DK142991B - Fremgangsmaade til fremstilling af 1-(l-(-)-gamma-amino-alfa-hydroxy-butyryl)-kanamycin a, eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

I ρ9 I

\r&/ (11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 142991 DANMARK (bi) in«.ci.3 c 07 h 15/22 «(21) Ansegning nr. 591 6/74 (22) Indleveret den 1 5 · DOV · 1 9 74 (24) Løbedeg 15» HOV. 1974 (44) Ansegningen fremlagt og p fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 9* ®8Τ· ' yc r

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

14. nov. 1975» 415589, US

25. maj 1974, 472780, US

(71) BRISTOL-MYERS COMPANY, 545 Park Avenue, New York, N.Y. 10022, US.

(72) opfinder: Takayuki Naito, 4-24-19, Nishi-shinjuku, Shinjuku-ku, Tokyo, JP: Susumu Nakagawa, 1-14-7, Nakai, Shinjuku-ku, Tokyo, JP: MasaMsa Oka, 2-15-1H, Shimo-meguro, Meguro-ku, Tokyo, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Th. Ostenfeld Patentbureau A/s.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af 1 -(L-(-)-gamma-amino-alfa-hydroxy-bu= tyryl)-kanamycin A, eller syreadditionsealte deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en sarlig fremgangsmåde til fremstilling af 1-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A

(IV), der er en kendt forbindelse med formlen: 6’ 41 CH2NH2 HO-K 1 W5« K0 Λ_^ nh2 6? vs HO^CJO« H2M\h 7x\ /

2 5 S’/Atl'· / HO-CK

° J/ ψ2.

CEy-NHg eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

2 142991

Kanamycin A besidder fire primære aminfunktioner ved 1, 3, 6' og 3" stillingerne i molekylet. Det er fastslået, at 6'-aminfunktionen er den mest reaktive, og at 1-aminfunktionen har den næststørste reaktivitet ved behandling med et elektrophilt middel. Både 3 og 3" stillingerne er mindre reaktive end både 1- og 6'-aminfunktionerne, men reagerer med acyleringsmidler til dannelse af materialer med ringe indhold af uønskede acylerede materialer.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3461/72 er det kendt at fremstille 1-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A eller B ved at man blokerer aminogruppen på 61-carbonatomet i kanamycin A eller B, derefter selektivt acylerer aminogruppen ved 1-stillingen med et derivat af L-(-)-γ-amino-a-hydroxy-smørsyre, hvori aminogruppen er beskyttet, og endelig fjerner de beskyttende grupper fra såvel 6'-stillingen som substituenten i 1-stillingen. Når denne kendte fremgangsmåde anvendes til fremstilling af kanamycin A derivatet (IV), kan der på grundlag af eksempel 3 i den nævnte ansøgning beregnes et totaludbytte på ca. 10% i forhold til den anvendte mængde af udgangsmaterialet kanamycin A.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af den omhandlede forbindelse (IV) hvorved der kan opnås udbytter på over 30%.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 593/74 skal det endvidere anses for kendt at fremstille den omhandlede forbindelse (IV) ved at man først omdanner 6-carbobenzoxy-kanamycin A (II) til en Schiff-base (III) og derefter behandler sidstnævnte med N-hydroxy-succinimidesteren af L-(-)-γ-benzyl-oxycarbonylamino-ct-hydroxysmørsyre (VI). Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse bygger på denne teknik, men adskiller sig ved at der anvendes en anden N-hydroxyimidester af syren (VI).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter således at man (A) behandler 6-carbobenzoxy-kanamycin A med formlen 3 142991 B0^ H0 ώ_ 13¾ V^=A/ HO 1/ o

II

med benzaldehyd, salicylaldehyd, p-nitrobenz-aldehyd, p-methoxybenzaldehyd eller pivaldehyd, idet der anvendes mindst tre mol aldehyd pr. mol forbindelse II, til fremstilling af forbindelsen med formlen H ? CH^-Pf-C-O-CHl-CrHc-EO \ “it, /

III

4 142991 hvor Z er en gruppe med formlen JJ JJ _ ‘ pj -h=c-/^-Ho2 , -*c-Q , -n-c-(^^_och3 , hHX h /“3 -"-'O eller-N-c ' c ~ , CH, hvorpå man (B) behandler forbindelsen med formlen III in situ eller efter isolering med en N-hydroxyimidester af syren med formlen 0 ?

ii II

H0-C-CH-CH2“CH2-NH-C-0-CH2-C6H5

OH

VI

hvorefter det derved dannede produkt hydrogeneres in situ til fremstilling af forbindelsen med formel IV, der om ønsket omdannes til et farmaceutisk anvendeligt salt deraf, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at N-hydroximid-esteren af nævnte syre eventuelt dannes in situ, og at den har formlen

O Q

{^ΥΛ - 0-C-CH-CH2-CH2-NH-C-0-CH2-CgH5 0

XX

og at der anvendes mindst 0,5 mol af forbindelse XX pr. mol forbindelse III, eller, når forbindelse (XX) dannes in situ, at den dannes i en mængde, som svarer til mindst 0,5 mol pr. mol forbindelse (III).

5 142991

Specielt udføres trin A fortrinsvis i et vandblandbart opløsningsmiddel såsom et alkoholisk opløsningsmiddel, f.eks. absolut ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol, et etheropløsningsmiddel, f.eks. tetrahydrofuran, di-oxan eller andre polære aprote eller ikke-aprote opløsningsmidler såsom f.eks. dimethylformamid og acetone eller blandinger deraf, eller blandinger deraf med vand,ved en temperatur i intervallet fra ca. 5°C til ca. tilbagesvalingstemperatui> fortrinsvis 5-40°C, i et tidsrum på fra ca. 30 minutter til ca. 5 timer.

Trin B udføres fortrinsvis med et forhold mellem forbindelse III og forbindelse XX på ca. 1:1, mere fortrinsvis 0,5 - ca. 1,0 mol XX pr. mol III, ved en temperatur i intervallet fra ca. -10°C til ca. +35°C, og fortrinsvis i et interval på fra +5°C til ca. 25°C, i et sådant tidsrum at acyleringen er løbet tilende, men i mindst 1-3 timer, hvorpå det organiske opløsningsmiddel fjernes før hydrogeneringen. Hydrogeneringen in situ udføres med hydrogen i nærværelse af en metalkatalysator i form af palladium, platin,

Raney nikkel, rhodium, ruthenium eller nikkel, men fortrinsvis palladium, og især palladium på trækul i vand eller et vand-vand-blandbart opløsningsmiddelsystem i form af vand og dioxan, tetrahydrofuran, ethylenglycoldimethylether, propylenglycoldimethylether og lignende, men fortrinsvis i vand ved en pH-værdi på 3 - 5, og fortrinsvis 4.

Ifølge et udførelseseksempel af fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandler man under trin (A) forbindelsen II med benzaldehyd, salicylaldehyd eller p-nitro-benzaldehyd,hvorved der under trin (B) fortrinsvis anvendes 0,5 til 0,85 mol forbindelse XX pr. mol forbindelse III, ved en temperatur på 15 - 30°C i 1 - 3 timer, i et opløsningsmiddelsystem som beskrevet ovenfor under trin A.

