CH617441A5 - Process for the preparation of a kanamycin A derivative - Google Patents
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- CH617441A5 CH617441A5 CH1521274A CH1521274A CH617441A5 CH 617441 A5 CH617441 A5 CH 617441A5 CH 1521274 A CH1521274 A CH 1521274A CH 1521274 A CH1521274 A CH 1521274A CH 617441 A5 CH617441 A5 CH 617441A5
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und wesentlich wirksameres Verfahren zur Herstellung von [l-L-(—)-y-20 Amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A sowie deren Salze. Diese Verbindung hat die Formel
IV
Kanamycin A weist vier primäre Aminogruppen in den Stellungen 1, 3, 6' und 3" des Moleküls auf. Es hat sich erwiesen, dass die Aminogruppe in 6'-Stellung davon die am reaktionsfähigste ist und dass die 1-Aminogruppe die zweitreaktionsfähigste ist, wenn die Substanz mit einem elektro-philen Agens behandelt wird. Die beiden Gruppen in 3-und 3"-Stellung sind weniger reaktionsfähig als diejenigen in 1- oder 6'-Stellung. Jedoch reagieren sie ebenfalls und ergeben in geringen Anteilen unerwünschte Acylierungspro-dukte. Demgemäss setzte sich die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein befriedigenderes Herstellungsverfahren ausfindig zu machen als dasjenige unserer Mitarbeiter, welches Gegenstand der US-Patentanmeldungen Nr. 221378 und 330 377 ist. Dabei sollte das neue Verfahren selektiver ausgerichtet sein auf die Acylierung der 1-Aminogruppe als auf diejenige der anderen Aminogruppen im Molekül.
Diese Zielsetzung wurde erreicht durch das erfindungs-gemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel IV, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte
A) Umsetzung einer Verbindung der Formel
5
617 441
mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, p-Methoxybenzaldehyd oder Pivaldehyd, im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu mindestens 3 Molen Aldehyd, zu einer Verbindung der Formel
O
hr. h ii ch2-n-c-o-ch2~ch worin Z ein Rest der Formel oder
H CHs -N=C-C—CHs CHs ist und
O
O
xo
15
20
25
B) Behandeln der so erhaltenen Verbindung III mit einer Verbindung der Formel
N-O-C-CH-CHa-CHs-NH-C-O-CHa-CeHs
I
OH
XX
einem molaren Verhältnis der Verbindungen III zu XX von ungefähr 1:1 bei einer Temperatur im Bereiche von —10 bis ungefähr + 35° C, insbesondere jedoch im Bereiche von + 5 bis ungefähr 25° C, wobei man eine Zeit einhält bis die Acylierung vollständig verlaufen ist, jedoch mindestens 1 bis 3 Stunden. Hernach wird das organische Lösungsmittel vor der Hydrierung zweckmässig abgetrennt. Die Hydrierung in situ lässt sich ausführen mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, wie beispielsweise Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch vorzugsweise mit Palladium und insbesondere mit Palladium auf Holzkohle. Man arbeitet dabei zweckmässig in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser oder einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetra-hydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther, Propylenglykoldi-methyläther und dergleichen, wobei Wasser als Lösungsmittel vorzuziehen ist und zweckmässig ein pH-Wert von 3 bis 5, jedoch am besten ein Wert von 4 eingehalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II umgesetzt mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd oder p-Methoxybenzaldehyd im Verhältnis von einem Mol der Verbindung II zu mindestens 3 Molen Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton bzw. Gemischen davon, mit Wasser im Temperaturbereich von 5 bis 40° C während 30 Minuten bis zu 5 Stunden. In der so erhaltenen Verbindung III bedeutet Z die Reste
30
45
50
im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu mindestens 0,5 Mol der Verbindung XX und nachfolgende Hydrierung des Rückstandes in situ der Formel IV.
Es empfiehlt sich, den Verfahrensschritt A auszuführen in 55 einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie einem Alkohol, z. B. absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Iso-propanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, oder in Methylenchlorid oder in einem Äther als Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, Dioxan oder einem anderen polaren aprotischen oder protischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid und Aceton, oder in Gemischen dieser Lösungsmittel oder Gemischen derselben mit Wasser. Dabei arbeitet man zweckmässig bei einer Temperatur im Bereiche von 5° C bis zur Rückflusstemperatur des verwendeten Lösungsmittels, während einer Umsetzungsperiode von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 5 Stunden.
Der Verfahrensschritt A wird vorzugsweise ausgeführt mit
60
65
HO
35
40
Die erhaltene Verbindung wird in situ oder nach deren Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung der Formel XX im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1 Mol der Verbindung XX und im Temperaturbereich zwischen 5 und 30° C während 1 bis 3 Stunden. Dabei verwendet man zweckmässig ein Lösungsmittel, wie es in Verfahrensschritt A verwendet wurde. Anschliessend wird das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel, jedoch vorzugsweise von Palladium auf Kohle in Wasser oder in einem Gemisch von Wasser mit einem in Wasser mischbaren Lösungsmittel hydriert. Als letztgenanntes Lösungsmittel kommen in Frage: Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldimethyl-äther, jedoch vorzugsweise Wasser. Auch hier wieder liegt der gültige pH-Wert bei 3 bis 5 und vorzugsweise bei 4.
Bei einem weiteren bevorzugten Herstellungsverfahren zur Verbindung IV wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II umgesetzt mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd oder p-Nitrobenzaldehyd im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu ungefähr 3 Molen Aldehyd in absolutem Äthanol, Methanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton bzw. Gemischen davon mit Wasser. Wiederum arbeitet man günstigerweise im Temperaturbereich von 5 bis 40° C während einer Periode von 30 Minuten bis 5 Stunden. In der erhaltenen Verbindung III
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bedeutet 6 die Reste
HO
Die erhaltene Verbindung III wird in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung XX im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 0,85 Molen der Verbindung XX und in einem Temperaturbereich von + 15 bis 30° C. Man arbeitet hierbei während 1 bis 3 Stunden in einem Lösungsmittel, wie es im Verfahrensschritt A verwendet wurde. Hernach wird aus dem Reaktionsgemenge das organische Lösungsmittel abgetrieben und der Rückstand in situ mit Wasserstoff in Gegenwart eines der genannten Katalysatoren, jedoch vorzugsweise mit Palladium auf Holzkohle, hydriert, wobei man in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel arbeitet, wobei wiederum Dioxan, Tetrahydro-
10
15
furan, Äthylenglykoldimethyläther und Propylenglykoldi-methyläther in Frage kommen, indessen das geeignete Lösungsmittel Wasser und der geeigneteste pH-Wert 4 ist.
Bei einem besonders günstigen Herstellungsverfahren für die Verbindung IV wird im Verfahrensschritt A die Verbindung II mit Benzaldehyd umgesetzt, im molaren Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu 3 Molen Benzaldehyd,
wobei man vorteilhafterweise in einer wässrigen Lösung von Tetrahydrofuran im Verhältnis 1:1 und im Temperaturbereich von 20 bis 30° C bei einem pH-Wert von ungefähr 10 arbeitet. Die Reaktionsdauer beträgt dabei 2 bis 4 Stunden. Erhalten wird die Verbindung der Formel lila
O H I
CH2-N-C-0-CH2-CgH5
lila
Diese Verbindung lila wird in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung der Formel XX im Verhältnis von 1 Mol lila von 0,6 bis 0,75 Molen der Verbindung XX bei einer Temperatur im Breich von 20 bis 30° C und während einer Zeit von 1 bis 3 Stunden. Als Lösungsmittel kann man dabei ein solches verwenden, wie es im Verfahrensschritt A gebraucht wurde oder auch ein Gemisch von Methylenchlorid, Methanol und Wasser oder ein Gemisch von Dimethylformamid, Aceton und Wasser.
Nach der Umsetzung wird das organische Lösungsmittel im Vakuum abgetrieben und der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt. Anschliessend wird in situ filtriert
45
50
mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle. Dabei entsteht die Verbindung IV.
Eine weitere, gleichfalls besonders vorzüglich geeignete Ausführungsform des Herstellungsverfahrens der Verbindung IV arbeitet im Verfahrensschritt A mit Salicylaldehyd, wobei auf 1 Mol der Verbindung II 3 Mole Salicylaldehyd in einem hälftigen Gemisch von Wasser und Tetrahydrofuran umgesetzt werden. Der geeignete Temperaturbereich liegt zwischen 20 und 30° C und der günstige pH-Bereich bei ungefähr 8. Die Umsetzung dauert 2 bis 4 Stunden, wobei die Verbindung der Formel Illb erhalten wird.
CH2-N-Ü-0-CH2-CgH5
Illb
Anschliessend wird im Verfahrensschritt B die so erhaltene Verbindung Illb in situ oder nach ihrer Abtrennung umgesetzt mit der Verbindung XX in einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung Illb zu ungefähr 0,6 bis 0,75 Molen der Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereiche von 20 bis 30° C während einer Zeit von 1 bis 3 Stunden. Wiederum kann als Lösungsmittel ein solches verwendet werden, wie es im Verfahrensschritt A gebraucht wurde oder ein Gemisch von Dimethylformamid, Aceton und Wasser. Nach vollendeter Umsetzung wird das organische Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, der pH-Wert der wässrigen Lösung mit Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt und der Rückstand in situ mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle zur Verbindung IV hydriert.
In dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck Nieder-alkyl einen Alkylrest, verzweigter oder geradliniger Art, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Niederalkanol ist ein gesättigter Alkohol, geradlinig oder verzweigt, mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, welcher eine OH-Gruppe enthält.
Eine Modifikation des vorgeschriebenen erfindungsge-mässen Verfahrens arbeitet noch vermehrt in situ und ergibt dabei die gleichen guten Ausbeuten der Verbindung IV mit geringeren Kosten.
So lässt sich beispielsweise die Verbindung XX in situ herstellen und mit der Verbindung der Formel III umsetzen in einem entsprechend geeigneten Verfahrensschritt. Dabei wird im Verfahrensschritt B die Verbindung der Formel IV hergestellt, indem die im Verfahrensschritt A hergestellte Verbindung III entweder in situ oder nach ihrer Abtrennung behandelt wird mit den Verbindungen der Formeln VI und XIX
O O
II II
H-O-C^CH-CH^CHa-NH^-C-O-CHä-CeHs und I
N-OH
XIX
gefolgt von der Zugabe von Dicyclohexylcarbodiimid in einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu ungefähr 0,5 bis 1,0 Molen jeder der Verbindungen VI und Di-cyclocarbodiimid und ungefähr 0,005 bis 0,25 Molen der Verbindung XIX. Dabei arbeitet man vorteilhaft in einem Temperaturbereich von — 10 bis + 35° C, jedoch insbesondere im Bereiche von + 5 bis + 25° C und während einer Reaktionsdauer von mindestens 10 Stunden. Als Lösungsmittel dient dabei zweckmässig ein solches, wie es für den Verfahrensschritt A gebraucht wurde. Nach Vollendung der Reaktion wird das organische Lösungsmittel abgetrieben und die Hydrierung des Rückstandes in situ in der vorbeschriebenen Weise durchgeführt.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses modifizierten Verfahrens arbeitet mit einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu je 0,5 bis 0,85 Molen der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid und 0,05 bis 0,425 Molen der Verbindung XIX in einem Temperaturbereich von + 5 bis 25° C während 1 bis 3 Stunden und in einem Lösungsmittel, wie es für den Verfahrensschritt A diente. Gegebenenfalls kann auch ein Molverhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu je 0,5 bis 0,8 Molen der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid sowie 0,05 bis 0,425 Molen der Ver617 441
bindung XIX Verwendung finden, wobei man vorteilhafterweise im Temperaturbereich von + 15 bis + 30° C während 15 bis 25 Stunden umsetzt. Die am günstigsten befundenen Reaktionsbedingungen arbeiten mit einem Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu 0,6 bis 0,75 Molen jeder der Verbindungen VI und Dicyclohexylcarbodiimid, sowie 0,06 bis 0,375 Molen der Verbindung XIX, im Temperaturbereich von 20 bis 30° C während 15 bis 20 Stunden Umsetzungsdauer.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeiten wurde gleichfalls ein verbessertes Herstellungsverfahren für das Ausgangsprodukt der Formel II
HO
CHo-N-C-0-CH~-C^H
HO
HO
NH
HO
HD
NH,
HO
gefunden. Dieses Verfahren umfasst die Behandlung der freien Base Kanamycin A mit N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid in einem Verhältnis von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 Mol N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid pro Mol Kanamycin A, wobei vorteilhafterweise ein Molverhältnis von 1:1 angewendet wird. Anschliessend wird gereinigt, z. B. durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, und Chromatographie der wässrigen Phase.
Die genannte Reaktion wird vorzugsweise durchgeführt in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, wobei die Konzentration des Tetrahydrofurans zweckmässig zwischen 40 und 60 % liegt. Man arbeitet dabei vorteilhaft im Temperaturbereich von 0 bis 25° C, insbesondere von + 5 bis -1- 10° C während höchstens 6 Stunden und insbesondere während ungefähr 4 Stunden.
Die Verbindung IV, l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A (BB-K8), besitzt ausgezeichnete antibakterielle Wirksamkeit, welche diejenige von Kanamycin A übertrifft. Dies wird illustriert in den beiden nachstehenden Tabellen, worin die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Kanamycin A und der Verbindung IV (BB-K8) gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien aufgezeichnet sind, wie sie erhalten werden mittels der Agar-Verdünnungsmethode nach Steer (Tabelle 1) und der Zweifach-Verdünnungsmethode (Tabelle 2). Das Agarmedium nach Müller-Hinton wurde für die Versuche der Tabelle 1 und die Infusionslösung nach Heart für die Versuche der Tabelle 2 verwendet.
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
617 441
8
Tabelle 1 (MIC mg/ml)
Organismus
Kanamycin A (6-8198)
Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4
Alk. faecalis
A-9423
16
8
Alk. faecalis
A-20648
>125
>125
Ent. cloacae
A-0656
4
4
Ent. species
A-20364
>125
2
Ent. hafniael
A-20674
1
1
E. coli
A-0636
2
1
E. coli
A-20664
16
4
E. coli
A-20665
>125
1
E. coli
A-20507
32
2
E. coli
A-20520
>125
4
E. coli
A-20365
>125
1
E. coli
A-2068+
2
2
E. coli
A-20682
>125
2
E. coli
A-20683
>125
8
E. coli
A-20681
>125
2
E. coli
A-15119
4
4
K. pneumoniae
A-0967
4
4
K. species
A-20328
>125
2
K. species
A-20330
32
32
K. species
A-20634
>125
4
K. pneumoniae
A-20680
>125
4
K. pneumoniae
A-0077
1
1
Pr. mirabilis
A-9900
2
2
Pr. morganii
A-15153
2
2
Pr. vulgaris
A-9555
2
1
Pr. rettgeri
A-9636
0,25
0,25
Pr. mirabilis
A-20645
4
4
Alk. faecalis
A-9423
16
8
Alk. faecalis
A-20648
>125
>125
Ent. cloacae
A-0656
4
4
Ent. species
A-20364
>125
2
Ent. hafniael
A-20674
- 1
1
E. coli
A-0636
2
1
E. coli
A-20664
16
4
E. coli
A-20665
>125
1
E. coli
A-20507
32
2
E. coli
A-20520
>125
4
E. coli
A-20365
>125
1
E. coli
A-20684
2
2
E. coli
A-20682
>125
2
E. coli
A-20683
>1"25
8
E. coli
A-20681
>125
2
E. coli
A-15119
4
4
K. pneumoniae
A-0967
4
4
K. species
A-20328
>125
2
K. species
A-20330
32
32
K. species
A-20634
>125
4
K. pneumoniae
A-20680
>125
4
K. pneumoniae
A-0077
1
1
Tabelle 1 (Fortsetzung) (MIC mg/ml)
Organismus
Kanamycin A (6-8198)
Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4
Pr. mirabilis
A-9900
2
2
Pr. morganii
A-15153
2
2
Pr. vulgaris
A-9555
2
1
Pr. rettgeri
A-9636
0,25
0,25
Pr. mirabilis
A-20645
4
4
Pr. mirabilis
A-20454
2
2
Providentia
stuartii
A-20615
2
1
Providencia
alkalifaciens
A-20676
1
1
Ps. aeruginosa
A-20229
32
2
Ps. aeruginosa
A-0943A
>125
16
Ps. aeruginosa
A-20653
>125
32
Ps. species
A-20601
>125, 63
16
Ps. species
A-20621
>125
>125
Ps. maltophilia
A-20620
32
>125
Sai. enteritidis
A-0531
1
0,5
Sai. derby
A-20087
>125
1
Ser. marcescens
A-20019
2
4
Ser. marcescens
A-9933
4
8
Ser. marcescens
A-20460
>125
4, 2
Ser. marcescens
A-20459
4
16
Shig. flexneri
A-9684
4
4
Aeromonas sp.
A-20670
2
2
Arizona sp.
A-20671
2
1
Citrobacter sp.
A-20673
4
4
Edwardsieila sp.
