JP2746287B2 - 脂質置換治療法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，心筋組織の脂肪組成の年齢に応じる変化，
および他の年齢に応じる生理学的性質の回復の方法に関
する。 （参考文献） 1.Barenholz,Y.ら,Biochemistry,15;2441（1976a）． 2.Barenholz,Y.ら,in Enzymes in Lipid Metabolism（G
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b）． （従来の技術） 老化により生ずる生化学的変化のひとつに膜の脂質組
成の変化がある。哺乳類の細胞膜においては，主な変化
はフォスファチジルコリン（PC;年齢と共に低下す
る），およびスフィンゴミエリン（SM）およびコレステ
ロール（年齢と共に増加する），の相対組成について起
こる（Barenholz）。PCとSMとの相対量の変化はリン脂
質の代謝回転の低い組織で特に大きい。例えば，大動脈
および動脈に関連する細胞膜は老化とともにPC/SM比が
６倍低下する。SMはまた動脈硬化を含むいくつかの病気
において増大する。このSM含量は大動脈の障害が進行す
ると総リン脂質の70〜80％と高くなる（Barenholz 198
2,1984）。 生体膜に由来するPCとSMとの最も顕著な差は，（ａ）
脂質の相転移温度，および（ｂ）脂質二重層中の２つの
脂質の水素結合特性である。大部分のスフィンゴミエリ
ンは30℃と40℃の間の範囲の生理学的温度に転移温度が
あり，これに対して，大部分の天然のフォスファチジル
コリンは転移温度が37℃より充分に高い（Barenholz 19
80,1982,1984）。水素結合に関しては，これら２つの脂
質の極性領域の差がSMを水素結合における水素の供与体
および受容体の両者にさせ得，一方PCは水素供与体のみ
になり得る。 これらの差に関連しているか否かは別として，哺乳動
物の細胞膜のPCのSMに対する相対含量は細胞機能に重大
に影響すると思われる。本発明者および共同研究者は最
近，時間の超過した培養での脂質組成および一次ラット
ミオサイトの活性の変化について報告した。細胞のPC
およびSM含量の測定によれば，培養の最初の３日間で
は,PC/SM比が５から約２に，そして，培養の次の14日間
にわたっては２から約１に低下するのが示された。脂質
組成の変化は，培養細胞の搏速度で測定したところ，心
臓細胞活性の劇的な変化を伴っていた。培養の７日〜12
日の間において，搏数／分は約160から約20へ低下し，
そしてVmax/DNAで表される，少なくとも７つの酵素の活
性の顕著な増大もまた観察された。これらの酵素の１つ
はクレアチンホスホキナーゼ（CPK）であり，これはミ
トコンドリアからミオフィブリルへの細胞内エネルギー
の輸送とエネルギー利用に連結したエネルギー生産の調
節とに大きな役割を果たしている（Yechiel 1985a,1985
b）。 コレステロールのリン脂質に対する比もまた，生体膜
の性質を調節する重要な決定因子であるらしい（Cooper
1977）。いくつかの研究により，生体膜のある性質は
コレステロールの増大または減少により変化し得ること
が示された（Borochov,Cooper 1978,Hasin）。一般に，
哺乳類の細胞膜ではSMおよびコレステロールレベルの変
化に強い正の相関がある。つまり，一方の含量の変化に
他方の変化が伴う（Wallach,Barenholz 1982,1984）。 いかに細胞がその異なった膜で種々の脂質組成を維持
するのか，または，なぜ脂質組成が老化により変化する
のかは明らかでない。理論的には，脂質の組成の変化
は，特異的脂質成分の合成または分解の速度の変化，も
しくは血清および細胞膜間での脂質の交換または輸送の
速度の変化の結果であり得る。後者の機構については，
培養生物細胞の脂質交換のインビトロ実験に関して強い
関心が払われた。多くの研究において，生体膜と人工の
脂質二重層小胞またはリポソームとの間での脂質交換が
示された（Pagano,Martin,Cooper 1977,Frank）。一般
