DE1228599B

DE1228599B - Verfahren zur Herstellung von Heparinamiden

Info

Publication number: DE1228599B
Application number: DEU8114A
Authority: DE
Inventors: Dr Gerard Nomine; Dr Robert Bucourt
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1960-06-21
Filing date: 1961-06-20
Publication date: 1966-11-17

Description

Verfahren zur Herstellung von Heparinarniden Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Amidierungsprodukten des Heparins, deren Carboxylgruppen zu 60 bis 95°/o amidiert sind.
Diese neuen Produkte werden im folgenden als »Heparinamide« bezeichnet.
Einige dieser neuen Verbindungen, vor allem die N-Methylheparinamide, weisen nützliche physiologische Eigenschaften auf, insbesondere eine erhöhte antilipämische Wirksamkeit, wobei sie praktisch frei von antikoagulierender Wirksamkeit sind, die typisch für die Verbindungen dieser Körperklasse ist.
Besonders das Natriumsalz des N-Methylheparinamids kann zur Behandlung der postprandialen oder chronischen Hyperlipämie, der Hypercholesterinämie, der Atheromatose, der hepatischen Steatosen und der lipoiden Nephrosen dienen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Heparinamiden der allgemeinen Formel wobei R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest, R' ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall und n etwa 10 bedeutet und wobei die Carboxylgruppen zu 60 bis 95°/o amidiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man das Heparin als Salz einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung mit Hilfe von Diazomethan an den Carboxylgruppen in den Methylester oder mit Hilfe eines Chlorameisensäure- alkylesters an den Carboxylgruppen in ein gemischtes Anhydrid aus Heparin und Kohlensäurealkylester überführt, dieses Derivat sodann mit Ammoniak oder einem primären Alkylamin zum Heparinamid umsetzt, das man gegebenenfalls, falls R ein Wasserstoffatom bedeutet, mit Hilfe von Diazomethan in das N-Methylheparinamid überführt, und daß man die Heparinamide in an sich bekannter Weise als Alkalisalz isoliert.
Nach einer ersten Durchführungsform der Erfindung verestert man zunächst die Carboxylgruppen des Heparins, indem man das Heparin als Salz einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung mit Diazomethan umsetzt.
Nach einer zweiten Durchführungsform der Erfindung stellt man zunächst ein gemischtes Anhydrid des Heparins mit einem Kohlensäurealkylester her, indem man das Heparin als Salz einer langkettigen, quaternären Ammoniumverbindung mit einem niederen Chlorameisensäurealkylester umsetzt. Die erwähnten langkettigen quaternären Ammoniumsalze des Heparins haben den Vorteil, in praktisch allen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. in Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran, löslich und in Wasser unlöslich zu sein; damit wird es durch diese Salze möglich, die N-Alkylierung der einfachen Heparinamide in wasserfreiem Medium durchzuführen; außerdem ist es dadurch möglich, Heparinamid zu isolieren und zu reinigen, indem wieder zum wäßrigen Medium übergegangen wird.
Die langkettigen quaternären Ammoniumsalze des Heparins und seiner funktionellen Derivate haben außerdem den Vorteil, daß sie sich durch eine wäßrige Lösung von Natrium- oder Kaliumacetat in die Natrium- oder Kaliumsalze des Heparins oder der entsprechenden funktionellen Derivate zersetzen lassen, die löslich in Wasser und unlöslich in Alkohol sind.
Für die hier nicht beanspruchte Herstellung der Heparin salze langkettiger, quaternärer Ammoniumverbindungen verwendet man vorteilhaft die folgenden Produkte: Benzyldimethyl - 2 - [2- (p-1, 1,1,3,3 3, tetramethylbutylphenoxy) - äthoxy] - äthylammoniumchlorid der Summenformel C27H42ClNO2 H20 und der Strukturformel das auch unter dem Trivialnamen »Benzethoniumchlorid« bekannt ist; ein Gemisch von Alkyl-tolylmethyl-trimethyl-ammoniumchloriden, deren Alkylreste zwischen CsH1s und C15H31 liegen und dessen Durchschnittsmolekulargewicht im Mittel etwa 331 beträgt, das im »Index des huiles sulfonées et détergents modernes« von J. P. 5 i 5 1 e y, II, S. 373, beschrieben ist; ferner Alkyl-dimethyl-benzyl-ammoniumbromid, das in dem erwähnten Index auf S. 287 angegeben ist; Dilauryl-dimethyl-ammoniumchlorid, das auf S. 261 des erwähnten Index angegeben ist und schließlich Alkyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid, das auf S. 286 des erwähnten Index angegeben ist.
