm = 162 (entsprechend
16,80in Benzoyl je Gramm. Theorie 17,0) Antikoagulierende Wirksamkeit: 3 Einheiten
je Milligramm Antilipämische Wirksamkeit: 29 Einheiten je Milligramm Stickstoffbestimmung:
2,40/0 Diese Verbindung ist in der Literatur noch nicht beschrieben worden.
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Beispiel 2 Herstellung von N-3 ,5-Dinitrobenzoylheparamin Man löst
0,5 g gemäß Beispiel 1, Stufe 2, erhaltenes N-Desulfoheparin in 10 ccm einer gesättigten
Natriumbicarbonatlösung (pH = 8,5) und versetzt sehr langsam mit 1,125 g 3,5-Dinitrobenzoylchlorid.
Man rührt 3 Stunden bei Zimmertemperatur, saugt das ausgefallene Natriumdinitrobenzoat
ab und engt die Lösung durch schwaches Erwärmen im Vakuum unter Stickstoff auf ein
Drittel des Volumens ein.
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Durch Zugabe von 50 ccm Athanol fällt das N-3,5-Dinitrobenzoyl-desulfoheparin
aus, das man absaugt. mit Alkohol, dem einige Tropfen Salzsäure zugesetzt sind,
und anschließend mit reinem Alkohol wäscht und über Nacht im Vakuum trocknet. Die
Ausbeute an weißem amorphem Produkt beträgt 0,550 g (entsprechend 80 bis 84()1o).
[aj200 - +94° (c = 10/0 in Wasser). Die Verbindung ist in Wasser löslich und in
üblichen organischen Lösungsmitteln unlöslich.
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NO2-Bestimmung: 12,30/0 (Theorie l3,00/o) Prüfung auf NH2: Spuren
Ul traviolettspektrum: AmaI = 237 mF, El= = 239 in Wasser Antikoagulierende Wirksamkeit:
1 bis 4 Einheiten je Milligramm Antilipämische Wirksamkeit: 100 bis 150 Einheiten
je Milligramm Analyse: N 5,80/o, S 6,60in Die Verbindung ist in der Literatur noch
nicht beschrieben worden.
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Beispiel 3 Herstellung von N-(3,5-Dimethylbenzoyl)-N-desulfoheparin
Man bringt unter Rühren 10 g gemäß Beispiel 1, Stufe 2, erhaltenes N-Desulfoheparin
unter Stickstoff in 200 ccm einer 0,50/obigen Natriumcarbonatlösung ein und erhitzt
2112 Stunden auf 80"C. Dann wird das Volumen im Vakuum auf etwa 25 ccm eingeengt.
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Man versetzt die erhaltene dickliche, blaßgelbe Lösung mit 65 ccm
Alkohol und stellt den pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure auf 3 ein. Es tritt Kohlendioxydentwicklung
auf. Man setzt erneut 150 ccm Alkohol zu, reibt zur Kristallisation, saugt ab, wäscht
mit 900/oigem Alkohol und trocknet im
Vakuum. Das erhaltene Produkt wird in 200 ccm
einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gelöst und mit 100 ccm Benzol versetzt.
Dann erwärmt man auf 50"C und bringt unter Rühren langsam in Anteilen von 12 ccm
eine Lösung von 30 bis 34 g 3,5 - Dimethylbenzoylchlorid (hergestellt nach H. R.
Snyder und R. R. A d a m s, Am. Soc., 1941, Bd. 63, S. 3280) in 85 ccm Benzol ein.
Der Zeitabstand zwischen einer Zugabe und der nächsten beträgt 1 Stunde. Die Zugabe
der Gesamtlösung des Acylierungsmittels dauert etwa 10 Stunden. Der pH-Wert des
Reaktionsgemisches wird während dieser Zeit durch Zugaben von Natriumbicarbonat
auf 8 bis 8,5 gehalten. Man läßt über Nacht bei Zimmertemperatur stehen, entfernt
dann das Benzol im Vakuum, filtriert, wäscht die unlöslichen Bestandteile mit Wasser
und engt die wäßrige Phase auf 200 ccm ein. Dann setzt man 100 ccm Alkohol zu, wobei
sich ein reichlicher Niederschlag bildet, und säuert mit Salzsäure bis zu einem
pH-Wert von 2,5 an. Das Produkt erstarrt. Nach Zugabe von 1400 ccm Alkohol saugt
man ab. wäscht mit 900/0igem Alkohol, trocknet im Vakuum und erhält so 8,68 g (entsprechend
66,5°/o) N-(3,5-Dimethylbenzoyl)-N-desulfoheparin, das zu 13.80/o solvatisiert ist.
