DE3045910C2

DE3045910C2 -

Info

Publication number: DE3045910C2
Application number: DE3045910A
Authority: DE
Inventors: Ian Dr. 3470 Hoexter De Gatfield
Original assignee: Haarmann & Reimer 3450 Holzminden De GmbH
Current assignee: Haarmann & Reimer 3450 Holzminden De GmbH
Priority date: 1980-12-05
Filing date: 1980-12-05
Publication date: 1987-08-27
Also published as: DE3045910A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Isolierung von Bitter stoffen sowie ein Verfahren zur Isolierung von Bitterstoffen aus Gemischen, die diese Bitterstoffe enthalten.

Es ist bekannt, daß biologische Markomoleküle und Biopolymere wie Enzyme, Antigene und Lektine durch Affinitätschromatographie aus sie enthaltenden Ge mischen isoliert werden können (Kirk Othmer, 3. Auf lage, 6, 35 (1979)). Bei den nach dem bekannten Ver fahren abgetrennten biologischen Makromolekülen und Biopolymeren handelt es sich um chemisch gleichartige Verbindungen. Ferner ist aus "Brautechnische Analysen methoden" von Prof. Dr. F. Drawert, Band I, 1978, S. 228/229 ein Verfahren zur Isolierung von Bitter stoffen bekannt, bei dem die einzelnen Bitterstoffe eines Bitterstoff-Gemisches durch Adsorption an Ionenaustauscher und nachfolgende Gradientenelution gewonnen werden.

Bitterstoffe sind chemisch verschiedenartige Verbindungen, die einen bitteren Geschmack aufweisen. Zur Definition vgl. "Römpps Chemie- Lexikon", Bd. 1: A-C, 1972, S. 377. Als Bitterstoffe seien beispielsweise Naringin, Chininsulfat, Coffein, Theobromin, Gentiopikrin, D-Gentiobiose und bitter schmeckende Proteinhydrolysate genannt.

Mit dem erfindungsgemäßen Mittel, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, können die Bitterstoffe aus allen Gemischen isoliert werden, in denen sie enthalten sind. Bevorzugt können Bitterstoffe aus Extrakten von behandelten und unbehandelten Pflanzen und Früchten, wie z. B. Enzian- und Kakaoextrakt und Proteinhydroly sate wie z. B. Caseinhydrolysat, isoliert werden.

Die Affinitätschromatographie als Trennmethode ist an sich bekannt (Kirk-Othmer, 3. Auflage, 6, 35-54 (1979)). Erfindungsgemäß führt man sie durch, indem man das den Bitterstoff enthaltende Gemisch mit einer unlöslichen Matrix in Kontakt bringt, auf der Bitterstoffrezepto ren fixiert sind, die durch Extraktion von zerkleinertem Tierzungengewebe mit Wasser gewonnen werden. Die Bitterstoffe werden von den Bitterstoffrezeptoren adsorbiert und nach Ent fernen der Begleitstoffe mit einer Pufferlösung desorbiert.

Als unlösliche Matrix kommen die für die Affinitäts chromatographie üblicherweise zu verwendenden Materia lien wie z. B. Polyacrylamidgel, Cellulose und Gele, die aus Dextran und Epichlorhydrin hergestellt werden, in Frage. Bevorzugt kann man Agarosegele wie z. B. SEPHAROSE ® verwenden.

Zur Fixierung der Bitterstoffrezeptoren kann man bevorzugt die Matrix mit Cyanogenbromid (CNBr) aktivieren. Die Aktivierung kann wie in Nature 214, Seite 1302 (1967) beschrieben, durchgeführt werden.

Als Desorbens seien die üblicherweise verwendeten Puffer lösungen wie z. B. Alkaliacetate, -phosphate und -borate genannt. Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man vorzugsweise eine Lösung von Natrium chlorid in Wasser. Insbesondere bevorzugt wird eine 2,5 bis 20 gew.-%ige wäßrige Natriumchloridlösung.

Als Bitterstoffrezeptoren werden erfindungsgemäß die Rezeptoren verwendet werden, die sich in den Zungen, bevorzugt dem hinteren Teil der Zungen, von Tieren (insbesondere Säugetieren) befinden und aus dem Ge webe gewonnen werden. Insbesondere bevorzugt gewinnt man die Bitterstoffrezeptoren aus dem hinteren Teil von zerkleinerten Rinderzungen, in dem die Bitter keit sensorisch wahrgenommen wird.