Ifølge et andet udførelseseksempel behandler man (A) forbindelsen II med benzaldehyd, idet der anvendes 3 mol benzaldehyd pr. mol forbindelse II, i en ca. 1:1 blanding af vand og tetrahydrofuran, ved ca. 20 - 30°C og ved en pH-værdi på ca. 10 i ca. 2-4 timer, til fremstilling af forbindelsen med formlen 6 142991 H il

“*1_^ «-O

ho— :h2oh\vJ

Ησ I / og

Ilia hr B) behandler forbindelse Ilia in situ eller efter isolering med forbindelsen med formlen XX, idet der anvendes 0,6 - 0,75 mol forbindelse XX pr. mol forbindelse Illa, ved en temperatur på ca. 20 - 30°C i et tidsrum på 1 - 3 timer, i et opløsningsmiddel som omhandlet under trin A), en blanding af methylenchlorid, methanol og vand eller en blanding af dimethylformamid, acetone og vand, hvorpå det organiske opløsningsmiddel fjernes i vakuum, pH-værdien indstilles til 4 med ammoniakvand, og remanensen hydrogeneres insitu med hydrogen ved atmosfæretryk i nærværelse af palladium-på-carbon til fremstilling af forbindelsen med formel IV.

Ifølge yderligere et udførelseseksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen behandler man forbindelsen med formlen II med salicylaldehyd, idet der anvendes 3 mol salicylaldehyd pr. mol forbindelse II, i en ca. 1:1 blanding af vand og tetrahydrofuran ved ca. 20 - 30°C og ved en pH-værdi på ca. 8 i ca. 2-4 timer, til fremstilling af forbindelsen med formlen 7 142991

O

HO-^. CH2-N-i-0-CH2-CgH5 ηοΛ_Λ HO

h N=C~f J

HO—CH.OH \ q-^7^ OH HO ] / rr og

Hib B) behandler forbindelse Illb in situ eller efter isolering med forbindelsen med formlen XX, idet der anvendes ca. 0,6 - 0,75 forbindelse XX pr. mol forbindelse Illb, ved en temperatur på ca. 20 - 30°C i et tidsrum på 1 - 3 timer og i et opløsningsmiddel som omhandlet under trin A) eller en blanding af dimethylformamid, acetone og vand, hvorpå det organiske opløsningsmiddel fjernes i vakuum, pH-værdien indstilles til 4 med ammonium-hydroxid, og remanensen hydrogeneres in situ med hydrogen ved atmosfæretryk i nærværelse af palladium-på-carbon til fremstilling af forbindelsen med formel IV.

Ifølge en foretrukken udførelsesform af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse dannes forbindelsen med formel XX in situ og omsættes direkte med forbindelsen med formel III i ét trin. Herved opnås de samme fremragende udbytter af forbindelsen med formel IV, og man undgår at isolere forbindelsen med formel XX. Denne udførelsesform er ejendommelig ved at forbindelsen med formlen XX dannes in situ ved omsætning af forbindelser med formlerne 8 U2991 1 s H-0-C-CH-CH2-CH2-NH-C-0-CH2-C6H5

OH

VI

og hvorefter dicyclohexylcarbodiimid tilsættes, idet der anvendes 0,5 - 1,0 mol af både forbindelse VI og dicyclohexylcarbodiimid og ca. 0,005 til 0,425 mol forbindelse XIX pr. mol forbindelse III.

Der anvendes fortrinsvis en temperatur i intervallet fra ca. -10°C til ca. +35°C, men fortrinsvis fra ca. 5 til 25°C i mindst 10 timer i et opløsningsmiddelsystem som beskrevet ovenfor under trin A), hvorpå det organiske opløsningsmiddel fjernes, og remanensen hydrogeneres in situ som beskrevet ovenfor til fremstilling af forbindelsen med formel IV.

Et eksempel på ovennævnte udførelsesform omfatter anvendelsen af 0,5 til 0,85 mol af både forbindelse VI og dicyclohexylcarbodiimid og ca. 0,05 til 0,425 mol af forbindelse XIX pr. mol forbindelse III ved en temperatur på 5 - 25°C i 1 - 3 timer i et opløsningsmiddelsystem som beskrevet under trin A), eller alternativt anvendes 0,5 til 0,8 mol af både forbindelse VI og dicyclohexylcarbodiimid og ca. 0,05 til 0,425 mol forbindelse XIX pr. mol forbindelse III ved en temperatur på 15 - 30°C i 15 - 25 timer. Det foretrækkes mest at anvende ca. 0,6 til 0,75 mol af både forbindelse VI og dicyclohexylcarbodiimid og ca. 0,06 til 0,375 mol forbindelse XIX pr. mol forbindelse III ved en temperatur på 20 - 30°C i 15 - 25 timer.

Til fremstilling af udgangsmaterialet med formlen 142991 9 Η 9 CH-'-N-'t-0-CH-”“Cf-Hc "Vi.

“Τή, i_ «*2

Hn f 2°« H0^^\ nN—o ^v_nh2 Ησ ii kan man behandle fri kanamycin A base med N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarbox-imid, idet der anvendes ca. 0,5 til 1,5 mol N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, eller specielt 1 mol deraf pr. mol kanamycin A, hvorefter man renser produktet, for eksempel ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel såsom n-butanol og kromatografi af den vandige fase.

Den ovennævnte reaktion udføres fortrinsvis i et vandigt-vand-blandbart organisk opløsningsmiddelsystem s&som f.eks. tetrahydro-furan-vand, fortrinsvis indeholdende 40 - 60% tetrahydrofuran,ved en temperatur på 0 - 25°C,eller fortrinsvis 5 - 10°C, i højst 6 timer, men fortrinsvis i ca. 4 timer.

Forbindelse IV, 1-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxy-butyryl]kanamycin A (BB-K8) besidder fremragende antibakteriel aktivitet, som er højere end aktiviteten af kanamycin A. De to tabeller neden for belyser de minimale inhibitoriske koncentrationer (MIC) af kanamycin A og forbindelse IV (BB-K8) imod et antal forskellige gram-positive og gram-negative bakterier, hvilke MIC-værdier er opnået ved hjælp af Steers Agar fortyndingsmetode (Tabel I) og dobbeltfortyndingsmetoden (Tabel II).Mueller-Hinton Agar Medium anvendtes ved undersøgelsen i Tabel I og hjerteinfusionsvæske anvendtes ved undersøgelsen i Tabel II.