に，細胞およびリポソーム間のリン脂質の交換は，高お
よび低密度血清アポリポタンパクを含む種々のリン脂質
輸送タンパクの存在により促進される（Wirtz,Kade
r）。生体膜およびリポソーム，および／または血清リ
ポタンパク粒子間のコレステロール交換もまた，よく知
られている（Hasin,Grunze,Pal）。 脂質交換により生体膜の脂質組成を変化させ得ること
は，細胞機能に対する脂質変化の効果を研究する手段を
提供する。例えば，上述のミオサイト培養系（時間の超
過した培養でPC/SM比の低下が搏頻度の低下を伴う）に
おいて，（ａ）細胞のもとの脂質組成が脂質交換により
回復され得るか；そして（ｂ）もしそうであれば，もと
の細胞機能，つまり最初の搏速度，もまた回復するか，
を問うことができる。本発明者および共同研究者は，小
単一層PCリポソームを細胞との脂質交換用の小胞として
用い，この問題の研究を行った（Yechiel 1985a,1985
b）。この研究により，脂質交換がPC/SMおよびPC/コレ
ステロール比の両者を増大させ，そして時間の超過した
培養細胞において正常な脂質組成への変化を回復させる
ことが示された。興味深いことに，脂質交換はまた，細
胞をPCリポソームに接触させた１日以内に搏頻度が約20
から160へ上昇するというように，細胞の搏頻度をその
もとのレベルに回復させた。脂質交換はまた，培養の経
過と共に通常増大するCPKのような細胞酵素を減少させ
た。 （発明の背景） 本発明の重要な観点によれば,PCに富んだリポソーム
が，消化管外の（非経口）投与により該リポソームを与
えられた動物の心筋細胞の脂質組成の年齢に関する変化
を回復させ得ることが見い出された。このリポソーム処
理の１つの重要な利点は，通常年齢とともに漸減する
（ラットでは約15ヶ月を越える年齢で始まる）呼吸スト
レスに抵抗する能力が有意に改善されることである。さ
らに，脂質交換とそれに付随する呼吸耐久力の改善は，
最初のリポソーム投与から数日以内に現れる。この方法
は家畜動物とヒトとの両方に適用し得る。 本発明の他の観点によれば，心筋脂質交換におけるリ
ポソーム処理の効果は，多くの生理学的変化に反映され
る。この変化は，処理した個体（家畜動物またはヒト）
の血清サンプルで容易に観察できる。これらの変化の１
つは，血清クレアチンホスホキナーゼ（CPK）の相対的
に若い動物の特性であるレベルへの低下である。典型的
には，相対的に老齢の動物の血清CPKは，リポソーム投
与を始めた後数日で50％またはそれ以上低下する。処理
動物で容易に見られる他の変化は浸透圧ショックに対す
る赤血球細胞の大きな耐性である。繰り返して述べれ
ば，この変化はより老齢の動物で最も強く見られ，処理
した個体の細胞はより若年のその動物の特性である浸透
圧的強度を示す。浸透圧的強度の変化はおそらく，リポ
ソーム処理の結果，赤血球細胞においてPC/SMおよび／
またはリン脂質／コレステロール比がより大きくなるこ
とによるものである。 本法を実施するには，ほぼ同年齢の個体の心臓組織に
特徴的に見られるものより実質的により多いPCと実質的
により少ないSMとを含むリポソームの懸濁液が提供され
る。ある好ましい実施態様においては，このリポソーム
は，主として0.02〜0.08ミクロンのサイズを有する小さ
い単層小胞（SUVs）であり，主としてまたはもっぱら，
卵PCのような精製PCからなる。このリポソーム懸濁液
は，少なくとも数日間にわたり，処理動物の血清CPKの
レベルを実質的に低下させるのに有効な量で投与され
る。処理の経過は，血中CPK,または血液細胞の脂質組成
または浸透圧的強度変化を監視することにより追跡され
得る。 リポソーム処理法の他の重要な利用は，処理個体の寿
命の増大についてである。実験動物での研究により，比
較的老齢の動物を長期間にわたりリポソームで処理する
と動物の寿命が，平均約36％延びることが示された。 本法のさらに他の重要な利用は，オスの生殖能力の増
強に対してである。本発明による比較的老齢の実験動物
のリポソームでの処理は，より老齢のオスの動物で通常
見られるほぼ完全な能力の消失を回復させた。この方法