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[a]D = +70,5 (c = 1°/o in Wasser). Der pH-Wert der wäßrigen Lösung
beträgt etwa 4,5. Die neue Verbindung bildet eine amorphe weißcremefarbige Festsubstanz.
die in Wasser leicht löslich, in Methylenchlorid und Propylenchlorid löslich und
in Alkohol, Ather, Aceton, Benzol und Chloroform unlöslich ist.
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Analyse: C 37,2 bis 37,4, H 4,2, N 2,0, S 8,40/o.
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Das UV-Spektrum zeigt im Vergleich zu dem des 3,5-Dimethylbenzoylcyclohexylamins.
daß das erhaltene Produkt zu 900/0 aus der Acylverbindung besteht.
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Antikoagulierende Wirksamkeit: 12,5 Einheiten je Milligramm Antilipämische
Wirksamkeit: 147 Einheiten je Milligramm Die Verbindung ist in der Literatur noch
nicht beschrieben worden.
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Beispiel 4 Herstellung von N-ß-Naphthoyl-N-desulfoheparin Man löst
unter Rühren bei 25"C 2,5 g gemäß Beispiel 1, Stufe 2, hergestelltes N-Desulfoheparin
in 70 ccm einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und 10 ccm Benzol.
Dann bringt man in 5 Stunden 4,9 g B-Naphthoylchlorid, gelöst in 60 ccm Benzol,
ein und rührt das Reaktionsgemisch über Nacht bei 25"C. Nach Filtrieren stellt man
den pH-Wert des Filtrats durch Zugabe von 12 n-Ameisensäure auf 3 bis 3,5 ein und
entfernt die während der Reaktion gebildete A-Naphthoesäure durch Extraktion mit
Äther. Durch Zugabe von 2 n-Natronlauge bringt man dann den pH-Wert auf 8,3 und
gießt in 5 Volumina Äthanol ein. Das Naphthoylderivat fällt aus. Man saugt es ab,
wäscht mit Äthanol und trocknet im Vakuum bei Zimmertemperatur. Die Ausbeute an
N-,-Naphthoyl-N-desulfoheparin (Natriumsalz) beträgt 2,3 g (entsprechend 70°/o der
Theorie). Die Verbindung ist
fest, weiß und zu 10 bis 1 60/o mit
Wasser solvatisiert.
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[a]200 für das trockene Produkt = 114" (c = 0,20/0 in Wasser). Die
Verbindung ist in Wasser leicht löslich und in Alkohol und Äther unlöslich.
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Ihr UV-Spektrum zeigt im Vergleich zu dem des ß-Naphthoylcyclohexylamins
daß das Produkt zu 78,50/o aus der Acylverbindung besteht.
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Antikoagulierende Wirksamkeit: 9,4 Einheiten je Milligramm Antilipämische
Wirksamkeit: 122 Einheiten je Milligramm Die Verbindung ist in der Literatur noch
nicht beschrieben worden.
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Beispiel 5 Herstellung von N-Glykolyl-N-desulfoheparin In einen Dreihalskolben
werden nacheinander 3,5 g Kalium-N-desulfoheparinat, 85 ml Wasser und 10,5 g Kaliumbicarbonat
eingebracht. Nach Auflösung wird eine aus 2,5 g Acetylglykolylchlorid und 25 ml
Benzol hergestellte Lösung zugegeben. Nun wird 5 Stunden mechanisch gerührt, und
anschließend wird erneut eine aus 5,5 g Acetylglykolylchlorid und 30 ml Benzol gebildete
Lösung zugesetzt. Anschließend werden 33 g Kaliumbicarbonat zugefügt.
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Nun wird 15 Stunden gerührt. Anschließend wird das Benzol im Vakuum
abdestilliert und durch Zugabe von 110ml einer 1 00/obigen wäßrigen Lösung von 2
- [2 - (p - 1,1,3,3 - Tetramethylbutylphenoxy) - äthoxy]-benzyldimethyläthylammoniumchlorid
(bekannt unter dem Warenzeichen »Hyamin 1622«) das gebiidete Acetylglykolyl-N-desulfohepårin
ausgefällt.
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Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Wasser gewaschen und danach
in 100 ml Butanol wieder aufgelöst. Die erhaltene butanolische Lösung wird dreimal
mit je 10 ml einer 20einigen Natriumacetatlösung verrührt. Die wäßrigen Phasen werden
abgetrennt, danach werden 150ml Methanol zugesetzt.
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Hierbei fällt das Acetylglykolyl-N-desulfoheparin aus. Man filtriert
ab, saugt trocken, wäscht mit Methanol und dann mit Äther. Man erhält so reines
Natriumacetylglykolyl - N - desulfoheparinat. Dieses Produkt wird in 85 ml Wasser
gelöst, auf 0CC abgekühlt und 85 ml 2 n-Natronlauge zugesetzt. Die Temperatur wird
dabei 2 Stunden aufrechterhalten.