10 142991

Tabel X (MIC-værdier mg/ml)

Forbindelse IV

Organisme Kanamycin A [BB-K8] (6-8198) prøve nr. 4

Alk. faecalis A-9423 16 8 " " A-20648 >125 >125

Ent. cloacae A-0656 4 4 " species A-20364 >125 2 " hafniae 1 A-20674 1 1 E. coli A-0636 2 1 " " A-20664 16 4 " " A-20665 >125 1 " " A-20507 32 2 " " A-20520 >125 4 " " A-20365 >125 1 " " A-20684 2 2 " " A-20682 >125 2 " " A-20683 >125 8 " " A-20681 >125 2 " " A-15119 4 4 K. pneumoniae A-0967 4 4 " species A-20328 >125 2 " " A-20330 32 32 " " A-20634 >125 4 " pneumoniae A-20680 >125 4 " " A-0077 1 1

Pr. mirabilis A-9900 2 2

Pr. morganii A-15153 2 2 " vulgaris A-9555 2 1 " rettgeri A-9636 0,25 0,25 " mirabilis A-20645 4 4 " " A-20454 2 2

Providencia stuartii A-20615 2 1 " alkalifaciens A-20676 1 1 11 142991

Tabel I (fortsat)

Forbindelse IV

Organisme Kanamycin A [BB-K8] (6-8198) prøve nr. 4

Ps. aeruginosa A-20229 32 2 " " A-0943A 125 16 » « A-20653 >125 32 " species A-20601 125, 63 16 " " A-20621 >125 >125 " maltophilia A-20620 32 >125

Sal. enteritidis A-0531 1 Of5 " derby A-20087 >125 1

Ser. marcescens A-20019 2 4 Η π A-9933 4 8 " " A-20460 >125 4, 2 " " A-20459 4 16

Shig. flexneri A-9684 4 4

Aeromonas sp. A-20670 2 2

Arizona sp. A-20671 2 1

Citrobacter sp. A-20673 4 4

Edwardsiella sp. A-20678 4 4

Staph, aureus A-9606 1 1 " " A-4749 0,5 1 " " A-9537 2 1 " " A-20610 >125 2 " " A-20240 >125 8 " " A-15197 1 2

Mueller-Hinton medium + 4% fåreblod

Str. faecalis A-9854 63 63 " " A-9575 125 >125

Str. pyogenes A-20200 32, 16 32 " " A-9604 125 125 " " A-15040 125 125 " " A-20065 125 125 D. pneumoniae A-9585 63, 32 63 " " A-20159 125 >125 12 142991

Tabel II (MIC-værdier mg/ml)

Forbindelse IV

Organisme Kanamycin A [BB-K8] (6-8196) prøve nr. 4 D. pneumoniae -5% serum A-0585 63 63

Str. pyrogenes +5% serum A-9604 125 125

Staph, aureus Smith A-9537 0,5 0,5 " " A-9497 0,5 0,5 " " A-20239 125 4 " " A-20240 125 4

Enter.cloacae A-0656 2 2

Enter.species A-20364 125 2 K. pneumoniae A-9867 2 4 E. coli K-12ML1410 A-20361 2 4 E. coli K-12 ML1630 A-20363 125 2 E. coli K-12 A-9632 2 1 E. coli A-20664 32 8 E. coli A-20665 125 8

Pr. mirabilis A-9900 2 16

Pr. morganii A-15153 4 16

Pr. vulgaris A-9436 1 2

Ps. aeruginosa A-20227 4 1

Ps. species A-20499 63 4

Ps. aeruginosa A-20653 125 4

Ps. species A-20621 125 125

Ser. marcescens A-20019 2 4 " " A-20141 16 16

De ovenstående MIC-værdier viser, at forbindelse IV (BB-K8) har større aktivitet end kanamycin A, især imod kanamycin A-resistente organismer.

MIC-værdierne stemmer også godt overens med de resultater, der opnåedes ved in vivo afprøvning af kanamycin A og forbindelse IV mod tre organismer.

Forbindelse IV og kanamycin A var lige effektive over for infektioner hos mus fremkaldt af kanamycin A-følsomme stammer af E. coli A-15119 og Staph, aureus A-9537. Skønt CD5Q-værdierne (helbredende dosis hos 50% af letalt inficerede mus) med hensyn til Staph, aureus 13 142991 A-9537 antyder, at forbindelse IV er en smule mindre aktiv end kanamycin A, er denne lille forskel sandsynligvis ikke signifikant, fordi dosiskoncentrationerne lå langt fra hinanden (5 x fortynding).

Kanamycin A var som forventet ikke særligt effektiv in vivo imod kanamycin-resistente stammer af E. coli A-20520, hvorimod forbindelse IV udviste en betydelig beskyttende virkning. Forbindelse IV var ca. 10 gange mere aktiv imod denne E. coli stamme indgivet ved en 4-behandlingskur end ved en 2-behandlingskur.

14 142991 i ri* cm *tf I cm "tf

-ri I

G Η o XXI XX

H O m I

00 q vo m l o o — o vo i o o σ'

S Ø 1 es CM VD

ø -ri o I

G x! CM -ri I · H

la om *d i ‘H i in ·

3 -Η O U I <0 · 0 0 H

G cm (B I 33 ·3 ··

bl Φ I > I -P P 0 CM

O X! <H I I <U OJG-PcmI

O O I > 0> o -P

►> tn h cm i i m ø o G &> > in HK s I CM I Η Γ' H G G 0

IH 34 O Η H 0 H

<D i in Η H 33 -P

m I 0 G Ό O

H I λ - as G Vi H

0) I "tf Λ (ti CD 33

-o I g -tf 0 3S O’ H

G I O CM Λ <D G +>

-Η i in Λ h G

Λ-rt CM I CM <1> ih 1 H si uh o i en Ό ø cm Ό

o O m XII XI ω·Η GH

IH O Q I f* W 2 0 n cm I "tf H ø °ø 35 ih id I -a ' -P C (U · « -H en I Η σι G 33 hi 35 Η Η I ”3 co O * I ^ H o h *3 i GO'rvS-tf

(D-rimH I H s (UH

c» HH « i ® i g «μ G Øl *> I G >1H 0 O »ø

H Ært! I I H ftO Η H C -P

GO O I 0 ø 0 *3 -P 0 x m H CM I I "tf I > H g G 34 ^ UB g I -a 0 0 ø 0 G 0

Η I M 35 > 33 H 0 O

S I ft -P "a 0 G G H

^ I O Η Λ Η o H

η I · B ft \ -Hft

> I 0 tr> Η -P

π I ri f! g Λ! (D>!ih > I g O O \ -P 0 ø cm i cm \ a Ιριηή

G i 0^3 g 0 G -P

η 33 X IX ^-5 £ t 'H S! H O I "“Ίΰ IB P > HH in m oil mi &> 0 ø p ø ho i > o * i *· G in ø G g ø h u om O cm ίο O -P 0 H -P 34 HO om i HGGrd+>lHin ø u om I ΐί Ϊ. 2 ω 2 ojj οι Η I ni IjiP SI tf Λ ØH O "3 I *1 ^ 5 w, m ei E-I>H Η I ΐί m J S1 2 i >10 g I G·® -ri ogo C 35 3 > I 0 33 I -P -rim

•H & 0 Øl I OOH H+J

ία Η O O I CHØCH 0

u_i 11 3 H Hil CM I OUHØ+IVOG

ίο ω ø s i i gø # 0 tilø tn I ØH3O4J0> g I ^4 -P g m 3 -a

Η I w G 34 "tf H

G I Η < H H pQ ft Η · I P 0 3 **

HU I o in 10 CM ID

HG i -P - ø -H 0 G i h · in in tn *·+) m ø H CM I H CM 33 Η H O 0 O P · C £> I HØØOrO'S+l a £ i 35 *3 ø ton ø 5 u I G -P G 0ΗΟΌ > en α I H 0 0 >3 *3 3 ·&

I ^ G G * M

i øgGØøtn-Pft

> 1 HHØOXiØOllH

Η I 00 00*3 Hø

u I g 35 P P 33 0 P

ø 0 | rtj H W 0 33 -P > 0 m tn i GH'øHtn-p'a.x H H IC H 3) G 0 3 >1 34

0 0 IH gU3 35 S G H H

*3 *3 10

G G I >i II II II

H Hig O

n 33 i ø O m H P I g ΰ 9 .

