CH617441A5

CH617441A5 - Process for the preparation of a kanamycin A derivative

Info

Publication number: CH617441A5
Application number: CH1521274A
Authority: CH
Inventors: Takayuki Naito; Susumu Nakagawa; Masahisa Oka
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1973-11-14
Filing date: 1974-11-14
Publication date: 1980-05-30
Also published as: FI60217C; GB1485450A; YU301774A; JPS5077345A; NL157910B; ES431912A1; SE7414332L; SE419649B; SE441272B; DK591674A; DK142991C; JPS572719B2; FI327074A; NO142785B; NO744064L; CA1030961A; FI60217B; NO142785C; YU39655B; DK142991B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und wesentlich wirksameres Verfahren zur Herstellung von [l-L-(—)-y-20 Amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A sowie deren Salze. Diese Verbindung hat die Formel The present invention relates to a new and much more effective process for the preparation of [l-L - (-) - y-20 amino-a-hydroxy-butyryl] -kanamycin A and salts thereof. This connection has the formula

IV IV

Kanamycin A weist vier primäre Aminogruppen in den Stellungen 1, 3, 6' und 3" des Moleküls auf. Es hat sich erwiesen, dass die Aminogruppe in 6'-Stellung davon die am reaktionsfähigste ist und dass die 1-Aminogruppe die zweitreaktionsfähigste ist, wenn die Substanz mit einem elektro-philen Agens behandelt wird. Die beiden Gruppen in 3-und 3"-Stellung sind weniger reaktionsfähig als diejenigen in 1- oder 6'-Stellung. Jedoch reagieren sie ebenfalls und ergeben in geringen Anteilen unerwünschte Acylierungspro-dukte. Demgemäss setzte sich die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein befriedigenderes Herstellungsverfahren ausfindig zu machen als dasjenige unserer Mitarbeiter, welches Gegenstand der US-Patentanmeldungen Nr. 221378 und 330 377 ist. Dabei sollte das neue Verfahren selektiver ausgerichtet sein auf die Acylierung der 1-Aminogruppe als auf diejenige der anderen Aminogruppen im Molekül. Kanamycin A has four primary amino groups at positions 1, 3, 6 'and 3 "of the molecule. The amino group at the 6' position has been found to be the most reactive and the 1-amino group is the second most reactive, when the substance is treated with an electrophilic agent. The two groups in the 3 and 3 "position are less reactive than those in the 1 or 6 'position. However, they also react and result in small amounts of undesirable acylation products. Accordingly, the present invention seeks to find a more satisfactory manufacturing process than that of our employees, which is the subject of U.S. Patent Application Nos. 221378 and 330 377. The new process should be more selective towards the acylation of the 1-amino group than that of the other amino groups in the molecule.

Diese Zielsetzung wurde erreicht durch das erfindungs-gemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel IV, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte This objective was achieved by the process according to the invention for the preparation of the compound of the formula IV, characterized by the process steps

A) Umsetzung einer Verbindung der Formel A) Implementation of a compound of the formula

5 5

617 441 617 441

mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, p-Methoxybenzaldehyd oder Pivaldehyd, im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu mindestens 3 Molen Aldehyd, zu einer Verbindung der Formel with benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde, p-methoxybenzaldehyde or pivaldehyde, in the ratio of 1 mole of compound II to at least 3 moles of aldehyde, to a compound of the formula

O O

hr. h ii ch2-n-c-o-ch2~ch worin Z ein Rest der Formel oder hr. h ii ch2-n-c-o-ch2 ~ ch wherein Z is a radical of the formula or

H CHs -N=C-C—CHs CHs ist und H CHs -N = C-C-CHs CHs and

O O

xo xo

15 15

20 20th

25 25th

B) Behandeln der so erhaltenen Verbindung III mit einer Verbindung der Formel B) treating the compound III thus obtained with a compound of the formula

N-O-C-CH-CHa-CHs-NH-C-O-CHa-CeHs N-O-C-CH-CHa-CHs-NH-C-O-CHa-CeHs

I I.

OH OH

XX XX

einem molaren Verhältnis der Verbindungen III zu XX von ungefähr 1:1 bei einer Temperatur im Bereiche von —10 bis ungefähr + 35° C, insbesondere jedoch im Bereiche von + 5 bis ungefähr 25° C, wobei man eine Zeit einhält bis die Acylierung vollständig verlaufen ist, jedoch mindestens 1 bis 3 Stunden. Hernach wird das organische Lösungsmittel vor der Hydrierung zweckmässig abgetrennt. Die Hydrierung in situ lässt sich ausführen mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie beispielsweise Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch vorzugsweise mit Palladium und insbesondere mit Palladium auf Holzkohle. Man arbeitet dabei zweckmässig in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser oder einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetra-hydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther, Propylenglykoldi-methyläther und dergleichen, wobei Wasser als Lösungsmittel vorzuziehen ist und zweckmässig ein pH-Wert von 3 bis 5, jedoch am besten ein Wert von 4 eingehalten wird. a molar ratio of the compounds III to XX of approximately 1: 1 at a temperature in the range from -10 to approximately + 35 ° C., but in particular in the range from + 5 to approximately 25 ° C., allowing a time until the acylation is complete passed, but at least 1 to 3 hours. The organic solvent is then expediently separated off before the hydrogenation. The hydrogenation in situ can be carried out with hydrogen in the presence of a metal catalyst, such as, for example, palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium and nickel, but preferably with palladium and in particular with palladium on charcoal. The procedure is advantageously carried out in water or in a mixture of water or a water-miscible organic solvent, such as dioxane, tetra-hydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether, propylene glycol dimethyl ether and the like, water being preferred as the solvent and expediently a pH of 3 to 5, however a value of 4 is best adhered to.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II umgesetzt mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd oder p-Methoxybenzaldehyd im Verhältnis von einem Mol der Verbindung II zu mindestens 3 Molen Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton bzw. Gemischen davon, mit Wasser im Temperaturbereich von 5 bis 40° C während 30 Minuten bis zu 5 Stunden. In der so erhaltenen Verbindung III bedeutet Z die Reste In a preferred embodiment of the process according to the invention, in process step A the compound II is reacted with benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde or p-methoxybenzaldehyde in the ratio of one mole of the compound II to at least 3 moles of aldehyde in absolute ethanol, methanol, n- Propanol, sec-butanol, tert-butanol, methylene chloride, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof, with water in the temperature range from 5 to 40 ° C. for 30 minutes to 5 hours. In the compound III thus obtained, Z represents the radicals

30 30th

45 45

50 50

im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu mindestens 0,5 Mol der Verbindung XX und nachfolgende Hydrierung des Rückstandes in situ der Formel IV. in the ratio of 1 mol of compound III to at least 0.5 mol of compound XX and subsequent hydrogenation of the residue in situ of formula IV.

Es empfiehlt sich, den Verfahrensschritt A auszuführen in 55 einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie einem Alkohol, z. B. absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Iso-propanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, oder in Methylenchlorid oder in einem Äther als Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, Dioxan oder einem anderen polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid und Aceton, oder in Gemischen dieser Lösungsmittel oder Gemischen derselben mit Wasser. Dabei arbeitet man zweckmässig bei einer Temperatur im Bereiche von 5° C bis zur Rückflusstemperatur des verwendeten Lösungsmittels, während einer Umsetzungsperiode von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden. It is advisable to carry out process step A in a water-miscible solvent, such as an alcohol, e.g. B. absolute ethanol, methanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol, or in methylene chloride or in an ether as a solvent, such as. B. tetrahydrofuran, dioxane or another polar aprotic or protic solvent, such as dimethylformamide and acetone, or in mixtures of these solvents or mixtures thereof with water. The process is expediently carried out at a temperature in the range from 5 ° C. to the reflux temperature of the solvent used, during a reaction period of from about 30 minutes to about 5 hours.

Der Verfahrensschritt A wird vorzugsweise ausgeführt mit Method step A is preferably carried out with

60 60

65 65

HO HO

35 35

40 40

Die erhaltene Verbindung wird in situ oder nach deren Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung der Formel XX im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1 Mol der Verbindung XX und im Temperaturbereich zwischen 5 und 30° C während 1 bis 3 Stunden. Dabei verwendet man zweckmässig ein Lösungsmittel, wie es in Verfahrensschritt A verwendet wurde. Anschliessend wird das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel, jedoch vorzugsweise von Palladium auf Kohle in Wasser oder in einem Gemisch von Wasser mit einem in Wasser mischbaren Lösungsmittel hydriert. Als letztgenanntes Lösungsmittel kommen in Frage: Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyl-äther, jedoch vorzugsweise Wasser. Auch hier wieder liegt der gültige pH-Wert bei 3 bis 5 und vorzugsweise bei 4. The compound obtained is reacted in situ or after its separation with the compound of the formula XX in the ratio of 1 mol of the compound III to approximately 0.5 to 1 mol of the compound XX and in the temperature range between 5 and 30 ° C. for 1 to 3 hours . A solvent such as that used in process step A is advantageously used. The organic solvent is then separated from the reaction mixture and the residue in situ with hydrogen in the presence of palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium or nickel, but preferably palladium on carbon in water or in a mixture of water with a water-miscible Solvent hydrogenated. The last-mentioned solvents are: dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether and propylene glycol dimethyl ether, but preferably water. Again, the valid pH is 3 to 5 and preferably 4.

Bei einem weiteren bevorzugten Herstellungsverfahren zur Verbindung IV wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II umgesetzt mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd oder p-Nitrobenzaldehyd im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu ungefähr 3 Molen Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton bzw. Gemischen davon mit Wasser. Wiederum arbeitet man günstigerweise im Temperaturbereich von 5 bis 40° C während einer Periode von 30 Minuten bis 5 Stunden. In der erhaltenen Verbindung III In a further preferred preparation process for compound IV, in process step A, compound II is reacted with benzaldehyde, salicylaldehyde or p-nitrobenzaldehyde in the ratio of 1 mol of compound II to approximately 3 mols of aldehyde in absolute ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n -Butanol, sec-butanol, tert-butanol, tetrahydrofuran, methylene chloride, dioxane, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof with water. Again, it is convenient to work in the temperature range of 5 to 40 ° C for a period of 30 minutes to 5 hours. In the compound III obtained

617 441 617 441

bedeutet 6 die Reste 6 means the residues

HO HO

Die erhaltene Verbindung III wird in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung XX im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,85 Molen der Verbindung XX und in einem Temperaturbereich von + 15 bis 30° C. Man arbeitet hierbei während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittel, wie es im Verfahrensschritt A verwendet wurde. Hernach wird aus dem Reaktionsgemenge das organische Lösungsmittel abgetrieben und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines der genannten Katalysatoren, jedoch vorzugsweise mit Palladium auf Holzkohle, hydriert, wobei man in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel arbeitet, wobei wiederum Dioxan, Tetrahydro- The compound III obtained is reacted in situ or after its separation with the compound XX in the ratio of 1 mol of the compound III to approximately 0.5 to 0.85 mol of the compound XX and in a temperature range from + 15 to 30 ° C. works here for 1 to 3 hours in a solvent as used in process step A. The organic solvent is then driven off from the reaction mixture and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen in the presence of one of the catalysts mentioned, but preferably with palladium on charcoal, working in water or in a mixture of water and a water-miscible solvent. where again dioxane, tetrahydro-

10 10th

15 15

furan, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldi-methyläther in Frage kommen, indessen das geeignete Lösungsmittel Wasser und der geeigneteste pH-Wert 4 ist. furan, ethylene glycol dimethyl ether and propylene glycol dimethyl ether are suitable, but the suitable solvent is water and the most suitable pH is 4.

Bei einem besonders günstigen Herstellungsverfahren für die Verbindung IV wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II mit Benzaldehyd umgesetzt, im molaren Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu 3 Molen Benzaldehyd, In a particularly favorable production process for the compound IV, the compound II is reacted with benzaldehyde in process step A, in a molar ratio of 1 mol of the compound II to 3 mols of benzaldehyde,

wobei man vorteilhafterweise in einer wässrigen Lösung von Tetrahydrofuran im Verhältnis 1:1 und im Temperaturbereich von 20 bis 30° C bei einem pH-Wert von ungefähr 10 arbeitet. Die Reaktionsdauer beträgt dabei 2 bis 4 Stunden. Erhalten wird die Verbindung der Formel lila advantageously working in an aqueous solution of tetrahydrofuran in a ratio of 1: 1 and in the temperature range from 20 to 30 ° C. at a pH of approximately 10. The reaction time is 2 to 4 hours. The compound of the formula purple is obtained

O H I O H I

CH2-N-C-0-CH2-CgH5 CH2-N-C-0-CH2-CgH5

lila purple

Diese Verbindung lila wird in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung der Formel XX im Verhältnis von 1 Mol lila von 0,6 bis 0,75 Molen der Verbindung XX bei einer Temperatur im Breich von 20 bis 30° C und während einer Zeit von 1 bis 3 Stunden. Als Lösungsmittel kann man dabei ein solches verwenden, wie es im Verfahrensschritt A gebraucht wurde oder auch ein Gemisch von Methylenchlorid, Methanol und Wasser oder ein Gemisch von Dimethylformamid, Aceton und Wasser. This purple compound is reacted in situ or after its separation with the compound of the formula XX in a ratio of 1 mol purple from 0.6 to 0.75 mol of the compound XX at a temperature in the range from 20 to 30 ° C. and for a period of time from 1 to 3 hours. A solvent such as that used in process step A or a mixture of methylene chloride, methanol and water or a mixture of dimethylformamide, acetone and water can be used as the solvent.

Nach der Umsetzung wird das organische Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben und der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt. Anschliessend wird in situ filtriert After the reaction, the organic solvent is stripped off in vacuo and the pH is adjusted to 4 using ammonium hydroxide. It is then filtered in situ

45 45

50 50

mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle. Dabei entsteht die Verbindung IV. with hydrogen at atmospheric pressure in the presence of palladium on carbon. This creates the compound IV.

Eine weitere, gleichfalls besonders vorzüglich geeignete Ausführungsform des Herstellungsverfahrens der Verbindung IV arbeitet im Verfahrensschritt A mit Salicylaldehyd, wobei auf 1 Mol der Verbindung II 3 Mole Salicylaldehyd in einem hälftigen Gemisch von Wasser und Tetrahydrofuran umgesetzt werden. Der geeignete Temperaturbereich liegt zwischen 20 und 30° C und der günstige pH-Bereich bei ungefähr 8. Die Umsetzung dauert 2 bis 4 Stunden, wobei die Verbindung der Formel Illb erhalten wird. A further, likewise particularly excellently suitable embodiment of the preparation process of compound IV works in process step A with salicylaldehyde, 3 mols of salicylaldehyde being reacted in 1 percent mixture of water and tetrahydrofuran to 1 mol of compound II. The suitable temperature range is between 20 and 30 ° C and the favorable pH range is about 8. The reaction takes 2 to 4 hours, whereby the compound of formula IIIb is obtained.