はより老齢の育種動物の処理に特に有用である。 従って，本発明の一般的な目的は，動物の呼吸ストレ
スへの抵抗能力を有意に高める方法で老齢個体を処理す
る方法を提供することである。 本発明の関連した目的は，心筋細胞の年齢に関係した
脂質組成の変化を回復させるような方法を提供すること
である。 本発明の他の目的は，処理の経過が血清酵素レベルま
たは赤血球細胞特性の変化により容易に監視できるよう
な方法を提供することである。 本発明のさらに他の目的は，老齢の個体により長い寿
命や性機能を含む質的な利点をもたらす方法を提供する
ことにある。 本発明のこれらおよび他の目的，そして特徴は，次の
本発明の要旨によりさらに充分に理解されるであろう。 （発明の要旨） I.リポソームの調製 A.サイズの不均一なリポソーム 本発明はひとつの局面においては，器官や組織（例え
ば心筋細胞および血球細胞）の脂質組成の年齢に関連し
た変化を，脂質交換により回復させるために，個体（家
畜動物またはヒト）へ非経口的にリポソームを投与する
ことを包含する。心筋の老化過程には,PCの低下および
付随したSMおよびコレステロールの上昇という特徴があ
る。そのため，該リポソームは，リポソームから心臓細
胞膜へのPCの交換，および心筋からリポソームへのSMの
交換を促進するように設計される。このリポソームはま
た，好ましくは器官および組織（例えば，心筋細胞およ
び赤血球細胞）からリポソームへのコレステロールの交
換を促進するように設計される。 所望の脂質交換を促進するために，処理される個体の
心臓組織の値（つまり，同年齢，種，および性の個体に
特徴的なPCおよびSMのレベル）よりリポソームPCのモル
％は実質的に高く，そしてリポソームSMのモル％は実質
的に低い。好ましくは，このリポソームは処理される個
体の心筋細胞より，少なくとも約25モル％高いPCと少な
くとも約10モル％低いSMとを含有する。実施例Ｉ〜VIII
に述べられ，そして使用されるひとつの好ましいリポソ
ーム標品においては，該リポソームは実質的に純粋なPC
で形成される。これらのリポソームは，実施例IIで見ら
れるように，心臓細胞のPC/SM比を増大させ，そしてコ
レステロールレベルを低下させるように作用する。コレ
ステロール減少の程度は，コレステロール量を０から処
理個体の心筋細胞中の量に相当するモル％にまで増大さ
せることにより，最大の減少から事実上減少しないとこ
ろまで変えることができる。 リポソーム脂質の選択において他に考慮する重要な事
柄は，リン脂質のアシル鎖組成である。上述のように，
年齢と共に起こるPCからSMへのリン脂質のシフトはま
た，膜リン脂質のアシル鎖部分の飽和度と鎖長との全体
的な増大を伴う。従って，脂質のPC成分は，少なくとも
遷移温度に関しては，より若い年齢の動物の心臓細胞の
アシル鎖組成の特徴であるアシル鎖組成を有することが
望ましい。ひとつの好ましい組成は卵PCであり，これは
主に１−パルミトイル,2−オレイルPCと１−パルミトイ
ル,2−リノレイルPCを含む。 このリポソームは，免疫源とならずそしてリポソーム
と心筋細胞間の所望の脂質交換を阻害しない限り，他の
脂質成分を含み得る。付加的な成分には，ホスファチジ
ルグリセロール（PG）またはホスファチジルセリン（P
S）のような，負荷電の脂質が含有され得る。もちろ
ん，これらの脂質のモルパーセントはPCに対し相対的に
低くなければならない。α−トコフェロール（α−
Ｔ），α−トコフェロール酢酸，またはα−トコフェロ
ールコハク酸のような脂質保護剤もまた，遊離ラジカル
損傷に対し該脂質成分を保護するために，リポソームを
形成する脂質に包含され得る（Levida）。典型的には，
そのような試薬は約0.5％〜２％の間のモルパーセント
で含まれる。リポソーム中のビタミンＥとポリ不飽和脂
質間のバランスを保つために，リポソームにα−Ｔを加
えることは有利である。 リポソーム形成の種々の方法が利用でき，そしてこれ
らは詳細に総説中で述べられている（Szoka1980）。一
般にこれらの方法は，約0.02から10ミクロンまたはそれ
以上の不均一なサイズのリポソームを生じる。後述のよ
うに，比較的小さく，そしてサイズが決まったリポソー