O Olø S U I

pt, ft I W ø 33 O

15 142991

Forbindelse XV er værdifuld som antibakterielt middel, profylaktisk tilskud i dyrefoder, terapeutisk middel for fjerkræ, pattedyr og mennesker og er især værdifuld ved behandlingen af infektionssygdomme forårsaget af gram-positive og gram-negative bakterier.

Forbindelse IV er ved oral indgivelse nyttig ved en behandling til præ-operativ sterilisation af indvoldene. Mængden af både aerob og anaerob flora, som er følsom over for dette middel, formindskes i tyktarmen. I forbindelse med passende mekanisk rensning er anvendelsen af forbindelse IV nyttig ved forberedelsen til tyktarmskirurgi.

Forbindelse IV er effektiv til behandling af systemiske bakterielle infektioner hos mennesker ved parenteral indgivelse i en mængde på ca. 250 - 3000 mg pr. dag delt op i doser tre eller fire gange om dagen. I almindelighed er forbindelsen effektiv ved indgivelse i en dosis på ca. 5,0 - 7,5 mg/kg legemsvægt hver 12. time.

I det følgende belyser eksempel 1-9 fremstillingen af udgangsmaterialer, mens eksempel 10 - 14 belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 5-norbornen-endo-2,3-dicarboxylsyreanhydrid (XVIII).

Forbindelsen fremstilledes i overensstemmelse med den af O. Diels og K. Alder , Ann. 460, 98 (1928) beskrevne metode. Til en omrørt suspension af 98,1 g (1 mol) maleinsyreanhydrid i 500 ml tør benzen sattes dråbevis 66,1 g (1 mol) cyclopentadien under afkøling. Blandingen omrørtes til dannelse af en krystallinsk udfældning, som opsamledes ved filtrering og rekrystalliseredes fra ligroin (i alt væsentligt n-hexan)-benzen (1:1) til dannelse af 116 g (71%) af det omhandlede produkt, der havde et smeltepunkt på 164-166°C (ifølge litteraturen 164-165°C).

Eksempel 2 N-hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dicarboximid (HONB) (XIX).

Den omhandlede forbindelse fremstilledes på den af L. Bauer og S.V. Miarka, J. Org. Chem., 24, 1923 (1959) omhandlede måde. Norbornen-anhydridet (XVIII), (115 g, 0,7 mol) sattes til en opløsning af hy-droxylamin fremstillet ved at sætte 47,5 g (0,45 mol) natriumcarbonat til en opløsning af 60,5 g (0,87 mol) hydroxylamin,hydrochlorid i 140 ml vand. Blandingen opvarmedes ved 60-70°C i 1 time og henstod natten over i køleskab. Krystallerne opsamledes ved filtrering, vaskedes med 120 ml kold 5 N HC1 og tørredes til dannelse af 84,9 g 16 142991 (70%) af forbindelse XIX smeltende ved 172°C. Moderluden syrnedes til pH 2 og ekstraheredes med CHCI3 (70 ml x 10). Inddampning af CHC13~ ekstrakterne gav en anden portion af forbindelse XIX (7,2 g, 6%) smeltende ved 170 - 172°C.

Eksempel 3

Fremstilling af L-(-)-γ-amino-g-hydroxysmørsyre ud fra ambutyrosin A eller B eller blandinger deraf.

Ambutyrosin A (5,0 g) [USA-patentskrift nr. 3.541.078] tilbage-svaledes med 160 ml 0,5 N natriumhydroxid i 1 time. Hydrolysatet neutraliseredes med 6 N HC1 og kromatograferedes på en kolonne af ”CG-50"(NH^+ type). Den ønskede L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre iso-leredes ved udvaskning af kolonnen med vand og fjernelse af vandet ved frysetørring. L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre er et krystallinsk materiale med et smeltepunkt på 212,5 - 214,5°C [spalte 2, linie 31-38 i USA-patentskrift nr. 3.541.078].

Eksempel 4

Fremstilling af L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre ud fra DL-a-hydroxy-γ-phtalimidsmørsyre.

A). Dehydroabietylammonium L-g-hydroxy-Y-phtalimidbutyrat;

Til en opløsning af 25 g (0,1 mol) a-hydroxy-γ-phtalimidsmørsyre^* i 200 ml ethanol sattes en opløsning af 29 g (0,1 mol) dehydro-abietylamin i 130 ml ethanol. Opløsningen omrystedes kraftigt i et . minut og henstod ved stuetemperatur i 5 timer, i hvilket tidsrum fine nåle udkrystalliserede. Krystallerne opsamledes ved filtrering, vaskedes med 50 ml ethanol og lufttørredes til opnåelse af 30,1 g (56%) af en diastereomer af dehydroabietylaminsaltet.Den diastereomere o 24 havde et smeltepunkt på 93 - 94 C og en specifik rotation [g]D -+15° (c.=2,5, methanol). Rekrystallisation fra 300 ml ethanol gav 23,2 g (43%) af det rene produkt. Dette produkt havde et smeltepunkt på 94 - 95°C og en specifik rotation [a]^ = (c = 2,5, metha nol) . Yderligere rekrystallisation ændrede ikke smeltepunktet og den specifikke rotation.

Analyse beregnet for: C32H42N2°5"H2°: C, 69,54; H, 8,02; N, 5,07

Fundet: C, 69,58; H, 8,08; N, 5,07 1. Y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.

17 142991 B). L-(-)-γ-amlno-a-hydroxysmørsyre: Til en opløsning af 1,5 g (0,014 mol) natriumcarbonat i 40 ml vand sattes 5,3 g (0,01 mol) dehydroabietylammonium L-a-hydroxy-Y-phtalimidbutyrat og 60 ml ether. Blandingen omrystedes kraftigt, indtil alt faststof var opløst. Ether-laget fraskiltes. Den vandige opløsning vaskedes to gange med 20-ml portioner ether og inddampedes til 15 ml under formindsket tryk.

Til koncentratet sattes 10 ml koncentreret saltsyre, og blandingen tilbagesvaledes i 10 timer. Efter afkøling fjernedes udskilt phtal-syre ved filtrering. Filtratet inddampedes under formindsket tryk. Remanensen opløstes i 10 ml vand, og opløsningen inddampedes til tørhed. Denne operation gentoges to gange til fjernelse af overskud af saltsyre. Den sirupagtige rest opløstes i 10 ml vand og filtreredes til fjernelse af en lille mængde uopløselig phtalsyre. Filtratet adsorberedes på en kolonne af "lR-120 "(H+, 1 cm x 35 cm), hvilken kolonne vaskedes med 300 ml vand og elueredes med 1 N ammoniumhydroxid-opløsning. Eluatet opsamledes i 15-ml fraktioner. De ninhydrin-positive fraktioner 10 - 16 forenedes og inddampedes under formindsket tryk til dannelse af en sirup, som krystalliserede gradvis. Krystallerne tritureredes med ethanol, filtreredes og tørredes i en vakuum-eks-sikkator til dannelse af 0,78 g (66%) L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre med et smeltepunkt på 206-207°C. Specifik rotation [a]j^ = ”29^ (c = 2,5, H2O). IR-spektret var identisk med spektret fra den autentiske prøve, der opnåedes ud fra ambutyrosin.