Die Gewinnung der Bitterstoffrezeptoren wird durch Extraktion des zerkleinerten Gewebes mit Wasser, Ab trennung der Feststoffe und nachfolgender Gefrier trocknung erfolgen. Zur Isolierung der Bitterstoff rezeptoren unterwirft man eine etwa 25%ige wäßrige Lösung des aus den Zungen gewonnenen Extraktes einer Affinitätschromatographie auf einer Matrix, beispiels weise epoxy-aktiviertes Agarosegel, auf dem ein Bitter stoff, beispielsweise Naringin, gebunden ist. Nachdem die Begleitstoffe, vorzugsweise mit Wasser, eluiert sind, werden die adsorbierten Bitterstoffrezeptoren durch ein Desorbens, beispielsweise eine wäßrige Na triumchloridlösung, desorbiert. Nach Abtrennung des Salzes wird der Bitterstoffrezeptor aus der wäßrigen Lösung durch Gefriertrocknung isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl im analy tischen als auch im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah rens richtet sich nach der zu verarbeitenden Menge des Bitterstoffes. Es ist möglich, das erfindungsgemäße Ver fahren in einem Rührgefäß oder einer Chromatographie säule durchzuführen. Im allgemeinen wird die Durch führung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Chromatographiesäule bevorzugt, weil es sich auf die se Weise am leichtesten (beispielsweise durch Auto matisierung) handhaben läßt.

Die zur Abtrennung der Bitterstoffe aus einem die Bitterstoffe enthaltenden Gemisch benötigte Matrix menge wird im allgemeinen empirisch bestimmt, da stärker bittere Stoffe auch stärker absorbiert wer den. Vorzugsweise können 0,5 bis 15 mg, insbesondere bevorzugt 3 bis 10 mg des Bitterstoffrezeptors auf 1 ml der Matrix fixiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Abtrennung der Bitterstoffe aus einem die Bitterstoffe enthaltenden Gemisch kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

Die für das Trennverfahren zu verwendende Matrix wird mit Cyanogenbromid aktiviert und mit einer wäßrigen Lösung der Bitterstoffrezeptoren behandelt. Hierbei werden die Bitterstoffrezeptoren auf der Matrix fixiert.

Das Bitterstoff enthaltende Gemisch wird in einer für die Affinitätschromatographie üblichen Weise auf die die Bitterstoffrezeptoren tragende Matrix gebracht. Die nicht-adsorbierte Komponente des Gemischs wird mit Wasser eluiert. Das Ende des Eluierens kann mit übli chen Methoden, beispielsweise mit einem UV-Detektor, festgestellt werden.

Das nachfolgende Abtrennen des Bitterstoffs erfolgt mit einer Pufferlösung als Desorbens. Die Lage der Bitterstofffraktion wird ebenfalls mit einem üblichen Detektor festgestellt.

Es ist überraschend, daß es mit Hilfe des erfindungs gemäßen Verfahrens möglich ist, Bitterstoffe aus chemisch so unterschiedlichen Verbindungsklassen wie Alkaloide, Purine, Glucoside und Peptide zu isolie ren, andererseits aber Verbindungen wie Purine, z. B. Adenin und Xanthin, die den bekannten Bitterstoffen Theobromin und Coffein sehr nahe verwandt sind, aber selber nicht bitter schmecken, nicht zurückge halten werden.

Beispiele Isolierung der Bitterstoffrezeptoren

300 g des hinteren Teiles von Rinderzungen werden zer kleinert und in 350 ml destilliertem Wasser 2 Stunden bei Zimmertemperatur kräftig gerührt. Dann wird über Gaze filtriert und das Filtrat durch Zentrifugieren von Trübstoffen befreit und gefriergetrocknet. Man erhält etwa 10 g eines Rinderzungenextraktes in Form eines rotbraunen Pulvers.

Naringin wird auf epoxy-aktivierte SEPHAROSE 6 B ® fixiert und mit dem so er haltenen Naringin-Agarosegel eine Glassäule (8 cm lang, 1,5 cm Durchmesser) gefüllt. 680 mg des Rinderzungen extraktes werden in 2 ml Wasser gelöst, auf die Säule aufgetragen und langsam solange mit bidestilliertem Wasser eluiert, bis in einem nachgeschalteten, bei 254 nm arbeitenden UV-Detektor die Extinktion des Eluates auf den Ausgangswert des Eluationsmittels zurückge gangen ist. Dann wird mit einer 10 gew.-%igen Natrium chloridlösung weiter eluiert. Der UV-Detektor zeigt die Fraktionen an, in denen sich die durch den Salz stoß freigesetzten hochmolekularen Proteine der Bitter stoffrezeptoren befinden. Das Naringin-Agarosegel in der Glassäule wird nun solange mit destilliertem Wasser ge waschen, bis die Leitfähigkeit des ablaufenden Wassers auf den Wert von destilliertem Wasser zurückgegangen ist. Dann wird der Reinigungsvorgang des Rinderzungenextrak tes solange wiederholt, bis die 10 g Rinderzungenextrakt verbraucht sind. Dann werden die Fraktionen mit den retardierten Bitterstoffrezeptoren vereinigt, auf einer Polycrylamidgel enthaltenden Säule (z. B. Biogel P-2) entsalzt und gefrier getrocknet. Man erhält 29,5 mg Bitterstoffrezeptoren in Form eines weißen Pulvers. Die Bitterstoffrezeptoren zeigen die Biuretreaktion.

14,8 mg der so isolierten Bitterstoff rezeptoren werden an eine durch 2 g Cyanogenbromid ak tivierte SEPHAROSE 4 B ® gekoppelt und nach dem Waschen mit destilliertem Wasser in eine Glassäule (7,5 cm lang, 0,8 cm Durchmesser) gefüllt.