A-20678
4
4
Staph. aureus
A-9606
1
1
Staph. aureus
A-4749
0,5
1
Staph. aureus
A-9537
2
1
Staph. aureus
A-20610
>125
2
Staph. aureus
A-20240
>125
8
Staph. aureus
A-15197
1
2
Müller-Hinton-Medium + 4 %
Schafsblut
Str. faecalis
A-9854
63
63
Str. faecalis
A-9575
125
>125
Str. pyogenes
A-20200
32, 16
32
Str. pyogenes
A-9604
125
125
Str. pyogenes
A-15040
125
125
Str. pyogenes
A-20065
125
125
D. pneumoniae
A-9585
63, 32
63
D. pneumoniae
A-20159
125
>125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
9
617 441
Tabelle 2 (MIC mg/ml)
Organismus
Kanamycin A (6-8196)
Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4
D. pneumoniae
± 5 °/o Serum A-0585
63
63
Str. pyrogenes
± 5 % Serum A-9604
125
125
Staph. aureus
Smith
A-9537
0,5
0,5
Staph. aureus
A-9497
0,5
0,5
Staph. aureus
A-20239
125
4
Staph. aureus
A-20240
125
4
Enter. cloacae
A-0656
2
2
Enter. species
A-20364
125
2
K. pneumoniae
A-9867
2
4
E. coli
K-12 ML1410
A-20361
2
4
E. coli
K-12 ML1663
A-20363
125
2
E. coli
K-12
4-9632
2
1
E. coli
A-20664
32
8
E. coli
A-20665
125
8
Pr. mirabilis
A-9900
2
16
Pr. morganii
A-15153
4
16
Pr. vulgaris
A-9436
1
2
Ps. aeruginosa
A-20227
4
1
Ps. species
A-20499
63
4
Ps. aeruginosa
A-20653
125
4
Tabelle 2 (Fortsetzung) (MIC mg/ml)
Organismus
Kanamycin A (6-8196)
Verbindung IV (BB-K8) Ansatz Nr. 4
Ps. species
A-20621
125
125
Ser. marcescens
A-20019
2
4
Ser. marcescens
A-20141
16
16
Die vorstehenden MIC-Werte zeigen, dass die Verbindung IV (BB-K8) dem Kanamycin A in seiner Wirksamkeit überlegen ist und besonders gegenüber Kanamycin A resistenten Organismen.
Die erhaltenen MIC-Werte stimmen gleichfalls gut über-ein mit den in vivo-Resultaten für alle drei Organismen,
gegen welche Kanamycin A und die Verbindung IV getestet wurden.
Die Verbindung IV und Kanamycin A waren gleichfalls wirksam bei Infektionen von Mäusen, verursacht durch Ka-namycin-A-empfindliche Stämme von E. coli A-15119 und Staph, aureus A-9537. Obgleich die CDso-Werte (Heilungsdosis bei 50 °/o letal infizierten Mäusen) für Staph. aureus A-9537 den Anschein erwecken, dass die Verbindung IV leicht weniger aktiv ist als Kanamycin A, ist die erhaltene kleine Differenz möglicherweise nicht schlüssig, da die Dosisbeträge weit auseinander lagen (fünffache Verdünnung).
Gegenüber dem Kanamycin-resistenten Stamm von E. coli A-20520 erwies sich Kanamycin A in vivo wie erwartet nicht als sehr wirksam. Dagegen zeigt die Verbindung IV ausgesprochen gute Schutzwirkung. Die Verbindung IV war ungefähr zehnmal wirksamer gegenüber diesem Stamm von E. coli, wenn sie in Form einer vierstufigen Behandlung appliziert wurde, als wenn sie in zweistufiger Behandlung verabfolgt wurde.
Tabelle 3
Vergleich von in-vivo- und in-vitro-Wirksamkeiten der Verbindung IV und Kanamycin A
Verbindung
Test-
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Escherichia coli
Nummer
A-9537
A-15119
A-20520
MIC
DCsob
MIC
CDso
MIC
CD50
Verbindung IV
1
1
2,0 X 2
2
2X2
2
66 X 2
2
0
—
—
—
—
5X4
Kanamycin A
1
1
0,5 X 2
4
4X2
125
200 X 2
2
—
—
—
—
—
200 X 4
aMIC = Minimale inhibitorische Konzentration (ug/ml). Versuche gemäss Chisholm und Mitarbeiter (Antimicrob. Agents and Chemotherapy 1969, S. 244, 1970) unter Verwendung von Müller-Hinton-Agar als Testmedium.
bCD5o = Heilungsdosis in 50 °/o der Fälle (mg/kg, behandelt x Anzahl Behandlungen). Mäuse wurden subkutan behandelt nach einer und vier Stunden nach der Infektion, falls zweimalige Behandlung erfolgte sowie zu den Zeiten 0, 2, 4 und 6 Stunden nach der Infektion, falls viermalige Behandlung erfolgte. Weitere Aspekte des Testes sind dargestellt von Price und Mitarbeitern (Journal of Antibiotics 22:1,1969).
0— = Nicht getestet.
617 441
10
Die Verbindung IV dient als wertvolles antibakterielles Agens als Zusätze zu Viehfutter, als therapeutisches Mittel bei Mensch, Säugetier und Federvieh und ist insbesondere wertvoll bei der Behandlung infektiöser Erkrankungen, welche durch grampositive und gramnegative Bakterien verursacht werden. Oral verabreicht wird die Verbindung hier nützlich zur Hilfsbehandlung für präoperative Sterilisation der Eingeweide. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora der Eingeweide werden von diesem Mittel reduziert. Begleitet von einer geeigneten mechanischen Reinigungsoperation ist es nützlich zur Vorbereitung einer Dickdarmbehandlung.
Die Verbindung IV ist wirksam bei der Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen vermittels parenteraler Verabreichung im Dosisbereich von ungefähr 250 mg bis 300 mg/Tag in dreifacher oder vierfacher täglicher Unterteilung. Im allgemeinen erweist sie sich wirksam bei einer Dosierung von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden.
Im folgenden wird die Herstellung einiger Vor- und Zwischenprodukte (A—N) sowie Ausführungsformen des er-findungsgemässen Verfahrens (Beispiele 1—8) beschrieben.
A) 5-Norbornen-endo-2,3-dicarbonsäureanhydrid (XVIII) Die Herstellung dieser Substanz wurde ausgeführt nach dem Verfahren von O. Diels und K. Aider, Annalen 460, 98 (1928). Zu einer gerührten Suspension von 98,1 g = 1 Mol Maleinsäureanhydrid in 500 ml trockenem Benzol wurden tropfenweise 66,1 g = 1 Mol Cyclopentadien unter Kühlen hinzugefügt. Die Mischung wurde gerührt und ergab eine kristalline Fällung, welche abfiltriert und aus einem Gemisch von Ligroin (zur Hauptsache n-Hexan) und Benzol (1:1) umkristallisiert wurde. Erhalten wurden 116 g entsprechend 71 %> Ausbeute der oben erwähnten Substanz. Schmelzpunkt 164 bis 166° C (Schmelzpunkt in der Literatur 164 bis 165° C).
B) N-Hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dicarboximid (HONB) (XIX)
Die Herstellung wurde ausgeführt nach den Verfahren von L. Bauer und S. V. Miarka, Journal of Organic Chem-istry, 24,1293 (1959). 115 g = 0,7 Mol des Norbornen-anhydrids (XVIII) wurden hinzugefügt zu einer Lösung von Hydroxylamin, welches hergestellt wurde durch Zugabe von 47,5 g = 0,45 Mol Natriumcarbonat zu einer Lösung von 60,5 g = 0,87 Mol Hydroxylamin-hydrochlorid in 140 ml Wasser. Das Gemisch wurde während einer Stunde auf 60 bis 70° C erwärmt und hernach über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die entstandenen Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 120 ml kalter 5-n HCl und getrocknet. Erhalten wurden 84,9 g entsprechend 70 % Ausbeute der Substanz XIX mit dem Schmelzpunkt 172° C. Die Mutterlauge wurde angesäuert auf pH 2 und zehnmal mit je 70 ml Chloroform extrahiert. Eindampfen der Chloroformextrakte ergab einen zweiten Anteil der Substanz XIX von 7,2 g = 6 % Ausbeute. Schmelzpunkt 170 bis 172° C.
C) N-Hydroxy-5-norbomen-2,3-dicarboximidester von L-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybuttersäure (XX) 2,06 g = 0,01 Mol Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) wurden hinzugefügt zu einer gerührten, auf 10° C abgekühlten Lösung von 2,53 g = 0,01 Mol L-y-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybuttersäure und 1,79 g = 0,01 Mol der Substanz XIX in 50 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF). Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit THF gewaschen. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand im Gewicht von 4,5 g wurde aufgegeben auf eine Silicagelsäule und eluiert mit Äthylacetat, wobei 4,0 g, entsprechend 96 %> des aktiven Esters XX als farbloses öl erhalten wurden. IR-Spektrum: v = 3300,1820, 1780, 1735, 1720,1695 cm-1. NMR-Spektrum: (CDCls + 1 Tropfen DaO) ô (in ppm) 1,63 (2H, q, J=9 Hz), 2,15 (2H, m), 3,40 (6H, m), 4,60 (1H, d—d, J=7 und 5 Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, breit), 7,40 (5H, s).
D) N-Benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XVII)
Zu einer gerührten Lösung von 2,64 g = 0,066 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser wurden 3,58 g = 0,02 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XIX) bei 10° C hinzugefügt. Die Lösung wurde tropfenweise versetzt mit 6,82 g = 0,04 Mol B enzyloxycarb onylchlorld im Verlauf von 40 Minuten bei 0 bis 5° C und das Gemisch nachher vier Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemenge wurde versetzt mit 20 ml n-Hexan, wobei eine weisse Fällung entstand. Sie wurde abfiltriert und darauf getrocknet. Das Rohprodukt wurde umkristallisiert aus Ben-zol/n-Hexan und ergab 5,1 g entsprechend 81 %> Ausbeute an farblosen Prismen der Substanz XVII. Schmelzpunkt 121 bis 122° C. IR (KBr): v = 1810,1780, 1740, 1630 cm-'. NMR-Spektrum (Aceton-de): ô (in ppm), 1,66 (2H, breit s), 3,45 (4H, m), 5,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J=l,5 Hz), 7,48 (5H, s).