Eksempel 5

Fremstilling af L-(-)-Y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxy- smørsyre (VI).

L-(-)-y-amino-a-hydroxysmørsyre (7,4 g, 0,062 mol) sattes til en opløsning af 5,2 g (0,13 mol) natriumhydroxid i 50 ml vand. Til den omrørte opløsning sattes dråbevis ved en temperatur på 0 - 5°C i løbet af et tidsrum på 0,5 time 11,7 g (0,068 mol) carbobenzoxy-chlorid,og omrøringen fortsatte i yderligere 1 time ved samme temperatur. Reaktionsblandingen vaskedes med 50 ml ether, surhedsgraden indstilledes til pH 2 med fortyndet saltsyre, og der ekstraheredes med fire 80-ml portioner ether. De etheriske ekstrakter forenedes, vaskedes med en lille mængde mættet natriumchloridopløsning, tørredes med vandfri natriumsulfat og filtreredes. Filtratet inddampedes i vakuum,og den resulterende remanens krystalliseredes fra benzen til dannelse af 11,6 g (74%) farveløse pladeformige krystaller med et smeltepunkt på 78,5 - 79,5°C og en specifik rotation på [a]D= -4,5° (c=2, CH^OH). IR-spektrum (KBr): Yc_0= 1740, 1690 cm NMR-spektrum (acetone-dg) cf(i ppm fra TMS) = 2,0 (2H, m), 3,29 (2H,d-d, 18 142991 J = 6,7 og 12 Hz), 4,16 (IH, d-d, J = 4,5 og 8 Hz), 4,99 (2H, s), 6,2 (2H, bred), 7,21 (5H, s).

Analyse beregnet for C^H^NOgi C, 56,91; H, 5,97; N, 5,53

Fundet: C, 56,66; H, 5,97; N, 5,47.

Eksempel 6 N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidesteren af L-y-benzyl- oxycarbonylamino-g-hydroxysmørsyre (XX)

Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) (2,06 g, 0,01 mol) sattes ved 10°C til en omrørt opløsning af 2,53 g (0,01 mol) L-γ-benzyloxycar-bonylamino —α-hydroxysmørsyre VI og 1,79 g (0,01 mol) af forbindelse XIX i 50 ml tør tetrahydrofuran. Blandingen omrørtes natten over ved stuetemperatur. Det udfældede dicyclohexylurinstof fjernedes ved filtrering og vaskedes med tetrahydrofuran. Filtratet og vaskevæskerne forenedes og inddampedes i vakuum. Den olieagtige remanens (4,5 g) ledtes igennem en silicagelkolonne og elueredes med ethylacetat til dannelse af 4,0 g (96%) af den aktive ester XX i form af en farveløs olie. IR-spektrum (Neat): 3300, 1820, 1780, 1735, 1720, 1695 cm NMR-spektrum (CDClg + 1 dråbe D20): <f(i ppm) = 1,63 (2H, q, J=9Hz), 2,15 (2H, m), 3,40 (6H, m) , 4,60 (IH, d-d, J=7 og 5Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, bred), 7,40 (5H, s).

Eksempel 7 N-benzyloxycarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (XVII).

Til en omrørt opløsning af 2,64 g (0,066 mol) natriumhydroxid i 50 ml vand sattes 3,58 g (0,02 mol) N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid XIX ved 10°C. Til opløsningen sattes dråbevis 6,82 g (0,04 mol) benzyloxycarbonylchlorid i løbet af et tidsrum på 40 minutter og ved 0 - 5°C, hvorefter blandingen omrørtes i 4 timer ved stuetemperatur. Til reaktionsblandingen sattes 20 ml n-hexan til dannelse af en hvid udfældning, som opsamledes ved filtrering og lufttørredes. Det rå produkt krystalliseredes fra benzen-n-hexan til dan-nelse af 5,1 g (81%) farveløse prismeformige krystaller af forbindelse XVII), der havde et smeltepunkt på 121 - 122°C.

IR-spektrum (KBr) = 1810, 1780, 1740, 1630 cm NMR-spektrum (acetone-dg): rf'd ppm) = 1,66 (2H, bred s), 3,45 (4H, m), 5,37 (2H, s), 6,12 (2H, t, J=l,5 Hz), 7,48 (5H, s).

Analyse beregnet for Ο^Η^ΝΟ^: C, 65,17; H, 4,83; N, 4,47.

Fundet: C, 65,50; H, 4,73; N, 4,44.

IS 142991 61-N-benzyloxycarbonylkanamycin A (II) [6'-Cbz)-kanamycin A].

Til en omrørt opløsning af 4,84 g (0,01 mol) af den frie kanamycin A base i 50 ml 50% vandig tetrahydrofuran sattes,fordelt i flere portioner, 3,14 g (0,01 mol) forbindelse XVII i løbet af et tidsrum på 1 time ved 7°C. Blandingen omrørtes fortsat i 4 timer og inddampedes i vakuum til fjernelse af det organiske opløsningsmiddel. Den resulterende vandige opløsning fortyndedes med 150 ml vand og ekstraheredes med to 100 ml portioner vandmættet butanol. Butanol-laget vaskedes med 100 ml vand og inddampedes i vakuum til dannelse af 1,78 g poly-Cbz-kanamycin A. Det vandige lag og vaskevæskerne forenedes og koncentreredes i vakuum til ca. 50 ml. Den vandige opløsning ledtes igennem en kolonne af ”CG-50“ionbytter harpiks (NH4 +, 140 ml), der elueredes successivt med 200 ml vand, 1,9 liter 0,05 N NH40H, 1,9 liter 0,1 N NH40H og til slut 1 liter 0,3 N NH40H. Eluatet opsamledes i 20 ml fraktioner og deltes i følgende to fraktioner på basis af Rf-værdien ved tyndtlagskromatografi [TLC (S-114',' 6'-Cbz-kanamycin = Rf 0,23, kanamycin = Rf 0,07)]. Hver fraktion inddampedes i vakuum, og remanensen tørredes i vakuum over phosphorpentoxid.

Fraktion Glas nr. Elueret med Mængde Indhold 1 106-144 0,1 N NH40H 3,44 g 6'-Cbz-kana- (56%) mycin (II) 2 203-212 0,3 N NH40H 0,54 g kanamycin (11%) genvundet.

Det således fremstillede 6'-Cbz-kanamycin (II) er meget rent og homogent som følge af tyndtlagskromatografi på en silicagel-plade og havde et smeltepunkt på 217-219°C. De fysisk-kemiske egenskaber stemte overens med egenskaberne af den autentiske prøve.

Eksempel 8

Fremstilling af N-(benzyloxycarbonyloxy)succinimid.

N-hydroxysuccinimid1 (23 °'2 mol) °Pløstes i en opløsning af 9 g (0,22 mol) natriumhydroxid i 200 ml vand. Til den omrørte opløsning sattes dråbevis 34 g (0,2 mol) carbobenzoxychlorid under vandafkøling, og derpå omrørtes blandingen ved stuetemperatur natten over til udskillelse af carbobenzoxyderivatet,som samledes ved filtrering, vaskedes med vand og lufttørredes. Udbyttet var 41,1 g (82%). Rekrystallisation fra benzen-n-hexan (10:1) gav farveløse prisme-formige krystaller smeltende ved 78 - 79°C.