Als Chiorameisensäureester wählt man vorzugsweise Chlorameisensäureäthylester.
Die Reaktion des Methylesters bzw. des gemischten Anhydrids mit primären Aminen, vor allem mit Methylamin, wird sehr vorteilhaft in einem wäßrigen Medium durchgeführt, doch erhält man auch gute Ergebnisse, wie dies später gezeigt wird - wenn man in einem wasserfreien Medium arbeitet, das aus einem Lösungsmittel, wie z. B. Formamid, bestehen kann.
So stellt man mit Hilfe von primären Aminen, wie z. B. Methylamin, Ätàylamin, Propylamin, Isopropylamin, Butylamin, Isobutylamin, tert.-Butylamin, die entsprechenden N-Alkylheparinamide her, nämlich: N-Methylheparinamid N-Äthylheparinamid N-Propylheparinamid N-Isopropylheparinamid N-Butylheparinamid N-Isobutylheparinamid N-tert.-Butylheparinamid Es ist vorteilhaft, die Amidierungsreaktionen unter Kühlung, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen -30 und + 25°C durchzuführen.
Im Falle der Herstellung von N-Methylheparinamid besteht eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, zunächst das einfache Heparinamid herzustellen und dann dieses in Form eines langkettigen, quaternären Ammoniumsalzes mit Di- azomethan zu methylieren. Hierbei erfolgt die Amidierung durch Ammoniak vorzugsweise im wäßrigen Medium.
Der Amidierungsgrad der Carboxylgruppen der so erhaltenen Produkte hängt von der Natur des Amins und den Arbeitsbedingungen ab, insbesondere der Aminkonzentration des Mediums, da der Amidierungsgrad gewöhnlich höher ist, wenn das Medium reicher an Amin ist.
Die Amidierungsreaktion - kann in einem wasserfreien Medium durchgeführt werden, aber sie ergibt auch sehr gute Resultate, wenn man in Gegenwart eimer geringen Menge Wasser arbeitet.
Diese zweite Durchführungsform, wonach zunächst ein gemischtes Anhydrid hergestellt wird, führt zu Produkten, deren antilipämische Wirksamkeit genauso hoch ist wie die der Produkte, die durch das erste Verfahren, wonach zunächst verestert wird, erhalten werden, deren antikoagulierende Wirksamkeitjedoch auf die Hälfte, bezogen auf diese Produkte, vermindert wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1 Herstellung des Heparinamids (Kaliumsalz) a) Heparinmethylester (Kaliumsalz) 30 g saures Benzethoniumsalz des Heparins werden in 300 ccm Methylenchlorid gelöst. Man kühlt auf 0° ab und gibt langsam 51 ccm einer Methylenchloridlösung hinzu, die je 100 ccm 14,7 7g Diazomethan enthält und läßt die Reaktionsmischung 10 Minuten lang bei 0° stehen. Man destilliert dann das Lösungsmittel im Vakuum, löst den Rückstand in 450 ccm mit Wasser gesättigtem Butanol auf und extrahiert die Butanollösung mit einer 20%igen Lösung aus Kaliumacetat. Die Extrakte werden in Äthanol geschüttet, man läßt 1 Stunde stehen, saugt ab, wäscht das erhaltene Produkt mit Äthanol und mit Äther und erhält 12,86 g Heparinmethylester als Kaliumsalz. Das Produkt ist zu 4,4% solvatisiert.
Es liegt in Form eines weißen testen Körpers vor, der in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B Alkohol, Äther, Aceton, Benzol, Chloroform, unlöslich ist und in Wasser und verdünnten wäßrigen Alkalien löslich ist. Es zersetzt sich in verdünnten wäßrigen Säuren. [α]D20 = +45° (c = 1°/o in Wasser).