CH2-N-Ü-0-CH2-CgH5 CH2-N-Ü-0-CH2-CgH5

Illb Illb

Anschliessend wird im Verfahrensschritt B die so erhaltene Verbindung Illb in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung XX in einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung Illb zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Molen der Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereiche von 20 bis 30° C während einer Zeit von 1 bis 3 Stunden. Wiederum kann als Lösungsmittel ein solches verwendet werden, wie es im Verfahrensschritt A gebraucht wurde oder ein Gemisch von Dimethylformamid, Aceton und Wasser. Nach vollendeter Umsetzung wird das organische Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, der pH-Wert der wässrigen Lösung mit Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt und der Rückstand in situ mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle zur Verbindung IV hydriert. Subsequently, in process step B, the compound Illb thus obtained is reacted in situ or after its separation with the compound XX in a ratio of 1 mol of the compound Illb to approximately 0.6 to 0.75 mol of the compound XX at a temperature in the range from 20 up to 30 ° C for a period of 1 to 3 hours. Again, the solvent used can be that used in process step A or a mixture of dimethylformamide, acetone and water. When the reaction is complete, the organic solvent is removed in vacuo, the pH of the aqueous solution is adjusted to 4 using ammonium hydroxide and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen at atmospheric pressure in the presence of palladium on carbon to give compound IV.

In dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck Nieder-alkyl einen Alkylrest, verzweigter oder geradliniger Art, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Niederalkanol ist ein gesättigter Alkohol, geradlinig oder verzweigt, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, welcher eine OH-Gruppe enthält. In this specification, the term lower alkyl means an alkyl radical, branched or straight, with 1 to 6 carbon atoms. Lower alkanol is a saturated alcohol, linear or branched, with 1 to 6 carbon atoms, which contains an OH group.

Eine Modifikation des vorgeschriebenen erfindungsge-mässen Verfahrens arbeitet noch vermehrt in situ und ergibt dabei die gleichen guten Ausbeuten der Verbindung IV mit geringeren Kosten. A modification of the prescribed method according to the invention works even more in situ and results in the same good yields of compound IV at lower costs.

So lässt sich beispielsweise die Verbindung XX in situ herstellen und mit der Verbindung der Formel III umsetzen in einem entsprechend geeigneten Verfahrensschritt. Dabei wird im Verfahrensschritt B die Verbindung der Formel IV hergestellt, indem die im Verfahrensschritt A hergestellte Verbindung III entweder in situ oder nach ihrer Abtrennung behandelt wird mit den Verbindungen der Formeln VI und XIX For example, compound XX can be prepared in situ and reacted with the compound of formula III in a correspondingly suitable process step. In process step B, the compound of the formula IV is prepared by treating the compound III prepared in process step A either in situ or after its separation with the compounds of the formulas VI and XIX

O O O O

II II II II

H-O-C^CH-CH^CHa-NH^-C-O-CHä-CeHs und I H-O-C ^ CH-CH ^ CHa-NH ^ -C-O-CHä-CeHs and I

N-OH N-OH

XIX XIX

gefolgt von der Zugabe von Dicyclohexylcarbodiimid in einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Molen jeder der Verbindungen VI und Di-cyclocarbodiimid und ungefähr 0,005 bis 0,25 Molen der Verbindung XIX. Dabei arbeitet man vorteilhaft in einem Temperaturbereich von — 10 bis + 35° C, jedoch insbesondere im Bereiche von + 5 bis + 25° C und während einer Reaktionsdauer von mindestens 10 Stunden. Als Lösungsmittel dient dabei zweckmässig ein solches, wie es für den Verfahrensschritt A gebraucht wurde. Nach Vollendung der Reaktion wird das organische Lösungsmittel abgetrieben und die Hydrierung des Rückstandes in situ in der vorbeschriebenen Weise durchgeführt. followed by the addition of dicyclohexylcarbodiimide in a ratio of 1 mole of compound III to about 0.5 to 1.0 mole of each of compounds VI and dicyclocarbodiimide and about 0.005 to 0.25 mole of compound XIX. This is advantageously carried out in a temperature range from -10 to + 35 ° C, but in particular in the range from + 5 to + 25 ° C and for a reaction time of at least 10 hours. The solvent used is expediently the one used for process step A. After completion of the reaction, the organic solvent is stripped off and the residue is hydrogenated in situ in the manner described above.

Eine bevorzugte Ausführungsform dieses modifizierten Verfahrens arbeitet mit einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu je 0,5 bis 0,85 Molen der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid und 0,05 bis 0,425 Molen der Verbindung XIX in einem Temperaturbereich von + 5 bis 25° C während 1 bis 3 Stunden und in einem Lösungsmittel, wie es für den Verfahrensschritt A diente. Gegebenenfalls kann auch ein Molverhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu je 0,5 bis 0,8 Molen der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid sowie 0,05 bis 0,425 Molen der Ver617 441 A preferred embodiment of this modified process works with a ratio of 1 mol of compound III to 0.5 to 0.85 mol of compounds VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.425 mol of compound XIX in a temperature range of + 5 to 25 ° C for 1 to 3 hours and in a solvent as used for process step A. Optionally, a molar ratio of 1 mol of compound III to 0.5 to 0.8 mol of compounds VI and dicyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.425 mol of Ver617 441

bindung XIX Verwendung finden, wobei man vorteilhafterweise im Temperaturbereich von + 15 bis + 30° C während 15 bis 25 Stunden umsetzt. Die am günstigsten befundenen Reaktionsbedingungen arbeiten mit einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu 0,6 bis 0,75 Molen jeder der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid, sowie 0,06 bis 0,375 Molen der Verbindung XIX, im Temperaturbereich von 20 bis 30° C während 15 bis 20 Stunden Umsetzungsdauer. Binding XIX find use, advantageously in the temperature range from + 15 to + 30 ° C for 15 to 25 hours. The most favorable reaction conditions operate with a ratio of 1 mole of compound III to 0.6 to 0.75 moles of each of compounds VI and dicyclohexylcarbodiimide, and 0.06 to 0.375 moles of compound XIX, in the temperature range from 20 to 30 ° C during 15 to 20 hours of implementation.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeiten wurde gleichfalls ein verbessertes Herstellungsverfahren für das Ausgangsprodukt der Formel II In the context of the present work, an improved manufacturing process for the starting product of the formula II was also developed

HO HO

CHo-N-C-0-CH~-C^H CHo-N-C-0-CH ~ -C ^ H

HO HO

NH NH

HO HO

HD HD

NH, NH,

HO HO

gefunden. Dieses Verfahren umfasst die Behandlung der freien Base Kanamycin A mit N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid in einem Verhältnis von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 Mol N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid pro Mol Kanamycin A, wobei vorteilhafterweise ein Molverhältnis von 1:1 angewendet wird. Anschliessend wird gereinigt, z. B. durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, und Chromatographie der wässrigen Phase. found. This method involves treating the free base kanamycin A with N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide in a ratio of about 0.5 to about 1.5 moles of N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornene-2,3- dicarboximide per mole of kanamycin A, a molar ratio of 1: 1 advantageously being used. Then it is cleaned, e.g. B. by extraction with an organic solvent, such as n-butanol, and chromatography of the aqueous phase.

Die genannte Reaktion wird vorzugsweise durchgeführt in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, wobei die Konzentration des Tetrahydrofurans zweckmässig zwischen 40 und 60 % liegt. Man arbeitet dabei vorteilhaft im Temperaturbereich von 0 bis 25° C, insbesondere von + 5 bis -1- 10° C während höchstens 6 Stunden und insbesondere während ungefähr 4 Stunden. Said reaction is preferably carried out in a mixture of water and a water-miscible organic solvent, such as. B. tetrahydrofuran, the concentration of tetrahydrofuran suitably between 40 and 60%. The process is advantageously carried out in the temperature range from 0 to 25 ° C., in particular from + 5 to -1-10 ° C. for at most 6 hours and in particular for about 4 hours.

Die Verbindung IV, l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A (BB-K8), besitzt ausgezeichnete antibakterielle Wirksamkeit, welche diejenige von Kanamycin A übertrifft. Dies wird illustriert in den beiden nachstehenden Tabellen, worin die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Kanamycin A und der Verbindung IV (BB-K8) gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien aufgezeichnet sind, wie sie erhalten werden mittels der Agar-Verdünnungsmethode nach Steer (Tabelle 1) und der Zweifach-Verdünnungsmethode (Tabelle 2). Das Agarmedium nach Müller-Hinton wurde für die Versuche der Tabelle 1 und die Infusionslösung nach Heart für die Versuche der Tabelle 2 verwendet. The compound IV, l-N- [L - (-) - y-amino-a-hydroxy-butyryl] -kanamycin A (BB-K8) has excellent antibacterial activity which surpasses that of kanamycin A. This is illustrated in the two tables below, where the minimum inhibitory concentrations (MIC) of kanamycin A and compound IV (BB-K8) against a variety of gram-positive and gram-negative bacteria as recorded by the agar dilution method are recorded Steer (Table 1) and the double dilution method (Table 2). The Müller-Hinton agar medium was used for the experiments in Table 1 and the heart infusion solution for the experiments in Table 2.

7 7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

617 441 617 441

8 8th

Tabelle 1 (MIC mg/ml) Table 1 (MIC mg / ml)

Organismus organism

Kanamycin A (6-8198) Kanamycin A (6-8198)

Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4 Compound IV (BB-K8) Approach No. 4

Alk. faecalis Alk. Faecalis

A-9423 A-9423

16 16

8 8th

Alk. faecalis Alk. Faecalis

A-20648 A-20648

>125 > 125

Ent. cloacae Ent. cloacae

A-0656 A-0656

4 4th

Ent. species Ent. species

A-20364 A-20364

>125 > 125

2 2nd

Ent. hafniael Ent. hafniael

A-20674 A-20674

1 1

E. coli E. coli

A-0636 A-0636

2 2nd

1 1

E. coli E. coli

A-20664 A-20664

16 16

4 4th

E. coli E. coli

A-20665 A-20665

>125 > 125

1 1

E. coli E. coli

A-20507 A-20507

32 32

2 2nd

E. coli E. coli

A-20520 A-20520

>125 > 125

4 4th

E. coli E. coli

A-20365 A-20365

>125 > 125

1 1

E. coli E. coli

A-2068+ A-2068 +

2 2nd

E. coli E. coli

A-20682 A-20682

>125 > 125

2 2nd

E. coli E. coli

A-20683 A-20683

>125 > 125

8 8th

E. coli E. coli

A-20681 A-20681

>125 > 125

2 2nd

E. coli E. coli

A-15119 A-15119

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-0967 A-0967

4 4th

K. species K. species

A-20328 A-20328

>125 > 125

2 2nd

K. species K. species

A-20330 A-20330

32 32

K. species K. species

A-20634 A-20634

>125 > 125

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-20680 A-20680

>125 > 125

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-0077 A-0077

1 1

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-9900 A-9900

2 2nd

Pr. morganii Pr. Morganii

A-15153 A-15153

2 2nd

Pr. vulgaris Pr. Vulgaris

A-9555 A-9555

2 2nd

1 1

Pr. rettgeri Pr. Rettgeri

A-9636 A-9636

0,25 0.25

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-20645 A-20645

4 4th

Alk. faecalis Alk. Faecalis

A-9423 A-9423

16 16

8 8th

Alk. faecalis Alk. Faecalis

A-20648 A-20648

>125 > 125

Ent. cloacae Ent. cloacae

A-0656 A-0656

4 4th

Ent. species Ent. species

A-20364 A-20364

>125 > 125

2 2nd

Ent. hafniael Ent. hafniael

A-20674 A-20674

- 1 - 1

1 1

E. coli E. coli

A-0636 A-0636

2 2nd

1 1

E. coli E. coli

A-20664 A-20664

16 16

4 4th

E. coli E. coli

A-20665 A-20665

>125 > 125

1 1

E. coli E. coli

A-20507 A-20507

32 32

2 2nd

E. coli E. coli

A-20520 A-20520

>125 > 125

4 4th

E. coli E. coli

A-20365 A-20365

>125 > 125

1 1

E. coli E. coli

A-20684 A-20684

2 2nd

E. coli E. coli

A-20682 A-20682

>125 > 125

2 2nd

E. coli E. coli

A-20683 A-20683

>1"25 > 1 "25

8 8th

E. coli E. coli

A-20681 A-20681

>125 > 125

2 2nd

E. coli E. coli

A-15119 A-15119

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-0967 A-0967

4 4th

K. species K. species

A-20328 A-20328

>125 > 125

2 2nd

K. species K. species

A-20330 A-20330

32 32

K. species K. species

A-20634 A-20634

>125 > 125

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-20680 A-20680

>125 > 125

4 4th

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-0077 A-0077

1 1

Tabelle 1 (Fortsetzung) (MIC mg/ml) Table 1 (continued) (MIC mg / ml)

Organismus organism

Kanamycin A (6-8198) Kanamycin A (6-8198)

Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4 Compound IV (BB-K8) Approach No. 4

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-9900 A-9900

2 2nd

Pr. morganii Pr. Morganii

A-15153 A-15153

2 2nd

Pr. vulgaris Pr. Vulgaris

A-9555 A-9555

2 2nd

1 1

Pr. rettgeri Pr. Rettgeri

A-9636 A-9636

0,25 0.25

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-20645 A-20645

4 4th

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-20454 A-20454

2 2nd

Providentia Providentia

stuartii stuartii

A-20615 A-20615

2 2nd

1 1

Providencia Providencia

alkalifaciens alkalifaciens

A-20676 A-20676

1 1

Ps. aeruginosa Ps. Aeruginosa

A-20229 A-20229

32 32

2 2nd

Ps. aeruginosa Ps. Aeruginosa

A-0943A A-0943A

>125 > 125

16 16

Ps. aeruginosa Ps. Aeruginosa

A-20653 A-20653

>125 > 125

32 32

Ps. species Ps. Species

A-20601 A-20601

>125, 63 > 125, 63

16 16

Ps. species Ps. Species

A-20621 A-20621

>125 > 125

Ps. maltophilia Ps. Maltophilia

A-20620 A-20620

32 32

>125 > 125

Sai. enteritidis Sai. enteritidis

A-0531 A-0531

1 1

0,5 0.5

Sai. derby Sai. derby

A-20087 A-20087

>125 > 125

1 1

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-20019 A-20019

2 2nd

4 4th

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-9933 A-9933

4 4th

8 8th

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-20460 A-20460

>125 > 125

4, 2 4, 2

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-20459 A-20459

4 4th

16 16

Shig. flexneri Shig. flexneri

A-9684 A-9684

4 4th

Aeromonas sp. Aeromonas sp.

A-20670 A-20670

2 2nd

Arizona sp. Arizona sp.

A-20671 A-20671

2 2nd

1 1

Citrobacter sp. Citrobacter sp.

A-20673 A-20673

4 4th

Edwardsieila sp. Edwardsieila sp.