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Anschließend setzt man 10 mol Essigsäure, 1 ml Natronlauge und schließlich
950 ml Methanol zu.
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Das Natriumsalz des Glykolyl-N-desulfoheparins fällt aus. Man nutscht
ab, wäscht mit Methanol, danach mit Ather und trocknet im Vakuum über Phosphorpentoxyd.
Man erhält so 2,2 g N-Glykolyl-N-desulfoheparin (Natriumsalz) in Form einer farblosen
mikrokristallinen Verbindung, die in Wasser und wäßrigen Lösungsmitteln löslich
und in Alkohol, Äther, Aceton und Benzol unlöslich ist.
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Diese Verbindung ist neu.
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Antikoagulierende Wirkung: 3,4 Einheiten je Milligramm Antilipämische
Wirkung: 91 Einheiten je Milligramm Das Acetylglykolylchlorid wird nach der Methode
von 0. M. Friedman, J. of Am. Chem. Soc., 76 (1954), S. 661, erhalten.
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Beispiel 6 Pivalylheparid In einen Kolben werden 2 mol N-Desulfoheparin
(Natriumsalz), 2 ml Wasser und 2 ml Pivalinsäureanhydrid eingebracht, bei 0 bis
5"C 5 Stunden gerührt, durch Zusatz von 5 n-NaOH auf pH 9 eingestellt, ohne daß
die Temperatur dabei 15"C überschreitet, dann werden 50 ml Methanol zugesetzt, filtriert,
vom Rückstand abgenutscht, mit Methanol gewaschen und im Vakuum zur Trockne gebracht.
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Der Rückstand wird erneut mit Pivalinsäureanhydrid behandelt.
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Man erhält so 0,40g Pivalylheparid (Ausbeute 68°/o) in Form eines
wasserlöslichen festen Stoffes.
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Antikoagulierende Wirkung: 2 Einheiten je Milligramm Antilipämische
Wirkung: 42 Einheiten (AL) je Milligramm Beispiel 7 Succinylheparid Man bringt in
einen Kolben 3 ml Wasser, 1 g N-Desulfoheparinnatriumsalz, 2,5 g Natriumbicarbonat
und 1,6 g Bernsteinsäureanhydrid ein, rührt 5 Stunden bei Zimmertemperatur, treibt
überschüssiges Natriumbicarbonat durch Ansäuern aus, stellt den pH-Wert auf 8,5
bis 9 ein und fügt 50 ml Methanol zu. Dann wird filtriert, vom Rückstand abgenutscht,
mit Methanol und danach mit Ather gewaschen und im Vakuum zur Trockne gebracht.
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Man erhält so 0,62 g Succinylheparid in Form eines festen weißen
wasserlöslichen Produktes.
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Antikoagulierende Wirkung: 0 Einheiten je Milligramm Antilipämische
Wirkung: 19 Einheiten (AL) je Milligramm Andere N-acylierte Derivate des Heparamins
werden nach der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.
Die nachfolgende Tabelle gibt die Konstanten der erhaltenen Produkte sowie die Ausbeuten
bei den Herstellungen an.
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Die allgemeinen Merkmale dieser Verbindungen sind: amorpher Zustand,
weiße Farbe, 10- bis l50/oige Solvatation, Löslichkeit in Wasser und verdünnten
wäßrigen Säuren oder Alkalien, Unlöslichkeit in üblichen organischen Lösungsmitteln.
| Verbindung*) UV-Spektrum Antikoagulierende AntilipamisdK |
| Wirksamkeit Wirksamkeit |
| RNHC A,az= 271 ml, $L,=205 11 103 |
| 0 |
*) R - NH - entspricht hier dem N-Desulfoheparin-molekül.
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Fortsetzung
| Antikeagulierende Antilipämische |
| Verbindung*) W3pektrurn Wirksanikeit Wirksamkeit |
| i |
| R-NH-C < - CH3 mar242TflEi1" 145 15 130 |
| /OMe |
| rn-29OmE11-77 6,3 6,3 =77 6,3 39,3 |
| CH-C1li |
| R - NH - C 4 / Vorliegen von Phenylen } 3 | 28 |
| 0 |
| Cl |
| R - NH - C - CH2 W Cl 8 Amaz=282 5my Es*,=19 19,1 7,3 41 |
| 0 |
| R-NH-S02- < C Amaz=23omF 4=143 11,5 j 130 |
*) R - NH - entspricht hier dem N-Desulfoheparin-molekül.