Analyse:
berechnet für C17H15NO5: C 65,17, H 4,83, N 4,47, gefunden: C 65,50, H 4,73, N4,44.
E) 6'-N-Benzyloxycarbonylkanamycin A (II) (6'-Cbz-Kanamycin A)
Zu einer gerührten Lösung von 4,84 g = 0,01 Mol der freien Base von Kanamycin A in 50 ml 50%igem wässrigem Tetrahydrofuran wurden 3,14 g = 0,01 Mol der Substanz XVII in verschiedenen Portionen im Verlauf von einer Stunde bei 7° C hinzugefügt. Die Mischung wurde weitere vier Stunden gerührt und hernach im Vakuum zur Entfernung des organischen Lösungsmittels eingedampft. Die verbliebene wässrige Lösung wurde verdünnt mit 150 ml Wasser und extrahiert mit zwei Portionen von je 100 ml wassergesättigten Butanols. Die Butanolschicht wurde gewaschen mit 100 ml Wasser und im Vakuum eingedampft, wobei 1,78 g Poly-Cbz-Kanamycin A zurückblieben. Die wässrige Schicht und die Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum nach ca. 50 ml eingeengt. Hernach wurde die wässrige Lösung auf eine Säule von «CG-50» Ionenaustauscherharz gegeben (NH4 + 140 ml). Die Säule wurde nacheinander versetzt mit 200 ml Wasser, 1,9 Liter 0,05-n NH4OH, 1,9 Liter 0,1-n NH4OH und schliesslich 1 Liter 0,3-n NH4OH. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von 20 ml und eingeteilt in die folgenden zwei Fraktionen auf Basis der Rf-Werte von Dünnschichtchromatogrammen (S-114, 6'-Cbz-Kana-mycin Rf 0,23, Kanamycin Rf 0,07). Die Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und der Rückstand über Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
Frak- Röhr- eluiert mit Menge Substanz tion chen- (Ausbeute)
Nr.
1 106—144 0,1-n NH4OH 3,44 g (56 %) 6'-Cbz-Kana-
mycin (II)
2 203—212 0,3-n NH4OH 0,54 g (11 •>/„) Kanamycyn zurückgewonnen
Das so hergestellte 6'-Cbz-Kanamycin (II) ist sehr rein
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
11
617 441
und erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie auf einer Silicagelplatte als homogen. Schmelzpunkt 217 bis 219° Celsius. Die physikalischen chemischen Eigenschaften der Substanz stimmen überein mit denjenigen einer authentischen Probe.
Beispiel 1
l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (BB-K8, IV) via Benzaldehyd-Schiffbase
Zu einer gerührten Lösung von 6,19 g = 0,01 Mol 6'-Cbz-Kananjycin (II) in 50 ml 50%igem Tetrahydrofuran wurden 3 ml = 0,03 Mol Benzaldehyd hinzugefügt. Das Gemisch wurde drei Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, hernach auf 5° C abgekühlt und dann behandelt mit einer Lösung von 4 g = 0,01 Mol der Substanz XX in 50 ml Tetrahydrofuran. Das Gemenge wurde eine Stunde lang bei 5° C gerührt, mit 6-n HCl auf den pH-Wert 2 eingestellt,
eine weitere Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt und hernach im Vakuum zur Vertreibung des organischen Lösungsmittels eingedampft. Die erhaltene wässrige Lösung wurde gewaschen mit 20 ml CH2CI2, worauf ihr pH-Wert mit 10°/oigem Ammoniak auf 4 eingestellt wurde. Anschliessend 5 wurde über Nacht hydriert mit 1,25 g 10°/oigem Palladium auf Kohle unter Atmosphärendruck bei Zimmertemperatur mit Wasserstoff. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit 20 ml Wasser gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt, ihr pH-Wert auf 8 mit 10%igem Ammoniak einge-10 stellt, worauf die Lösung aufgegeben wurde auf eine Säule von «CG-50» (NH4 + 200 ml), welche hernach eluiert wurde mit 0,4 Litern Wasser, 1,2 Liter 0,1-n NH4OH, 2,06 Liter 0,3-n NH4OH, 0,92 Liter 0,5-n NH4OH und schliesslich 1,2 Liter 1,0-n NH4OH. Das Eluat wurde gesammelt in Frak-15 tionen von je 20 ml, welche aufgrund des Rf-Wertes auf einer Silicagelplatte (610 Ninhydrin) sowie biologischer Tests unter Verwendung von B. subtilis PCI 219 und P. aerugenosa A 9843 in folgende Teile unterteilt wurden. Jeder dieser Teile wurde im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet.
Fraktion
Röhrchen Nr.
eluiert mit wässrigem NH4OH
Gewichtsausbeute
Ausbeute an biologisch aktiver Substanz
1
90—99
0,3-n
1603 mg (33 %)
1490 mg (30 o/o)1 Kanamycin zurückgewonnen BB-K 29
2
152—161
0,3-n
483 mg (8 0/0)
BB-K 29
3
162—169
0,3-n
376 mg (6 %)
196 mg (3 o/o)2 BB-K 29 + BB-K 8
4
170—197
0,3- bis 0,5-n
1877 mg (30 °/o)
1350 mg (23 o/0)2 BB-K 8 + BB-K 11
5
198—203
0,5-n
100 mg (2 o/»)
BB-K 11
6
238—257
1,0-n
146 mg (2 0/0)
Diacylverbindung
1 getestet mit B. subtilis PCI 219
2 getestet mit K. pneumoniae A 20680, welches sensitiv ist zu BB-K8 und hoch resistent zu Kanamycin BB-K 11 und BB-K 29.
Die Fraktion 4 im Gewicht von 1,877 g wurde aufgelöst in 10 ml demineralisiertem Wasser. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 10°/oiger Salzsäure auf 6 eingestellt, wonach die Lösung adsorbiert wurde an 15 ml einer «CG-50»-Säule (NH4 + -Form), die anschliessend eluiert wurde mit 100 ml 5Q 0,3-n NH4OH und 200 ml 0,5-n NH4OH. Das Eluat wurde gesammelt in Fraktionen von je 20 ml. Die Röhrchen Nr. 6 und Nr. 8 bis 17 waren Ninhydrin-positiv. Der Inhalt der Röhrchen Nr. 8 bis 17 wurde vereinigt und auf Vakuum auf ungefähr 1 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde behan- ^ delt mit 3 ml Methanol und anschliessend filtriert. Der
Filterrückstand wurde gewaschen mit 0,5 ml 75°/oigem wässrigem Methylalkohol. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, verdünnt mit zusätzlichen 10 ml Methylalkohol und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die amorphe Fällung wurde abfiltriert, das Filtrat geimpft, wobei farblose Kristalle der Substanz IV entstanden. Sie erwiesen sich als identisch mit einem authentischen Muster. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und lyophylisiert. Ausbeute und Test jeder dieser Fraktionen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
IV
Testergebnis gegen x paipigcuiiia gcgoii ;
B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis
Ausbeute amorphes Pulver
70 mg
737 ,t</mg
927 p/mg
0,9 »/o
1,1 %
Kristalle
1098 mg
1163 jtt/mg
1087 |tt/mg
19 »/o
19 0/0
lyophylisiertes Pulver
180 mg
608 ///mg
504 ,«/mg
1,9 0/0
1,6 0/0
BB-K 11 ist 3"-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kana-mycin A.
BB-K 29 ist 3-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kana-mycin A.
617 441
12
F) Herstellung von L-(—)-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VI)
7,4 g = 0,062 Mol L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybuttersäure wurden hinzugefügt zu einer Lösung von 5,2 g = 0,13 Mol Natriumhydroxid in 50 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise bei 0 bis 5° C im Verlauf von einer halben Stunde 11,7 g = 0,068 Mol Carbobenzoxychlorid hinzugefügt und hernach eine weitere Stunde lang bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gewaschen mit 50 ml Äther, sein pH-Wert auf 2 mit verdünnter Salzsäure eingestellt, worauf extrahiert wurde mit vier Portionen von je 80 ml Äther. Die Ätherextrakte wurden vereinigt, gewaschen mit einem geringen Anteil gesättigter Natriumchloridlösung, getrocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der verbliebene Rückstand umkristallisiert aus Benzol. Erhalten wurden 11,6 g entsprechend 74 °/o Ausbeute farbloser Plättchen mit dem Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5° C. [a]D = — 4,5° (c=2, CHsOH). IR-Spektrum in KBr: yc=0: 1740,1690 cm-1. NMR-Spektrum (Aceton do) ò (in ppm aus TMS) 2,0 (2H, m), 3,29 (2H, d—d, J=6,7 und 12 Hz), 4,16 (1H, d—d, J=4,5 und 8 Hz), 4,99 (2H, s), 6,2 (2H, breit), 7,21 (5H, s).
Analyse:
berechnet für C12H15NO5: C 56,91, H 5,97, N 5,53,
gefunden: C 56,66, H 5,97, N5,47.
