FI60217C - Foerfarande foer framstaellning av 1-(l-(-)-ny-amino-alfa-hydroxibutyryl)kanamycin a - Google Patents

Description

Γβΐ KUULUTUSjULKAISU , n 0 . n W (11) UTLÄGGNINGSSICIUFT 6021 7 (^) Patent cieddelat ^ '*~0' (51) Ky.ik.Wci.3 C 07 H 15/22 SUOM I—FI N LAN D (21) Petenttihakemu* — Pttenttrwdknlng 3270/71+ (22) Hakemlipttv* — An*6knlnf*di| 11.11.71+ (23) Alkupihrl —Glltlghetadig II.II.7I+ (41) Tulkit Julkiseksi — Bllvlt offentllg 15.05.75

Patentti- ja rekisterihallitus ..A ...... ,. , . , _ , , (44) Nihtlvlkslpenon ja kuul.|ulkilsun pvm. — n n

Patent-och registerstyrelsen ' Antttkan utlagd oeh utl.skrlften publicerad 31.08.81 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus— Begird prioritet 11+.11.73 23.05.7^ USA (US) I+I5589, 1+72780 (71) Bristol-^ers Company, 3l+5 Park Avenue, New York, N.Y., USA(US) (72) Takayuki Naito, Tokyo, Susumu Nakagawa, Tokyo, Masahisa Oka, Tokyo,

Japan i-Japan(JP) (7I+) Oy Kolster Ab

(5I+) Menetelmä l-/L-(-)-Y'-amino-qi-hydroksibutyryyli7-kanamysiini A:n valmistamiseksi - Förfarande för fraraställning av l-/t-(-)-^amino-rt.-hydr-oxibutyryiykanamycin A

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä 1—Jju~( —)-J)^amino—o(-hydroksibutyryyli7— kanamysiini A:n valmistamiseksi, jolla on kaava CH0-NH0 HO —t I 2 2

/H

HO I NH0 0 CH OH HO —-7v^\

HO-^ * / ^V-NH

\ - 0 / C=0

H2N / H0-CH

»° \/ H

7¼ HH2 2 60217 jolle menetelmälle on tunnusomaista, että kaavan

H S

ho _ ch2-n-c-o-ch2-c6h5

HO

/ III

H0 z °— HO-i--Λ “VL o /^-z z /^Λ / H0 \ / 0/ mukainen yhdiste, jossa Z on ryhmä H V_ Ά./~\ H J V- -N=C / N02 ’ -N=C \ / ’ _N=C \ / 0CH3»

HO

hV\ H

-N=C“V 7 tai -N=C-C ~—CH3 ^ch3 saatetaan in situ reagoimaan vähintään moolisuhteessa 1:0,5 yhdisteen kanssa, jolla on kaava 0 2 2

) N-0-C-CH-CHo-CH -NH-C-0-CHo-C/-H1. XX

™ " 5 ja reaktiotuote hydrataan in situ kaavan IV mukaiseksi yhdisteeksi.

3 60217

Kanamysiini A:ssa, jolla on kaava 6' V CH2-NH2 H0 — H0 _ °\

,, NH

, „ CH20H HO-1—_T\ H0 —iL 5 Ας^Α1

VaJ 5" / m2 H?N --^ °\ / 2 ^T7^"/ H0 Ö on neljä primaarista amiinifunktiota molekyylin 1-, 3-, 6'- ja 3"-asemissa.

On osoitettu, että 6'-amiinifunktio on reaktiivisin ja 1-amiinifunktio on toiseksi reaktiivisin käsiteltäessä elektrofiilisellä aineella. Sekä 3~ että 3,,-asemat ovat vähemmän reaktiivisia kuin joko 1- tai 6’-amiinifunktio, mutta ne reagoivat antaen alhaisen ^-määrän ei-toivottuja asyloituja aineita.

1-/L-(-)* γ-amino- c<-hydroksihutyryyli7-kanamysiini A:n (BB-K8) valmistus tunnetaan FI-patenttijulkaisusta 56 388. Tässä julkaisussa esitetyn menetelmän mukaisesti BB-K8:n saanto on kuitenkin sangen alhainen. Esimerkissä 2 BB-K8:aa saatiin 552 mg (19,2 %). Tuote sisälsi kuitenkin BB-Κδ vain 560 ^ug/mg (puhtaus-aste 56 %). Kun tuote puhdistettiin, saatiin 98 mg 96-$:isen puhdasta tuotetta, mikä vastaa 96 #:isen BB-K8:n kokonaissaantoa 3,85 %. Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä BB-K8:aa saadaan, kuten jäljempänä olevista esimerkeistä ilmenee, huomattavasti paremmalla saannolla.