A-20678 A-20678

4 4th

Staph. aureus Staph. aureus

A-9606 A-9606

1 1

Staph. aureus Staph. aureus

A-4749 A-4749

0,5 0.5

1 1

Staph. aureus Staph. aureus

A-9537 A-9537

2 2nd

1 1

Staph. aureus Staph. aureus

A-20610 A-20610

>125 > 125

2 2nd

Staph. aureus Staph. aureus

A-20240 A-20240

>125 > 125

8 8th

Staph. aureus Staph. aureus

A-15197 A-15197

1 1

2 2nd

Müller-Hinton-Medium + 4 % Müller-Hinton medium + 4%

Schafsblut Sheep blood

Str. faecalis St. Faecalis

A-9854 A-9854

63 63

Str. faecalis St. Faecalis

A-9575 A-9575

125 125

>125 > 125

Str. pyogenes St. pyogenes

A-20200 A-20200

32, 16 32, 16

32 32

Str. pyogenes St. pyogenes

A-9604 A-9604

125 125

Str. pyogenes St. pyogenes

A-15040 A-15040

125 125

Str. pyogenes St. pyogenes

A-20065 A-20065

125 125

D. pneumoniae D. pneumoniae

A-9585 A-9585

63, 32 63, 32

63 63

D. pneumoniae D. pneumoniae

A-20159 A-20159

125 125

>125 > 125

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

9 9

617 441 617 441

Tabelle 2 (MIC mg/ml) Table 2 (MIC mg / ml)

Organismus organism

Kanamycin A (6-8196) Kanamycin A (6-8196)

Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4 Compound IV (BB-K8) Approach No. 4

D. pneumoniae D. pneumoniae

± 5 °/o Serum A-0585 ± 5 ° / o serum A-0585

63 63

Str. pyrogenes St. pyrogenes

± 5 % Serum A-9604 ± 5% serum A-9604

125 125

Staph. aureus Staph. aureus

Smith Smith

A-9537 A-9537

0,5 0.5

Staph. aureus Staph. aureus

A-9497 A-9497

0,5 0.5

Staph. aureus Staph. aureus

A-20239 A-20239

125 125

4 4th

Staph. aureus Staph. aureus

A-20240 A-20240

125 125

4 4th

Enter. cloacae Enter. cloacae

A-0656 A-0656

2 2nd

Enter. species Enter. species

A-20364 A-20364

125 125

2 2nd

K. pneumoniae K. pneumoniae

A-9867 A-9867

2 2nd

4 4th

E. coli E. coli

K-12 ML1410 K-12 ML1410

A-20361 A-20361

2 2nd

4 4th

E. coli E. coli

K-12 ML1663 K-12 ML1663

A-20363 A-20363

125 125

2 2nd

E. coli E. coli

K-12 K-12

4-9632 4-9632

2 2nd

1 1

E. coli E. coli

A-20664 A-20664

32 32

8 8th

E. coli E. coli

A-20665 A-20665

125 125

8 8th

Pr. mirabilis Pr. Mirabilis

A-9900 A-9900

2 2nd

16 16

Pr. morganii Pr. Morganii

A-15153 A-15153

4 4th

16 16

Pr. vulgaris Pr. Vulgaris

A-9436 A-9436

1 1

2 2nd

Ps. aeruginosa Ps. Aeruginosa

A-20227 A-20227

4 4th

1 1

Ps. species Ps. Species

A-20499 A-20499

63 63

4 4th

Ps. aeruginosa Ps. Aeruginosa

A-20653 A-20653

125 125

4 4th

Tabelle 2 (Fortsetzung) (MIC mg/ml) Table 2 (continued) (MIC mg / ml)

Organismus organism

Kanamycin A (6-8196) Kanamycin A (6-8196)

Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4 Compound IV (BB-K8) Approach No. 4

Ps. species Ps. Species

A-20621 A-20621

125 125

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-20019 A-20019

2 2nd

4 4th

Ser. marcescens Ser. marcescens

A-20141 A-20141

16 16

Die vorstehenden MIC-Werte zeigen, dass die Verbindung IV (BB-K8) dem Kanamycin A in seiner Wirksamkeit überlegen ist und besonders gegenüber Kanamycin A resistenten Organismen. The above MIC values show that the compound IV (BB-K8) is superior in its effectiveness to kanamycin A and especially to organisms resistant to kanamycin A.

Die erhaltenen MIC-Werte stimmen gleichfalls gut über-ein mit den in vivo-Resultaten für alle drei Organismen, The MIC values obtained are also in good agreement with the in vivo results for all three organisms,

gegen welche Kanamycin A und die Verbindung IV getestet wurden. against which kanamycin A and compound IV were tested.

Die Verbindung IV und Kanamycin A waren gleichfalls wirksam bei Infektionen von Mäusen, verursacht durch Ka-namycin-A-empfindliche Stämme von E. coli A-15119 und Staph, aureus A-9537. Obgleich die CDso-Werte (Heilungsdosis bei 50 °/o letal infizierten Mäusen) für Staph. aureus A-9537 den Anschein erwecken, dass die Verbindung IV leicht weniger aktiv ist als Kanamycin A, ist die erhaltene kleine Differenz möglicherweise nicht schlüssig, da die Dosisbeträge weit auseinander lagen (fünffache Verdünnung). Compound IV and Kanamycin A were also effective in mouse infections caused by strains of E. coli A-15119 and Staph, aureus A-9537 susceptible to Ka-namycin-A. Although the CDo values (healing dose in 50 ° / o lethally infected mice) for Staph. If aureus A-9537 gives the impression that compound IV is slightly less active than kanamycin A, the small difference obtained may not be conclusive, since the dose amounts were far apart (five times dilution).

Gegenüber dem Kanamycin-resistenten Stamm von E. coli A-20520 erwies sich Kanamycin A in vivo wie erwartet nicht als sehr wirksam. Dagegen zeigt die Verbindung IV ausgesprochen gute Schutzwirkung. Die Verbindung IV war ungefähr zehnmal wirksamer gegenüber diesem Stamm von E. coli, wenn sie in Form einer vierstufigen Behandlung appliziert wurde, als wenn sie in zweistufiger Behandlung verabfolgt wurde. As expected, kanamycin A was not very effective in vivo against the kanamycin-resistant strain of E. coli A-20520. In contrast, the compound IV shows extremely good protective action. Compound IV was approximately ten times more effective against this strain of E. coli when administered as a four-step treatment than when it was administered as a two-step treatment.

Tabelle 3 Table 3

Vergleich von in-vivo- und in-vitro-Wirksamkeiten der Verbindung IV und Kanamycin A Comparison of in vivo and in vitro activities of compound IV and kanamycin A

Verbindung connection

Test- Test-

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

Escherichia coli Escherichia coli

Nummer number

A-9537 A-9537

A-15119 A-15119

A-20520 A-20520

MIC MIC

DCsob DCsob

MIC MIC

CDso CDso

MIC MIC

CD50 CD50

Verbindung IV Compound IV

1 1

2,0 X 2 2.0 X 2

2 2nd

2X2 2X2

2 2nd

66 X 2 66 X 2

2 2nd

0 0

— -

5X4 5X4

Kanamycin A Kanamycin A

1 1

0,5 X 2 0.5 X 2

4 4th

4X2 4X2

125 125

200 X 2 200 X 2

2 2nd

— -

200 X 4 200 X 4

aMIC = Minimale inhibitorische Konzentration (ug/ml). Versuche gemäss Chisholm und Mitarbeiter (Antimicrob. Agents and Chemotherapy 1969, S. 244, 1970) unter Verwendung von Müller-Hinton-Agar als Testmedium. aMIC = minimum inhibitory concentration (µg / ml). Experiments according to Chisholm and co-workers (Antimicrob. Agents and Chemotherapy 1969, p. 244, 1970) using Müller-Hinton agar as test medium.

bCD5o = Heilungsdosis in 50 °/o der Fälle (mg/kg, behandelt x Anzahl Behandlungen). Mäuse wurden subkutan behandelt nach einer und vier Stunden nach der Infektion, falls zweimalige Behandlung erfolgte sowie zu den Zeiten 0, 2, 4 und 6 Stunden nach der Infektion, falls viermalige Behandlung erfolgte. Weitere Aspekte des Testes sind dargestellt von Price und Mitarbeitern (Journal of Antibiotics 22:1,1969). bCD5o = healing dose in 50 ° / o of cases (mg / kg, treated x number of treatments). Mice were treated subcutaneously after one and four hours after infection if treated twice and at 0, 2, 4 and 6 hours after infection if treated four times. Other aspects of the test are presented by Price and co-workers (Journal of Antibiotics 22: 1.1969).

0— = Nicht getestet. 0— = not tested.

617 441 617 441

10 10th

Die Verbindung IV dient als wertvolles antibakterielles Agens als Zusätze zu Viehfutter, als therapeutisches Mittel bei Mensch, Säugetier und Federvieh und ist insbesondere wertvoll bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, welche durch grampositive und gramnegative Bakterien verursacht werden. Oral verabreicht wird die Verbindung hier nützlich zur Hilfsbehandlung für präoperative Sterilisation der Eingeweide. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora der Eingeweide werden von diesem Mittel reduziert. Begleitet von einer geeigneten mechanischen Reinigungsoperation ist es nützlich zur Vorbereitung einer Dickdarmbehandlung. The compound IV serves as a valuable antibacterial agent as additives to animal feed, as a therapeutic agent in humans, mammals and poultry and is particularly valuable in the treatment of infectious diseases which are caused by gram-positive and gram-negative bacteria. Administered orally, the compound is useful here as an auxiliary treatment for preoperative sterilization of the intestine. This means that both the aerobic and the anaerobic flora of the intestines are reduced. Accompanied by a suitable mechanical cleaning operation, it is useful for preparing a colon treatment.

Die Verbindung IV ist wirksam bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen vermittels parenteraler Verabreichung im Dosisbereich von ungefähr 250 mg bis 300 mg/Tag in dreifacher oder vierfacher täglicher Unterteilung. Im allgemeinen erweist sie sich wirksam bei einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden. Compound IV is effective in the treatment of bacterial infections in humans by parenteral administration in the dose range of approximately 250 mg to 300 mg / day in triplicate or quadruple daily division. In general, it is effective at a dose of approximately 5.0 to 7.5 mg / kg body weight every 12 hours.

Im folgenden wird die Herstellung einiger Vor- und Zwischenprodukte (A—N) sowie Ausführungsformen des er-findungsgemässen Verfahrens (Beispiele 1—8) beschrieben. The production of some preliminary and intermediate products (A-N) and embodiments of the process according to the invention (Examples 1-8) are described below.

A) 5-Norbornen-endo-2,3-dicarbonsäureanhydrid (XVIII) Die Herstellung dieser Substanz wurde ausgeführt nach dem Verfahren von O. Diels und K. Aider, Annalen 460, 98 (1928). Zu einer gerührten Suspension von 98,1 g = 1 Mol Maleinsäureanhydrid in 500 ml trockenem Benzol wurden tropfenweise 66,1 g = 1 Mol Cyclopentadien unter Kühlen hinzugefügt. Die Mischung wurde gerührt und ergab eine kristalline Fällung, welche abfiltriert und aus einem Gemisch von Ligroin (zur Hauptsache n-Hexan) und Benzol (1:1) umkristallisiert wurde. Erhalten wurden 116 g entsprechend 71 %> Ausbeute der oben erwähnten Substanz. Schmelzpunkt 164 bis 166° C (Schmelzpunkt in der Literatur 164 bis 165° C). A) 5-norbornene-endo-2,3-dicarboxylic anhydride (XVIII) The preparation of this substance was carried out according to the method of O. Diels and K. Aider, Annalen 460, 98 (1928). To a stirred suspension of 98.1 g = 1 mol maleic anhydride in 500 ml dry benzene, 66.1 g = 1 mol cyclopentadiene was added dropwise with cooling. The mixture was stirred to give a crystalline precipitate which was filtered off and recrystallized from a mixture of ligroin (mainly n-hexane) and benzene (1: 1). 116 g corresponding to 71%> yield of the above-mentioned substance were obtained. Melting point 164 to 166 ° C (melting point in the literature 164 to 165 ° C).

B) N-Hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dicarboximid (HONB) (XIX) B) N-Hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide (HONB) (XIX)

Die Herstellung wurde ausgeführt nach den Verfahren von L. Bauer und S. V. Miarka, Journal of Organic Chem-istry, 24,1293 (1959). 115 g = 0,7 Mol des Norbornen-anhydrids (XVIII) wurden hinzugefügt zu einer Lösung von Hydroxylamin, welches hergestellt wurde durch Zugabe von 47,5 g = 0,45 Mol Natriumcarbonat zu einer Lösung von 60,5 g = 0,87 Mol Hydroxylamin-hydrochlorid in 140 ml Wasser. Das Gemisch wurde während einer Stunde auf 60 bis 70° C erwärmt und hernach über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 120 ml kalter 5-n HCl und getrocknet. Erhalten wurden 84,9 g entsprechend 70 % Ausbeute der Substanz XIX mit dem Schmelzpunkt 172° C. Die Mutterlauge wurde angesäuert auf pH 2 und zehnmal mit je 70 ml Chloroform extrahiert. Eindampfen der Chloroformextrakte ergab einen zweiten Anteil der Substanz XIX von 7,2 g = 6 % Ausbeute. Schmelzpunkt 170 bis 172° C. The preparation was carried out according to the methods of L. Bauer and S.V. Miarka, Journal of Organic Chemistry, 24, 1293 (1959). 115 g = 0.7 mol of the norbornene anhydride (XVIII) was added to a solution of hydroxylamine, which was prepared by adding 47.5 g = 0.45 mol of sodium carbonate to a solution of 60.5 g = 0.87 Moles of hydroxylamine hydrochloride in 140 ml of water. The mixture was heated to 60-70 ° C over an hour and then left in the refrigerator overnight. The crystals formed were filtered off, washed with 120 ml of cold 5N HCl and dried. 84.9 g corresponding to 70% yield of substance XIX with a melting point of 172 ° C. were obtained. The mother liquor was acidified to pH 2 and extracted ten times with 70 ml of chloroform each time. Evaporation of the chloroform extracts gave a second portion of substance XIX of 7.2 g = 6% yield. Melting point 170 to 172 ° C.

C) N-Hydroxy-5-norbomen-2,3-dicarboximidester von L-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybuttersäure (XX) 2,06 g = 0,01 Mol Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) wurden hinzugefügt zu einer gerührten, auf 10° C abgekühlten Lösung von 2,53 g = 0,01 Mol L-y-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybuttersäure und 1,79 g = 0,01 Mol der Substanz XIX in 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF). Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit THF gewaschen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand im Gewicht von 4,5 g wurde aufgegeben auf eine Silicagelsäule und eluiert mit Äthylacetat, wobei 4,0 g, entsprechend 96 %> des aktiven Esters XX als farbloses öl erhalten wurden. IR-Spektrum: v = 3300,1820, 1780, 1735, 1720,1695 cm-1. NMR-Spektrum: (CDCls + 1 Tropfen DaO) ô (in ppm) 1,63 (2H, q, J=9 Hz), 2,15 (2H, m), 3,40 (6H, m), 4,60 (1H, d—d, J=7 und 5 Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, breit), 7,40 (5H, s). C) N-Hydroxy-5-norbomen-2,3-dicarboximide ester of Lybenzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutyric acid (XX) 2.06 g = 0.01 mole of dicyclohexylcarbodiimide (DDC) was added to a stirred, cooled to 10 ° C Solution of 2.53 g = 0.01 mol of Ly-benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybutyric acid and 1.79 g = 0.01 mol of substance XIX in 50 ml of dry tetrahydrofuran (THF). The mixture was stirred at room temperature overnight. The precipitated dicyclohexylurea was filtered off and washed with THF. The filtrate and washing solution were combined and evaporated in vacuo. The oily residue weighing 4.5 g was applied to a silica gel column and eluted with ethyl acetate, whereby 4.0 g, corresponding to 96%> of the active ester XX, were obtained as a colorless oil. IR spectrum: v = 3300, 1820, 1780, 1735, 1720, 1695 cm-1. NMR spectrum: (CDCls + 1 drop DaO) ô (in ppm) 1.63 (2H, q, J = 9 Hz), 2.15 (2H, m), 3.40 (6H, m), 4, 60 (1H, d-d, J = 7 and 5 Hz), 5.13 (2H, s), 6.20 (2H, broad), 7.40 (5H, s).

