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Verfahren zur Herstellung von N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparinen
oder deren Alkalisalzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparinen oder deren Alkalisalzen. Diese Verbindungen
sind insbesondere zur Behandlung von Störungen des Blutgerinnungsvermögens anwendbar.
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In der britischen Patentschrift 863 235 wurden bereits N-Acylderivate
des N-Desulfoheparins, wie beispielsweise das N-Benzoyl-N-desulfoheparin, das N-p-Nitrobenzoyl-N-desulfoheparin
und das N-(3,5-Dimethylbenzoyl)-N-desulfoheparin, beschrieben, die eine sehr geringe
antikoagulierende Wirkung besitzen.
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Weiterhin ist aus der britischen Patentschrift 867 064 die Uberführung
von N-Desulfoheparin in substituierte Harnstoffderivate bekannt, wobei Verbindungen
wie N-Butylheparylharnstoff, Phenylheparylharnstoff oder a-Naphthylheparylharnstoff
erhalten werden, die eine wenig ausgeprägte antikoagulierende Aktivität besitzen.
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Die erfindungsgemäß herstellbaren N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparine
oder deren Alkalisalze haben eine starke antikoagulierende Wirkung und insbesondere
eine verzögerte antikoagulierende Wirkung, die 6 bis 10 Stunden nach dem Zeitpunkt
der Verabreichung feststellbar ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparinen
oder deren Alkalisalzen der allgemeinen Formel
in welcher R ein Wasserstoff- oder Alkaliatom und wenigstens eine der Gruppen R1,
R2, R3 und R4 - SO3R und die übrigen - H oder - SO3R bedeuten, wobei R die vorstehend
angegebene Bedeutung hat und der Wert von n etwa 10 ist durch
Acylierung von N-Desulfoheparin
ist dadurch gekennzeichnet, daß man in jeweils an sich bekannter Weise das N-Desulfoheparin
in das Salz einer quaternären Ammoniumbase mit langer Kohlenstoffkette überführt,
dieses Salz mit einem Anhydrid
oder einem gemischten Anhydrid einer
mono- oder polysulfonierten Benzoesäure umsetzt und gegebenenfalls das erhaltene
Amid durch Umsetzung mit einem niederen Alkaliacylat in das Alkalisalz überführt.
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In dem folgenden Schema sind die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
sich abspielenden Umsetzungen zusammengefaßt.
| COOH H2COSO3H COOH H2COSO,3H |
| 1. L°>L OH + quaternäres Ammoniumsalz |
| 0HÜo)Öo Ammoniumsalz des N-Desulfo- |
| O NH2 OH NH2 mit langer Kette heparins |
| H, SO3H 3 |
| 2. Quaternäres |
| Ammoniumsalz des + Anhydrid der sulfo- tertiäres Amin N-(Sulfobenzoyl)- |
| N-Desulfoheparins nierten Benzoesäure ' N-desulfoheparin |
| 3. N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparin niederes Alkaliacylat
Aikalisalz z des N-(Sulfobenzoyl)- |
| N-desulfoheparins |
Als quaternäre Ammoniumsalze werden bevorzugt Trimethyl-(methyldodecylbenzyl)-ammoniumchlorid,
Dilauryldimethylammoniumchlorid und insbesondere Benzyldimethyl - 2 - [2 - (p -
1,1,3,3 - tetramethylbutylphenoxy)-äthoxy]-äthylammoniumchlorid (im folgenden mit
I bezeichnet) verwendet.
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Als Anhydrid oder gemischtes Anhydrid einer mono- oder polysulfonierten
Benzoesäure verwendet man vorzugsweise o- Sulfobenzoesäureanhydrid, 2,4-Disulfobenzoesäureanhydrid,
das gemischte Anhydrid aus 3,5-Disulfobenzoesäure und Sithoxycarbonsäure oder dem
gemischten Anhydrid aus m-Sulfobenzoesäure und Athoxycarbonsäure.