Kaavan III mukaisen yhdisteen valmistus on kuvattu Fl-patenttihakemuksessa no 309/7**.

Kaavan IV mukaisen yhdisteen valmistus käyttäen välituotteena kaavan III mukaisia aldehydejä on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 309/7*+. Siinä on kuitenkin kaavan III mukainen yhdiste saatettu reagoimaan L- (-) - "jT-bent syy li -oksikarbonyyliamino- o(.-hydroksivoihappo-N-hydroksisukkinimidiesterin kanssa, kun esillä olevassa hakemuksessa on käytetty L-Y^bentsyylioksikarbonyyliamino-c^-hydroksivoihappo-N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imidiesteriä (XX).

u 60217

Kaavan XX mukaista yhdistettä käytettäessä reaktion selektiivisyys on parempi kuin käytettäessä sukkinimidiesteriä. Patenttihakemuksen 309/7*+ esimerkissä 1 lopputuotteen BB-K8:n saanto on 19»*+ % tai laskettuna reagoineen kanamysiini A:n suhteen 33,5 %· BB-K8 :n saanto käytettäessä kaavan XX mukaista norborneeni-johdannaista on, kuten esimerkistä U voidaan nähdä, 36,52 %. Samalla sivutuotteiden määrä on vähäisempi.

Kaavan III ja kaavan XX mukaisen yhdisteen välinen reaktio suoritetaan edullisesti moolisuhteessa noin 1:1 lämpötila-alueella noin -10° - noin +35°C, edullisemmin +5° - noin 25°C, jolloin reaktioaika on vähintään 1-3 tuntia, tämän jälkeen orgaaninen liuotin poistetaan ennen hydrausta. Hydraus in situ suoritetaan vedyllä metallikatalysaattorin läsnäollessa, kuten palladium-, platina-, Raney-nikkeli-, rodium-, rutenium- ja nikkeli-, mutta varsinkin palladium-katalysaattorin ja erityisesti palladiumhiilikatalysaattorin läsnäollessa, vedessä tai liuotinsysteemissä, jossa on vettä ja veden kanssa sekoittuvaa liuotinta. Näitä ovat vesi ja dioksaani, tetrahydrofuraani, etyleeniglykolidimetyyli-eetteri, propyleeniglykolidimetyylieetteri tms. Reaktioseoksen pH on 3~5, kuitenkin edullisimmin h.

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan edullisesti siten, että kaavan III mukaista yhdistettä käsitellään in situ tai eristämisen jälkeen kaavan XX mukaisella yhdisteellä moolisuhteessa: yhtä yhdisteen III moolia kohti käytetään noin 0,5-1,0 moolia yhdistettä XX, lämpötila-alueella +5-35°C yhdestä tunnista 3 tuntiin absoluuttisessa etanolissa, metanolissa, n-propanolissa, sek.-buta-nolissa, tert.-butanolissa, metyleenikloridissa, tetrahydrofuraanissa, dioksaa-nissa, dimetyyliformamidissa tai asetonissa, tai näiden seoksessa veden kanssa; tämän jälkeen orgaaninen liuotin poistetaan ja jäännös hydrataan in situ vedellä metallikatalysaattorin läsnäollessa, kuten palladiumin, platinan, Raney-nikkelin, rodiumin, ruteniumin ja nikkelin, mutta erityisesti palladiumin tai varsinkin palladiumhiilikatalysaattorin läsnäollessa, vedessä tai veden ja veden kanssa sekoittuvan liuottimen seoksessa, edullisesti jossakin seuraavista systeemeistä: vesi ja dioksaani, tetrahydrofuraani, etyleeniglykolidimetyylieetteri ja propyleeniglykolidimetyylieetteri, edullisimmin kuitenkin vesi, pH:ssa 3-5, edullisemmin *+, jolloin saadaan kaavan IV mukaista yhdistettä.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa myös siten, että useampi reaktiovaihe suoritetaan in situ, jolloin saadaan samoilla erittäin hyvillä saannoilla kaavan IV mukaista yhdistettä alhaisemmilla kustannuksilla.

Kaavan XX mukainen yhdiste voidaan esimerkiksi valmistaa in situ ja saattaa reagoimaan kaavan IIT mukaisen yhdisteen kanssa yhtenä reaktiovaiheena.