Beispiel 1

10 mg Chininsulfat werden in 1,5 ml destilliertem Was ser soweit wie möglich gelöst, unlöslicher Bodensatz durch Zentrifugieren entfernt und die Lösung auf die Chromatographiesäule aufgetragen. Zur Entfernung von nicht-gebundenem Chininsulfat wird die Säule solange mit bidestilliertem Wasser eluiert, bis im nach geschalteten, bei 254 µm arbeitenden UV-Detektor die Extinktion des Eluates auf den Ausgangswert des Elutions mittels zurückgegangen ist. Dann wird mit einer 10 gew.-%igen Natriumchloridlösung eluiert, wobei der UV-Detektor einen deutlichen Peak zeigt. Aus der UV- Extinktion kann unter Berücksichtigung der molaren Extinktionskoeffizienten die retardierte Menge an Chininsulfat ausgerechnet werden. Sie beträgt 18,1 · 10^-2 mg. Das UV-Spektrum der retardierten Fraktion ent spricht dem des Chininsulfats mit seinen typischen Maxima bei 280 und 330 nm.

Werden anstelle von Chininsulfat Coffein bzw. Theobro min eingesetzt, so betragen die retardierten Mengen 0,59 · 10^-2 mg bzw. 0,45 · 10^-2 mg. Wie aus den retar dierten Mengen zu ersehen ist, besteht eine enge Korrelation (r = + 0,99; n = 4) zwischen ihnen und den aus H. Aebi et al., Kosmetika, Riechstoffe und Lebens mittel, Zusatzstoffe, Stuttgart 1978, Seite 198/199 bekannten Bitterwerten (Chinin = 100; Coffein = 8; Theobromin = 5).

Beispiel 2

Analog zu Beispiel 1 werden 21 mg D-Gentiobiose, ein bitter schmeckendes β-verknüpftes Disaccarid, auf die Chromatographiesäule gegeben. Gebundene Gentiobiose wurde mit 10 gew.-%iger Natriumchloridlösung von der Säule eluiert und im Eluat mit dem Phenol-Schwefelsäure- Reagenz (Reske K. und Schott H., Angew. Chem., Int. Ed., 12, 417 (1973) bei 485 nm im nachgeschalteten Detektionsschritt nachgewiesen.

Beispiel 3

Enzianextrakt, der nach "Riechstoffe, Aromen, Kosmetika" 27 (1977), Heft 5, S. 120 den Bitterstoff Gentiopikrin enthält, wird in Wasser suspendiert, durch Filtration von Fest stoffen befreit und gefriergetrocknet. 56 mg des so gewonnenen Extraktes werden in 1,0 ml Wasser gelöst und entsprechend Beispiel 1 auf die Chromatographiesäule gegeben. Das Gentiopikrin wird mit 10 gew.-%iger Na triumchloridlösung von der Chromatographiesäule elu iert und zeigt wie erwartet mit dem Phenol-Schwefel säure-Reagenz, eine positive Reaktion bei 485 µm

Beispiel 4

600 mg Caseinhydrolysat (Hydrophobizitätswert Q = 1298) werden in vier Portionen entsprechend Beispiel 1 auf die Chromatographiesäule gegeben. Die adsorbierten Peptide werden mit 10 gew.-%iger Natriumchloridlösung von der Chromatographiesäule eluiert, auf einer Polyacryl amidgel enthaltenden Säule entsalzt und vereinigt. Es werden 32,8 mg einer Peptidfraktion entsprechend einer Ausbeute von 5,5% bezogen auf das Caseinhydrolysat, erhalten.

Eine sensorische Prüfung durch ein Testgremium ergab, daß die so erhaltene Fraktion eindeutig bitterer schmeckte als das Ausgangshydrolysat. Die Aminosäure analyse und der daraus errechnete mittlere Hydropho bizitätswert Q = 1411 bestätigte das sensorische Er gebnis. Wie aus der Zeitschrift "Lebensmittelfor schung und Untersuchung" 147, 64 (1971) zu entnehmen ist, schmecken Peptide mit Q < 1400 bitter.

Claims

1. Mittel zur Isolierung von Bitterstoffen aus diese ent haltenden Gemischen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer unlöslichen Matrix besteht, auf die Bitterstoff rezeptoren fixiert sind, die durch Extraktion von zer kleinertem Tierzungengewebe mit Wasser gewonnen wurden.

2. Verfahren zur Isolierung von Bitterstoffen aus einem diese enthaltenden Gemisch durch Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Gemisch eine Affinitätschromatographie an einer unlöslichen Matrix durchführt, auf der Bitterstoffrezeptoren fixiert sind, die durch Extraktion von zerkleinertem Tierzungengewebe mit Wasser gewonnen wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix Agarose-Gel, Polyacrylamid-Gel, Cellulose oder ein aus Dextran und Epichlorhydrin hergestelltes Gel eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,5 bis 15 mg, vorzugsweise 3 bis 10 mg des Bitter stoffrezeptors auf 1 ml Matrix fixiert.