1. G.W. Anderson et al., J. Am. Chem. Soc., £6, 1839 (1964).

20 142991

Eksempel 9

Fremstilling af 6'-carbobenzoxykanamycin A (II).

En opløsning af 42,5 g (90 mmol) af den frie base af kanamycin A i 450 ml vand og 500 ml dimethylformamid afkøledes til under 9°C og omrørtes kraftigt. Til opløsningen sattes dråbevis i løbet af et tidsrum på 2 timer en opløsning af 22,4 g (90 mmol) N-(benzyloxy-carbonyloxy)succinimid i 500 ml dimethylformamid. Blandingen omrørtes ved -10°C - 0°C natten over og derpå ved stuetemperatur i 1 dag. Reaktionsblandingen inddampedes under formindsket tryk ved en temperatur på under ca. 50°C. Den olieagtige remanens opløstes i en blanding af 500 ml vand og 500 ml butanol, idet blandingen filtreredes til fjernelse af uopløseligt materiale og separeredes i to lag. Butanol -laget og vandlaget behandledes henholdsvis med butanolmættet vand (500 ml x 2) og vandmættet butanol (500 ml x 2) under anvendelse af en til modstrømsfordeling svarende teknik. De tre vandige lag forenedes og inddampedes til tørhed under formindsket tryk til dannelse af en olieagtig remanens, idet en del heraf krystalliserede ved henstand ved stuetemperatur. Til remanensen,indbefattet krystallerne, sattes ca. 100 ml methanol, som opløste olien og adskilte den fra krystallerne. Efter tilsætning af ca. 300 ml ethanol holdtes blandingen ved stuetemperatur natten over til dannelse af en krystallinsk masse, som samledes ved filtrering. Den vejede 44 g. Produktet indeholdt en lille mængde kanamycin A, hvilket påvistes ved tyndtlagskromatografi under anvendelse af n-propanol-pyridin-eddikesyre-vand (15:10:3:12) som opløsningsmiddelsystem og ninhydrin som fremkaldelsesmiddel.

Det rå produkt opløstes i 300 ml vand og kromatograferedes på en kolonne (30 mm diameter) af "cG-501'ionbytter harpiks (NH4+ type, 500 ml). Kolonnen udludedes med 0,1 N ammoniumhydroxidopløsning,og eluatet opsamledes i 10-ml fraktioner. Det ønskede produkt fandtes i glas nr. 10-100, medens kanamycin A genvandtes fra langsommere bevægende fraktioner,og stillingsisomeren eller -isomerene af produktet syntes at befinde sig i hurtigere bevægende fraktioner. Fraktionerne 10-100 forenedes og inddampedes til tørhed under formindsket tryk til dannelse af 24,6 g (45%) af et farveløst produkt (6-carbo-benzoxykanamycin A (II) [6r-Cbz-kanamycin A],der begyndte at smelte og antage farve -ved 204°C og dekomponere ved 212°C under gasudvikling. Specifik rotation [alD +106° (c=2, 1^0). Tyndtlagskromatografi (silica-gel"F254'/ ninhydrin) .

21 U2991 _Rf-værdi__

Opløsningsmiddelsystem 6'-Cbz-kanamycin A Kanamycln A

n-^propanol-pyridin- 0,42 0,33 0,15/ 0,04

eddikesyre-H-O

(15:10:3:12) (hovedbe- (mindre bestandstanddel) del) acetone-eddikesyre-H20 0,24 0,14 (20:6:74) CHCl^-methanol- kane. NE^OH-i^O 0,76 0,50 (1:4:2:1) * o ηΛ* iæthylacetat-n-propanol-kc)nc 0,22 0,04 (45:105:60) * Påvist vha. anthronsvovlsyre.

Slutproduktet viste sig ved tyndtlagskromatografi med et af de afprøvede opløsningsmiddelsystemer at være ledsaget af to mindre bestanddele. Imidlertid anvendtes slutproduktet uden yderligere rensning til fremstilling af BB-K8 (IV).

Eksempel 1Q

1-N-[I-(-)-γ-amlno-g-hydroxybutyryl]kanamycln A (BB-K8, IV) via benzaldehyd-Schiff-base.

Til en omrørt opløsning af 6,19 g (0,01 mol) 6'-Cbz-kanamycin (II) i 50 ml 50% tetrahydrofuran sattes 3 ml (0,03 mol) benzaldehyd. Blandingen omrørtes i 3 timer ved stuetemperatur, afkøledes til 5°C og behandledes så med en opløsning af 4 g (0,01 mol) forbindelse XX i 50 ml tetrahydrofuran. Blandingen omrørtes i 1 time ved 5°C, surhedsgraden indstilledes til pH 2 med 6 N HC1, hvorefter blandingen omrørtes i yderligere 1 time ved stuetemperatur og derpå inddampedes i vakuum til fjernelse af det organiske opløsningsmiddel. Den resulterende vandige opløsning vaskedes med 20 ml CHjC^/ surhedsgraden indstilledes til pH 4 med 10% NH^OH, hvorpå blandingen hydrogeneredes natten over under atmosfærisk tryk og ved stuetemperatur under anvendelse af 1,25 g 10% palladium-på-carbon. Katalysatoren frafiltre-redes og vaskedes med 20 ml vand. Filtratet og vaskevæskerne forenedes, surhedsgraden indstilledes til pH 8 med 10% NH^OH, og blandingen ledtes igennem en kolonne af *fcG-50‘'(NH^+, 200 ml), der elueredes med 0,4 liter vand, 1,2 liter 0,1 N NH40H, 2,06 liter 0,3 N NH40H, 0,92 liter 0,5 N NH40H og til slut 1,2 liter 1,0 N NH40H. Eluatet opsamledes i 20 ml fraktioner og opdeltes i følgende fraktioner på 22 14299 1 basis af Rf-værdierne ved tyndtlagskromatografi på silicagelplade (S-110, ninhydrin) og skiveprøver under anvendelse af B. subtilis PCI 219 og P_;_ aeruginosa A 9843.Hver fraktion inddampedes i vakuum og frysetørredes.

φ 23 142991 w

i—I

C Φ η 'd υ c

>1 00 H H

S t—i Λ

Φ tA P

3 I « o

f8 ffl I H

X «Q

ffl P

P + ®

Φ + P P

σι σ> η tu x C οι οι oo η Η Μ S >1 ft)

> « « « « 0 P

C I I I I re! » ¢) ffl (0 fl ffl -rt O' W ffl 03 03¾ O' 00 « ffl Q) H OJ ffl P ★ CN *

.jj ^ φ M

>. dp dP O

,Q O dP 00 Ή

>φ ΓΟ 00 OJ

M ·— —· — Η φ · χ tn θ’ θ' > θ' mSgS σόι •Η . .