D) N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XVII) D) N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (XVII)

Zu einer gerührten Lösung von 2,64 g = 0,066 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser wurden 3,58 g = 0,02 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XIX) bei 10° C hinzugefügt. Die Lösung wurde tropfenweise versetzt mit 6,82 g = 0,04 Mol B enzyloxycarb onylchlorld im Verlauf von 40 Minuten bei 0 bis 5° C und das Gemisch nachher vier Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemenge wurde versetzt mit 20 ml n-Hexan, wobei eine weisse Fällung entstand. Sie wurde abfiltriert und darauf getrocknet. Das Rohprodukt wurde umkristallisiert aus Ben-zol/n-Hexan und ergab 5,1 g entsprechend 81 %> Ausbeute an farblosen Prismen der Substanz XVII. Schmelzpunkt 121 bis 122° C. IR (KBr): v = 1810,1780, 1740, 1630 cm-'. NMR-Spektrum (Aceton-de): ô (in ppm), 1,66 (2H, breit s), 3,45 (4H, m), 5,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J=l,5 Hz), 7,48 (5H, s). To a stirred solution of 2.64 g = 0.066 mol sodium hydroxide in 50 ml water was added 3.58 g = 0.02 mol N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (XIX) at 10 ° C. The solution was added dropwise with 6.82 g = 0.04 mol of benzyloxycarb onylchloride in the course of 40 minutes at 0 to 5 ° C. and the mixture was subsequently stirred at room temperature for four hours. The reaction mixture was mixed with 20 ml of n-hexane, resulting in a white precipitation. It was filtered off and then dried. The crude product was recrystallized from benzene / n-hexane and gave 5.1 g corresponding to 81%> yield of colorless prisms of substance XVII. Melting point 121 to 122 ° C. IR (KBr): v = 1810.1780, 1740, 1630 cm- '. Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (acetone-de): ô (in ppm), 1.66 (2H, broad s), 3.45 (4H, m), 5.37 (2H, s), 6.12 (2H, t , J = 1.5 Hz), 7.48 (5H, s).

Analyse: Analysis:

berechnet für C17H15NO5: C 65,17, H 4,83, N 4,47, gefunden: C 65,50, H 4,73, N4,44. calculated for C17H15NO5: C 65.17, H 4.83, N 4.47, found: C 65.50, H 4.73, N4.44.

E) 6'-N-Benzyloxycarbonylkanamycin A (II) (6'-Cbz-Kanamycin A) E) 6'-N-Benzyloxycarbonylkanamycin A (II) (6'-Cbz-Kanamycin A)

Zu einer gerührten Lösung von 4,84 g = 0,01 Mol der freien Base von Kanamycin A in 50 ml 50%igem wässrigem Tetrahydrofuran wurden 3,14 g = 0,01 Mol der Substanz XVII in verschiedenen Portionen im Verlauf von einer Stunde bei 7° C hinzugefügt. Die Mischung wurde weitere vier Stunden gerührt und hernach im Vakuum zur Entfernung des organischen Lösungsmittels eingedampft. Die verbliebene wässrige Lösung wurde verdünnt mit 150 ml Wasser und extrahiert mit zwei Portionen von je 100 ml wassergesättigten Butanols. Die Butanolschicht wurde gewaschen mit 100 ml Wasser und im Vakuum eingedampft, wobei 1,78 g Poly-Cbz-Kanamycin A zurückblieben. Die wässrige Schicht und die Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum nach ca. 50 ml eingeengt. Hernach wurde die wässrige Lösung auf eine Säule von «CG-50» Ionenaustauscherharz gegeben (NH4 + 140 ml). Die Säule wurde nacheinander versetzt mit 200 ml Wasser, 1,9 Liter 0,05-n NH4OH, 1,9 Liter 0,1-n NH4OH und schliesslich 1 Liter 0,3-n NH4OH. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von 20 ml und eingeteilt in die folgenden zwei Fraktionen auf Basis der Rf-Werte von Dünnschichtchromatogrammen (S-114, 6'-Cbz-Kana-mycin Rf 0,23, Kanamycin Rf 0,07). Die Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und der Rückstand über Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. To a stirred solution of 4.84 g = 0.01 mol of the free base of kanamycin A in 50 ml of 50% aqueous tetrahydrofuran was added 3.14 g = 0.01 mol of substance XVII in various portions over the course of one hour 7 ° C added. The mixture was stirred for a further four hours and then evaporated in vacuo to remove the organic solvent. The remaining aqueous solution was diluted with 150 ml of water and extracted with two portions of 100 ml of water-saturated butanol. The butanol layer was washed with 100 ml of water and evaporated in vacuo, leaving 1.78 g of poly-Cbz-kanamycin A. The aqueous layer and the washing solutions were combined and concentrated in vacuo to about 50 ml. The aqueous solution was then placed on a column of «CG-50» ion exchange resin (NH4 + 140 ml). The column was successively mixed with 200 ml of water, 1.9 liters of 0.05-n NH4OH, 1.9 liters of 0.1-n NH4OH and finally 1 liter of 0.3-n NH4OH. The eluates were collected in fractions of 20 ml and divided into the following two fractions based on the Rf values of thin layer chromatograms (S-114, 6'-Cbz-Kana-mycin Rf 0.23, Kanamycin Rf 0.07). The fractions were evaporated in vacuo and the residue was dried over vacuum over phosphorus pentoxide.

Frak- Röhr- eluiert mit Menge Substanz tion chen- (Ausbeute) Frak tube eluted with quantity of substance (yield)

Nr. No.

1 106—144 0,1-n NH4OH 3,44 g (56 %) 6'-Cbz-Kana- 1 106-144 0.1-n NH4OH 3.44 g (56%) 6'-Cbz-Kana-

mycin (II) mycin (II)

2 203—212 0,3-n NH4OH 0,54 g (11 •>/„) Kanamycyn zurückgewonnen 2 203-212 0.3-n NH4OH 0.54 g (11 • / /) Kanamycyn recovered

Das so hergestellte 6'-Cbz-Kanamycin (II) ist sehr rein The 6'-Cbz-Kanamycin (II) thus produced is very pure

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

11 11

617 441 617 441

und erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie auf einer Silicagelplatte als homogen. Schmelzpunkt 217 bis 219° Celsius. Die physikalischen chemischen Eigenschaften der Substanz stimmen überein mit denjenigen einer authentischen Probe. and proves to be homogeneous in thin layer chromatography on a silica gel plate. Melting point 217 to 219 ° Celsius. The physical chemical properties of the substance match those of an authentic sample.

Beispiel 1 example 1

l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (BB-K8, IV) via Benzaldehyd-Schiffbase l-N- [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A (BB-K8, IV) via benzaldehyde Schiff base

Zu einer gerührten Lösung von 6,19 g = 0,01 Mol 6'-Cbz-Kananjycin (II) in 50 ml 50%igem Tetrahydrofuran wurden 3 ml = 0,03 Mol Benzaldehyd hinzugefügt. Das Gemisch wurde drei Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, hernach auf 5° C abgekühlt und dann behandelt mit einer Lösung von 4 g = 0,01 Mol der Substanz XX in 50 ml Tetrahydrofuran. Das Gemenge wurde eine Stunde lang bei 5° C gerührt, mit 6-n HCl auf den pH-Wert 2 eingestellt, To a stirred solution of 6.19 g = 0.01 mol of 6'-Cbz-Kananjycin (II) in 50 ml of 50% tetrahydrofuran was added 3 ml = 0.03 mol of benzaldehyde. The mixture was stirred at room temperature for three hours, then cooled to 5 ° C. and then treated with a solution of 4 g = 0.01 mol of substance XX in 50 ml of tetrahydrofuran. The mixture was stirred at 5 ° C. for one hour, adjusted to pH 2 with 6N HCl,

eine weitere Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt und hernach im Vakuum zur Vertreibung des organischen Lösungsmittels eingedampft. Die erhaltene wässrige Lösung wurde gewaschen mit 20 ml CH2CI2, worauf ihr pH-Wert mit 10°/oigem Ammoniak auf 4 eingestellt wurde. Anschliessend 5 wurde über Nacht hydriert mit 1,25 g 10°/oigem Palladium auf Kohle unter Atmosphärendruck bei Zimmertemperatur mit Wasserstoff. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit 20 ml Wasser gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt, ihr pH-Wert auf 8 mit 10%igem Ammoniak einge-10 stellt, worauf die Lösung aufgegeben wurde auf eine Säule von «CG-50» (NH4 + 200 ml), welche hernach eluiert wurde mit 0,4 Litern Wasser, 1,2 Liter 0,1-n NH4OH, 2,06 Liter 0,3-n NH4OH, 0,92 Liter 0,5-n NH4OH und schliesslich 1,2 Liter 1,0-n NH4OH. Das Eluat wurde gesammelt in Frak-15 tionen von je 20 ml, welche aufgrund des Rf-Wertes auf einer Silicagelplatte (610 Ninhydrin) sowie biologischer Tests unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 und P. aerugenosa A 9843 in folgende Teile unterteilt wurden. Jeder dieser Teile wurde im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet. stirred for a further hour at room temperature and then evaporated in vacuo to drive off the organic solvent. The aqueous solution obtained was washed with 20 ml of CH 2 Cl 2 and its pH was adjusted to 4 with 10% ammonia. Then 5 was hydrogenated overnight with 1.25 g of 10% palladium on carbon under atmospheric pressure at room temperature with hydrogen. The catalyst was filtered off and washed with 20 ml of water. The filtrate and washing solutions were combined, their pH was adjusted to 8 with 10% ammonia, and the solution was applied to a column of “CG-50” (NH4 + 200 ml), which was then eluted with 0, 4 liters of water, 1.2 liters of 0.1-n NH4OH, 2.06 liters of 0.3-n NH4OH, 0.92 liters of 0.5-n NH4OH and finally 1.2 liters of 1.0-n NH4OH. The eluate was collected in fractions of 20 ml each, which were divided into the following parts on the basis of the Rf value on a silica gel plate (610 ninhydrin) and biological tests using B. subtilis PCI 219 and P. aerugenosa A 9843. Each of these parts was evaporated in vacuo and freeze-dried.

Fraktion fraction

Röhrchen Nr. Tube no.

eluiert mit wässrigem NH4OH eluted with aqueous NH4OH

Gewichtsausbeute Weight yield

Ausbeute an biologisch aktiver Substanz Yield of biologically active substance

1 1

90—99 90-99

0,3-n 0.3-n

1603 mg (33 %) 1603 mg (33%)

1490 mg (30 o/o)1 Kanamycin zurückgewonnen BB-K 29 1490 mg (30 o / o) 1 kanamycin recovered BB-K 29

2 2nd

152—161 152-161

0,3-n 0.3-n

483 mg (8 0/0) 483 mg (8 0/0)

BB-K 29 BB-K 29

3 3rd

162—169 162-169

0,3-n 0.3-n

376 mg (6 %) 376 mg (6%)

196 mg (3 o/o)2 BB-K 29 + BB-K 8 196 mg (3 o / o) 2 BB-K 29 + BB-K 8

4 4th

170—197 170-197

0,3- bis 0,5-n 0.3 to 0.5 n

1877 mg (30 °/o) 1877 mg (30 ° / o)

1350 mg (23 o/0)2 BB-K 8 + BB-K 11 1350 mg (23 o / 0) 2 BB-K 8 + BB-K 11

5 5

198—203 198-203

0,5-n 0.5-n

100 mg (2 o/») 100 mg (2 o / »)

BB-K 11 BB-K 11

6 6

238—257 238-257

1,0-n 1.0-n

146 mg (2 0/0) 146 mg (2 0/0)

Diacylverbindung Diacyl compound

1 getestet mit B. subtilis PCI 219 1 tested with B. subtilis PCI 219

2 getestet mit K. pneumoniae A 20680, welches sensitiv ist zu BB-K8 und hoch resistent zu Kanamycin BB-K 11 und BB-K 29. 2 tested with K. pneumoniae A 20680, which is sensitive to BB-K8 and highly resistant to Kanamycin BB-K 11 and BB-K 29.

Die Fraktion 4 im Gewicht von 1,877 g wurde aufgelöst in 10 ml demineralisiertem Wasser. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 10°/oiger Salzsäure auf 6 eingestellt, wonach die Lösung adsorbiert wurde an 15 ml einer «CG-50»-Säule (NH4 + -Form), die anschliessend eluiert wurde mit 100 ml 5Q 0,3-n NH4OH und 200 ml 0,5-n NH4OH. Das Eluat wurde gesammelt in Fraktionen von je 20 ml. Die Röhrchen Nr. 6 und Nr. 8 bis 17 waren Ninhydrin-positiv. Der Inhalt der Röhrchen Nr. 8 bis 17 wurde vereinigt und auf Vakuum auf ungefähr 1 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde behan- ^ delt mit 3 ml Methanol und anschliessend filtriert. Der Fraction 4, weighing 1.877 g, was dissolved in 10 ml of demineralized water. The pH of the solution was adjusted to 6 with 10% hydrochloric acid, after which the solution was adsorbed on 15 ml of a «CG-50» column (NH4 + form), which was then eluted with 100 ml of 5Q 0. 3-n NH4OH and 200 ml 0.5-n NH4OH. The eluate was collected in fractions of 20 ml each. Tubes No. 6 and No. 8 to 17 were ninhydrin positive. The contents of tubes # 8 through 17 were combined and concentrated in vacuo to approximately 1 ml. The concentrate was treated with 3 ml of methanol and then filtered. The

Filterrückstand wurde gewaschen mit 0,5 ml 75°/oigem wässrigem Methylalkohol. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, verdünnt mit zusätzlichen 10 ml Methylalkohol und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die amorphe Fällung wurde abfiltriert, das Filtrat geimpft, wobei farblose Kristalle der Substanz IV entstanden. Sie erwiesen sich als identisch mit einem authentischen Muster. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und lyophylisiert. Ausbeute und Test jeder dieser Fraktionen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. The filter residue was washed with 0.5 ml of 75% aqueous methyl alcohol. The filtrate and washings were combined, diluted with an additional 10 ml of methyl alcohol and left overnight at room temperature. The amorphous precipitate was filtered off, the filtrate was inoculated, colorless crystals of substance IV being formed. They turned out to be identical to an authentic pattern. The filtrate was evaporated in vacuo and lyophilized. The yield and test of each of these fractions are summarized in the table below.

IV IV

Testergebnis gegen x paipigcuiiia gcgoii ; Test result against x paipigcuiiia gcgoii;

B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis

Ausbeute amorphes Pulver Yield amorphous powder

70 mg 70 mg

737 ,t</mg 737, t </ mg

927 p/mg 927 p / mg

0,9 »/o 0.9 »/ o

1,1 % 1.1%

Kristalle Crystals

1098 mg 1098 mg

1163 jtt/mg 1163 jtt / mg

1087 |tt/mg 1087 | tt / mg

19 »/o 19 »/ o

19 0/0 19 0/0

lyophylisiertes Pulver lyophilized powder

180 mg 180 mg

608 ///mg 608 /// mg

504 ,«/mg 504, «/ mg

1,9 0/0 1.9 0/0

1,6 0/0 1.6 0/0

BB-K 11 ist 3"-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kana-mycin A. BB-K 11 is 3 "-N- [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kana mycin A.

BB-K 29 ist 3-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kana-mycin A. BB-K 29 is 3-N- [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kana mycin A.