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Als niederes Acylat eines Alkalimetalles verwendet man vorzugsweise
Natriumacetat.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Natriumsalz des N-(2-Sulfobenzoyl)-N-desulfoparins Man
gibt 9,07 g N-Desulfoheparin in 50 ml Wasser, fügt dann 250 ml einer 100/obigen
wäßrigen Lösung von I zu, homogenisiert den gebildeten Niederschlag, läßt etwa 1
Stunde stehen, trennt ab und wäscht mit Wasser. Man erhält 28,5 g I-Salz des N-Desulfoheparins,
welches man als solches in der nachfolgenden Stufe des Herstellungsverfahrens anwendet.
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Man bringt unter Rühren 3 g des vorstehend aufgeführten Salzes in
60 ml Tetrahydrofuran ein und rührt bis zur Lösung. Dann fügt man nacheinander unter
Rühren 3 ml Triäthylamin und 1,5 g o-Sulfobenzoesäureanhydrid zu: Man rührt während
15 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird im Vakuum zur Trockne eingedampft,
der Rückstand in 30 ml wäßrigem n-Butanol aufgenommen, die Lösung in n-Butanol mehrmals
mit einer 200/oigen Natriumacetatlösung extrahiert, die vereinigten Extrakte filtriert,
das Filtrat in Methanol gegossen und etwa 1 Stunde stehengelassen, der gebildete
Nieder-
schlag abgetrennt, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,047
g des Natriumsalzes des N-(2-Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparins .
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Die UV-Absorption (in n/10-Salzsäure) bei 266 und 272 mt* entspricht
etwa 1,3 bis 1,4 10-3 Mol Sulfobenzoesäure je Gramm des Produkts.
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Das Produkt ist in Wasser löslich, unlöslich in Alkohol, Ather, Aceton,
Benzol und Chloroform.
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Durch verdünnte wäßrige Säuren wird es hydrolysiert und durch verdünnte
wäßrige Alkalien zersetzt.
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Analyse: (C76H77077N4SllNal5)n = (2976,12)n: Berechnet . . . S 11,850/0;
gefunden . S 11,4°/o.
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Die Verbindung ist in der Literatur nicht beschrieben.
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Antikoagulierende Aktivität: 36,511,5 UAT/mg (vgl. Bull. Soc. Chim.
Biol., 40, 1958, S. 1221).
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Beispiel 2 Natriumsalz des N-(2,4-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparins
Man löst 17,88 g des Kaliumsalzes des N-Desulfoheparins in 100 ml Wasser, fügt dann
500 ml einer 100/oigen wäßrigen I-Lösung zu, homogenisiert das Reaktionsgemisch
und läßt während etwa 2 Stunden stehen, trennt den Niederschlag ab, wäscht ihn mit
Wasser und trocknet ihn im Vakuum. Man erhält 56 g des I-Salzes des N-Desulfoheparins.
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Man bringt unter Rühren 49 g dieses Salzes in 1000 ml Tetrahydrofuran
ein, fügt dann nach der Lösung bei Raumtemperatur die Lösung des I-Salzes des 2,4-Disulfobenzoesäureanhydrids
in Tetrahydrofuran, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist, hinzu und rührt
das Reaktionsgemisch während etwa 17 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend dampft
man im Vakuum zur Trockne ein, ohne 50° C zu überschreiten, nimmt den Rückstand
in 500 ml wäßrigem n-Butanol auf, extrahiert mehrmals mit einer 200/oigen wäßrigen
Natriumacetatlösung,
vereinigt die Extrakte und filtriert sie, fügt
750 ml Methanol zu und läßt etwa 1 bis 2 Stunden stehen.
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Anschließend filtriert man den gebildeten Niederschlag, wäscht ihn
nacheinander mit Methanol und Äther, trocknet und erhält das rohe Natriumsalz des
N-(2,4-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparins. Man reinigt dieses Produkt, indem man
eine wäßrige Lösung desselben durch ein stark basisches Anionenaustauschharz leitet,
welches die funktionelle Struktur eines quaternären Ammoniums besitzt.