Analyse: C52H73O73N4S11K11 = 2705.
Berechnet: C 23, 08°/o, H 2, 72°/o, N 2, 07°/o, OCH 4, 6°/o ; gefunden: C 22,8 bis 22,9%, H 3,0 bis 2,7%, N 1,9%.
OCH3 4,4%.
Dieses Produkt ist in der Literatur nicht beschrieben.
Auf ähnliche Weise stellt man Heparinmethylester in Form des Natriumsalzes her, wobei man eine Natriumacetatlösung zum Extrahieren der das Benzethoniumsalz enthaltenden Butanollösung verwendet.
Das saure Benzethoniumsalz des Heparins wird in hier nicht beanspruchter Weise folgendermaßen hergestellt: Man löst 40 g Natriumheparinat, das zu 7,2% solvatisiert ist, in 160 ccm Wasser, fügt 10 ccm Ameisensäure und dann 810 ccm einer 10%igen Lösung von Benzethoniumchlorid zu (pH-Wert etwa 4 bis 5).
Die Reaktionsmischung wird einige Minuten lang gerührt; man saugt das ausgefallene Produkt ab, wäscht mit Wasser und trocknet. Man erhält so 86,8 g (91,4%) saures Benzethoniumsalz des Heparins, bei dem die -O-SO3H-Gruppen und - NH - SO3H-Gruppen des Heparins durch Benzethonium neutralisiert und die - COOH-Gruppen frei sind. b) Amidierung Man sättigt 800 ccm einer Ammoniaklösung von 220Be' bei +3° mit Ammoniakgas. Man fügt unter Rühren bei +3° eine Lösung von 8 g Heparinmethylester in Form des Kaliumsalzes in 40 ccm destilliertem Wasser hinzu, sättigt erneut mit Ammoniak und läßt 48 Stunden lang bei 0° stehen. Man verjagt dann den Ammoniak durch Destillation im Vakuum unterhalb 200.
Zu der zurückbleibenden wäßrigen Lösung gibt man eine Lösung von 16 g Benzethoniumchlorid in 160 ccm destilliertem Wasser. Das Benzethoniumsalz fällt aus, man saugt es ab und wäscht es mit Wasser; dann löst man es in mit Wasser gesättigtem Butanol und extrahiert mit einer 20%igen wäßrigen Kaliumacetatlösung. Man gießt die Extrakte in Äthanol und saugt die ausgefallene Substanz ab, die man über Phosphorsäureanhydrid trocknet. Man erhält 7,08 g des Produktes mit einem Amidierungsgrad von etwa 72°/o, das die folgenden Merkmale aufweist: Solvatisierung: 7, 75°/o ; Estergruppen: 0 Analyse: C48H69O69S11N8K11 = 2645.
Berechnet: C 21,79%, H 2,62%, N 4,23%, 5 13,33%; gefunden: C 22,0 bis 22, 1°/o, H 2,6%, N 3,5 bis 3,6%, S 12, 3°/o.
Physiologische Wirksamkeit: Antilipämische Wirkung: 116 E/mg, was korrigiert 136 E/mg ergibt.
Antikoagulierende Wirkung: 25 E/mg, was korrigiert 30 E/mg ergibt.
Die korrigierten Werte werden hier und im folgenden nach Abzug des Gehalts an Kristallwasser auf der Basis von wasserfreiem Heparinamid berechnet.
Dieses Produkt ist in der Literatur- nicht beschrieben.
Auf ähnliche Weise stellt man ein Heparinamid in Form des Natriumsalzes her, wobei man eine Natriumacetatlösung an Stelle der Kaliumacetatlösung zur Extraktion der Butanollösung, welche das Benzethoniumsalz enthält, verwendet.