5 60217

Siten kaavan TV mukainen yhdiste voidaan valmistaa saattamalla kaavan III mukainen yhdiste reagoimaan kaavojen 0 0

H-0-C-CH-CHo-CH -NH-C-O-CH -C^H,- VI

, £- 2 2 o 5

OH

ja 0

} N-OH XIX

O

mukaisten yhdisteiden kanssa disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa.

Tällöin yhtä yhdisteen III moolia kohti käytetään noin 0,5-1 ,0 moolia sekä yhdistettä VI että disykloheksyylikarhodi-imidiä ja noin 0,005-0,25 moolia yhdistettä XIX, reaktiolämpötila on noin -10 - +35°C, edullisemmin +5:stä noin 25°C:een, reaktioaika on vähintään 10 tuntia ja liuottimena käytetään jotakin edellä kuvatuista systeemeistä. Tämän jälkeen orgaaninen liuotin poistetaan ja jäännös hydrataan in situ, kuten edellä on kuvattu, jolloin saadaan kaavan IV mukainen yhdiste.

Kaavan IV mukainen yhdiste on arvokas antibakteerinen aine, ravintolisä-aine eläinruokinnassa, terapeuttinen aine siipikarjalla ja eläimillä, myös ihmisellä, ja erityisen arvokas käsiteltäessä gram-positiivisten ja gram-negatii-visten bakteerien aiheuttamia tartuntatauteja.

Kaavan IV mukaisen yhdisteen antibakteerisia ja terapeuttisia ominaisuuksia on käsitelty FI-patenttijulkaisussa 56 388.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 1-N-ZL-(-)- ~|T-amino- ^hydroksibutyryylijkanamysiini A (BB-K8, IV) bentsaldehydi-Schiffin emäksen välityksellä

Sekoitettuun 6’-Cbz-kanamysiinin liuokseen (II) (6,19 g, 0,01 moolia) liuokseen 50 ml:ssa 50 %:sta. THF lisättiin 3 ml (0,03 moolia) bentsaldehydiä. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 3 tuntia, se jäähdytettiin 5°C:een ja sitä käsiteltiin yhdisteen XX (1+ g, 0,01 moolia) liuoksella 50 ml:ssa THF.

Seosta sekoitettiin tunnin ajan 5°C:ssa, pH säädettiin 2:ksi 6-n HCl:llä, sekoitettiin vielä tunnin ajan huoneen lämpötilassa, sitten orgaaninen liuos haihdutettiin tyhjössä. Saatu vesiliuos pestiin 20 ml:11a CH^Cl^, pH säädettiin 6 60217 1+:ään 10 %: sella NH^OHilla ja liuosta hydrattiin yli yön normaalipaineessa huoneen lämpötilassa käyttäen katalysaattorina 1,25 g 10 % palladium-hiiltä. Katalysaattori suodatettiin ja pestiin 20 ml:11a vettä. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin, pH säädettiin 8:aan 10 $:sella NH^0H:lla ja liuos ajettiin CG-50-pylvään (NH^, 200 ml) lävitse, eluoitiin 0,U litralla vettä, 1,2 litralla 0,1-n NH^OH:ta, 2,06 litralla 0,3-n NH]+0H:ta, 0,92 litralla 0,5-n NH^OH:ta ja lopuksi 1,2 litralla 1 ,0-n NH^0H:ta. Eluaatti koottiin 20 ml:n fraktioina ja jaettiin seuraaviksi fraktioiksi Rf-arvon perusteella (TLC, piigeelilevy S-110, ninhydriini) ja kiekkokokeen perusteella, jolloin käytettiin B. subtilis PCI 219 ja P. aerugenosa A 98^3. Kukin fraktio haihdutettiin tyhjössä ja kylmäkuivattiin.

7 60217 i id •h :d t> p d :d P d p ·Η

□Or- co Ό p -P

r- ·Η d P -P

d W id ® -P d d I W λ P ·Η <L> P id CP t >a co d p d -π CP PP id ω d d CP d :d id ·η co ·η + -P I—IE· co d *H + ·Η H d ® • h co On On t— O L*idid d CO >> CM CM CO T- H !> P d •he >> ω id :d d ddWWWWto H-pid *h O id t I I I 0Ö d p a id