ムが本発明の実施には好ましいので，サイズと不均一性
を下げるためのリポソーム懸濁液の第２の処理段階が通
常要求される。 第１のリポソーム懸濁液を形成するひとつの好ましい
方法においては，小胞を形成する脂質を適当な有機溶媒
系にとり，そして真空でまたは不活性ガス下で，容器内
に脂質膜を形成するように乾燥させる。滅菌食塩水のよ
うな水性懸濁媒体をこの膜に加え，そして容器を脂質が
完全に水和するまで，典型的には１〜２時間の間攪拌す
る。加えられる水性媒体の量は、好ましくは100ml当た
り約10〜30gの脂質を含むリポソーム懸濁液が生成する
ような量である。 この脂質は水和し，そのサイズが約0.5ミクロン〜約1
0ミクロンまたはそれ以上の多層小胞（MLV）を形成す
る。一般に,MLVのサイズ分布は，さらに激しい振盪条件
下での脂質の水和によりわずかにより小さいサイズに移
行する。実施例１は，リポソームのサイズを減じるため
に超音波照射でMLVを処理するのに先立つ，卵PC MLVの
調製を述べる。 リポソーム形成に用いられる水性媒体は，リポソーム
の保存時の安定性を増す１種もしくはそれ以上の水溶性
試薬を含んでもよい。ひとつの好ましい安定化剤は，デ
スフェリオキサミンのような鉄特異的トリヒドロキサミ
ンキレート化剤である。脂質の過酸化と薬剤含有リポソ
ームの遊離ラジカル損傷を減じるためのこの化合物の使
用は,1985年12月６日出願の“リポソーム／アントラキ
ノン薬剤組成物および方法”という米国特許出願で報告
されている。簡単に述べれば，α−Ｔのような親油性の
遊離ラジカル捕捉剤と水溶性キレート化剤との組み合わ
せは，どちらか一方の保護剤のみの場合より，脂質の過
酸化損傷に対し，実質的に優れた保護効果をもたらすこ
とが示された。このキレート化剤は媒体中の遊離鉄の量
より過剰なモル数で水性媒体に含まれる。典型的には，
約10〜50μＭのキレート化剤濃度で充分である。 B.リポソームのサイズの調整 リポソーム懸濁液は，小胞の選択的なサイズ分布を達
成するために，約１ミクロン未満，好ましくは約0.2〜
0.3ミクロン未満の範囲となるように，サイズ調整を行
ってもよい。このサイズの範囲にあるリポソームは，デ
プス フィルター（depth filter）での濾過によって，
容易に滅菌され得る。より小さい小胞は，また，保存中
に集合する傾向が小さい。従って，該組成物が非経口投
与される場合，血管の閉塞という深刻な問題を潜在的に
減少させる。最終的にサブミクロンの範囲にサイズを小
さくしたリポソームは，均一な生物学的分布および薬剤
除去特性を示す。 リポソームのサイズ，およびサイズの不均一さを減少
させるのに，本発明に適したいくつかの手法が有効であ
る。バスまたはプローブソニケーションによりリポソー
ム懸濁液に超音波照射することにより，顕著なサイズの
減少をおこし，約0.02〜0.08ミクロンの間のサイズの小
さい単一層小胞（SUV）が生じる。SUVを調製するのに使
用する超音波手法は実施例１に示される。ホモジナイゼ
ーションは，剪断エネルギーにより，大きなリポソーム
断片をより小さなものにするもう一つの方法である。典
型的なホモジナイゼーション法において,MLVは，標準的
なエマルジョンホモジナイザーにより，選択したポリー
ムサイズ（典型的な場合，およそ0.1〜0.5ミクロンの
間）が観察されるまで，再循環される。いずれの方法に
おいても，粒子のサイズの分布は，通常のレーザービー
ム粒子サイズ判別装置によって監視され得る。 小孔ポリカーボネート膜を通してのリポソームの押出
は，リポソームのサイズを，比較的良く特定されたサイ
ズ分布（膜孔のサイズに依存して，平均約0.03と１ミク
ロンの間の範囲にある）にまで減少させるための効果的
な方法である。典型的には，所望のリポソームのサイズ
分布が得られるまで，懸濁液を膜を通して数回循環させ
る。リポソームのサイズを段階的に減少させるために，
リポソームは孔が連続的に小さくなっている膜を通して
押出され得る。 より最近では,1ミクロンを越えるおよび１ミクロンを
下まわる不均一なサイズのリポソームの懸濁液を，非対
称セラミックフィルターを通過させることにより，効率
的にサイズ調整され得ることが発見された。好ましいセ