G) N-Hydroxysuccinimidester von L-(—)-y-Benzyloxy-carbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VII)
Zu einer Lösung von 10,6 g = 0,042 Mol der Substanz VI und 4,8 g = 0,042 Mol N-Hydroxysuccinimid1 in 200 ml Äthylacetat wurde auf 0° C abgekühlt und hernach versetzt mit 8,6 g = 0,042 Mol Dicyclohexylcarbodiimid. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank gelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Filtrat auf ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Dabei entstanden farblose Kristalle der Substanz VII, welche abfiltriert wurden. Erhalten wurden 6,4 g, Schmelzpunkt 121 bis 122,5° C. Das Filtrat wurde zur Trockne im Vakuum eingedampft und der kristalline Rückstand gewaschen mit 20 ml Benzol/n-Hexan, wobei eine zusätzliche Menge der Substanz VII erhalten wurde. Die gesamte Ausbeute betrug 13,4 g (92 %>). [a]D = 1,5° (c=2, CHCls). IR (KBr) yc=0 1810, 1755, 1740, 1680 cm-1. NMR (Aceton-ds) <3 (in ppm aus TMS) 2,0 (2H, m), 2,83 (4H, s), 3,37 (2H, d—d, J=6,5 und 12,5), 4,56 (1H, m), 4,99 (2H; s), 6,3 (2H, breit), 7,23 (5H, s).
Analyse:
berechnet für C16H18N2O7: C 54,85, H 5,18, N 8,00,
gefunden: C54,79, H 5,21, N8,14,
54,70, 5,20, 8,12.
1 G. W. Anderson und Mitarbeiter, Journal of American Chemical Society, 86,1839 (1964).
H) Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid
23 g = 0,2 Mol N-Hydroxysuccinimid wurden aufgelöst in einer Lösung von 9 g = 0,22 Mol Natriumhydroxid in 200 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung wurden tropfenweise 34 g = 0,2 Mol Carbobenzoxichlorid unter Kühlung mit Wasser hinzugefügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt zwecks Abscheidung des Carbo-benzoxiderivates, welches abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet wurde. Ausbeute 41,1 g entsprechend 82%. Umkristallisieren aus Benzol/n-Hexan (10:1) ergab farblose Prismen, welche bei 78 bis 79° C schmolzen.
I) Herstellung von 6'-Carbobenzoxykanamycin A (II)
Eine Lösung von 42,5 g = 90 mMol der freien Base von Kanamycin A in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid (DMF) wurde auf 9° C abgekühlt und kräftig gerührt. Zu der Lösung wurden tropfenweise im Verlauf von ungefähr zwei Stunden 22,4 g = 90 mMol N-(Benzyloxy-carbonyloxy)-succinimid, gelöst in 500 ml DMF, hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei —10 bis 0° C über Nacht gerührt und hernach einen Tag lang weiter gerührt bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemenge wurde unter vermindertem Druck und unterhalb 50° C eingedampft. Der ölige Rückstand wurde aufgelöst in einem Gemenge von 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, wonach das Gemisch filtriert wurde zwecks Abtrennung unlöslichen Materials und schliesslich in zwei Schichten getrennt wurde. Butanol-und wässrige Schicht wurden behandelt mit 500 ml butanol-gesättigtem Wasser je zweimal und je zweimal mit 500 ml wassergesättigtem Butanol unter Verwendung einer Technik ähnlich der Gegenstromverteilung. Die drei wässrigen Schichten wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein öliger Rückstand verblieb. Ein Teil desselben kristallisierte beim Stehen bei Zimmertemperatur aus. Zum Rückstand zusammen mit den Kristallen wurden 100 ml Methanol hinzugegeben, worin sich das Öl auflöste und von den Kristallen abgetrennt wurde. Nach Zugabe von ungefähr 300 ml Äthanol wurde das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gehalten und ergab eine kristalline Masse, welche abfiltriert wurde. Sie wog 44 g. Das Produkt enthielt einen geringen Anteil an Kanamycin A, wie vermittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) und Ninhydrin als Sprühreagens nachgewiesen wurde.
Das Rohprodukt wurde aufgelöst in 300 ml Wasser und chromatographiert an einer Säule von 30 mm Durchmesser und 500 ml Volumen. Die Säule enthielt «CG-50»-Ionen-austauscherharz vom NH«i+-Typ. Die Säule wurde eluiert mit 0,1-n Ammoniumhydroxidlösung und das Eluat gesammelt in Fraktionen von je 10 ml. Das erwünschte Produkt war enthalten in den Röhrchen Nr. 10 bis 100, wogegen Kanamycin A sich in den langsamer laufenden Fraktionen befand und die Stellungsisomeren des Produktes in den schneller laufenden Fraktonen vorhanden zu sein schienen. Die Fraktionen 10 bis 110 wurden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Erhalten wurden 24,6 g = 45 °/o Ausbeute, farblosen 6-Carbobenzoxykanamy-cins A (II) (6'-Cbz-Kanamycin A). Die Substanz begann zu schmelzen und sich zu verfärben bei 204° C und zersetzte sich bei 212° C unter Gasentwicklung. [a]D = + 106° (c=2, H2O). Dünnschichtchromatographie auf Silicagel «F254» mit Ninhydrin ergab folgende Resultate:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
13 617 441
Rf-Wert
Lösungsmittel-System 6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A
n-PrOH-Pyridin-AcOH-HaO 0,42 0,33 0,15 0,04 (15:10:3:12) (Haupt- (Nebenteil) anteil)
Aceton-Ac0H-H20 0,24 0,14 (20:6:74)
CHCl3-Me0H-c.NH40H-H20 0,76 0,50 (1:4:2:1)
AcOMe-n-PrOH-C.NH4OH 0,22* 0,04* (45:105:60)
*Nachgewiesen mit Anthron-Schwefelsäure
Es erwies sich, dass das Endprodukt begleitet war von zwei kleineren Anteilen bei einem der für die Dünnschichtchromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme. Indessen wurde das Endprodukt ohne weitere Reinigung für die 20 Herstellung von BB-K8 (IV) verwendet.
K) Herstellung von L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B oder Gemischen davon 5,0 g Ambutyrosin A (US-Patent 3 541 078, veröffent- 25 licht am 17. November 1970) wurden am Rückfluss gekocht mit 160 ml 0,5-n Natriumhydroxid während einer Stunde. Das Hydrolysat wurde neutralisiert mit 6-n HCl und chro-matographiert an einer Säule von «CG-50» vom NH4+-Typ. Die erwünschte L-(—)-^-Amino-«-hydroxybuttersäure wurde 30 isoliert durch Entwickeln der Säule mit Wasser und Abtrennung des Wassers vermittels Gefriertrocknens. Die L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wurde charakterisiert als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5° C (vgl. Kolonne 2, Zeilen 31—38 des US-Patentes 35 Nr. 3 541 078).
L) Herstellung von L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus DL-a-hydroxy-y-phthalimidobuttersäure
A. Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-y- 40
phthalimidobutyrat
Zu einer Lösung von 25 g = 0,1 Mol 2-Hydroxy-y-phthalimidobuttersäure1 in 200 ml Äthanol wurde eine Lösung von 29 g = 0,1 Mol Dehydroabietylamin in 130 ml 4J Äthanol hinzugefügt. Die Lösung wurde kräftig eine Minute lang geschüttelt und hernach während 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen, während welcher Zeit feine Nadeln auskristallisierten. Die Kristalle wurden abfiltriert, gewaschen mit 50 ml Äthanol und an Luft getrocknet, wobei 30,1 g entsprechend 56 % Ausbeute eines Diastereomeren des 50 Dehydroabietylaminsalzes erhalten wurden. Schmelzpunkt
93 bis 94° C. [«] q4 = +15° (c=2,5, MeOH). Umkristallisieren aus 300 ml Äthanol ergab 23,2 g=43'°/o Ausbeute des reinen Produktes. Schmelzpunkt 94 bis 95° C. [a] ^ 55
= +10,8° (c=2,5 MeOH). Weiteres Umkristallisieren änderten den Schmelzpunkt und die spezifische Drehung nicht.
Analyse:
berechnet für C32H42N2O5 • H2O: C 69,54, H 8,02, N 5,07 gefunden: C 69,58, H 8,08, N5,07.
1 Y. Saito und Mitarbeiter, Tetrahedron Letters, 1970,
4863.