ρ<33ρρρρρΡΡΡ·η ® >3 P

dPAJPPPPPPCPTJ M id d p d ro a! <L> ή d cm mm co d

co d P ·Η P

13¾ d o H

r-· 13¾ P Αί H P

r- O d <L) ,r~3 cn mm d d ο

P CM AI H P P

O I H ,d H

O νο o P d d H

ο σν o\ in daw • η -p ·- m -π d co CP ·- 1- d p d

0 co -h W

g -π p I

3 ο ο CP

0) p o PP

d -π ft d p id ' M-3 ·Η ,¾

^ Vt ^ dp AJ

Vi. Vt Vi Vt H-~-d d o m o h d d o pm co vo m cm cm p h ^ p d -— —· — ή h d d ω o d d

dbD bp öO M bO bp ppp O

ws a a a a a ρ p p;

O f-( · H * H CO

dm m vo o vo « Ai o Ai •ho co t— c— o -=t· ·η B o d vo p-mco<-*- ·η d H "-3 CL, t- t— d Ρ ·Η p Pi do d 1 P< A! J d co ΰ o d p d ·η ή A· d d H H P P ® h -H d Ö d Ai

.. p -d P ω I

K P O p A! O ·

O 3 3 Ai I 00 C

P· CP CO Ah On VO P

« >5 r- O p S co d p; cm cm p d ·Η iO , p • d ddddd hpl>»m <3 pi I I I i I H p r> ο ω •nm m m in in ο ·ηοο Ph p P^Ci ΛΛΛΛΛ O O -P CÖÖ • HO O O O O i- d .ri CO CO ·Η to CP p W p d On

p I ·η H O CM

> id p · ·η a

d p d d p 3 W

d I h d H p P I

p m id p d d cp

•ri ·> B Id O CO Pi CP

Ο Ο P d Ai d P id p · · d P P id ·Η CP fed ·Ρ cd ·η> a aj p ·η d d d •ri d d p p p» p p id id «- p Pi p p ·- P d P d p p Ο ·Η d Pi S >> id

·· ·η d C -'d I

d P 3 ·Η Ah X PP

P P P PP

d ·- o\ t— m t— p —-d d d P Ov VO VO CT\ O in p ό p p " • H ON ’-'-'-CMCM -Hdo P P d

Ail lllll d co d p p-ri PO cm cm o co co O co co p P d 3 On LA VO f— O'. m 3 ·Η Ή ·Η ·Η (li i-i-i-i-CM copid d dp

P P O O CO

p ä p d d b O d P co co s A! CO P d o o >3 p p d •rt rH id O O d O CP O d W W Ah

• H

^ oj cn ~=t lt\ vo c\j on u 8 60217

Fraktio U (1,877 g) liuotettiin 10 ml:aan deionisoitua vettä. Liuoksen pH säädettiin 10 #:sella HCl:lla 6:een ja liuos adsorboitiin CG-50-patsaalle (NH^, 15 ml) joka eluoitiin 100 ml:lla 0,3-n NH^OHita ja 200 mlrlla 0,5~n NH^OHtta. Eluaatti koottiin 20 ml:n fraktioina. Putket 6 ja 8-17 olivat ninhydriiniposi-tiivisia. Putkien 8-17 sisältö yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä noin 1 ml:ksi. Väkevöitettä käsiteltiin 3 ml:11a Me0H:ta ja suodatettiin. Suodatin pestiin 0,5 ml:11a 75 $:sta vesipitoista Me0H:ta. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin, laimennettiin vielä 10 ml:lla Me0H:ta ja jätettiin huoneen lämpötilaan yön yli. Amorfinen sakka suodatettiin, ja suodokseen ympättiin kidealkioita, jolloin saatiin värittöminä kiteinä yhdistettä IV, joka oli identtinen autenttisen näytteen kanssa. Suodos haihdutettiin tyhjössä ja lyofilisoitiin. Kunkin fraktion saanto ja koe esitetään seuraavassa taulukossa.

IV Määrä Koe Saanto B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis K. pneumoniae

Amorfinen 70 mg 737 ^i/mg 927 ^i/mg 0,9 % 1,1 % j auhe

Kiteet 1098 mg 1163 " 1087 " 19 Ϊ 19 Ϊ

Lyofilisoitu l80 mg 608 " 50U " 1,9 ^ 1,6 % jauhe BB-K 11 on 3"-N-/L-(-)-”y-amino-c^-hydroksibutyryyliZ-kanamysiini A.

BB-K 29 on 3-N-/i>(-)-iT-amino-<A-hydroksibutyryyli7-kanamysiini A.