617 441 617 441

12 12

F) Herstellung von L-(—)-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VI) F) Preparation of L - (-) - y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybutyric acid (VI)

7,4 g = 0,062 Mol L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybuttersäure wurden hinzugefügt zu einer Lösung von 5,2 g = 0,13 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise bei 0 bis 5° C im Verlauf von einer halben Stunde 11,7 g = 0,068 Mol Carbobenzoxychlorid hinzugefügt und hernach eine weitere Stunde lang bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gewaschen mit 50 ml Äther, sein pH-Wert auf 2 mit verdünnter Salzsäure eingestellt, worauf extrahiert wurde mit vier Portionen von je 80 ml Äther. Die Ätherextrakte wurden vereinigt, gewaschen mit einem geringen Anteil gesättigter Natriumchloridlösung, getrocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der verbliebene Rückstand umkristallisiert aus Benzol. Erhalten wurden 11,6 g entsprechend 74 °/o Ausbeute farbloser Plättchen mit dem Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5° C. [a]D = — 4,5° (c=2, CHsOH). IR-Spektrum in KBr: yc=0: 1740,1690 cm-1. NMR-Spektrum (Aceton do) ò (in ppm aus TMS) 2,0 (2H, m), 3,29 (2H, d—d, J=6,7 und 12 Hz), 4,16 (1H, d—d, J=4,5 und 8 Hz), 4,99 (2H, s), 6,2 (2H, breit), 7,21 (5H, s). 7.4 g = 0.062 mol L - (-) - j / -amino-a-hydroxybutyric acid was added to a solution of 5.2 g = 0.13 mol sodium hydroxide in 50 ml water. To the stirred solution, 11.7 g = 0.068 mol of carbobenzoxychloride was added dropwise at 0 to 5 ° C over a period of half an hour, followed by stirring at the same temperature for a further hour. The reaction mixture was washed with 50 ml of ether, its pH was adjusted to 2 with dilute hydrochloric acid, followed by extraction with four 80 ml portions of ether. The ether extracts were combined, washed with a small amount of saturated sodium chloride solution, dried with anhydrous sodium sulfate and filtered. The filtrate was evaporated in vacuo and the remaining residue was recrystallized from benzene. 11.6 g corresponding to 74% yield of colorless platelets with a melting point of 78.5 to 79.5 ° C. were obtained. [A] D = -4.5 ° (c = 2, CHsOH). IR spectrum in KBr: yc = 0: 1740.1690 cm-1. NMR spectrum (acetone do) ò (in ppm from TMS) 2.0 (2H, m), 3.29 (2H, d-d, J = 6.7 and 12 Hz), 4.16 (1H, d - d, J = 4.5 and 8 Hz), 4.99 (2H, s), 6.2 (2H, broad), 7.21 (5H, s).

Analyse: Analysis:

berechnet für C12H15NO5: C 56,91, H 5,97, N 5,53, calculated for C12H15NO5: C 56.91, H 5.97, N 5.53,

gefunden: C 56,66, H 5,97, N5,47. found: C 56.66, H 5.97, N 5.47.

G) N-Hydroxysuccinimidester von L-(—)-y-Benzyloxy-carbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VII) G) N-hydroxysuccinimide ester of L - (-) - y-benzyloxy-carbonylamino-a-hydroxybutyric acid (VII)

Zu einer Lösung von 10,6 g = 0,042 Mol der Substanz VI und 4,8 g = 0,042 Mol N-Hydroxysuccinimid1 in 200 ml Äthylacetat wurde auf 0° C abgekühlt und hernach versetzt mit 8,6 g = 0,042 Mol Dicyclohexylcarbodiimid. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank gelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat auf ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Dabei entstanden farblose Kristalle der Substanz VII, welche abfiltriert wurden. Erhalten wurden 6,4 g, Schmelzpunkt 121 bis 122,5° C. Das Filtrat wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft und der kristalline Rückstand gewaschen mit 20 ml Benzol/n-Hexan, wobei eine zusätzliche Menge der Substanz VII erhalten wurde. Die gesamte Ausbeute betrug 13,4 g (92 %>). [a]D = 1,5° (c=2, CHCls). IR (KBr) yc=0 1810, 1755, 1740, 1680 cm-1. NMR (Aceton-ds) <3 (in ppm aus TMS) 2,0 (2H, m), 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d—d, J=6,5 und 12,5), 4,56 (1H, m), 4,99 (2H; s), 6,3 (2H, breit), 7,23 (5H, s). To a solution of 10.6 g = 0.042 mol of substance VI and 4.8 g = 0.042 mol of N-hydroxysuccinimide 1 in 200 ml of ethyl acetate was cooled to 0 ° C. and then mixed with 8.6 g = 0.042 mol of dicyclohexylcarbodiimide. The mixture was left in the refrigerator overnight. The excreted dicyclohexylurea was filtered off and the filtrate was concentrated to approximately 50 ml under reduced pressure. This gave rise to colorless crystals of substance VII, which were filtered off. 6.4 g were obtained, melting point 121 to 122.5 ° C. The filtrate was evaporated to dryness in vacuo and the crystalline residue was washed with 20 ml of benzene / n-hexane, an additional amount of substance VII being obtained. The total yield was 13.4 g (92%>). [a] D = 1.5 ° (c = 2, CHCls). IR (KBr) yc = 0 1810, 1755, 1740, 1680 cm-1. NMR (acetone-ds) <3 (in ppm from TMS) 2.0 (2H, m), 2.83 (4H, s), 3.37 (2H, d-d, J = 6.5 and 12, 5), 4.56 (1H, m), 4.99 (2H; s), 6.3 (2H, broad), 7.23 (5H, s).

Analyse: Analysis:

berechnet für C16H18N2O7: C 54,85, H 5,18, N 8,00, calculated for C16H18N2O7: C 54.85, H 5.18, N 8.00,

gefunden: C54,79, H 5,21, N8,14, found: C54.79, H 5.21, N8.14,

54,70, 5,20, 8,12. 54.70, 5.20, 8.12.

1 G. W. Anderson und Mitarbeiter, Journal of American Chemical Society, 86,1839 (1964). 1 G. W. Anderson and co-workers, Journal of American Chemical Society, 86, 1839 (1964).

H) Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid H) Preparation of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide

23 g = 0,2 Mol N-Hydroxysuccinimid wurden aufgelöst in einer Lösung von 9 g = 0,22 Mol Natriumhydroxid in 200 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise 34 g = 0,2 Mol Carbobenzoxichlorid unter Kühlung mit Wasser hinzugefügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt zwecks Abscheidung des Carbo-benzoxiderivates, welches abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet wurde. Ausbeute 41,1 g entsprechend 82%. Umkristallisieren aus Benzol/n-Hexan (10:1) ergab farblose Prismen, welche bei 78 bis 79° C schmolzen. 23 g = 0.2 mol of N-hydroxysuccinimide were dissolved in a solution of 9 g = 0.22 mol of sodium hydroxide in 200 ml of water. 34 g = 0.2 mol of carbobenzoxychloride were added dropwise to the stirred solution with cooling with water and the mixture was stirred at room temperature overnight for the purpose of separating off the carbobenzoxy derivative, which was filtered off, washed with water and dried in air. Yield 41.1 g corresponding to 82%. Recrystallization from benzene / n-hexane (10: 1) gave colorless prisms which melted at 78 to 79 ° C.

I) Herstellung von 6'-Carbobenzoxykanamycin A (II) I) Preparation of 6'-carbobenzoxykanamycin A (II)

Eine Lösung von 42,5 g = 90 mMol der freien Base von Kanamycin A in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid (DMF) wurde auf 9° C abgekühlt und kräftig gerührt. Zu der Lösung wurden tropfenweise im Verlauf von ungefähr zwei Stunden 22,4 g = 90 mMol N-(Benzyloxy-carbonyloxy)-succinimid, gelöst in 500 ml DMF, hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei —10 bis 0° C über Nacht gerührt und hernach einen Tag lang weiter gerührt bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemenge wurde unter vermindertem Druck und unterhalb 50° C eingedampft. Der ölige Rückstand wurde aufgelöst in einem Gemenge von 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, wonach das Gemisch filtriert wurde zwecks Abtrennung unlöslichen Materials und schliesslich in zwei Schichten getrennt wurde. Butanol-und wässrige Schicht wurden behandelt mit 500 ml butanol-gesättigtem Wasser je zweimal und je zweimal mit 500 ml wassergesättigtem Butanol unter Verwendung einer Technik ähnlich der Gegenstromverteilung. Die drei wässrigen Schichten wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein öliger Rückstand verblieb. Ein Teil desselben kristallisierte beim Stehen bei Zimmertemperatur aus. Zum Rückstand zusammen mit den Kristallen wurden 100 ml Methanol hinzugegeben, worin sich das Öl auflöste und von den Kristallen abgetrennt wurde. Nach Zugabe von ungefähr 300 ml Äthanol wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gehalten und ergab eine kristalline Masse, welche abfiltriert wurde. Sie wog 44 g. Das Produkt enthielt einen geringen Anteil an Kanamycin A, wie vermittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) und Ninhydrin als Sprühreagens nachgewiesen wurde. A solution of 42.5 g = 90 mmol of the free base of kanamycin A in 450 ml of water and 500 ml of dimethylformamide (DMF) was cooled to 9 ° C. and stirred vigorously. To the solution was added dropwise 22.4 g = 90 mmol of N- (benzyloxycarbonyloxy) succinimide dissolved in 500 ml of DMF over the course of about two hours. The mixture was stirred at -10 to 0 ° C overnight and then stirred at room temperature for a day. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure and below 50 ° C. The oily residue was dissolved in a mixture of 500 ml of water and 500 ml of butanol, after which the mixture was filtered to remove insoluble material and finally separated in two layers. Butanol and aqueous layers were treated with 500 ml of butanol-saturated water twice and twice with 500 ml of water-saturated butanol using a technique similar to the countercurrent distribution. The three aqueous layers were combined and evaporated to dryness under reduced pressure, leaving an oily residue. Part of it crystallized when standing at room temperature. To the residue together with the crystals, 100 ml of methanol was added, in which the oil dissolved and was separated from the crystals. After adding approximately 300 ml of ethanol, the mixture was kept at room temperature overnight to give a crystalline mass which was filtered off. It weighed 44 g. The product contained a small amount of kanamycin A, as demonstrated by thin layer chromatography using n-propanol-pyridine-acetic acid-water (15: 10: 3: 12) and ninhydrin as a spray reagent.

Das Rohprodukt wurde aufgelöst in 300 ml Wasser und chromatographiert an einer Säule von 30 mm Durchmesser und 500 ml Volumen. Die Säule enthielt «CG-50»-Ionen-austauscherharz vom NH«i+-Typ. Die Säule wurde eluiert mit 0,1-n Ammoniumhydroxidlösung und das Eluat gesammelt in Fraktionen von je 10 ml. Das erwünschte Produkt war enthalten in den Röhrchen Nr. 10 bis 100, wogegen Kanamycin A sich in den langsamer laufenden Fraktionen befand und die Stellungsisomeren des Produktes in den schneller laufenden Fraktonen vorhanden zu sein schienen. Die Fraktionen 10 bis 110 wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Erhalten wurden 24,6 g = 45 °/o Ausbeute, farblosen 6-Carbobenzoxykanamy-cins A (II) (6'-Cbz-Kanamycin A). Die Substanz begann zu schmelzen und sich zu verfärben bei 204° C und zersetzte sich bei 212° C unter Gasentwicklung. [a]D = + 106° (c=2, H2O). Dünnschichtchromatographie auf Silicagel «F254» mit Ninhydrin ergab folgende Resultate: The crude product was dissolved in 300 ml of water and chromatographed on a column 30 mm in diameter and 500 ml in volume. The column contained «CG-50» ion exchange resin of the NH «i + type. The column was eluted with 0.1N ammonium hydroxide solution and the eluate was collected in fractions of 10 ml. The desired product was contained in tubes No. 10 to 100, whereas kanamycin A was in the slower running fractions and the positional isomers of Product appeared to be present in the faster running fractons. Fractions 10 to 110 were combined and evaporated to dryness under reduced pressure. 24.6 g = 45% yield, colorless 6-carbobenzoxykanamycin A (II) (6'-Cbz-kanamycin A) were obtained. The substance began to melt and change color at 204 ° C and decomposed at 212 ° C with evolution of gas. [a] D = + 106 ° (c = 2, H2O). Thin layer chromatography on silica gel "F254" with ninhydrin gave the following results:

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

13 617 441 13 617 441

Rf-Wert RF value

Lösungsmittel-System 6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A Solvent system 6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A

n-PrOH-Pyridin-AcOH-HaO 0,42 0,33 0,15 0,04 (15:10:3:12) (Haupt- (Nebenteil) anteil) n-PrOH-pyridine-AcOH-HaO 0.42 0.33 0.15 0.04 (15: 10: 3: 12) (main (secondary) part)

Aceton-Ac0H-H20 0,24 0,14 (20:6:74) Acetone-Ac0H-H20 0.24 0.14 (20: 6: 74)

CHCl3-Me0H-c.NH40H-H20 0,76 0,50 (1:4:2:1) CHCl3-Me0H-c.NH40H-H20 0.76 0.50 (1: 4: 2: 1)

AcOMe-n-PrOH-C.NH4OH 0,22* 0,04* (45:105:60) AcOMe-n-PrOH-C.NH4OH 0.22 * 0.04 * (45: 105: 60)

*Nachgewiesen mit Anthron-Schwefelsäure * Detected with anthrone-sulfuric acid

Es erwies sich, dass das Endprodukt begleitet war von zwei kleineren Anteilen bei einem der für die Dünnschichtchromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme. Indessen wurde das Endprodukt ohne weitere Reinigung für die 20 Herstellung von BB-K8 (IV) verwendet. The final product was found to be accompanied by two minor portions in one of the solvent systems used for thin layer chromatography. Meanwhile, the final product was used for the production of BB-K8 (IV) without further purification.

K) Herstellung von L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B oder Gemischen davon 5,0 g Ambutyrosin A (US-Patent 3 541 078, veröffent- 25 licht am 17. November 1970) wurden am Rückfluss gekocht mit 160 ml 0,5-n Natriumhydroxid während einer Stunde. Das Hydrolysat wurde neutralisiert mit 6-n HCl und chro-matographiert an einer Säule von «CG-50» vom NH4+-Typ. Die erwünschte L-(—)-^-Amino-«-hydroxybuttersäure wurde 30 isoliert durch Entwickeln der Säule mit Wasser und Abtrennung des Wassers vermittels Gefriertrocknens. Die L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurde charakterisiert als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5° C (vgl. Kolonne 2, Zeilen 31—38 des US-Patentes 35 Nr. 3 541 078). K) Preparation of L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid from ambutyrosin A or B or mixtures thereof 5.0 g of ambutyrosin A (US Pat. No. 3,541,078, published November 17, 1970) refluxed with 160 ml of 0.5N sodium hydroxide for one hour. The hydrolyzate was neutralized with 6N HCl and chromatographed on a column of «CG-50» of the NH4 + type. The desired L - (-) - ^ - amino - «- hydroxybutyric acid was isolated by developing the column with water and separating the water by freeze-drying. The L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid was characterized as a crystalline material with a melting point of 212.5 to 214.5 ° C (see Column 2, lines 31-38 of US Patent 35 No. 3 541 078).