65
B) L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure Zu einer Lösung von 1,5 g = 0,014 Mol Natriumkarbonat in 40 ml Wasser wurden 5,3 g = 0,01 Mol Dehydro-
abietylammonium-L-a-hydroxy-y-phthalimidobutyrat und 60 ml Äther hinzugefügt. Das Gemisch wurde kräftig geschüttelt bis alle feuchte Substanz aufgelöst war. Die Ätherschicht wurde abgetrennt. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äther gewaschen und auf 15 ml unter vermindertem Druck eingedampft. Zum Konzentrat wurden 10 ml konzentrierte Salzsäure hinzugefügt und das Gemisch 10 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die abgeschiedene Phthalsäure abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde gelöst in 10 ml Wasser und die Lösung zur Trockne eingedampft. Diese Operation wurde zweimal wiederholt zwecks Entfernung überschüssiger Salzsäure. Der schliesslich verbliebene Sirup wurde aufgelöst in 10 ml Wasser und filtriert zwecks Entfernung eines geringen Anteils unlöslicher Phthalsäure. Das Filtrat wurde adsorbiert an einer Säule von «IR-120» (H + , 1 cm X 35 cm). Die Säule wurde gewaschen mit 300 ml Wasser und eluiert mit 1-n Ammoniumhydroxidlösung. Das Eluat wurde gesammelt in Fraktionen von je 15 ml Ninhydrin-positive Fraktionen 10 bis 16 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Dabei erhielt man einen Sirup, welcher allmählich auskristallisierte. Die Kristalle wurden verrieben mit Äthanol, filtriert und getrocknet in einem Vakuumexsiccator. Erhalten wurden 0,78 g entsprechend 66 % Ausbeute an L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure. Schmelzpunkt 206 bis
207° C. [a] = —29° (c=2,5 H2O). Das IR-Spektrum war identisch mit demjenigen einer authentischen Probe, welche aus Ambutyrosin erhalten worden war.
Beispiel 2
Herstellung von 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-tri-p-nitrobenzalkanamycin A (IIIc)
9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24° C, worauf 8,7945 g = 58,2 mMol p-Nitrobenzaldehyd hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde am Rückfluss gekocht. Dabei veränderte es sich in eine klare gelbe Lösung, aus welcher sich jedoch rasch eine weisse feste Substanz abzuscheiden begann. Das Gemenge wurde am Rückfluss drei Stunden lang erwärmt, hernach abgekühlt und das ausgefallene Produkt abfiltriert. Es wurde gewaschen mit ein wenig absolutem Alkohol. Die Ausbeute betrug 14,0 g entsprechend 94,5 % an weissen Kristallen. Schmelzpunkt 233 bis 234° C (unkorrigiert).
Analyse:
berechnet für C47H51N7O19: C 55,46 H 5,05 N 9,63
gefunden: C 55,39, H 5,08, N9,60.
617 441
14
Beispiel 3
Herstellung von l-N-(L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IV)
5,0 g = 4,91 mMol 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-tri-p-nitro- 5 benzalkanamycin A wurden gelöst in 50 ml Dimethylformamid bei 24° C. 2,064 g = 5,895 mMol L-(—)-j/-Benzyl-oxycarbonylamino-cHhydroxybuttersäure-N-hydroxysuccin-imidester wurden gelöst in 20 ml Dimethylformamid bei 24° C und die Lösung langsam unter kräftigem Rühren hin- m zugefügt zu der Lösung der Schiff'schen Base IHc im Verlauf von 75 Minuten. Die Lösung wurde über Nacht bei 24° C gerührt; unter Verwendung eines Dampfstrahlvakuums wurde die Lösung schliesslich bei 40° C zur Trockne eingedampft. Anschliessend wurde sie wiederholt, mit je 100 ml Methanol 15 zur Trockne eingedampft und ergab ein viskoses Öl. Das Öl wurde gelöst in 100 ml wässrigem Dioxan (1:1), wonach 10 ml Eisessig hinzugefügt wurden. Hernach wurde die Lösung eingebracht in einen Parrkolben von 500 ml zusammen mit 2,5 g 5°/oigem Palladium auf Kohle (Engelhard) und während 20 vier Stunden bei 24° C mit Wasserstoff von 3,2 Atmosphären reduziert. Der gesamte Druckabfall in dieser Zeit betrug im geschlossenen Gefäss 6,1 Atmosphären, wobei verschiedene Male der Druck erneuert wurde. Das Gemisch wurde filtriert durch ein Bett von Diatomeenerde, welches hernach dreimal 25 mit 50%igem wässrigem Dioxan gewaschen wurde. Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockne gebracht und azeotrop
In diesem Versuch betrug das Verhältnis von BB-K8 zu Kanamycin A 0,45.
Die nach diesem Verfahren erhaltene Verbindung IV war authentisch mit einem Produkt, welches erhalten wurde nach der in der amerikanischen Patentanmeldung Nr. 221 378 beschriebenen Methode. Schmelzpunkt 194° C (Zersetzung).
lalj} = + 85° (c=2, H2O). Die relative Wirksamkeit gegenüber B. subtüis (Agarplatte) = 960 fig/mg (Standard: Kanamycin A als freie Base).
Analyse:
berechnet für C22H43N5O13 • 2H2ÌCO3:
C 40,62, H 6,68, N9,87,
gefunden: C 40,21, H 6,96, N9,37,
39,79, 6,87, 9,49.
Beispiel 4
Herstellung des Monosulfats von l-N-[L-(—)-j>-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A
1 Mol l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamy- 60 ein A wurde gelöst in 1 bis 3 Litern Wasser. Die Lösung wurde filtriert zur Abtrennung allfälliger ungelöster Feststoffe. Zu der gekühlten Lösung wurde unter Rühren 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser, hinzugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, wonach kalter Äthylalkohol 6S hinzugegeben wurde, bis eine Fällung erfolgte. Die feste Substanz wurde abfiltriert und erwies sich als das gewünschte Monosulfat.
destilliert mit 100 ml n-Butanol und schliesslich wiederholt mit Methanol erneut zur Trockne eingedampft, wobei ein viskoses Öl entstand. Dieses wurde aufgelöst in 30 ml Methanol und langsam eingegossen in 1000 ml auf 5 bis 10° C gekühlten Diäthyläthers unter kräftigem Rühren. Nachdem die erhaltene Suspension eine halbe Stunde lang in einem Eisbad gerührt worden war, wurde die darin entstandene Ausfällung abfiltriert und sofort getrocknet in einem Vakuum-exsiccator über P2O5. Das erhaltene Gemisch wog 4,9620 g. Dünnschichtchromatographie zeigte, dass es zur Hauptsache aus der Verbindung IV, Kanamycin A und einigen Spuren von di- und trisubstituiertem Kanamycin A sowie aus 4-Amino-2-hydroxybuttersäure bestand.
Die verschiedenen Fraktionen wurden getrennt unter Verwendung einer Glassäule von 40 X 100 mm, gepackt mit «Amberlite IRC-50» (NH4+-Form, Typ I, 0,15—0,75 mm Korngrösse), worin ein Bett von ca. 980 mm Harz enthalten war. Die Säule wurde beladen mit 4,600 g des Rohgemisches, aufgelöst in 1 ml Wasser. Hernach wurde die Säule eluiert mit einem Gradienten von Wasser bis 2-n NH4OH, wobei das Eluat in Fraktionen von je 15 ml gesammelt wurde. Insgesamt wurden 295 Fraktionen erhalten. Anschliessend wurde die Säule gewaschen mit 1,5 Liter 3-n NH4OH. Die Fraktionen wurden vereinigt aufgrund der optischen Drehungen, wonach feste Anteile daraus vermittels Lyophylise isoliert wurden.
(IV) 33,5 "/o.
Beispiel 5
Herstellung des Disulfats von l-N-[L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybutyrylj-kanamycin A (BB-K8-2H2S04)
35 g l-N-[L-(—)-y-Amino-ß-hydroxybutyryl]-kanamycin A (als Monobicarbonattrihydrat), wurden gelöst in 125 ml entionisiertem Wasser. Dabei ergab sich ein pH-Wert von ungefähr 9,0. Der pH-Wert wurde erniedrigt auf 7,5 mit 50 Vol.-% wässriger Schwefelsäure.
8,5 g «Darco G-60» (Aktivkohle) wurden hinzugefügt, worauf das Gemenge eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur aufgeschlemmt wurde. Die Kohle wurde abfiltriert und gewaschen mit 40 ml Wasser. Die dabei erhaltene Waschlösung wurde dem Filtrat zugegeben.
In den vereinigten Lösungen wurde der pH-Wert mit 50 Vol.-°/oiger Schwefelsäure auf 2 bis 2,6 eingestellt. Dabei entwickelte sich eine grosse Menge Kohlensäure. Die Lösung wurde Hausvakuum während 20 Minuten angeschlossen, um zusätzliche Kohlensäure auszutreiben.
8V2 g «Darco G-60» wurden zu der entgasten Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur aufgeschlemmt. Hernach wurde die Kohle abfiltriert und mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wurde dem Filtrat zugefügt.
In den vereinigten Lösungen wurde der pH-Wert mit 50 Vol-°/oiger Schwefelsäure auf 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wurde unter raschem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumteile) hinzugegeben. Das Gemisch wurde fünf Minuten beim
Fraktion Nr.