φ ο kD ο s w Ο σ> σι uo 0 1 Η ί* Η ro mm ο Η Η rj ® •ri 03 Ή θ' ο Μ 4Ρ dP rr. H) Η

φ OOdPdPOdPdP rH

+J ro oo uo ro cn <n M

i 1 --- —^ --- —' ·—· —' φ

> Ό I

Λ tn O' O' O' tn tn ffl ίο s s β e s g -n 3 °

+) 00 00 Ό Γ~ O UO °°JT

Op O 00 O- O' O 'S’ <71 ICC

S VO^OOOOHH H o-rl

> Η H <N N U

H < Ej -i ^25 Q\ RJ fo

rrt 03 Ή M

'd« z ϋΐ S ,

•ri o uo HOP

g «sr *· Ή SO

raaaaaoas p 3 m-i tna i -S 2 ,

ffl ro oo oo a uo o 3 3 P

•rltJl » * 00 * * ra & Φ MHOOO-OH > Φ ¾ O · J o 3 3 m K.

Η Φ tn

ffl > · * H

m ^ Φ φ P

Ρ Λ O' > > >i • Ό r hooo-ooo- -P P m C σι uo ό oo o uo O' 01¾

OOHHHOSOJ & »C

ra i i i i i i m m φ

<d o fN oi o CO oo P PP

H oiuovor^ooro Φ φ m HHHHOJ Ό

3 3 S

H CH

c * * o

•H

P

^ h ni oo "d* in >x> ιΰ p ffl 24 142991

Fraktion 4 (1,877 g) opløstes i 10 ml deioniseret vand. Opløsningens surhedsgrad indstilledes til pH 6 med 10% HCl,og den adsorbe-redes på en ’bG-50" kolonne (NH^ + , 15 ml), der elueredes med 100 ml 0,3 N NH^OH og 200 ml 0,5 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 20-ml fraktioner. Glas nr. 6 og 8 - 17 var ninhydrin-positive. Glas nr. 8-17 forenedes og koncentreredes i vakuum til ca. 1 ml. Koncentratet behandledes med 3 ml methanol og filtreredes. Filteret vaskedes med 0,5 ml 75% vandig methanol. Filtratet og vaskevæskerne forenedes, fortyndedes med yderligere 10 ml methanol og fik lov at stå natten over ved stuetemperatur. Idet den amorfe udfældning frafiltreredes, podedes filtratet til dannelse af farveløse krystaller af forbindelse IV, som viste sig at være identisk med en autentisk prøve. Filtratet inddampedes i vakuum og lyofiliseredes. Udbytte og afprøvning af hver fraktion fremgår af tabellen nedenfor.

25 142991 ft) Η β Ο

g <#J ο» c»P

3 Φ η cn vo β - η ft ιΗ r-i κ α)

+J

4J m > ·Η Λ η φ -Η <#P c>P (#> D +> ,0 σ\ σι cn rø ο 1-1 Η «1 Οι θ' θ' α> gas td \ \ \ •Η Μ Μ Μ β cd ω ω 0 φ Ό Τ3 e φ ο) φ 3 λ -β ij φ β β β β φ Φ Φ a Γ' . CN 00 Ο ίβ σι ο ιο γ—ί φ > ·& tn On θ' u ase ft \ \ > σι β β β -Η φ Φ Φ i-) Ό Ό Ό -Η φ Φ Φ +) Λ Λ Λ Λ β β β 3 Φ Φ Φ Φ Γ» οο οο • I Μ Ό Ο 03 Γ-· Η Ό 1—1 Φ en θ' θ'

τ) S6S

en β ο οο ο S r- cn οο g ο ^ β φ >

rH

a > Η β ·Ρ φ Φ φ > β Μ Η β Φ Η β φ Μ φ ft ι-Η *β φ Η ΓΗ β +> Φ -Η •Η 4-1 -Ρ ,β Λ β W ft β Ο >1 0 Ο S β >1 ft <3 W ιβ 26 142991 —B~ff. -*-·*- er 3"-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A.

SB~ff 29 er 3-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A.

Eksempel 11

Fremstilling af monosulfatsaltet af 1-N-[L-(-)-γ-amino-a- hydroxybutyryl] kanamycin A.

Et mol 1-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A opløstes i 1 - 3 liter vand. Opløsningen filtreredes til fjernelse af eventuelle uopløste faststoffer. Til den afkølede og omrørte opløsning sattes et mol svovlsyre opløst i 500 ml vand. Blandingen omrørtes i 30 minutter, hvorpå kold ethanol sattes til blandingen, indtil udfældning forekom. Faststofferne opsamledes ved filtrering og viste sig at være det ønskede monosulfatsalt.

Eksempel 12

Fremstilling af disulfatsaltet af l-N-[L-(~)-γ-amino-a- hydroxybutyryl] kanamycin A - (BB-K8 · 2^50^).

35 g 1-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A(i form af monohydrogencarbonat,trihydratet) opløstes i 125 ml deioniseret vand. pH-værdien viste sig at være ca. 9,0. pH-værdien sænkedes til 7-7,5 med 50 volumenprocent svovlsyre.

8½ g "Darco G-60" (aktiveret trækul) tilsattes, og blandingen opslæmmedes ved stuetemperatur i en halv time. Det aktive trækul fjernedes ved passende filtrering og vaskedes med 40 ml vand. Vaskevandet sattes til filtratet.

Surhedsgraden af den ovennævnte kombination af filtrat og vaskevand indstilledes til pH 2 - 2,6 med 50 volumenprocent svovlsyre.

Der udvikledes en stor mængde carbondioxid. Opløsningen fik lov at stå under vakuum og omrøring i 20 minutter til uddrivelse af yderligere carbondioxid.

8½ g "Darco G-60" sattes til den afgassede opløsning. Blandingen opslæmmedes i en halv time ved stuetemperatur. Det aktive kul fjernedes ved passende filtrering og vaskedes med 35 ml deioniseret vand. Vandet sattes til filtratet.

Surhedsgraden af kombinationen af filtrat og vaskevand indstilledes til pH 1 - 1,3 med 50 volumenprocent svovlsyre. Denne opløsning sattes under hurtig omrøring i løbet af 10 minutter til 600 - 800 ml methanol (3-4 voluminer methanol). Blandingen omrørtes i 5 minutter ved pH 1 - 1,3, ledtes igennem en 100 mesh sigte, omrørtes i 2 minutter og fik lov at falde til ro i 5 minutter. Det meste af den ovenpå flydende væske bortdekanteredes. Den resterende opslæmning filtrere- 27 142991 des på passende måde, vaskedes med 200 ml methanol og vakuumtørredes ved 50°C i 24 timer. Udbyttet af amorft BB-K8 (dihydrogensulfat)9 var 32 - 34 g og havde en specifik rotation på [a)D = +74,75 (H^O) og dekomponerede ved 220 - 223°C.

Jfi

Elementær analyse (på tør basis ) % C 32,7, 33,5, 32,3 33,5 % N 8,78, 8,7, 8,2, 8,8 8,97 % S 8,75, 8,9, 7,8, 8,85 8,2 % aske nul * Karl Pisher vandindhold: 2,33, 1,79, 2,87% (teoretisk vand indhold for monohydratet er 2,25%), Dette salt er hygroskopisk, men ikke henflydende. Efter opbevaring af en prøve i luften ved stuetemperatur i 18 timer var vandindholdet forøget til 9,55, 9,89% (teoretisk vandindhold for pentahydratet er 10,33%).