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Man leitet die gesamte wäßrige Lösung, deren Herstellung vorstehend
beschrieben ist, durch das Harz, aber sammelt nur die Fraktion, die einen positiven
Test, bei der Ausfällung mit I ergibt, spült die Säule mit destilliertem Wasser,
vereinigt die Eluate, behandelt sie mit Tierkohle, filtriert und neutralisiert das
Filtrat durch Zugabe von Essigsäure. Dann stellt man den pH-Wert mit Natronlauge
auf 7,8 ein, fällt durch Zugabe von Methanol aus, trennt den Niederschlag ab und
trocknet ihn, wäscht ihn nacheinander mit Methanol und Äther, trocknet ihn und erhält
16,7 g Natriumsalz des N-(2,4-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparins.
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Schwefelgehalt:12,650/0 (Theorie: 14,18°/o).
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UV-Spektrum (in n/10-HCl-Lösung): #max = 221 mµ, E1cm1% = 107, #max
= 263 mµ, E1cm1% = 11,2, imax = 270 mµ, E:C, = 12,4, #max = 277 mµ, E1cm1% = 11,1.
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Antikoagulierende Aktivität: 66,2 UAT/mg.
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Das Produkt ist in Wasser löslich, in Alkohol Äther, Aceton, Benzol
und Chloroform unlöslich.
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Die Verbindung ist in der Literatur nicht beschrieben.
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Die Lösung des I-Salzes des 2,4-Disulfobenzoesäureanhydrids wird
in hier nicht beanspruchter Weise folgendermaßen hergestellt: Man löst 70 g des
Natriumsalzes der 2,4-Disulfobenzoesäure in 700 ml Wasser und 70 ml Ameisensäure.
Anschließend fügt man 1550 ml einer 100/oigen wäßrigen I-Lösung zu, extrahiert mehrmals
mit Methylenchlorid, vereinigt die Extrakte und dampft sie ein, vertreibt das Wasser
azeotrop mit Benzol, nimmt den trockenen Rückstand in 700 ml Trichloräthylen auf,
erhitzt am Rückfluß bis zur Lösung, läßt auf etwa 50 bis 60°C abkühlen und gibt
unter Rühren 105 ml Thionylchlorid zu. Man rührt weiter während etwa 2 Stunden bei
einer Temperatur zwischen 75 und 80"C, destilliert am Anfang unter normalem Druck,
anschließend im Vakuum, bis keine Spuren von Thionylchlorid mehr vorhanden sind.
Man nimmt anschließend den Rückstand in 700 ml Tetrahydrofuran auf, behandelt die
Lösung mit Tierkohle und filtriert.
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Beispiel 3 N-(3,5-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparin und dessen Natriumsalz
Man fügt zu der in nachstehender Weise erhaltenen Lösung des 3.5 - Disulfobenzoesäureanhydrids
eine Lösung von 2 g des I-Salzes des N-Desulfoheparins (hergestellt gemäß Beispiel
2) und 0,5 ml Triäthylamin in 30 ml Tetrahydrofuran.
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Man rührt das Gemisch 90 Minuten lang bei 50°C unter Einleiten von
Stickstoff. Die Lösung wird anschließend im Vakuum zur Trockne eingedampft.
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Man erhält das N-(3,5-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparin in Form eines
amorphen Niederschlags.
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Dieser wird in 30 ml mit Wasser gesättigtem Butanol gelöst. Man schüttelt
diese Lösung dreimal mit 5 ml einer 200/oigen wäßrigen Lösung von Natriumacetat
aus. Die wäßrige Lösung wird filtriert und dann in 100 ml Methanol gegossen. Es
fällt das Natriumsalz des N-(3,5-Disulfobenzoyl)-N-desulfoheparins aus. Man gewinnt
es durch Filtrieren, trocknet, wäscht es mit Methanol mit 200/0 Wasser und saugt
ab. Man erhält so 0,5 bis 0,55 g des Natriumsalzes, was einer Ausbeute von 55 bis
600/0 entspricht. Das erhaltene Produkt zeigt einen Amidgehalt, der etwa zwischen
82 und 95°/o des theoretischen Wertes liegt.
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UV-Spektrum (in n/10-Salzsäure): Infl. bei etwa 270 und 230 mop.
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Antikoagulierende Aktivität: 31i3 UAT/mg.
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Das UV-Spektrum entspricht einem Gehalt von 0,97 bis 1,13 10-3 Mol
3,5-Disulfobenzoesäure je Gramm des Produktes (Theorie: 1,18 10-3/g).