Beispiel 2 Herstellung des N-Methylheparinamids (Natriumsalz) in wasserfreiem Medium Man kondensiert bei -30 bis 400 30 ccm Monomethylamin und fügt eine auf 0° abgekühlte Lösung von 0,5 g des nach Beispiel 1, a) hergestellten Heparinmethylesters in Form des Natriumsalzes und 15 ccm Formamid hinzu. Die Reaktionsmischung wird bei einer Temperatur von - 10 bis - 150 2 Stunden lang gehalten. Man verjagt dann unter Vakuum den Uberschuß des Methylamins und fügt dann eine Lösung aus 15 g Benzethoniumchlorid in 100 ccm Wasser hinzu. Nach dem Stehen über Nacht saugt man das Benzethoniumsalz ab, das man in 20 com mit Wasser gesättigtes Butanol einführt.
Man extrahiert mit einer 20%igen wäßrigen Natriumacetatlösung, gießt die Extrakte in Alkohol und saugt das N-Methylheparinamid ab, das man mit Alkohol wäscht und über Phosphorsäureanhydrid trocknet.
Ausbeute 458 mg (88%) an zu 13,1% solvatisiertem Produkt.
Antilipämische Wirksamkeit: 151 E/mg.
Antikoagulierende Wirksamkeit: 11 E/mg (korrigierte Werte).
Stickstoffgehalt: 3,8 % (die Theorie beträgt 4, 41°/o).
Nach dem Stickstoffgehalt beträgt der Amidierungsgrad 71, %.
Dieses Produkt ist in der Literatur nicht beschrieben.
Auf ähnliche Weise stellt man ein N-Methylheparinamid-Kaliumsalz her, wobei man eine Kaliumacetatlösung an Stelle der Natriumacetatlösung zum Extrahieren der Butanollösung, die das Benzethoniumsalz enthält, verwendet.
Beispiel 3 Herstellung des N-Methylheparinamids (Natriumsalz) in wäßrigem Medium Man läßt Monomethylamin in 25 ccm Wasser perlen, wobei die Temperatur zwischen 0 und +5° gehalten wird, bis das Volumen 50 ccm erreicht, fügt 0,5 g des nach Beispiel 1, a) hergestellten Heparinmethylesters in Form des Natriumsalzes hinzu und rührt die entstandene Mischung 2 Stunden lang bei + 10°. Man verjagt dann das Methylamin im Vakuum, fügt eine Lösung aus 1,5 g Benzethoniumchlorid in 100 ccm Wasser hinzu und läßt diese dann bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Man saugt ab, löst das abgesaugte Produkt in 20 ccm mit Wasser gesättigtem Butanol und extrahiert mit einer Natriumacetatlösung. Man gießt die Extrakte in Alkohol und saugt das N-Methylheparinamid ab, das man über Phosphorsäureanhydrid trocknet.
Ausbeute: 478 mg Produkt (95, 5°/o), das zu 9,95% solvatisiert ist. [α]D20 = +50,7° (c = 1% in Wasser).
Antilipämische Wirksamkeit: 148 E/rng.
Antikoagulierende Wirksamkeit: 10,5 E/mg (korrigierte Werte).
Analyse: C52H77O69S11N8Na11 = 2524.
Schwefelgehalt ... 13,03% (Theorie : 13, 97°/o).
Stickstoffgehalt ... 4, 1°/o.
Nach dem Stickstoffgehalt beträgt der Amidierungsgrad 85°/o.
Beispiel 4 Herstellung - des N-Methylheparinamids (Kaliumsalz) durch Methylierung von Heparinamid Man löst 2 g Heparinamid (Natriumsalz), das gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, in 10 ccm Wasser, fügt 2 ccm Ameisensäure und dann 34 ccm einer 10%igen Lösung von Benzethoniumchlorid hinzu.
Das saure Benzethoniumsalz, das ausfällt, wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Phosphorsäureanhydrid löst man es .in 50 ccm Methylenchlorid und führt dann 10 ccm einer Diazomethanlösung mit einem Gehalt von 11 g/l ein. Die Reaktionsmischung wird einige Minuten stehengelassen und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 75 ccm mit Wasser gesättigtem Butanol aufgenommen und mit einer 20%igen wäßrigen Kaliumacetatlösung extrahiert.
Man gießt die Extrakte in Alkohol, saugt den Niederschlag ab, wäscht und trocknet und erhält 1,7 g zu 7,1% solvatisiertes Produkt, das 5,05% Kaliumacetat enthält.