ラミックフィルターは，セラフロー ミクロフィルター
（Ceraflow Microfilter）であり,0.2〜１μの内部表面
小孔サイズを有する。ノートン社（Norton Company;Wor
cester,MA）より市販品が入手され得，これは，マルチ
フィルターカートリッジタイプ濾過器として供給されて
いる。このサイズ調整の方法は，米国特許出願に“リポ
ソーム押出法”として記述され,1986年２月13日に出願
されている。 １ミクロンより小さい選択された閾値を下まわるサイ
ズの粒子を有するリポソーム懸濁液を生成するのに用い
られる他の方法として，遠心分離および分子ふるいクロ
マトグラフィーがあげられる。これらの２つの方法は，
大きな粒子を小さな粒子へ変化させるというよりはむし
ろ，より大きなリポソームを優先的に取り除くというこ
とを包含する。従ってリポソーム収量は低下する。 サイズ調整したリポソーム懸濁液は，通常の0.22ミク
ロン デプス メンブレンフィルターのような，約0.2
ミクロンの粒子識別サイズを持つ除菌膜を通過さすこと
により容易に滅菌し得る。所望であれば，リポソーム懸
濁液は，貯蔵のため凍結乾燥でき，使用直前に再調製し
うる。 II.処理方法および結果 A.リポソームの投与 １つの処理方法では，心筋細胞の脂質組成に所望の変
化がおこるまで，リポソーム懸濁液を１回（dose）また
はそれ以上非経口投与する。心筋細胞の脂質組成の変化
は，血清CPKおよび赤血球の性質の変化を伴い，その処
理の過程は血液のサンプリングによって容易に追跡し得
る。 このリポソームは連続して，簡便に投与でき，少なく
とも数日間にわたって与えることができ，そして好まし
くは処理を受けている個体の生涯にわたって,1〜数ヶ月
の間隔での連続して投与し続けられる。各投与における
リポソームの投与量は，体重1kgあたり約0.01〜1.0gの
間が好ましく，実質的にはそれより少なくてもよい。80
kgの個体に対する典型的な用量は，脂質約40〜80gであ
り，これは20％までのリポソーム懸濁液200ml〜400mlに
相当する。投与は静脈注射により行われ得る。しかし，
投与する部位の組織および血液の損傷を最小にするた
め，少なくとも約１時間をかける静脈点滴によって投与
するのが好ましい。このリポソームは，滅菌食塩水，ま
たはブドウ糖／食塩培地のような栄養分を含むもしくは
薬剤を含む媒質に懸濁し，リポソーム療法を他の非経口
投与療法と組み合わせてもよい。 最初の投与の前に，血清酵素および／または血球の特
徴を決定するために血液のサンプルを採取する。この特
徴は，リポソーム処理の過程において監視される。以下
に考察するように，リポソーム処理は血清CPKレベルの
容易に測定できる低下を引きおこし，そのレベルをより
若い年齢の個体に特徴的なレベルにまで低下させる。こ
のCPKの低下は，おそらく筋肉細胞における年齢と関係
した脂質組成の逆転を反映しており，それについては，
実施例IIおよびIIIでそれぞれ述べる。リポソーム処理
は，少なくとも約25％，好ましくは50％もしくはそれ以
上の血清CPKの低下が観察されるまで続けられる。実施
例２における実験では，血清CPKレベルは，処理後９日
間で処理前の約15％に減少した。 リポソーム処理はまた，赤血球の脂質組成および浸透
圧強度の容易に観察できる変化を与える。これらの変化
は後の実施例IVおよびＶで述べられる。一連の狭い範囲
で勾配をつけた食塩水のひとつに充填した細胞を懸濁す
るときに遊離するヘモグロビンの百分率を測定する簡単
な分光光度技術を用いて，浸透圧に対する強度が決定さ
れ得る。その方法は実施例Ｖで述べられる。 赤血球の脂質組成の変化は，まず赤血球の脂質を抽出
し，次いで，既存のクロマトグラフィー法により，選択
された脂質成分を分離することにより決定され得る。PC
/SM比の決定のために,PCとSMとは，薄層クロマトグラフ
ィー（TLC）により，実施例ＩおよびIVに記述のように
容易に分離され得る。リポソーム処理の経過を監視する
ために，赤血球PC/SM比の変化を追跡することの利点
は，比較的大きなPC/SM変化が観察されることにある。