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Die Verbindung ist in der Literatur nicht beschrieben.
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Die Lösung des 3,5-Disulfobenzoesäureanhydrids wird in hier nicht
beanspruchter Weise folgendermaßen hergestellt: In einem Erlenmeyer-Kolben von 500
ml löst man 3,75 g Kalium-3,5-disulfobenzoat in 50 ml destilliertem Wasser. Der
pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von Kalilauge auf 10 eingestellt. Dann werden
160 ml einer 100/oigen I-Lösung zugefügt.
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Das I-Salz der 3,5-Disulfobenzoesäure fällt aus. Man trennt durch
Filtrieren ab, digeriert dann zweimal mit 10 ml Methylenchlorid. Die organische
Lösung wird mit Wasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne
eingedampft. Der trockene Extrakt wird in 30 ml Tetrahydrofuran wieder gelöst. Die
Lösung wird in einen Dreihalskolben übergeführt und auf 0 bis +5"C unter Rühren
und Stickstoffatmosphäre abgekühlt. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von 0,1
ml Triäthylamin auf 10 ein, fügt dann 0,75ml Chlorameisensäureäthylester zu, wobei
man das Rühren in Stickstoffatmosphäre aufrechterhält. Nach 15 Minuten fügt man
1,5 ml einer 10%igen Triäthylaminformiatlösung in Tetrahydrofuran zu, durch welche
der Uberschuß des Chlorameisensäureäthylesters zersetzt wird.
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Beispiel 4 Natriumsalz des N-(3-Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparins Man
fügt zu der in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellten Lösung von m-Sulfobenzoesäureanhydrid
30 ml einer 10%igen Lösung des I-Salzes des N-Desulfoheparins in Tetrahydrofuran.
Man spült den Behälter, in dem das Salz enthalten war, mit 10 ml Tetrahydrofuran.
Das Gemisch wird während einer Stunde bei +5"C unter Stickstoffatmosphäre gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird anschließend im Vakuum zur Trockne eingedampft.
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Der amorphe Rückstand wird in 50 ml mit Wasser gesättigtem Butanol
wieder gelöst. Die Lösung des N-(m-Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparins wird dann mit
10 ml, 10 ml und schließlich 5 ml einer wäßrigen 200/oigen Natriumacetatlösung ausgeschüttelt.
Die dekantierte wäßrige Phase wird filtriert und in 100 ml
Methanol
gegossen. Der Niederschlag des Natriumsalzes wird schließlich abgesaugt, gewaschen
und getrocknet.
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Man erhält so 1,05 g Natriumsalz des N-(3-Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparins,
d. h. eine Ausbeute von 750/0.
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- NH2-Gehalt <40/0 (wiedergegeben als N-Desulfoheparin), S-Gehalt
11,50/0 (Theorie: 11,88).
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UV-Spektrum (in n/10-Salzsäure): Beugungen bei 230 mp, E:C, = 79,5,
bei 270 mµ, El% = 6,6.
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Diese Absorption entspricht 1,06 10-3 Mol m - Sulfobenzoesäure je
Gramm des Produktes (Theorie: 1,35 10-3). Der Amidwert liegt somit in der Größenordnung
von 800/0.
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Antikoagulierende Aktivität: 29 UAT/mg.
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Die Verbindung ist in der Literatur nicht beschrieben.
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Die Lösung des m-Sulfobenzoesäureanhydrids erhält man in hier nicht
beanspruchter Weise folgendermaßen: In einem Erlenmeyer-Kolben von 300ml werden
nacheinander 5,2 g Natrium-m-sulfobenzoat, 125 ml destilliertes Wasser und 2,5 ml
Natronlauge gegeben.
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Das Natrium-m-sulfobenzoat löst sich rasch. Man erhält eine alkalische
Lösung mit einem pH-Wert von etwa 10. Man fügt dann 200 ml einer 100/oigen wäßrigen
I-Lösung zu. Es fällt das I-Salz der m-Sulfobenzoesäure aus. Der durch Filtrieren
abgetrennte amorphe Niederschlag wird zweimal mit 100 ml Methylenchlorid aufgenommen.