Stickstoffgehalt: 3,5 bis 3,6% (korrigiert, Theorie: 4, 23°/o).
Antilipämische Wirksamkeit: 125 E/mg.
Antikoagulierende Wirksamkeit: 8,9 E/mg (korrigierte Werte).
Der Stickstoffgehalt bestätigt, daß der Amidierungsgrad des Ausgangsproduktes von 72°/o in dem xerhaltenen Produkt konstant geblieben ist.
Auf ähnliche Weise stellt man ein N-Methylheparinamid-Natriumsalz her, wobei man eine Natriumacetatlösung an Stelle der Kaliumacetatlösung zum Extrahieren der Hyaminsalz enthaltenden Butanollösung verwendet.
Beispiel 5 Herstellung eines N-Methylheparinamids In eine auf 0 bis +2° abgekühlte, 0,3% Wasser enthaltende Lösung von 6 g neutralem Heparin- benzethoniumsalz, das beispielsweise nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 989 438 hergestellt wurde, in 120 ccm Tetrahydrofuran gibt man 2 ccm Chlorameisensäureäthylester. Man rührt 15 Minuten lang bei 0 bis +20; dann läßt man Monomethylamin derart durchperlen, daß 41 Gas in 15 Minuten eingeführt werden, wobei so gekühlt wird, daß die Temperatur nie +7° überschreitet.
Man rührt dann noch 45 Minuten lang bei 0 bis +2°. Man destilliert zur Trockne im Vakuum bei Raumtemperatur. Der Rückstand wird in 80 ccm mit Wasser gesättigtem n-Butanol gelöst. Man macht vier aufeinanderfolgende Extraktionen mit 6 com einer 20%igen, wäßrigen Natriumacetatlösung. Die vereinigten Extrakte werden mit 43 ccm einer 10%igen Lösung von Benzethoniumchlorid behandelt. Nach lstündigem Stehen saugt man ab, wäscht in Wasser, nimmt in 60 ccm mit Wasser gesättigtem Butanol auf und macht drei Extraktionen mit je 6 ccrn einer 20%igen wäßrigen Natriumacetatlösung.
Das erhaltene Produkt ist weiß, unlöslich in Alkohol und Äther und löslich in Wasser und in wäßrigen, verdünnten Säuren und Alkalien.
[aln +55 bis 58° (c = 1°/o in Wasser).
Amidierungsgrad: 90°/o.
Solvatisierung: 7, 7°/o.
Schwefel: 13,75% (die Theorie beträgt 13,98).
Antilipämische Wirksamkeit: 179 E/mg.
Antikoagulierende Wirksamkeit: 4,1 E/mg.
Als Vergleichsdaten zu den obigen Beispielen werden die antilipämischen und antikoagulierenden Aktivitäten des Heparins angegeben: Antilipämische Aktivität: 150 E/mg.
Antikoagulierende Aktivität: 150 E/mg.
Die von C. Plo tka und R. Jequier (Arcii.
Int. Pharmacodyn., 1960, 126, S. 143) definierte antilipämische Einheit entspricht dem 150. Teil der klärenden Aktivität einer Heparinvergleichslösung, die 150 antikoagulierende Einheiten pro Milligramm aufweist.
Ein Vergleich dieser Aktivitäten mit den Angaben für die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen zeigt die deutliche Uberlegenheit der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von Heparinamiden der allgemeinen Formel wobei R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest, R' ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall und n etwa 10 bedeutet und wobei die Carboxylgruppen zu 60 bis 95°/o amidiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man das Heparin als Salz einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung mit Hilfe von Diazomethan an den Carboxylgruppen in den Methylester oder mit Hilfe eines Chlorameisen- säure-alkylesters an den Carboxylgruppen in ein gemischtes Anhydrid aus Heparin und Kohlensäurealkylester überführt, dieses Derivat sodann mit Ammoniak oder einem primären Alkylamin zum Heparinamid umsetzt, das man gegebenenfalls, falls R ein Wasserstoffatom bedeutet, mit Hilfe von Diazomethan in das N-Methyl-heparinamid überführt, und daß man die Heparinamide in an sich bekannter Weise als Alkalisalz isoliert.