例えば，実施例IVに記述の９日間処理において,18ヶ月
齢ラットの赤血球のPC/SM比は，ほとんど７倍まで増加
する。 この処理用のリポソームは，心臓組織細胞のような組
織や器官からリポソームへのコレステロールの交換を促
進する（リポソーム中の低コレステロール含量によっ
て）ために設計される場合にも，処理の経過は，コレス
テロール含量の変化をたどることにより，追跡され得
る。膜コレステロールの変化を測定し表示する方法は，
実施例ＩおよびIIIに詳述する。リポソーム処理中の赤
血球におけるリン脂質組成の変化は，一般にPC/SMの変
化よりおだやかである。 この最初のリポソーム投与に続き，血清CPK（または
赤血球の特性）のレベルを測定する。そして，第２のリ
ポソーム用量を，典型的には，この最初の投与の２〜７
日後に与える。測定される血清の特性がプラトーになり
始めるまで，さらに２〜７日の間隔で同じように投与さ
れてもよい。その後，例えば１〜２ヶ月ごとの周期的な
リポソーム処理を続けることにより，個体は所望の脂質
組成の状態が維持され得る。実施例VIIIは，実験動物を
初めに１週間あけて２回のリポソーム投与で処理し，次
いで,2ヶ月ごとに１回リポソームを注射し続ける処理様
式について例示する。この動物は，未処理の動物より少
なくとも36％長生きした。 B.生化学的効果 上記のリポソーム処理を実験動物で試験し，心筋細胞
のうちの年齢に関係した脂質組成の変化を回復させ，呼
吸ストレスに対する耐性を増加させる効果を決定した。
一連の試験において,18ヶ月齢のラットを,3回のリポソ
ーム用量で処理した。この処理は,3日おきに行い、６日
間投与した（３回注射）。最後の注射の３日後に，この
動物を実験に供した。心筋細胞のPC/SMおよびコレステ
ロール含量を，実施例IIに詳述したように決定した。得
られた値を，比較的若い動物（３ヶ月齢）および処理し
ていない18ヶ月齢の動物から得られた値と比較した。そ
の結果は，通常３ヶ月から18ヶ月の年齢の間でおこるPC
/SM比の1/2以上の減少，コレステロール含量の３倍以上
の増加が，このリポソーム処理によって完全に回復した
ことを示す。 この３つの動物群で，実施例IIIに記述のように，そ
の心筋CPKレベルおよび血清CPKレベルも試験した。ラッ
トにおいて３ヶ月齢の動物と18ヶ月齢の動物との間で通
常おこる脂質組成の変化は，心筋細胞CPKおよび血清CPK
の約３倍の増加を伴う。リポソーム処理の９日後，心臓
細胞CPKは通常３ヶ月齢の動物にみられるレベルまで，
約1/3に減少する。また，血清CPKは実質的に３ヶ月齢動
物より著しく低いレベルまで，約1/8に減少する。それ
ゆえ，処理された動物の血清CPKの劇的な減少は，リポ
ソーム処理中におこる心臓脂質変化の感度の高い指標に
なる。処理中に同時におこる心筋CPKの減少は，心筋CPK
のレベルの低下が部分的に血清CPKの減少に起因するこ
とを示す。 上記した心臓細胞の脂質組成の変化を心臓全体のホモ
ジネートで調べた。従って，この変化は，心筋（心臓）
細胞および結合繊維芽細胞の両方から脂質が寄与される
ことを示す。この観察された脂質組成の変化が心筋細胞
での変化をも反映することを確認するため,3ヶ月齢およ
び18ヶ月齢の動物から心臓細胞を単離し，心筋の再集合
を生じる条件下で培養し，次いで，卵PCリポソームとの
脂質交換を試験した。この方法および結果は実施例VIに
詳述する。この再集合物は,3ヶ月齢および18ヶ月齢の動
物からの細胞と比較すると,PC/SM比の減少およびコレス
テロールレベルの増加を示した。また，それらの年齢に
関係した変化は，この卵PCリポソームとのインキュベー
ションにより，実質的に回復した。この結果は，インビ
ボで心臓組織中に見られる脂質の効果が，少なくとも部
分的には，心筋膜脂質の変化によることを示す。 この３つの各動物群からの赤血球で，赤血球中での脂
質組成の変化および浸透圧耐性の変化を試験した。この
結果は，上記および実施例IVおよびＶで論じる。簡単に
言えば，リポソームは,PC/SM比およびコレステロールレ
ベルの年齢に関連した変化（通常３ヶ月齢と18ヶ月齢と
の間でおこる,3ヶ月齢の動物からの心筋では,PC/SM比が