L) Herstellung von L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus DL-a-hydroxy-y-phthalimidobuttersäure L) Preparation of L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid from DL-a-hydroxy-y-phthalimidobutyric acid

A. Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-y- 40 A. Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-y-40

phthalimidobutyrat phthalimidobutyrate

Zu einer Lösung von 25 g = 0,1 Mol 2-Hydroxy-y-phthalimidobuttersäure1 in 200 ml Äthanol wurde eine Lösung von 29 g = 0,1 Mol Dehydroabietylamin in 130 ml 4J Äthanol hinzugefügt. Die Lösung wurde kräftig eine Minute lang geschüttelt und hernach während 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen, während welcher Zeit feine Nadeln auskristallisierten. Die Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 50 ml Äthanol und an Luft getrocknet, wobei 30,1 g entsprechend 56 % Ausbeute eines Diastereomeren des 50 Dehydroabietylaminsalzes erhalten wurden. Schmelzpunkt To a solution of 25 g = 0.1 mol 2-hydroxy-y-phthalimidobutyric acid 1 in 200 ml ethanol was added a solution of 29 g = 0.1 mol dehydroabietylamine in 130 ml 4J ethanol. The solution was shaken vigorously for one minute and then left to stand at room temperature for 5 hours, during which time fine needles crystallized. The crystals were filtered off, washed with 50 ml of ethanol and dried in air, whereby 30.1 g corresponding to 56% yield of a diastereomer of the 50 dehydroabietylamine salt were obtained. Melting point

93 bis 94° C. [«] q4 = +15° (c=2,5, MeOH). Umkristallisieren aus 300 ml Äthanol ergab 23,2 g=43'°/o Ausbeute des reinen Produktes. Schmelzpunkt 94 bis 95° C. [a] ^ 55 93 to 94 ° C. [«] q4 = + 15 ° (c = 2.5, MeOH). Recrystallization from 300 ml of ethanol gave 23.2 g = 43% yield of the pure product. Melting point 94 to 95 ° C. [a] ^ 55

= +10,8° (c=2,5 MeOH). Weiteres Umkristallisieren änderten den Schmelzpunkt und die spezifische Drehung nicht. = + 10.8 ° (c = 2.5 MeOH). Further recrystallization did not change the melting point and the specific rotation.

Analyse: Analysis:

berechnet für C32H42N2O5 • H2O: C 69,54, H 8,02, N 5,07 gefunden: C 69,58, H 8,08, N5,07. calculated for C32H42N2O5 • H2O: C 69.54, H 8.02, N 5.07 found: C 69.58, H 8.08, N5.07.

1 Y. Saito und Mitarbeiter, Tetrahedron Letters, 1970, 1 Y. Saito and co-workers, Tetrahedron Letters, 1970,

4863. 4863.

65 65

B) L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure Zu einer Lösung von 1,5 g = 0,014 Mol Natriumkarbonat in 40 ml Wasser wurden 5,3 g = 0,01 Mol Dehydro- B) L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid To a solution of 1.5 g = 0.014 mol sodium carbonate in 40 ml water, 5.3 g = 0.01 mol dehydro-

abietylammonium-L-a-hydroxy-y-phthalimidobutyrat und 60 ml Äther hinzugefügt. Das Gemisch wurde kräftig geschüttelt bis alle feuchte Substanz aufgelöst war. Die Ätherschicht wurde abgetrennt. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äther gewaschen und auf 15 ml unter vermindertem Druck eingedampft. Zum Konzentrat wurden 10 ml konzentrierte Salzsäure hinzugefügt und das Gemisch 10 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die abgeschiedene Phthalsäure abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde gelöst in 10 ml Wasser und die Lösung zur Trockne eingedampft. Diese Operation wurde zweimal wiederholt zwecks Entfernung überschüssiger Salzsäure. Der schliesslich verbliebene Sirup wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und filtriert zwecks Entfernung eines geringen Anteils unlöslicher Phthalsäure. Das Filtrat wurde adsorbiert an einer Säule von «IR-120» (H + , 1 cm X 35 cm). Die Säule wurde gewaschen mit 300 ml Wasser und eluiert mit 1-n Ammoniumhydroxidlösung. Das Eluat wurde gesammelt in Fraktionen von je 15 ml Ninhydrin-positive Fraktionen 10 bis 16 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Dabei erhielt man einen Sirup, welcher allmählich auskristallisierte. Die Kristalle wurden verrieben mit Äthanol, filtriert und getrocknet in einem Vakuumexsiccator. Erhalten wurden 0,78 g entsprechend 66 % Ausbeute an L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure. Schmelzpunkt 206 bis abietylammonium-L-a-hydroxy-y-phthalimidobutyrate and 60 ml ether added. The mixture was shaken vigorously until all of the moist substance had dissolved. The ether layer was separated. The aqueous solution was washed twice with 20 ml ether and evaporated to 15 ml under reduced pressure. 10 ml of concentrated hydrochloric acid was added to the concentrate and the mixture was refluxed for 10 hours. After cooling, the phthalic acid separated off was filtered off. The filtrate was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in 10 ml of water and the solution evaporated to dryness. This operation was repeated twice to remove excess hydrochloric acid. The remaining syrup was dissolved in 10 ml of water and filtered to remove a small amount of insoluble phthalic acid. The filtrate was adsorbed on a column of "IR-120" (H +, 1 cm X 35 cm). The column was washed with 300 ml of water and eluted with 1N ammonium hydroxide solution. The eluate was collected in fractions of 15 ml of ninhydrin-positive fractions 10 to 16 were combined and evaporated under reduced pressure. This gave a syrup which gradually crystallized out. The crystals were triturated with ethanol, filtered and dried in a vacuum desiccator. 0.78 g was obtained, corresponding to a 66% yield of L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyric acid. Melting point 206 to

207° C. [a] = —29° (c=2,5 H2O). Das IR-Spektrum war identisch mit demjenigen einer authentischen Probe, welche aus Ambutyrosin erhalten worden war. 207 ° C. [A] = -29 ° (c = 2.5 H2O). The IR spectrum was identical to that of an authentic sample obtained from ambutyrosine.

Beispiel 2 Example 2

Herstellung von 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-tri-p-nitrobenzalkanamycin A (IIIc) Preparation of 6'-carbobenzoxy-1,3,3-tri-p-nitrobenzalkanamycin A (IIIc)

9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24° C, worauf 8,7945 g = 58,2 mMol p-Nitrobenzaldehyd hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde am Rückfluss gekocht. Dabei veränderte es sich in eine klare gelbe Lösung, aus welcher sich jedoch rasch eine weisse feste Substanz abzuscheiden begann. Das Gemenge wurde am Rückfluss drei Stunden lang erwärmt, hernach abgekühlt und das ausgefallene Produkt abfiltriert. Es wurde gewaschen mit ein wenig absolutem Alkohol. Die Ausbeute betrug 14,0 g entsprechend 94,5 % an weissen Kristallen. Schmelzpunkt 233 bis 234° C (unkorrigiert). 9.0 g = 14.5 mmol of 6'-carbobenzoxykanamycin A were suspended in 500 ml of absolute ethanol at 24 ° C., whereupon 8.7945 g = 58.2 mmol of p-nitrobenzaldehyde were added. The mixture was refluxed. It changed to a clear yellow solution, from which a white solid substance began to separate quickly. The mixture was heated under reflux for three hours, then cooled and the precipitated product was filtered off. It was washed with a little absolute alcohol. The yield was 14.0 g, corresponding to 94.5% of white crystals. Melting point 233 to 234 ° C (uncorrected).

Analyse: Analysis:

berechnet für C47H51N7O19: C 55,46 H 5,05 N 9,63 calculated for C47H51N7O19: C 55.46 H 5.05 N 9.63

gefunden: C 55,39, H 5,08, N9,60. found: C 55.39, H 5.08, N9.60.

617 441 617 441

14 14

Beispiel 3 Example 3

Herstellung von l-N-(L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IV) Preparation of l-N- (L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A (IV)

5,0 g = 4,91 mMol 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-tri-p-nitro- 5 benzalkanamycin A wurden gelöst in 50 ml Dimethylformamid bei 24° C. 2,064 g = 5,895 mMol L-(—)-j/-Benzyl-oxycarbonylamino-cHhydroxybuttersäure-N-hydroxysuccin-imidester wurden gelöst in 20 ml Dimethylformamid bei 24° C und die Lösung langsam unter kräftigem Rühren hin- m zugefügt zu der Lösung der Schiff'schen Base IHc im Verlauf von 75 Minuten. Die Lösung wurde über Nacht bei 24° C gerührt; unter Verwendung eines Dampfstrahlvakuums wurde die Lösung schliesslich bei 40° C zur Trockne eingedampft. Anschliessend wurde sie wiederholt, mit je 100 ml Methanol 15 zur Trockne eingedampft und ergab ein viskoses Öl. Das Öl wurde gelöst in 100 ml wässrigem Dioxan (1:1), wonach 10 ml Eisessig hinzugefügt wurden. Hernach wurde die Lösung eingebracht in einen Parrkolben von 500 ml zusammen mit 2,5 g 5°/oigem Palladium auf Kohle (Engelhard) und während 20 vier Stunden bei 24° C mit Wasserstoff von 3,2 Atmosphären reduziert. Der gesamte Druckabfall in dieser Zeit betrug im geschlossenen Gefäss 6,1 Atmosphären, wobei verschiedene Male der Druck erneuert wurde. Das Gemisch wurde filtriert durch ein Bett von Diatomeenerde, welches hernach dreimal 25 mit 50%igem wässrigem Dioxan gewaschen wurde. Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockne gebracht und azeotrop 5.0 g = 4.91 mmol 6'-carbobenzoxy-l, 3.3 "-tri-p-nitro-5 benzalkanamycin A were dissolved in 50 ml dimethylformamide at 24 ° C. 2.064 g = 5.895 mmol L - (- ) -j / -Benzyl-oxycarbonylamino-c-hydroxybutyric acid-N-hydroxysuccin imide ester was dissolved in 20 ml of dimethylformamide at 24 ° C. and the solution was slowly added with vigorous stirring to the solution of Schiff's base IHc in the course of 75 The solution was stirred overnight at 24 ° C. Using a steam jet vacuum, the solution was finally evaporated to dryness at 40 ° C. It was then repeated, evaporated to dryness with 100 ml of methanol 15 to give a viscous oil Oil was dissolved in 100 ml aqueous dioxane (1: 1), 10 ml glacial acetic acid was added and the solution was then placed in a 500 ml Parr flask along with 2.5 g 5% palladium on carbon (Engelhard) and during 20 four hours at 24 ° C with hydrogen from 3.2 atmospheres fall during this time was 6.1 atmospheres in the closed vessel, the pressure being renewed several times. The mixture was filtered through a bed of diatomaceous earth, which was then washed three times with 50% aqueous dioxane. The combined filtrates were brought to dryness and azeotropic

In diesem Versuch betrug das Verhältnis von BB-K8 zu Kanamycin A 0,45. In this experiment, the ratio of BB-K8 to kanamycin A was 0.45.

Die nach diesem Verfahren erhaltene Verbindung IV war authentisch mit einem Produkt, welches erhalten wurde nach der in der amerikanischen Patentanmeldung Nr. 221 378 beschriebenen Methode. Schmelzpunkt 194° C (Zersetzung). Compound IV obtained by this process was authentic with a product obtained by the method described in U.S. Patent Application No. 221,378. Melting point 194 ° C (decomposition).

lalj} = + 85° (c=2, H2O). Die relative Wirksamkeit gegenüber B. subtüis (Agarplatte) = 960 fig/mg (Standard: Kanamycin A als freie Base). lalj} = + 85 ° (c = 2, H2O). The relative effectiveness compared to B. subtüis (agar plate) = 960 fig / mg (standard: Kanamycin A as free base).

Analyse: Analysis:

berechnet für C22H43N5O13 • 2H2ÌCO3: calculated for C22H43N5O13 • 2H2ÌCO3:

C 40,62, H 6,68, N9,87, C 40.62, H 6.68, N9.87,

gefunden: C 40,21, H 6,96, N9,37, found: C 40.21, H 6.96, N9.37,

39,79, 6,87, 9,49. 39.79, 6.87, 9.49.

Beispiel 4 Example 4

Herstellung des Monosulfats von l-N-[L-(—)-j>-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A Preparation of the Monosulfate of l-N- [L - (-) - j> -Amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A

1 Mol l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamy- 60 ein A wurde gelöst in 1 bis 3 Litern Wasser. Die Lösung wurde filtriert zur Abtrennung allfälliger ungelöster Feststoffe. Zu der gekühlten Lösung wurde unter Rühren 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser, hinzugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, wonach kalter Äthylalkohol 6S hinzugegeben wurde, bis eine Fällung erfolgte. Die feste Substanz wurde abfiltriert und erwies sich als das gewünschte Monosulfat. 1 mol of l-N- [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamy- 60 an A was dissolved in 1 to 3 liters of water. The solution was filtered to remove any undissolved solids. 1 mol of sulfuric acid, dissolved in 500 ml of water, was added to the cooled solution with stirring. The mixture was stirred for 30 minutes after which cold ethyl alcohol 6S was added until precipitation occurred. The solid substance was filtered off and turned out to be the desired monosulfate.

destilliert mit 100 ml n-Butanol und schliesslich wiederholt mit Methanol erneut zur Trockne eingedampft, wobei ein viskoses Öl entstand. Dieses wurde aufgelöst in 30 ml Methanol und langsam eingegossen in 1000 ml auf 5 bis 10° C gekühlten Diäthyläthers unter kräftigem Rühren. Nachdem die erhaltene Suspension eine halbe Stunde lang in einem Eisbad gerührt worden war, wurde die darin entstandene Ausfällung abfiltriert und sofort getrocknet in einem Vakuum-exsiccator über P2O5. Das erhaltene Gemisch wog 4,9620 g. Dünnschichtchromatographie zeigte, dass es zur Hauptsache aus der Verbindung IV, Kanamycin A und einigen Spuren von di- und trisubstituiertem Kanamycin A sowie aus 4-Amino-2-hydroxybuttersäure bestand. distilled with 100 ml of n-butanol and finally repeatedly evaporated to dryness with methanol, giving a viscous oil. This was dissolved in 30 ml of methanol and slowly poured into 1000 ml of diethyl ether cooled to 5 to 10 ° C. with vigorous stirring. After the suspension obtained had been stirred in an ice bath for half an hour, the resulting precipitate was filtered off and immediately dried in a vacuum desiccator over P2O5. The resulting mixture weighed 4.9620 g. Thin layer chromatography showed that it mainly consisted of compound IV, kanamycin A and some traces of di- and trisubstituted kanamycin A and 4-amino-2-hydroxybutyric acid.

Die verschiedenen Fraktionen wurden getrennt unter Verwendung einer Glassäule von 40 X 100 mm, gepackt mit «Amberlite IRC-50» (NH4+-Form, Typ I, 0,15—0,75 mm Korngrösse), worin ein Bett von ca. 980 mm Harz enthalten war. Die Säule wurde beladen mit 4,600 g des Rohgemisches, aufgelöst in 1 ml Wasser. Hernach wurde die Säule eluiert mit einem Gradienten von Wasser bis 2-n NH4OH, wobei das Eluat in Fraktionen von je 15 ml gesammelt wurde. Insgesamt wurden 295 Fraktionen erhalten. Anschliessend wurde die Säule gewaschen mit 1,5 Liter 3-n NH4OH. Die Fraktionen wurden vereinigt aufgrund der optischen Drehungen, wonach feste Anteile daraus vermittels Lyophylise isoliert wurden. The various fractions were separated using a 40 X 100 mm glass column packed with "Amberlite IRC-50" (NH4 + form, Type I, 0.15-0.75 mm grain size), in which a bed of approximately 980 mm Resin was included. The column was loaded with 4,600 g of the crude mixture dissolved in 1 ml of water. The column was then eluted with a gradient of water to 2-n NH4OH, the eluate being collected in fractions of 15 ml each. A total of 295 fractions were obtained. The column was then washed with 1.5 liters of 3-n NH4OH. The fractions were pooled based on the optical rotations, after which solid fractions were isolated using Lyophylise.