Lähtöaine valmistettiin seuraavasti: L- if-bentsyylioksikarbonyyliamino-ck-hydroksivoihapon N-hydroksi-5- norborneeni-2,3-dikarboksimidiesterin (XX) valmistus Disykloheksyylikarbodi-imidiä (DDC) (2,06 g, 0,01 moolia) lisättiin 10°C:ssa sekoitettuun L- y-bentsyylioksikarbonyyliamino- oL-hydroksivoihapon (2,53 g» 0,01 moolia) ja yhdisteen XIX (1 ,79 g, 0,01 moolia) liuokseen 50 ml:ssa kuivaa THF (tetrahydrofuraani). Seosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla ja pestiin THF:llä.

Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Öljymäinen jäännös (U,5 g) ajettiin piigeelipylvään lävitse ja eluoitiin etyyliasetaatilla, jolloin saatiin U,0 g (96 %) aktiivista esteriä XX värittömänä öljynä. Infrapunaspektri (IR, Neat): 3300, 1820, 1780, 1735, 1720, 1695 cm Ί. Ydinmagneettinen resonanssi-spektri (NMR) (CDC13 + 1 tippa D20): £(ppm) 1,63 (2H, q, J=9Hz), 2,15 (2H,m) 3,U0 (6h, m), U,60 (1H, d-d, J=7 ja 5 Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, leveä), 7,i*0 (5H, s).

7 60217 I :3 •H *3 <0 > O β :3 P 3 ρ ·η ao «- to t) -p 4-3 T- ·η q <υ p 3 « "ö 3 -μ c 3 i Ai ,ρ p -h <u P :3 pq i >> 0 β -p 3 ·η pq W tee to oi β PQ 3 :3 :3 ·Η to -rl + 4-3 Η Θ to β ·Η + ·γ4 H C 0

• H 0 OM Om O As β :3 H

0 A> cm cm oo *- h a φ β • HS >> (U :tö :cfl β 3 3 Ai Ai Ai Ai 0 rl 43 :qJ ·Η O C I I I I CÖ β P S =3 4-3 co 3 pq pq PQ pq ·η 3 As 43 G +3 pq pq pq pq Ό to :3 β 43

3 ei M 0 -H

3 cm co co to β en 3 0 ·η 0

tÖ O 1—I

r-' -¾¾ %% 43 Jtj lH β T- o β 0 Ό ro co m cö tö ai 0 CM M H 43 tl)

O I H rC H

X O MO O 033 H

O On om ctm 3 S 0 • H pr 1— to *h to ao pq r- T- G -P β O to ·Η Ai

S -h 43 I

3oo PQ

0 -P o PQ

a -h ft 1) ,ο «d r-'· ^ ‘1-3 ·Η Ai —« r-» ^ 3 43 Ai

Vä. Vä. H β G

O (O O rH 3 3 0

p CO 00 MO CO CM CM 0H P

β —- --- ^ ·Η H cd 3 0 O 3 β

3 M ÖDMMbDM p Ai P O

«e eeaee 0 φ p O H ·Η ·Η 3 ero CO MO e— O MO Ai Ai O Ai

• HO 00 E— t— O pj- ·Η S O

3 MO _d-rOOOr-<- Ή β I—I •'-i PG r- .— 3 0 Ή 4> ft 3 0 3 1 P, X · Cd

to β O 3 P

3 -H ·Η x 3 g H H P -P ® rH -H 3 G β Ai

p Ό 0 3 I

Ä p O 0 M o · O 3 3 Ai I CO β ps- 0 0 Ai OM MO 0 K A» <- 0 o a 0 3 pi CM CM p

3 -H :θ , P

• β βββββ H P As H <3 PI C I I t I rH P A O 0 • H to CO CO UM LCM O ·ΗΟΟ pH 0 pL, * ·«·'»>*>»> OOP 3β • HO O O O O *- 3 -H W 0 "rl w pq p (¾ ·ρ β θ\

0 l -H 1—I O CM

a s3 p · -h a β P G 3 p 3 fcci

3 I H 3 H P 0 I

P (O :3 rH 3 β PQ

• H «· S i3 O 0 ft W

O O 0 β Ai 3 H :3 0 · · 3 rH Φ :3 ·Η PQ Ai ·Ό W ·<~3 o A! .

rH ·<Η β β β • H 3 β Φ 0..