増加しかつコレステロールレベルが減少する）をより大
きく回復させる。脂質組成におこる変化は，より大きな
浸透圧耐性に反映されている。 III.治療上の使用 A.呼吸ストレスに対する耐性の増加 本発明の重要な治療上の応用は，心臓ストレスへの患
者の耐性を増加させることにある。この応用は，心筋梗
塞のような心臓損傷（cardiac trauma）を患っている
人，または，心臓損傷の危険性の高い人に対し有益であ
る。いずれのケースにおいても，酸素要求の増加または
血圧の上昇という形の心臓へのストレスが加わると，心
臓の不全または，心臓への重大な損傷を引きおこす。 この処理の効用は，実験動物で示された。ここでは，
処理前後の動物の心臓ストレスに対する耐性を，標準的
な実験室方法により測定した。この方法では，容量の正
確に規定された小室内に動物をおく。この小室は外部と
のガス交換ができない。試験の経過中，酸素の消耗およ
び二酸化炭素の蓄積により，動物の血圧を徐々に,0近く
のレベルまで減少させる。この小室内で，動物の血圧低
下がほとんど０になる前に，呼吸ストレスに対する耐性
を測定する。この試験の結果は，実施例VIIで報告す
る。３回のリポソーム処理後，および最初の処理の９日
後に,18ヶ月齢のラットは，未処理のラットより，約50
％長く血圧を維持できた。この処理したラットは，ま
た，未処理のラットより，血清CPKの増加速度がずっと
遅いことが示された。この試験期間中を通じた血液の追
跡により，処理動物および未処理の動物の両方が，類似
の血中酸素レベルおよび二酸化炭素レベルを維持するこ
とが示された。このことは，処理した動物のより良好な
能力が，単に血液−ガス含量の効果ではなかったことを
示す。 発明者およびその共同研究者は，膜脂質組成と，培地
中でのラット筋細胞の多くの生物学的特性との間の関係
を研究した。この生物学的特性は，多数の酵素のレベル
変化，細胞形態，および心臓筋細胞の鼓動速度を含む。
上に述べた研究では，この細胞のPC/SM比が,14日間の培
養期間中に1/7に減少し，コレステロール含量/DNAが，
同じ期間において，約1.6倍に増加することが示され
た。この培地にPC SUVを加えると，この細胞内の年齢と
関連した変化の全てが回復した。この変化には，膜脂質
組成，酵素レベル，細胞形態，および心臓活性（これは
鼓動の頻度として測定される）が含まれる。特に，リポ
ソーム添加による細胞の鼓動初速度の迅速な回復は，脂
質組成が，心筋細胞の能力の決定的な因子であることを
示唆している。従って，リポソーム処理した動物で見ら
れる呼吸ショックに対する耐性の増加は，少なくとも部
分的には，心臓の能力が高められたためと思われる。 この処理法は，一般に，上に概説したリポソーム投与
様式に従う。この方法では，個体に，好ましくは体重1k
gあたり約0.5〜2gの脂質の初期用量を投与し，その後，
次の用量を１回またはそれ以上,2〜７日ごとに，約0.00
1〜1g脂質／動物重量（kg）／日の長期間の用量割合で
投与する。１〜２ヶ月ごとに投与される約0.1〜1g脂質/
kgの持続用量が採用されてもよい。処理に用いたリポソ
ームは，このリポソームから心臓細胞へのPCの脂質交
換，および上記のように，この反対方向でのSMの交換を
促進するように処方されている。このリポソームは，ま
た，好ましくは，この細胞からリポソームへのコレステ
ロールの交換を促進するべく処方される。そして，ある
より好ましいリポソーム処方は純粋な卵PCから構成され
る。しかし，長期間の処理では，このリポソームにコレ
ステロールを含ませ，この赤血球中のあまりに大きなコ
レステロールの消耗を防ぐのが望ましい。 心臓の脂質組成の生化学的な変化は，上に述べたよう
に，関連する血清CPKの変化および／または赤血球の脂
質組成の変化，または浸透圧に対する強度の変化を測定
することにより，監視される。心臓の機能は，治療期間
中では，従来のEKGにより監視され得る。 B.動物の寿命の延長 本発明のもう１つの観点によれば，上に記述のよう
に，リポソーム処理をうけた実験動物は，処理を受けて
いない動物よりも，実質的に長生きすることが発見され
た。オスの実験用ラットの寿命に関する研究の結果を実