(IV) 33,5 "/o. (IV) 33.5 "/ o.

Beispiel 5 Example 5

Herstellung des Disulfats von l-N-[L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycin A (BB-K8-2H2S04) Preparation of the disulfate of l-N- [L - (-) - j / -Amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycin A (BB-K8-2H2S04)

35 g l-N-[L-(—)-y-Amino-ß-hydroxybutyryl]-kanamycin A (als Monobicarbonattrihydrat), wurden gelöst in 125 ml entionisiertem Wasser. Dabei ergab sich ein pH-Wert von ungefähr 9,0. Der pH-Wert wurde erniedrigt auf 7,5 mit 50 Vol.-% wässriger Schwefelsäure. 35 g of l-N- [L - (-) - y-amino-ß-hydroxybutyryl] -kanamycin A (as monobicarbonate trihydrate) were dissolved in 125 ml of deionized water. This resulted in a pH of approximately 9.0. The pH was lowered to 7.5 with 50% by volume aqueous sulfuric acid.

8,5 g «Darco G-60» (Aktivkohle) wurden hinzugefügt, worauf das Gemenge eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur aufgeschlemmt wurde. Die Kohle wurde abfiltriert und gewaschen mit 40 ml Wasser. Die dabei erhaltene Waschlösung wurde dem Filtrat zugegeben. 8.5 g of “Darco G-60” (activated carbon) were added, after which the mixture was suspended for half an hour at room temperature. The coal was filtered off and washed with 40 ml of water. The washing solution obtained was added to the filtrate.

In den vereinigten Lösungen wurde der pH-Wert mit 50 Vol.-°/oiger Schwefelsäure auf 2 bis 2,6 eingestellt. Dabei entwickelte sich eine grosse Menge Kohlensäure. Die Lösung wurde Hausvakuum während 20 Minuten angeschlossen, um zusätzliche Kohlensäure auszutreiben. In the combined solutions, the pH was adjusted to 2 to 2.6 with 50% by volume sulfuric acid. A large amount of carbonic acid developed. The solution was connected to house vacuum for 20 minutes to drive off additional carbonic acid.

8V2 g «Darco G-60» wurden zu der entgasten Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur aufgeschlemmt. Hernach wurde die Kohle abfiltriert und mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wurde dem Filtrat zugefügt. 8V2 g "Darco G-60" were added to the degassed solution. The mixture was slurried at room temperature for half an hour. The coal was then filtered off and washed with 35 ml of deionized water. The water was added to the filtrate.

In den vereinigten Lösungen wurde der pH-Wert mit 50 Vol-°/oiger Schwefelsäure auf 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wurde unter raschem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumteile) hinzugegeben. Das Gemisch wurde fünf Minuten beim In the combined solutions, the pH was adjusted to 1 to 1.3 with 50% by volume sulfuric acid. This solution was added to 600 to 800 ml of methanol (3 to 4 parts by volume) with rapid stirring over a period of 10 minutes. The mixture was stirred for five minutes

Fraktion Nr. Fraction No.

Zusammensetzung composition

Gewicht Gramm Weight grams

Rohgewicht Gramm Gross weight grams

Biotest Bioassay

Ausbeute % Yield%

120—150 201—224 228—241 120-150 201-224 228-241

Kana A BB-K29 BB-K8 Kana A BB-K29 BB-K8

1,1654 0,4000 0,6523 1.1654 0.4000 0.6523

1,257 0,430 0,7036 1.257 0.430 0.7036

809 809

786 ± 101* 786 ± 101 *

42,6 19,2** 42.6 19.2 **

* Mittel von vier Plattentests ± Standardabweichung * Average of four plate tests ± standard deviation

** Unter Berücksichtigung der zurückgewonnenen Menge Kanamycin A betrug die Umwandlung in BB-K8 ** Taking into account the amount of kanamycin A recovered, the conversion to BB-K8 was

40 40

45 45

50 50

15 15

617 441 617 441

pH-Wert 1 bis 1,3 gerührt, hernach passiert durch ein Sieb mit 0,15 mm Maschenbreite, erneut während zwei Minuten gerührt und hernach 5 Minuten lang absitzen gelassen. Der Hauptteil der überstehenden Lösung wurde dekantiert. Die verbliebene Aufschlämmung wurde filtriert, gewaschen mit 200 ml Methanol und im Vakuum bei 50° C während 24 Stunden getrocknet. Die Ausbeute an amorphem BB-K8 pH 1 to 1.3 stirred, then passed through a 0.15 mm mesh screen, stirred again for two minutes and then left to sit for 5 minutes. Most of the supernatant solution was decanted. The remaining slurry was filtered, washed with 200 ml of methanol and dried in vacuo at 50 ° C for 24 hours. The yield of amorphous BB-K8

99 99

(Dihydrogensulfat)a betrug 32 bis 34 g. [a] j-j H20 = + 74,74, Zersetzung bei 220 bis 223° C. (Dihydrogen sulfate) a was 32 to 34 g. [a] j-j H20 = + 74.74, decomposes at 220 to 223 ° C.

Elementaranalyse (bezogen auf Trockengewicht*) Elemental analysis (based on dry weight *)

o/oC 32,70, 33,50, 32,30, 33,50 o / oC 32.70, 33.50, 32.30, 33.50

o/oN 8,78, 8,70, 8,20, 8,80, 8,97 o / oN 8.78, 8.70, 8.20, 8.80, 8.97

o/o S 8,75, 8,90, 7,80, 8,85, 8,20 o/o Asche keine o / o S 8.75, 8.90, 7.80, 8.85, 8.20 o / o ash none

* Wassergehalt nach Karl Fischer: 2,33, 1,79, 2,87 % (theoretisch für das Monohydrat 2,25 o/„). Das Salz ist hygroskopisch, jedoch nicht zerfliesslich. Nach Lagern eines aliquoten Teils in Luft bei Zimmertemperatur während 18 Stunden stieg der Wassergehalt an auf 9,55 %, 9,89 % (theoretisch für das Pentahydrat 10,33 °/o). * Water content according to Karl Fischer: 2.33, 1.79, 2.87% (theoretically for the monohydrate 2.25 o / "). The salt is hygroscopic, but not deliquescent. After storing an aliquot in air at room temperature for 18 hours, the water content rose to 9.55%, 9.89% (theoretically 10.33 ° / o for the pentahydrate).

M) l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IV), nicht über den Weg des Schiffbase-Zwischenproduktes Zu einer gerührten Lösung von 1,36 g = 2,2 mMol 6'-N-Cbz-kanamycin (II) in 60 ml 50°/oigem wässrigem Tetrahydrofuran wurden tropfenweise 930 mg = 2 mMol des aktiven Esters XX in 10 ml Tetrahydrofuran im Verlauf von 30 Minuten bei Zimmertemperatur hinzugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und hernach hydriert mit 1,0 g 10°/oigem Palladium auf Kohle unter Atmosphärendruck bei Zimmertemperatur. Der Katalysator wurde abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft zur Abtrennung des organischen Lösungsmittels. Die erhaltene wässrige Lösung wurde passiert durch eine Säule von «CG-50» (NH4 + , 70 ml), die nacheinander pyridiert wurde mit 0,4 Litern Wasser, 0,5 Litern 0,1-n NH4OH, 0,5 Litern 0,3-n NH4OH, 1 Liter 0,5-n NH4OH und schliesslich mit 0,5 Litern 1-n NH4OH. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von je 20 ml und unterteilt auf Basis der Dünnschichtchromatographie-RF-Werte auf einer Silicagelplatte («S-110», Ninhydrin) sowie der Bioteste gegen B. subtilis PCI 219 und K. pneumoniae Typ 22 = 3038 A 20680. Jede dieser Teile wurde im Vakuum eingedampft und Iyophylisiert. M) IN - [L - (-) - y-amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A (IV), not via the way of the Schiff base intermediate To a stirred solution of 1.36 g = 2.2 mmol 6 ' -N-Cbz-kanamycin (II) in 60 ml of 50% aqueous tetrahydrofuran, 930 mg = 2 mmol of the active ester XX in 10 ml of tetrahydrofuran were added dropwise over a period of 30 minutes at room temperature. The mixture was stirred overnight and then hydrogenated with 1.0 g of 10% palladium on carbon under atmospheric pressure at room temperature. The catalyst was separated and washed with water. The filtrate and washing solutions were combined and evaporated in vacuo to remove the organic solvent. The aqueous solution obtained was passed through a column of “CG-50” (NH4 +, 70 ml), which was successively pyridized with 0.4 liters of water, 0.5 liters of 0.1N NH4OH, 0.5 liters of 0 , 3-n NH4OH, 1 liter of 0.5-n NH4OH and finally with 0.5 liters of 1-n NH4OH. The eluates were collected in fractions of 20 ml each and divided on the basis of the thin-layer chromatography RF values on a silica gel plate (“S-110”, ninhydrin) and the bioassays against B. subtilis PCI 219 and K. pneumoniae type 22 = 3038 A 20680. Each of these parts was evaporated in vacuo and lyophilized.

Beispiel 6 Example 6

6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicylkanamycin A 9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24° C, worauf 58,2 mMol Salicylaldehyd hinzugegeben wurden. Das Gemisch wurde am Rückfluss erwärmt. Dabei veränderte es sich in eine klare gelbe Lösung und es begann sich daraus bald eine weisse feste Substanz abzuscheiden. Die Mischung wurde drei Stunden lang am Rückfluss gekocht, hernach abgekühlt und die ausgefallene feste Substanz abfiltriert. Hernach wurde gewaschen mit absolutem Äthanol. Der Schmelzpunkt nach Umkristallisieren aus einem Gemenge von Tetrahydrofuran-Methanol-Heptan 4:1:5 betrug nach dem Trocknen 196 bis 198° C. 6'-carbobenzoxy-l, 3,3 "-trisalicylkanamycin A 9.0 g = 14.5 mmol of 6'-carbobenzoxykanamycin A were suspended in 500 ml of absolute ethanol at 24 ° C., after which 58.2 mmol of salicylaldehyde were added The mixture was heated to reflux, changing to a clear yellow solution and soon a white solid began to separate out of it. The mixture was refluxed for three hours, then cooled, and the precipitated solid was filtered off absolute ethanol The melting point after recrystallization from a mixture of tetrahydrofuran-methanol-heptane 4: 1: 5 after drying was 196 to 198 ° C.

Analyse: Analysis:

berechnet für C47H54N4N4O16: calculated for C47H54N4N4O16:

C 60,62, H 5,86, N6,02, C 60.62, H 5.86, N6.02,

gefunden: C 58,67, H 5,73, N5,98. found: C 58.67, H 5.73, N5.98.

Wassergehalt nach Karl Fischer: 2,45 %. Water content according to Karl Fischer: 2.45%.

Analyse korrigiert für den Wasseranteil: Analysis corrected for the water content:

gefunden: C 60,14, H 5,60, N 6,13. found: C 60.14, H 5.60, N 6.13.

Beispiel 7 Example 7

Herstellung von l-N-[L-(—)-j>-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A über das in situ Verfahren In einer geeigneten Vorrichtung wurden 1000 g = 1,074 Mol 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicyl-kanamycin A in 11,400 ml Tetrahydrofuran bei 22 bis 25° C aufgeschlämmt. Es wurden 600 ml Wasser unter Rühren hinzugefügt. Innerhalb 10 Minuten erfolgte eine klare Auflösung. In Form fester Substanzen wurden 181,5 g = 0,716 Mol 4-Benzyl-oxycarbonyIamino-2-hydroxybuttersäure und 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid zu der Lösung hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung lag im Bereich von 5,5 bis 6,0. Unter Einhalten einer Temperatur von 22 bis 25° C wurden 162,3 g = 0,787 Mol Dicyclohexylcarbodiimid, aufgelöst in 3000 ml trockenem Tetrahydrofuran, hinzugefügt. Die Aufschlämmung wurde 24 Stunden bei 22 bis 25° C gerührt und hernach auf 0 bis 5° C abgekühlt, wobei Dicyclo-hexylharnstoff während zwei Stunden auskristallisierte. Preparation of IN - [L - (-) - j> -Amino-a-hydroxybutyryl] -kanamycin A via the in situ method In a suitable device 1000 g = 1.074 mol of 6'-carbobenzoxy-l, 3.3 "- trisalicyl-kanamycin A slurried in 11.400 ml of tetrahydrofuran at 22 to 25 ° C. 600 ml of water were added with stirring, a clear dissolution took place within 10 minutes. In the form of solid substances, 181.5 g = 0.716 mol of 4-benzyloxycarbonyamino -2-hydroxybutyric acid and 0.12 mol of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide were added to the solution, and the pH of the solution ranged from 5.5 to 6.0 while maintaining a temperature of 162.3 g = 0.787 mol of dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 3000 ml of dry tetrahydrofuran were added at 22 to 25 ° C. The slurry was stirred at 22 to 25 ° C. for 24 hours and then cooled to 0 to 5 ° C., with dicyclo-hexylurea crystallized during two hours.

Der Harnstoff wurde abfiltriert und der Filterkuchen gewaschen mit 800 ml 95°/oigem wässrigem Tetrahydrofuran. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und in Volumen unter Vakuum auf eine Menge von 3000 ml eingeengt. Nun wurden 4000 ml Methanol hinzugefügt und das Volumen erneut im Vakuum auf 3000 ml reduziert. The urea was filtered off and the filter cake was washed with 800 ml of 95% aqueous tetrahydrofuran. The filtrate and washing solutions were combined and concentrated in volume to 3000 ml in vacuo. Now 4000 ml of methanol were added and the volume was reduced again to 3000 ml in vacuo.

Zu der so erhaltenen Lösung wurden 2000 ml absolutes Methanol bei 40° C hinzugegeben, worauf die Lösung bekeimt wurde mit 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicyl-kanamycin A und zwecks Kristallisierenlassens eine halbe bis eine Stunde lang abgekühlt wurde. Hernach wurden 2000 ml Wasser im Verlauf von einer halben Stunde unter guter Durchmischung bei ungefähr 22 bis 25° C hinzugegeben. Die Durchmischung wurde zwei Stunden lang fortgesetzt. Hernach wurde die Temperatur im Verlauf von einer Stunde auf 0 bis 5° C abgesenkt. To the solution thus obtained was added 2000 ml of absolute methanol at 40 ° C., whereupon the solution was germinated with 6'-carbobenzoxy-l, 3,3 "-trisalicyl-kanamycin A and cooled for half an hour to one hour to allow it to crystallize. Then, 2000 ml of water was added over half an hour with thorough mixing at about 22 to 25 ° C. Mixing was continued for two hours, after which the temperature was reduced to 0 to 5 ° C. over an hour.