i> ρ 0 :3 t3 T- P Ρβ p p «-

Ρ β 0 3 P P

O ·γ4 β Ρβ .H Ai Ai

•H β β :3 :3 I

β P 3 -H Ai Ai «

P P P PQ

G t-0\t— COE— 0^3 3 3 0 OM MOMOOmOLCM p p P P" • H OM r- t— 1 CM CM ·Η 3 O Ρ ρβ

Ail lllll β 0 3 Φ 0·Η PO CM CM Ο ΟΟ CO O00 Ρ Ρβ

3 OM U~\ MO t— O. to 3 ·Η -H Ή -H

pit r-i— t— CM 00 :3 β β · H

ρ ρ Ο Ο 0 0 Ρ Ρ 3 3 As

0 3 0 0 0 E

Ai 0 Ρ 3 O O S 0 0 β • Η Η «3 Ο 0 3 O pq Ο β Ai Ai Ai

•M

CM CO -tf to, MO r- CM CO

β &·, 8 60217

Fraktio Π (1,877 g) liuotettiin 10 ml:aan deionisoitua vettä. Liuoksen pH säädettiin 10 #:sella HCl:lla 6:een ja liuos adsorboitiin CG-50-patsaalle (NH^, 15 ml) joka eluoitiin 100 ml :11a 0,3_n NH^0H:ta ja 200 ml :11a 0,5~n NH^OH^a. Eluaatti koottiin 20 ml:n fraktioina. Putket 6 ja 8—1T olivat ninhydriiniposi-tiivisia. Putkien 8-17 sisältö yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä noin 1 ml:ksi. Väkevöitettä käsiteltiin 3 ml:11a Me0H:ta ja suodatettiin. Suodatin pestiin 0,5 ml:11a 75 %:sta vesipitoista Me0H:ta. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin, laimennettiin vielä 10 ml:11a Me0H:ta ja jätettiin huoneen lämpötilaan yön yli. Amorfinen sakka suodatettiin, ja suodokseen ympättiin kidealkioita, jolloin saatiin värittöminä kiteinä yhdistettä IV, joka oli identtinen autenttisen näytteen kanssa. Suodos haihdutettiin tyhjössä ja lyofilisoitiin. Kunkin fraktion saanto ja koe esitetään seuraavassa taulukossa.

IV Määrä Koe Saanto B. subtilis K. pneumoniae B. subtilis K. pneumoniae

Amorfinen 70 mg 737 ^i/mg 927 ji/mg 0,9 % 1,1 % j auhe

Kiteet 1098 mg 1163 " 1087 " 19 JC 19 %

Lyofilisoitu 180 mg 608 " 50U " 1,9 ^ 1,6 % jauhe BB-K 11 on 3"-N-ZL-(-J-TT-amino-c<-hydroksibutyryyli/-kanamysiini A.

BB-K 29 on 3-N-/L-(-)-‘jf-amino-<A-hydroksibutyryyli/-kanamysiini A.

Lähtöaine valmistettiin seuraavasti: L- ^r~bentswlioksikarbonyyliamino-g<.-hydroksivoihapon N-hydroksi-5~ norborneeni-2,3-dikarboksimidiesterin (XX) valmistus Disykloheksyylikarbodi-imidiä (DDC) (2,06 g, 0,01 moolia) lisättiin 10°C:ssa sekoitettuun L-y-bentsyylioksikarbonyyliamino- o^-hydroksivoihapon (2,53 g, 0,01 moolia) ja yhdisteen XIX (1,79 g, 0,01 moolia) liuokseen 50 ml:ssa kuivaa THF (tetrahydrofuraani). Seosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyyliurea poistettiin suodattamalla ja pestiin THF:llä.

Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Öljymäinen jäännös (k,5 g) ajettiin piigeelipylvään lävitse ja eluoitiin etyyliasetaatilla, jolloin saatiin H,0 g (96 %) aktiivista esteriä XX värittömänä öljynä. Infrapunaspektri (IR, Neat): 3300, 1820, 17Ö0, 1735» 1720, 1695 cm 1. Ydinmagneettinen resonanssi-spektri (NMR) (CDCl^ + 1 tippa D20): £(ppm) 1,63 (2N, q, J=9Hz), 2,15 (2H,m) 3,HO (6H, m), H,60 (1H, d-d, J=7 ja 5 Hz), 5,13 (2H, s), 6,20 (2H, leveä), 7 ,H0 (5H, s).