Eksempel 13

A) 61-carbobenzoxy-1,3,3"-trjsalicylalkanamycin A

6'-carbobenzoxykanamycin A (9,0 g, 14,5 mmol) suspenderedes i 500 ml absolut ethanol ved 24°C,og 58,2 mmol salicylaldehyd tilsattes. Blandingen opvarmedes til tilbagesvaling. I løbet af dette tidsrum ændrede blandingen sig til en klar gul opløsning, men ved tilbagesvaling begyndte et hvidt faststof hurtigt at dannes. Blandingen op-varmedes ved tilbagesvaling i 3 timer, afkøledes så, og produktet opsamledes ved filtrering og vaskedes med en lille smule absolut ethanol. Smeltepunktet efter rekrystallisation fra 4:1:5 tetrahydro-furan-methanol-heptan og tørring var 196 - 198°C.

Analyse beregnet for C47H54N4°]_5: C, 60,62; H, 5,86; N, 6,02

Fundet: C, 58,67; H, 5,73; N, 5,98

Karl Fisher vandindhold = 2,45.

Fundne analyse korrigeret for vand:C, 60,14; H, 5,60; N, 6,13.

B) Fremstilling af 1-N-[L-(-)-γ-amlno-g-hydroxybutyryl]kanamycin A via in situ processen.

I et passende apparatur opslaanmedes 1000 g (1,074 mol) 6*-carbo-benzoxy-l,3,3H-trisalicylal-kanamycin A i 11.400 ml tetrahydrofuran ved 22 - 25°C. Under omrøring tilsattes 600 ml vand. Faststoffet opløstes i løbet af ca. 10 minutter. I form af faststoffer sattes 181,5 g (0,716 mol) 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxysmørsyre og 0,12 mol N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid til opløsningen. pH- 28 142991 værdien ligger på 5,5 - 6,0. Idet der opretholdtes en temperatur på 22 - 25°C,tilsattes 162,3 g (0,787 mol) dicyclohexylcarbodiimid opløst i 3000 ml tør tetrahydrofuran. Opslæmningen omrørtes i 24 timer ved 22 - 25°C og afkøledes så til 0 - 5°C til udkrystallisation af dicyclohexylurinstoffet i løbet af 2 timer.

Urinstoffet fjernedes ved filtrering, og filterkagen vaskedes med 800 ml af en tetrahydrofuran-vandblanding (95:5). Filtratet og vaskevæskerne forenedes, og voluminet formindskedes under vakuum til 3000 ml. 4000 ml methanol tilsattes, og voluminet formindskedes igen i vakuum til 3000 ml.

Til den således opnåede opløsning sattes 2000 ml absolut methanol ved 40°C, og opløsningen podedes med 6'-carbobenzoxy-l,3,3"-trisali-cylal-kanamycin A og fik lov at afkøle til udfældning af krystaller i ^ - 1 time. Derpå tilsattes 2000 ml vand i løbet af en halv time under god omrøring ved ca. 22 - 25°C i 2 timer. Temperaturen formindskedes så til 0 - 5° i 1 time.

Faststofferne fjernedes ved filtrering og vaskedes med 900 ml af en kold methanol-vandblanding (2:1) og derpå med 800 ml methanol. Filtraterne og vaskevæskerne gemtes. Filterkagen bestod i alt væsentligt af 6'-carbobenzoxy-l,3,3"-trisalicylalkanamycin A.

De ovennævnte filtrater fortyndedes med 1000 ml vand. Der tilsattes 2000 ml methylenchlorid. pH-værdien sænkedes ved 25°C til 1,8 - 2,0 med 6 N HC1. pH-værdien holdtes på denne værdi i en halv time.

Methylenchloridlaget separeredes,og den vandige fase vaskedes med yderligere 2000 ml methylenchlorid. De forenede organiske faser gemtes af hensyn til mulig salicylaldehyd-genvinding.

Den vandige fases pH-værdi hævedes til 3,5 - 4,0 med koncentreret ammoniakvand. Denne opløsning hydrogeneredes ved stuetempera tur ved et hydrogengastryk på 345 kPa i nærværelse af 5% Pd/C. Det biologisk aktive udbytte af det ønskede produkt i opløsning var 30 -45% af det teoretiske.

Eksempel 14_

Fremstilling af forbindelse IV under anvendelse af forskellige molforhold N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid under fastholdelse af de andre molforhold.

Ved i eksempel 13 B at erstatte de anvendte 0,12 mol N- hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (HONB) med de nedenfor angivne molprocenter opnåedes de anførte procentvise udbytter af forbindelse IV:

Claims (3)

1. 29 142991 Forsøg Mo1-% HQNB % udbytte af forbindelse IV 1 0 9,33 2 2 20,07 3 10 31,72 4 50 36,52 5 100 36,01 Af det ovenstående ses, at forbindelse IV kan fremstilles i fuldstændigt fravær af N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid. Imidlertid kan det også ses, at de bedste udbytter af forbindelse IV opnås, når N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid anvendes i en mængde, som udgør 10 - 50 mol-% af den ved acyleringsreaktionen anvendte molære mængde 4-benzyloxycarbonylamino-2-hydroxysmørsyre. Den præcise mekanisme, hvorved den blokerede kanamycin A acyleres, kendes ikke. Det iagttages imidlertid, at nærværelsen af N-hydroxy-5-norbornen- 2,3-dicarboximid på en eller anden måde giver bedre udbytter end tidligere opnået.
2. 1. Fremgangsmåde til fremstilling af 1-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxy-butyryl]-kanamycin A med formlen CHp-KH? BO Λ —H—x CHpOH HO Λ— E° —s. I / NH yv!— / c=o h2n / ho-(|h o 1¾ n KHa eller farmaceutisk anvendelige syreadditionssalte deraf, ved hvilken man (A) behandler 6-carbobenzoxy-kanamycin A med formlen
3. 30 U2991 O _ H il HQ ^-N-å-0-Ci^-C6H5 -¾¾ E0 f20K vA-7^ / H° i7 XX med benzaldehyd, salicylaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-methoxybenzalde-hyd eller pivaldehyd, idet der anvendes mindst tre mol aldehyd pr. mol forbindelse II, til fremstilling af forbindelsen med formlen K ? CH^N-C-O-CiL-arHc sk III 31 142991 hvor Z betegner en gruppe med formlen Η H -N=lfy«°2 , -»=C-0 , -N«CHØ-OCH3 . "V\ H /C"3 -Μ*°Ό eller -"*C ‘ C \CH3 ' CBj hvorpå man (B) behandler forbindelsen med formlen III in situ eller efter isolering med en N-hydroxyimidester af syren med formlen 0 ? II » HO-C-CH-CH2-ch2-nh-c-o-ch2-c6h5 OH hvorefter det derved dannede produkt hydrogeneres in situ til fremstilling af forbindelsen med formel IV, der, om ønsket, omdannes til et farmaceutisk anvendeligt salt deraf, kendetegnet ved, at N-hydroxyimidesteren af nævnte syre eventuelt dannes in situ og at den har formlen ? I I \ | ^o-c-ch-ch2-ch2-nh-c-o-ch2~c6h5 OH ^ II o XX og at der anvendes mindst 0,5 mol af forbindelse (XX) pr. mol forbindelse (III), eller, når forbindelse (XX) dannes in situ, at den dannes i en mængde, som mindst svarer til 0,5 mol pr. mol forbindelse (III).