Abfiltrieren der festen Anteile und Waschen mit 900 ml kaltem wässrigem Methanol (2:1) und dann mit 800 ml Methanol waren die nächsten Schritte. Filtrate und Waschlösungen wurden beiseite gestellt. Der Filterkuchen besteht zur Hauptsache aus wiedergewonnenem 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicylalkanamycin A. Filtering off the solid portions and washing with 900 ml of cold aqueous methanol (2: 1) and then with 800 ml of methanol were the next steps. Filtrates and wash solutions were set aside. The filter cake mainly consists of recovered 6'-carbobenzoxy-l, 3,3 "-trisalicylalkanamycin A.

Die Filtrate wurden verdünnt mit 1000 ml Wasser, anschliessend wurden 2000 ml Methylenchlorid hinzugefügt. Bei 25° C wurde der pH-Wert mit 6-n HCl auf 1,8 bis 3,0 reduziert. Dieser pH-Wert wurde eine halbe Stunde lang beibehalten. The filtrates were diluted with 1000 ml of water, then 2000 ml of methylene chloride were added. At 25 ° C the pH was reduced to 1.8 to 3.0 with 6N HCl. This pH was maintained for half an hour.

Nun wurde die Methylenchloridschicht abgetrennt und die wässrige Phase mit zusätzlichen 2000 ml Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden beiseite gestellt, um daraus Salicylaldehyd wieder gewinnen zu können. Now the methylene chloride layer was separated and the aqueous phase washed with an additional 2000 ml of methylene chloride. The combined organic phases were set aside so that salicylaldehyde could be recovered from them.

In der wässrigen Phase wurde der pH-Wert mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 3,5 bis 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde hernach bei Zimmertemperatur mit Wasserstoff in Gegenwart von 5%igem Palladium auf Kohle und bei 3,5 Atmosphären hydriert. Die Ausbeute am erwünschten Produkt erwies sich gemäss einem Biotest auf 30 bis 45 % der Theorie. In the aqueous phase, the pH was adjusted to 3.5 to 4.0 with concentrated ammonium hydroxide. This solution was then hydrogenated at room temperature with hydrogen in the presence of 5% palladium on carbon and at 3.5 atmospheres. The yield of the desired product was 30 to 45% of theory according to a bioassay.

Beispiel 8 Example 8

Herstellung der Verbindung IV unter Verwendung verschiedener Molprozente an N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid bei konstanten Molprozenten der anderen Reaktanten Werden anstelle von 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen- Preparation of compound IV using different molar percentages of N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide at constant molar percentages of the other reactants. Instead of 0.12 mol of N-hydroxy-5-norbornene

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

617 441 617 441

16 16

2,3-dicarboximid (HONB) in der Arbeitsweise des Beispiels 7 verschiedene andere Molprozente dieser Verbindung verwendet, so erhält man die nachfolgenden Ausbeuten an der Verbindung IV: 2,3-dicarboximide (HONB) used various other mole percentages of this compound in the procedure of Example 7, the following yields of compound IV are obtained:

Versuch Mol-°/o Ausbeute in %> Nr. HONB an Verbindung IV Experiment Mol% yield in%> No. HONB of compound IV

1 0 1 0

2 2 2 2

3 10 3 10

4 50 4 50

5 100 5 100

Aus den obigen Resultaten ist ersichtlich, dass die Ver- 15 bindung IV bei kompleter Abwesenheit von HONB hergestellt werden kann. Gleichfalls kann daraus aber auch ersehen werden, dass die besten Ausbeutern an der Verbindung IV erhalten werden, wenn die Molprozente an HONB 10 bis 50 o/o des molaren Anteils an 4-Benzyloxycarbonylamino-2- 20 hydroxybuttersäure bei der Acylierungsreaktion betragen. Der genaue Mechanismus, vermittels welchem die Acylierung des blockierten Kanamycins A vor sich geht, ist unbekannt. It can be seen from the above results that compound IV can be established in the complete absence of HONB. Likewise, it can also be seen from this that the best yielders of compound IV are obtained if the molar percent of HONB is 10 to 50% of the molar proportion of 4-benzyloxycarbonylamino-2- 20 hydroxybutyric acid in the acylation reaction. The exact mechanism by which the blocked kanamycin A is acylated is unknown.

Indessen lässt sich beobachten, dass die Gegenwart von HONB in irgend einer Art bessere Ausbeuten bewirkt als die 25 zuvor erhaltenen. However, it can be observed that the presence of HONB in some way produces better yields than the 25 previously obtained.

N) Herstellung von l-N-[L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybutyryl]f-kanamycin A (IV) 6'-Carbobenzoxy-l,3,3'-trisalicylalkanamycin A in einer Menge von 18,6 g — 20,0 Mol, hergestellt gemäss Beispiel 18, wurden aufgelöst in 55 ml Dimethylformamid bei 45° C. Zu dieser Lösung wurden 7,3 ml Wasser und 102 ml Aceton hinzugefügt. Die Lösung wurde auf ungefähr 25 e C abkühlen gelassen und hernach auf einmal versetzt mit 50 ml einer Lösung von Aceton und 9,9 Mol L-(—)-y-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-succinimidester. Das Reaktionsgemenge wurde bei ungefähr 20° C 40 Stunden lang gerührt. Nun wurden nacheinander 150 ml Wasser und einige Kristalle von 6'-Carbobenzoxy-l,3,3'-trisalicyl-alkanamycin A hinzugefügt und das Gemisch bei ungefähr N) Preparation of lN- [L - (-) - j / -amino-a-hydroxybutyryl] f-kanamycin A (IV) 6'-carbobenzoxy-l, 3,3'-trisalicylalkanamycin A in an amount of 18.6 g - 20.0 mol, prepared according to Example 18, were dissolved in 55 ml of dimethylformamide at 45 ° C. 7.3 ml of water and 102 ml of acetone were added to this solution. The solution was allowed to cool to approximately 25 ° C and then 50 ml of a solution of acetone and 9.9 mol of L - (-) - y-benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybutyric acid N-hydroxy-succinimide ester were added all at once. The reaction mixture was stirred at approximately 20 ° C for 40 hours. Now 150 ml of water and a few crystals of 6'-carbobenzoxy-l, 3,3'-trisalicylalkanamycin A were added in succession and the mixture at approximately

25° C eine Stunde lang und hernach drei Stunden lang bei 25 ° C for one hour and then for three hours

0 bis 5° C gerührt. Der Überschuss an nicht umgesetzter Salicylaldehyd-Schiffbase kristallisierte aus und wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit 60 ml50°/oigem wässrigem Aceton gewaschen. Dann wurde der Kuchen getrocknet und gewogen und ergab 9,4 g zurückerhaltener Schiff-sehe Base vom Schmelzpunkt (roh) 170 bis 185° C. 0 to 5 ° C stirred. The excess of unreacted salicylaldehyde ship base crystallized out and was filtered off. The filter cake was washed with 60 ml of 50% aqueous acetone. Then the cake was dried and weighed to give 9.4 g of recovered Schiff's base from melting point (raw) 170 to 185 ° C.

Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Filtrat wurde behandelt mit 40 ml Methylenchlorid und sein pH-Wert von 6,2 auf 2,0 erniedrigt zwecks Entfernung weiteren Ausgangsmaterials. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht extrahiert mit zweimal 40 ml Methylenchlorid. Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde auf 3,7 eingestellt und geringe Anteile Aceton und Methylenchlorid daraus im Vakuum entfernt. Die wässrige Lösung wurde hernach mit 3 g 5%iger Palladium auf Kohle als Katalysator bei 24° C während 15 Stunden und bei einem Druck von 3,0 Atmosphären mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert durch Diatomeenerde zwecks Entfernen des Katalysators. Dann wurde das Filtrat auf 100 ml Volumen gebracht. Eine Probe dieser Lösung von The filtrate obtained in the manner described above was treated with 40 ml of methylene chloride and its pH was lowered from 6.2 to 2.0 in order to remove further starting material. The layers were separated and the aqueous layer extracted with twice 40 ml of methylene chloride. The pH of the aqueous layer was adjusted to 3.7 and small amounts of acetone and methylene chloride were removed therefrom in vacuo. The aqueous solution was then hydrogenated with 3 g of 5% palladium on carbon as a catalyst at 24 ° C. for 15 hours and at a pressure of 3.0 atmospheres. The reaction mixture was filtered through diatomaceous earth to remove the catalyst. Then the filtrate was brought to 100 ml volume. A sample of this solution from

1 ml wurde für Platten und Scheibentests abgezweigt. Der Plattentest ergab 1936 ng/ml an Verbindung V und der Scheibentest ergab 2325 /zg/ml, was einer Ausbeute von 33,4% an Endprodukt entspricht. Die verbliebenen 99 ml der Lösung wurden auf ein Volumen von ungefähr 30 ml eingeengt und durch eine Chromatographiesäule in der z. B. in Beispiel 14 vorbeschriebenen Weise hindurchgeschickt. Die vereinigten Fraktionen, welche die Verbindung IV enthielten, in einer Menge von 500 ml, wurden konzentriert auf ungefähr 20 ml, zu welchen 45 ml Methanol hinzugegeben wurden, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von ungefähr 1 ml was branched off for plates and disk tests. The plate test gave 1936 ng / ml of compound V and the disk test gave 2325 / zg / ml, which corresponds to a yield of 33.4% of the final product. The remaining 99 ml of the solution were concentrated to a volume of approximately 30 ml and passed through a chromatography column in the z. B. sent in Example 14 as described above. The combined fractions containing Compound IV in an amount of 500 ml were concentrated to approximately 20 ml to which 45 ml of methanol was added, followed by the dropwise addition of approximately

25 ml Isopropanol zwecks Kristallisation des Produktes. Das kristalline Material wurde abfiltriert, gewaschen mit einem hälftigen Gemisch von Methanol und Isopropanol und getrocknet. Erhalten wurden 2,31 g von BB-K8, d. h. der Verbindung der Formel IV. Ein Plattentest der festen Substanz ergab einen Wirkungswert von 836 jitg/mg, entsprechend einer Reinheit von 83,6 % und einer tatsächlichen Ausbeute der reinen Verbindung der Formel IV von 33,3 %, bezogen auf 9,9 mMol des Ausgangsmaterials. 25 ml isopropanol to crystallize the product. The crystalline material was filtered off, washed with a half mixture of methanol and isopropanol and dried. 2.31 g of BB-K8, i.e. H. of the compound of the formula IV. A plate test of the solid substance showed an activity value of 836 jitg / mg, corresponding to a purity of 83.6% and an actual yield of the pure compound of the formula IV of 33.3%, based on 9.9 mmol of the starting material.

9,33 20,07 31,72 36,52 36,01 9.33 20.07 31.72 36.52 36.01

35 35

M M

Claims

617 441

PATENT CLAIMS 1. Method of connecting the

Formula ch2-nh2

h2n and their salts, characterized by the process steps

A) implementation of a compound of formula h

çh2-n-c! -o-ch2-c6h5

H2N

CH2-C6H5

10th

where Z is a residue of the formulas

-N = C ^^ V-NC> 2, -N = C- ^ v

30th

H

-N = C-

/. \

35

H CHs I / -N = C-C-CHs

CHs

OCHs,

and

HO

-N = C-

or

40

B) treating the compound III thus obtained with a compound of the formula

O

45 f)] .N-O-C-CH-CHa-Cm-NH-C-O-CHs-CeHs

O

I.

OH

XX

50

with benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde, p-methoxybenzaldehyde or pivaldehyde in the ratio of 1 mole of compound II to at least 3 moles of aldehyde to a compound of the formula in the ratio of 1 mole of compound III to at least 0.5 mole of compound XX and subsequent hydrogenation of the residue in situ to the compound of formula IV.

2. The method according to claim 1, characterized in that process step A in one of the following-55 the solvent: absolute ethanol, methanol, n-propan-ol, methylene chloride, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert.- Butanol, tetrahydrofuran, dioxane, dimethylformamide or acetone or mixtures thereof or mixtures thereof with water, in the temperature range from 5 ° C. to reflux temperature and for 30 minutes to 5 hours, that process step B is carried out at -10 to 35 ° C. for at least one hour in a solvent of the type described for step A, whereupon the organic solvent is separated off and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen in the presence of one of the following metal catalysts: palladium, platinum, Raney nickel, rhodium, ruthenium or nickel, wherein in Water or in a mixture of water and one of the

60

65

3rd

617 441

following water-soluble solvent: dioxane, tetra-hydrofuran, ethyl glycol dimethyl ether or propylene glycol dimethyl ether and is carried out at a pH of 3 to 5.

3. The method according to claim 1 or claim 5 2, characterized in that in process step A benzaldehyde, salicylaldehyde, p-nitrobenzaldehyde or p-methoxybenzaldehyde are used, and that the reaction takes place at a temperature between 5 and 40 ° C, and in that Process step B per mole of compound III 0.5 to 1.0 mole of compound XX are reacted at a temperature of + 5 to 35 ° C. for 1 to 3 hours.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that in process step A benzaldehyde, 15th

Salicylaldehyde or p-nitrobenzaldehyde are used in the ratio of 1 mole of compound II to approximately 3 moles of aldehyde, and that in process step B 0.5 to 0.85 mole of compound XX per mole of compound III obtained at a temperature in the range of + 5 to 30 ° C are implemented, and that the hydrogenation is carried out at a pH of about 4.

5. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that in process step A, the compound II is reacted in a ratio of 1: 3 moles with benzaldehyde, at a temperature of 20 to 30 ° C, for 2 to 4 hours and is operated at a pH of about 10, whereupon the compound of formula

ÏÎ

n = "- {3rd

purple in situ or after their isolation with the compound of formula XX in a ratio of 1 mol purple to 0.6 to 0.75 mol XX is reacted at 20 to 30 ° C for 1 to 3 hours, with one of the im Process step A used, a mixture of methylene chloride, methanol and water or a mixture of dimethylformamide, acetone and water is used, whereupon the organic solvent was removed from the reaction mixture in vacuo, the pH of the residue with

40

45

Ammonium hydroxide set to 4, and the residue is hydrogenated in situ with hydrogen at atmospheric pressure in the presence of palladium on carbon to give compound IV.

6. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that in process step A, the compound II is reacted in a ratio of 1: 3 moles with salicylaldehyde, at 20 to 30 ° C, for 2 to 4 hours and at a pH -Value of about 8 is worked, after which the compound of formula obtained

2 2 6 5

Illb

617 441

4th

is reacted in situ or after their isolation with the compound of the formula XX in a ratio of 1 mol Illb to 0.6 to 0.75 mol XX at 20 to 30 ° C. for 1 to 3 hours, one of the solvents in process step A used or a mixture of dimethyl-formamide, acetone and water is used, whereupon the organic solvent is stripped from the reaction mixture in vacuo, the pH of the residue is adjusted to 4 with ammonium hydroxide and the residue in situ with hydrogen at atmospheric pressure in the presence of palladium is hydrogenated on carbon to compound IV.

7. Application of the method according to claim 1 for the preparation of a compound of formula IV, characterized in that in process step B the compound of formula XX is prepared in situ by reacting the compounds of formulas VI and XIX

O O

II II

H-O-O-CH-CH ^ CHa-NH ^ C-O-CHa-CeHs and OH

VI

N-OH

10th

15

XIX

which are reacted with the compound of the formula III in the ratio of 1 mol of the compound III to 0.5-0.1 mol of the compounds VI and cyclohexylcarbodiimide and 0.05 to 0.25 mol of the compound XIX, using a solvent according to the process step A of claim 1, wherein working at a temperature of 5 to 25 ° C for 1 to 3 hours.