9 60217

Esimerkki 2 1-N-/L-(-)- ]^-amino-<X-hydroksibutyryyli7kanamysiini A:n (IV) valmistus

Sekoitettuun 6'-N-Cbz-kanamysiinin (II) (1,36 g, 2,2 mmoolia) liuokseen 60 ml:ssa 50 %:st& vesipitoista THF:ää lisättiin tipoittain huoneen lämpötilassa 30 minuutin kuluessa 930 mg (2 mmoolia) aktiivista esteriä XX 10 ml:ssa THF:ää. Seosta sekoitettiin yli yön ja sitten hydrattiin normaalipaineessa huoneen lämpötilassa 10 %:lla palladiumhiilellä (1,0 g). Katalysaattori poistettiin ja pestiin vedellä. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin, orgaaninen liuotin haihdutettiin tyhjössä. Saatu vesiliuos vietiin CG-50-pylväälle (NH^, 70 ml), joka eluoitiin peräkkäin 0,1+ litralla vettä, 0,5 litralla 0,1-n NH^0H:ta, 0,5 litralla 0,3-n NH^OHrta, 1 litralla 0,5~n NH^OHrta ja lopuksi 0,5 litralla 1-n NH^0H:ta. Eluaatti koottiin 20 ml:n fraktioina ja jaettiin osiin Rf-arvon perusteella (TLC piigeelilevyllä, S—110, ninhydriini ) ja B sublitis PCI 219:ää ja K. pneumoniae tyyppi 223038 A 20680:tä käyttävien kiekko-kokeiden perusteella. Kukin fraktio haihdutettiin tyhjössä ja lyofilisoitiin.

Esimerkki 3 1-N-ZL-(- )-y"-amino- ck-hydroksibutyryyli_7kanamysiini A:n valmistus in situ prosessilla

Sopivassa laitteistossa lietettiin 22-25°C:ssa 1000 g (1,07*+ moolia) 6'-karbobentsoksi-1,3,3"-trisalisyläalikanamysiini A:ta 11 1+00 ml:aan THF:ää. Lisättiin sekoittaen 600 ml vettä. Liukeneminen tapahtui noin 10 minuutissa. Liuokseen lisättiin 181,5 g (0,716 moolia) l+-bentsyylioksikarbonyyliamino-2-hydroksivoihappoa ja 0,12 moolia N-hydroksi~5-norborneeni-endo-2,3-dikarboksimidia (ΧΙχ). pH oli alueella 5,5~6,0. Lämpötila pidettiin 22-25°C:ssa, ja seokseen lisättiin 162,3 g (0,787 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä liuotettuna 3000 ml:aan kuivaa THF:ää. Lietettä sekoitettiin 2h tuntia 22-25°C:ssa, sitten jäähdytettiin 0-5°C:ssa 2 tuntia disykloheksyyliurean kiteyttämiseksi.

Urea poistettiin suodattamalla ja sakka pestiin 800 ml:11a 95/5 THF-vesi-seosta. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa 3000 ml:ksi.

Lisättiin 1+000 ml metanolia ja haihdutettiin jälleen tyhjössä 3000 ml:ksi. Näin saatuun liuokseen lisättiin 2000 ml absoluuttista metanolia l+0°C:ssa, sitten liuos ympättiin 6'-karbobentsoksi-1,3,3"-trisalisylaalikanamysiini A:lla ja sen annettiin jäähtyä ja kiteytyä 0,5-1 tuntia. Sitten lisättiin 2000 ml vettä 1/2 tunnin aikana ja sekoitettiin hyvin 2 tuntia noin 22-25°C:ssa.

Sitten lämpötila laskettiin tunnin ajaksi 0-5°C:een.

10 6021 7

Sakka poistettiin suodattamalla ja pestiin 900 ml:11a kylmää 2:1 metanoli-vesiseosta ja sitten 800 ml:11a metanolia. Suodos ja pesunesteet otettiin talteen. Sakka oli pääasiassa talteenotettua 6'-karbobentsoksi-1,3,3"-trisalisylaalikana-mysiini A:ta.

Yllä saatu suodos ja pesunesteet laimennettiin 1000 ml:11a vettä. Tähän lisättiin 2000 ml metyleenikloridia. pH säädettiin 25°C:ssa 1,8-2,0:aan 6-n HCl:llä. Tämä pH pidettiin 1/2 tuntia.

Metyleenikloridikerros erotettiin ja vesikerros pestiin vielä 2000 ml:11a metyleenikloridia. Yhdistetyt orgaaniset faasit otetaan talteen mahdollisen salisyylialdehydin talteenottamiseksi.

Vesifaasin pH kohotetaan 3,5~^»0:aan väkevällä ammoniumhydroksidilla.

2 Tämä liuos hydrattiin huoneen lämpötilassa paineessa 3,5 kg/cm vetykaasulla 5 #:sen Pd/C:n läsnäollessa. Halutun tuotteen biosaanto liuoksessa oli 30—U5 % teoreettisesta.