Zusammensetzung
Gewicht Gramm
Rohgewicht Gramm
Biotest
Ausbeute %
120—150 201—224 228—241
Kana A BB-K29 BB-K8
1,1654 0,4000 0,6523
1,257 0,430 0,7036
809
786 ± 101*
42,6 19,2**
* Mittel von vier Plattentests ± Standardabweichung
** Unter Berücksichtigung der zurückgewonnenen Menge Kanamycin A betrug die Umwandlung in BB-K8
40
45
50
15
617 441
pH-Wert 1 bis 1,3 gerührt, hernach passiert durch ein Sieb mit 0,15 mm Maschenbreite, erneut während zwei Minuten gerührt und hernach 5 Minuten lang absitzen gelassen. Der Hauptteil der überstehenden Lösung wurde dekantiert. Die verbliebene Aufschlämmung wurde filtriert, gewaschen mit 200 ml Methanol und im Vakuum bei 50° C während 24 Stunden getrocknet. Die Ausbeute an amorphem BB-K8
99
(Dihydrogensulfat)a betrug 32 bis 34 g. [a] j-j H20 = + 74,74, Zersetzung bei 220 bis 223° C.
Elementaranalyse (bezogen auf Trockengewicht*)
o/oC 32,70, 33,50, 32,30, 33,50
o/oN 8,78, 8,70, 8,20, 8,80, 8,97
o/o S 8,75, 8,90, 7,80, 8,85, 8,20 o/o Asche keine
* Wassergehalt nach Karl Fischer: 2,33, 1,79, 2,87 % (theoretisch für das Monohydrat 2,25 o/„). Das Salz ist hygroskopisch, jedoch nicht zerfliesslich. Nach Lagern eines aliquoten Teils in Luft bei Zimmertemperatur während 18 Stunden stieg der Wassergehalt an auf 9,55 %, 9,89 % (theoretisch für das Pentahydrat 10,33 °/o).
M) l-N-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IV), nicht über den Weg des Schiffbase-Zwischenproduktes Zu einer gerührten Lösung von 1,36 g = 2,2 mMol 6'-N-Cbz-kanamycin (II) in 60 ml 50°/oigem wässrigem Tetrahydrofuran wurden tropfenweise 930 mg = 2 mMol des aktiven Esters XX in 10 ml Tetrahydrofuran im Verlauf von 30 Minuten bei Zimmertemperatur hinzugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und hernach hydriert mit 1,0 g 10°/oigem Palladium auf Kohle unter Atmosphärendruck bei Zimmertemperatur. Der Katalysator wurde abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft zur Abtrennung des organischen Lösungsmittels. Die erhaltene wässrige Lösung wurde passiert durch eine Säule von «CG-50» (NH4 + , 70 ml), die nacheinander pyridiert wurde mit 0,4 Litern Wasser, 0,5 Litern 0,1-n NH4OH, 0,5 Litern 0,3-n NH4OH, 1 Liter 0,5-n NH4OH und schliesslich mit 0,5 Litern 1-n NH4OH. Die Eluate wurden gesammelt in Fraktionen von je 20 ml und unterteilt auf Basis der Dünnschichtchromatographie-RF-Werte auf einer Silicagelplatte («S-110», Ninhydrin) sowie der Bioteste gegen B. subtilis PCI 219 und K. pneumoniae Typ 22 = 3038 A 20680. Jede dieser Teile wurde im Vakuum eingedampft und Iyophylisiert.
Beispiel 6
6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicylkanamycin A 9,0 g = 14,5 mMol 6'-Carbobenzoxykanamycin A wurden suspendiert in 500 ml absolutem Äthanol bei 24° C, worauf 58,2 mMol Salicylaldehyd hinzugegeben wurden. Das Gemisch wurde am Rückfluss erwärmt. Dabei veränderte es sich in eine klare gelbe Lösung und es begann sich daraus bald eine weisse feste Substanz abzuscheiden. Die Mischung wurde drei Stunden lang am Rückfluss gekocht, hernach abgekühlt und die ausgefallene feste Substanz abfiltriert. Hernach wurde gewaschen mit absolutem Äthanol. Der Schmelzpunkt nach Umkristallisieren aus einem Gemenge von Tetrahydrofuran-Methanol-Heptan 4:1:5 betrug nach dem Trocknen 196 bis 198° C.
Analyse:
berechnet für C47H54N4N4O16:
C 60,62, H 5,86, N6,02,
gefunden: C 58,67, H 5,73, N5,98.
Wassergehalt nach Karl Fischer: 2,45 %.
Analyse korrigiert für den Wasseranteil:
gefunden: C 60,14, H 5,60, N 6,13.
Beispiel 7
Herstellung von l-N-[L-(—)-j>-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A über das in situ Verfahren In einer geeigneten Vorrichtung wurden 1000 g = 1,074 Mol 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicyl-kanamycin A in 11,400 ml Tetrahydrofuran bei 22 bis 25° C aufgeschlämmt. Es wurden 600 ml Wasser unter Rühren hinzugefügt. Innerhalb 10 Minuten erfolgte eine klare Auflösung. In Form fester Substanzen wurden 181,5 g = 0,716 Mol 4-Benzyl-oxycarbonyIamino-2-hydroxybuttersäure und 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid zu der Lösung hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung lag im Bereich von 5,5 bis 6,0. Unter Einhalten einer Temperatur von 22 bis 25° C wurden 162,3 g = 0,787 Mol Dicyclohexylcarbodiimid, aufgelöst in 3000 ml trockenem Tetrahydrofuran, hinzugefügt. Die Aufschlämmung wurde 24 Stunden bei 22 bis 25° C gerührt und hernach auf 0 bis 5° C abgekühlt, wobei Dicyclo-hexylharnstoff während zwei Stunden auskristallisierte.
Der Harnstoff wurde abfiltriert und der Filterkuchen gewaschen mit 800 ml 95°/oigem wässrigem Tetrahydrofuran. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und in Volumen unter Vakuum auf eine Menge von 3000 ml eingeengt. Nun wurden 4000 ml Methanol hinzugefügt und das Volumen erneut im Vakuum auf 3000 ml reduziert.
Zu der so erhaltenen Lösung wurden 2000 ml absolutes Methanol bei 40° C hinzugegeben, worauf die Lösung bekeimt wurde mit 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicyl-kanamycin A und zwecks Kristallisierenlassens eine halbe bis eine Stunde lang abgekühlt wurde. Hernach wurden 2000 ml Wasser im Verlauf von einer halben Stunde unter guter Durchmischung bei ungefähr 22 bis 25° C hinzugegeben. Die Durchmischung wurde zwei Stunden lang fortgesetzt. Hernach wurde die Temperatur im Verlauf von einer Stunde auf 0 bis 5° C abgesenkt.
Abfiltrieren der festen Anteile und Waschen mit 900 ml kaltem wässrigem Methanol (2:1) und dann mit 800 ml Methanol waren die nächsten Schritte. Filtrate und Waschlösungen wurden beiseite gestellt. Der Filterkuchen besteht zur Hauptsache aus wiedergewonnenem 6'-Carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicylalkanamycin A.
Die Filtrate wurden verdünnt mit 1000 ml Wasser, anschliessend wurden 2000 ml Methylenchlorid hinzugefügt. Bei 25° C wurde der pH-Wert mit 6-n HCl auf 1,8 bis 3,0 reduziert. Dieser pH-Wert wurde eine halbe Stunde lang beibehalten.
Nun wurde die Methylenchloridschicht abgetrennt und die wässrige Phase mit zusätzlichen 2000 ml Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden beiseite gestellt, um daraus Salicylaldehyd wieder gewinnen zu können.
In der wässrigen Phase wurde der pH-Wert mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 3,5 bis 4,0 eingestellt. Diese Lösung wurde hernach bei Zimmertemperatur mit Wasserstoff in Gegenwart von 5%igem Palladium auf Kohle und bei 3,5 Atmosphären hydriert. Die Ausbeute am erwünschten Produkt erwies sich gemäss einem Biotest auf 30 bis 45 % der Theorie.
Beispiel 8
Herstellung der Verbindung IV unter Verwendung verschiedener Molprozente an N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid bei konstanten Molprozenten der anderen Reaktanten Werden anstelle von 0,12 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
617 441
16
2,3-dicarboximid (HONB) in der Arbeitsweise des Beispiels 7 verschiedene andere Molprozente dieser Verbindung verwendet, so erhält man die nachfolgenden Ausbeuten an der Verbindung IV:
Versuch Mol-°/o Ausbeute in %> Nr. HONB an Verbindung IV
1 0
2 2
3 10
4 50
5 100
Aus den obigen Resultaten ist ersichtlich, dass die Ver- 15 bindung IV bei kompleter Abwesenheit von HONB hergestellt werden kann. Gleichfalls kann daraus aber auch ersehen werden, dass die besten Ausbeutern an der Verbindung IV erhalten werden, wenn die Molprozente an HONB 10 bis 50 o/o des molaren Anteils an 4-Benzyloxycarbonylamino-2- 20 hydroxybuttersäure bei der Acylierungsreaktion betragen. Der genaue Mechanismus, vermittels welchem die Acylierung des blockierten Kanamycins A vor sich geht, ist unbekannt.
Indessen lässt sich beobachten, dass die Gegenwart von HONB in irgend einer Art bessere Ausbeuten bewirkt als die 25 zuvor erhaltenen.