Die organische Lösung wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und
unter Atmosphärendruck zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand des Salzes
wird in etwa 50 ml Tetrahydrofuran wieder gelöst.
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Nach vollständiger Lösung stellt man mit Tetrahydrofuran genau auf
ein Volumen von 100 ml ein.
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Von dieser Lösung bringt man 50 ml in einen Dreihalskolben. Man kühlt
auf 50 + 1 unter Rühren und unter Stickstoffatmosphäre ab. Man stellt den pH-Wert
der Lösung mit Trimethylamin auf 10 ein und bringt 1 ml frisch destillierten Chlorameisensäureäthylester
ein. Die Temperatur des Gemisches
steigt langsam, bis sie 5°C erreicht. Man hält
dann 30 Minuten bei dieser Temperatur. Anschließend fügt man 3 ml einer 100/oigen
Lösung von Triäthylaminformiat in Tetrahydrofuran zu.
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Die N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparine können zur Behandlung von
Thrombosen, Thrombophlebiten, Embolien, bei drohenden Lungen- oder Herzinfarkten,
bei Arteriiten, bei Angina pectoris und trophischen postphlebitischen Störungen
verwendet werden.
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Sie besitzen gegenüber dem Heparin insbesondere den Vorteil, daß
sie eine verlängerte Wirkung ausüben, wodurch wiederholte intravenöse Injektionen
oder die fortlaufenden venösen Perfusionen vermieden werden, wie sie bei sehr erhöhten
Heparindosierungen der Fall sind. Sie besitzen darüber hinaus gegenüber den vom
Dicumarin abstammenden antikoagulierenden Mitteln den Vorteil, daß sie rasch und
mit einer gut zu bestimmenden Verzögerung wirken, während die Dicumarinderivate,
die die Synthese des Thrombins in der Leber hemmen (Antagonisten des Vitamin K),
eine spät eintretende Wirkung zeigen, deren Dauer jedoch nicht mit Sicherheit vorhergesehen
werden kann.
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Schließlich zeigt sich die Wirkung der N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparine
in sämtlichen Stadien der Koagulierung, was ihre Wirkung sicherer und weniger gefährlich
für den Organismus macht.
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Die N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparine werden intravenös verabreicht.
Auf oralem Wege wirken sie nicht.
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Die wirksame Dosis liegt zwischen 400 mg und 2 g je Tag beim Erwachsenen,
je nach der Verabreichungsart.
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Verzögerte Wirkung bei intravenöser Verabreichung Diese Wirkung wurde
beim Kaninchen untersucht.
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Sie wurde gemessen, indem die Koagulierungszeit in regelmäßigen Abständen
(2, 4, 6,8, 10 Stunden nach der intravenösen Injektion der zu untersuchenden Verbindung)
bestimmt wurde. Die Verbindungen wurden in Dosen von 10 mg/kg und 20 mg/kg verabreicht.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
| Antikoagulierende Aktivität |
| 10 mg/kg 20 mg/kg |
| Verabreichte Verbindung |
| internationale Dauer der internationale Dauer der |
| Einheiten je Wirkung Einheiten je Wirkung |
| Kilogramm in Stunden Kilogramm in Stunden |
| Heparin (Vergleich ................................ 1350 4
2700 6 bis 7 |
| N-(2-Sulfobenzoyl)-desulfoheparin (Beispiel 1) ....... 340
6 680 9 |
| N-(3-Sulfobenzoyl)-desulfoheparin (Beispiel 4) ....... 250
3 |
| N-(3,5-Disulfobenzoyl)-desulfoheparin (Beispiel 3) .... 300
2 600 3 |
| N-(2,4-Disulfobenzoyl)-desulfoheparin (Beispiel 2) .... 220
6 bis 7 440 9 bis 10 |
Wie sich aus der Tabelle ergibt, besitzen die N-(Sulfobenzoyl)-N-desulfoheparine
eine verlängerte antikoagulierende Wirkung bei erheblich schwächeren antikoagulierenden
Dosen (ausgedrückt in Inter-
nationalen Einheiten gemäß United States Pharmacopoeia
(USP)-Codex, 15. Auflage), als sie bei Heparin notwendig sind, um eine Wirkung in
derselben Größenordnung zu erzielen.