Lähtöaineena käytetyn N-hydroksi-5-norborneeni-endo-2,3-dikarboksimidin (HONB) (XIX) valmistus

Valmistus suoritettiin L. Bauer'in ja S.V. Miarka'n (J. Org. Chem., 2U, 1293, (1959)) menetelmällä. 5~norborneeni-endo-2,3-dikarboksyylihappoanhydridiä (115 g, 0,T moolia) lisättiin hydroksyyliamiiniliuokseen, joka oli valmistettu lisäämällä *+7,5 g (0,1+5 moolia) natriumkarbonaattia hydroksyyliamiinihydro-kloridin (60,5 g, 0,87 moolia) liuokseen 1^0 ml:ssa vettä. Seosta kuumennettiin tunnin ajan 60~70°C:ssa ja seisotettiin yli yön jääkaapissa. Kiteet erotettiin suodattamalla, pestiin 120 ml:lla kylmää 5~n HCl:ää ja kuivattiin, jolloin saatiin 8U,9 g (70 %) yhdistettä XIX, sp. 172°C. Eraäliuos tehtiin happameksi pH 2:een ja uutettiin CHCl^lla (70 ml x 10). Haihduttamalla CHCl^uutokset saatiin toinen erä yhdistettä XIX (7,2 g, 6 #), sp. 170-172°C.

Esimerkki U

Yhdisteen IV valmistus käyttäen erilaisia #-määriä N-hydroksi-5-norborneeni- 2.3-dikarboksi-imidiä samalla pitäen muut mooli-#:t vakioina Käyttämällä esimerkin 3 menetelmässä siinä käytetyn N-hydroksi-5-norbornee-ni-2,3-dikarboksi-imidimäärän (0,12 moolia HONB) sijasta seuraavia vaihtelevia mooliprosentteja olivät yhdisteen IV ^-saannot seuraavat:

Koe_Mooli-# HONB_Yhdisteen IV saanto # 1 0 9,33 2 2 20,07 3 10 31,72 k 50 36,52 5 100 36,01 11 6021 7

Yllä olevista tuloksista nähdään, että reaktiossa saadaan yhdistettä IV täysin ilman HONB:ia. Kuitenkin voidaan myös havaita, että parhaat yhdisteen IV saannot saadaan kun HONB:in mooli-# on 10-50 % asylointireaktiossa käytetyn 1*-bentsyylioksikarbonyyliamino-2-hydroksivoihapon moolimäärästä. Suojatun kanamysii-ni A:n asylointireaktion täsmällistä mekanismia ei tunneta. On kuitenkin huomattu, että H0NB:n läsnäolo jostakin syystä tuottaa parempia saantoja kuin aikaisemmin saadut.

Claims (2)

1. 6021 7 Patenttivaatimus: Menetelmä 1-/L-(-)-Y-amino-c*-hydroksibutyryyli7-kanamysiini A:n valmistamiseksi, jolla on kaava HO CVNH2 H° >4 H° 1 NH_ ° VK ch2oh ho —i-7\\ H0-I / — NH 'y'*-o / c=o H N --1- \ / ΤΆ / HO \ / CH2 ° CH? m2 tunnettu siitä, että kaavan H ° ho ch2-n-c-o-ch2-c6h5 H°^—7\\ 111 H° A z CHpOH HO^—— ho>L *-Wa/ “ V 13 £0217 mukainen yhdiste, jossa Z on ryhmä -»=0^0, -„^0-och3, HO H ,/Λ · H -N=C-^ y tai -N=C-C -CH3 \=/ Sv'CH3 saatetaan in situ reagoimaan vähintään moolisuhteessa 1:0,5 yhdisteen kanssa, jolla on kaava 0 2
2. 2 I ) N-0-C-CH-CH2-CH2-NH-C-0-CH2-CgH XX OH 0 ja reaktiotuote hydrataan in situ kaavan IV mukaiseksi yhdisteeksi. 6 0 21 7 1U Förfarande för framställning av 1-/L-(-)-*J^"-amino-o^-hydroxibutyryl7-kanamycin A med formeln HO —K PH2-NH2 HO \ NH V_ ch2oh ho —j-7\\ HO—^ -o / c=o 7"Λ / HOiH „0 V c„ m2 kännetecknat därav, att main omsätter föreningen med formeln H S CHo-N-C-0-CHo-C£Hc HO -V 2 2 6 5 HO 0- CH20H ho -j--tO\ /^z z / HO 0