N) Herstellung von l-N-[L-(—)-j/-Amino-a-hydroxybutyryl]f-kanamycin A (IV) 6'-Carbobenzoxy-l,3,3'-trisalicylalkanamycin A in einer Menge von 18,6 g — 20,0 Mol, hergestellt gemäss Beispiel 18, wurden aufgelöst in 55 ml Dimethylformamid bei 45° C. Zu dieser Lösung wurden 7,3 ml Wasser und 102 ml Aceton hinzugefügt. Die Lösung wurde auf ungefähr 25 e C abkühlen gelassen und hernach auf einmal versetzt mit 50 ml einer Lösung von Aceton und 9,9 Mol L-(—)-y-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-succinimidester. Das Reaktionsgemenge wurde bei ungefähr 20° C 40 Stunden lang gerührt. Nun wurden nacheinander 150 ml Wasser und einige Kristalle von 6'-Carbobenzoxy-l,3,3'-trisalicyl-alkanamycin A hinzugefügt und das Gemisch bei ungefähr
25° C eine Stunde lang und hernach drei Stunden lang bei
0 bis 5° C gerührt. Der Überschuss an nicht umgesetzter Salicylaldehyd-Schiffbase kristallisierte aus und wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit 60 ml50°/oigem wässrigem Aceton gewaschen. Dann wurde der Kuchen getrocknet und gewogen und ergab 9,4 g zurückerhaltener Schiff-sehe Base vom Schmelzpunkt (roh) 170 bis 185° C.
Das in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Filtrat wurde behandelt mit 40 ml Methylenchlorid und sein pH-Wert von 6,2 auf 2,0 erniedrigt zwecks Entfernung weiteren Ausgangsmaterials. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht extrahiert mit zweimal 40 ml Methylenchlorid. Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde auf 3,7 eingestellt und geringe Anteile Aceton und Methylenchlorid daraus im Vakuum entfernt. Die wässrige Lösung wurde hernach mit 3 g 5%iger Palladium auf Kohle als Katalysator bei 24° C während 15 Stunden und bei einem Druck von 3,0 Atmosphären mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert durch Diatomeenerde zwecks Entfernen des Katalysators. Dann wurde das Filtrat auf 100 ml Volumen gebracht. Eine Probe dieser Lösung von
1 ml wurde für Platten und Scheibentests abgezweigt. Der Plattentest ergab 1936 ng/ml an Verbindung V und der Scheibentest ergab 2325 /zg/ml, was einer Ausbeute von 33,4% an Endprodukt entspricht. Die verbliebenen 99 ml der Lösung wurden auf ein Volumen von ungefähr 30 ml eingeengt und durch eine Chromatographiesäule in der z. B. in Beispiel 14 vorbeschriebenen Weise hindurchgeschickt. Die vereinigten Fraktionen, welche die Verbindung IV enthielten, in einer Menge von 500 ml, wurden konzentriert auf ungefähr 20 ml, zu welchen 45 ml Methanol hinzugegeben wurden, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von ungefähr
25 ml Isopropanol zwecks Kristallisation des Produktes. Das kristalline Material wurde abfiltriert, gewaschen mit einem hälftigen Gemisch von Methanol und Isopropanol und getrocknet. Erhalten wurden 2,31 g von BB-K8, d. h. der Verbindung der Formel IV. Ein Plattentest der festen Substanz ergab einen Wirkungswert von 836 jitg/mg, entsprechend einer Reinheit von 83,6 % und einer tatsächlichen Ausbeute der reinen Verbindung der Formel IV von 33,3 %, bezogen auf 9,9 mMol des Ausgangsmaterials.
9,33 20,07 31,72 36,52 36,01
35
M
Claims (8)
- 617 441PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung derFormel ch2-nh2h2n sowie deren Salze, gekennzeichnet durch die VerfahrensschritteA) Umsetzung einer Verbindung der Formel hçh2-n-c!-o-ch2-c6h5H2NCH2-C6H510worin Z ein Rest der Formeln-N=C^^V-NC>2, -N=C- ^ v30H-N=C-
- /. \35H CHs I / -N=C-C—CHsCHsOCHs,undHO-N=C-oder40B) Behandeln der so erhaltenen Verbindung III mit einer Verbindung der FormelO45 f )] .N-O-C-CH-CHa-Cm-NH-C-O-CHs-CeHsOOIOHXX50mit Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, p-Methoxybenzaldehyd oder Pivaldehyd im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu mindestens 3 Molen Aldehyd zu einer Verbindung der Formel im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu mindestens 0,5 Mol der Verbindung XX und nachfolgende Hydrierung des Rückstandes in situ zur Verbindung der Formel IV.
- 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt A in einem der folgen-55 den Lösungsmittel: absolutem Äthanol, Methanol, n-Propan-ol, Methylenchlorid, Isopropanol, n-Butanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid oder Aceton bzw. Gemischen davon oder Gemischen davon mit Wasser, im Temperaturbereich von 5° C bis Rückflusstemperatur und während 30 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt wird, dass der Verfahrensschritt B ausgeführt wird bei —10 bis 35° C während mindestens einer Stunde in einem Lösungsmittel der für den Schritt A beschriebenen Art, worauf das organische Lösungsmittel abgetrennt und der Rückstand in situ hydriert wird mit Wasserstoff in Gegenwart eines der folgenden Metallkatalysatoren: Palladium, Platin, Raneynickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel, wobei in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und einem der60653617 441folgenden wasserlöslichen Lösungsmittel: Dioxan, Tetra-hydrofuran, Äthylglycoldimethyläther oder Propylenglycol-dimethyläther und bei einem pH-Wert von 3 bis 5 gearbeitet wird.
- 3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder Patentanspruch 5 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt A Benzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Nitrobenzaldehyd oder p-Methoxybenzaldehyd verwendet werden, und dass die Umsetzung bei einer Temperatur zwischen 5 und 40° C erfolgt, sowie dass im Verfahrensschritt B pro Mol der Verbin- 10 dung III 0,5 bis 1,0 Mol der Verbindung XX bei einer Temperatur von + 5 bis 35° C während 1 bis 3 Stunden umgesetzt werden.
- 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt A Benzaldehyd, 15Salicylaldehyd oder p-Nitrobenzaldehyd im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung II zu ungefähr 3 Molen Aldehyd verwendet werden, und dass im Verfahrensschritt B pro Mol der erhaltenen Verbindung III 0,5 bis 0,85 Mol der Verbindung XX bei einer Temperatur im Bereich von + 5 bis 30° C umgesetzt werden, sowie dass die Hydrierung bei einem pH-Wert von ungefähr 4 durchgeführt wird.
- 5. Verfahren nach Patentanspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt A die Verbindung II im Verhältnis von 1:3 Molen mit Benzaldehyd umgesetzt wird, wobei bei einer Temperatur von 20 bis 30° C, während 2 bis 4 Stunden und bei einem pH-Wert von etwa 10 gearbeitet wird, worauf die erhaltene Verbindung der FormelÏÎn="-{3lila in situ oder nach ihrer Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol lila zu 0,6 bis 0,75 Mol XX bei 20 bis 30° C während 1 bis 3 Stunden umgesetzt wird, wobei als Lösungsmittel eines der im Verfahrensschritt A verwendeten, ein Gemisch von Methylenchlorid, Methanol und Wasser oder ein Gemisch von Di-methylformamid, Aceton und Wasser verwendet wird, worauf das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemenge im Vakuum abgetrennt, der pH-Wert des Rückstandes mit4045Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt, und der Rückstand in situ mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle zur Verbindung IV hydriert wird.
- 6. Verfahren nach Patentanspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt A die Verbindung II im Verhältnis von 1:3 Molen mit Salicylaldehyd umgesetzt wird, wobei bei 20 bis 30° C, während 2 bis 4 Stunden und bei einem pH-Wert von etwa 8 gearbeitet wird, worauf die erhaltene Verbindung der Formel2 2 6 5Illb617 4414in situ oder nach ihrer Isolierung mit der Verbindung der Formel XX in einem Verhältnis von 1 Mol Illb zu 0,6 bis 0,75 Mol XX bei 20 bis 30° C während 1 bis 3 Stunden umgesetzt wird, wobei als Lösungsmittel eines der im Verfahrensschritt A verwendeten oder ein Gemisch von Dimethyl-formamid, Aceton und Wasser dient, worauf das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemenge im Vakuum abgetrieben, der pH-Wert des Rückstandes mit Ammoniumhydroxid auf 4 eingestellt und der Rückstand in situ mit Wasserstoff bei Atmosphärendruck in Gegenwart von Palladium auf Kohle zur Verbindung IV hydriert wird.
- 7. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt B die Verbindung der Formel XX in situ hergestellt wird durch Umsetzung der Verbindungen der Formeln VI und XIXO OII IIH-O-O-CH-CH^CHa-NH^C-O-CHa-CeHs und OHVIN-OH1015XIXdie umgesetzt werden mit der Verbindung der Formel III im Verhältnis von 1 Mol der Verbindung III zu 0,5—0,1 Mol der Verbindungen VI und Cyclohexylcarbodiimid sowie 0,05 bis 0,25 Mol der Verbindung XIX, unter Verwendung eines Lösungsmittels gemäss Verfahrensschritt A von Anspruch 1, wobei bei einer Temperatur von 5 bis 25° C während 1 bis 3 Stunden gearbeitet wird.
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