施例VIIに記述する。簡単に言えば,30ヶ月齢のラット
に，リポソームの初期注射を与え,1週間後に第２の注射
を行う。さらに２ヶ月ごとに持続注射を行う。ある未処
理ラット群は,32〜38ヶ月齢の間で死に，平均死亡年齢
は約34ヶ月であった。処理した動物の群では,42〜48ヶ
月齢の間で，死んだ。 比較的年齢が高くなるまで，すなわち，その動物が通
常死ぬであろう時期の数ヶ月以内になるまで，処理を始
めなかった場合でさえ，処理した動物では寿命が延びた
ことに注目するのは，興味深い。この結果は，年齢が高
くても，リポソームが，脂質組成の年齢に関連した変化
を回復させるのに効果的なことを示している。約36％の
寿命の延長は，リポソーム処理により生じる脂質組成の
変化が，寿命に関係する広範囲の生理的恩恵（多分，心
臓の能力の増加を含む）を与えることを示す。達成でき
るその寿命の延長は，人間に投影した結果から評価でき
る。人間の寿命の平均して約２年が，実験用ラットの１
ヶ月に相当すると仮定すると，リポソーム治療は，寿命
を大きく延長するだろう。 C.オスの生殖能力の増加 リポソーム処理によって与えられるもう１つの恩恵
は，処理したオスの生殖能力の明らかな増加である。実
施例VIIIに報告されている研究では,30ヶ月齢およびそ
れ以上の高齢の実験用ラットに,6日間にわたり３回リポ
ソーム用量を投与した。通常，この年齢のラットは，若
い生殖力のあるメスのラットと同じかごに入れたとき，
子を生ますことができない。例えば,10匹の処理してい
ないこの齢のラットを，各３匹の平均５〜６ヶ月齢のメ
スのラットと飼育したとき,30匹のメスのうち２匹だけ
が妊娠した。各場合では，そのひと腹の子は，より若い
オスが生ませる通常ひと腹10〜13匹の子より少なかっ
た。処理したラットは，対照的に，正常のオスの生殖力
を示した。このラットは全て３匹のメスをいずれも妊娠
させ，いずれのひと腹の子の数も，正常な10〜14匹だっ
た。 動物での処理様式では，つがいにする前に，数日〜数
週間にわたり一連のリポソーム注射を行う。処理の経過
は，先に論じたように，血清CPKの変化，または赤血球
の変化を監視することにより，上述のごとく追うことが
できる。この処理は，特に，馬，牛の飼育に有用である
と期待される。この場合、選択された動物の飼育寿命の
延長は有益である。 以下の実施例で，本発明の種々の局面および使用につ
いて例示する。しかし，その範囲を限定するつもりは全
くない。 材料 卵のホスファチジルコリン（卵PC）とウシの脳のスフ
ィンゴミエリン（SM）は，既知の方法（Shintsky,Basen
holz 1976）に従って調製した。両脂質は薄層クロマト
グラフィー分析によると99％以上純粋であった。この卵
PCの脂肪酸組成は，既に報告されている組成（Hertz）
と同様であった。この調製物の主要なPCは,1−パルミト
イル,2−オレイルPCおよび１−パルミトイル,2−リノレ
イルPCであった。およそ99％純粋なコレステロールはシ
グマ（Sigma,セントルイス,MO）から得た。0.25シリカ
ゲルHRおよび0.024シリカゲルの薄層クロマトグラフィ
ー板は，それぞれメルヒ（Merch,ダムルスタット，ドイ
ツ）とアナルテッヒ（Analtech,ニューアーク,DE）から
得た。 実施例Ｉ 小さな単層小胞の調製 クロロホルムに溶かした卵PCを100mlの容器に入れ，
窒素存在下で乾燥して薄膜にした。滅菌生理食塩水を最
終濃度約100mg/ml程度に脂質膜に加え，この脂質膜を攪
拌しながら水和した。次いで，生じた多重層小胞（ML
V）懸濁液は，ヒートシステムソニケーター，モデル375
Wを最高出力の40〜50％で１時間使用して音波処理され
た。この懸濁液の温度は，音波処理中にて窒素存在下で
約４℃に維持された。この音波処理された懸濁液を100,
000gで１時間の超遠心により，大きい小胞から分離し
た。約100mg/ml濃度のSUVの懸濁液を滅菌濾過した。 実施例II 心筋細胞の脂質組成における年齢およびSUV処理の効果 オスのウイスターラットの心筋細胞の脂質組成を,3ヶ
月齢,18月齢およびリポソーム処理した18ヶ月齢につい
て調べた。この３つの群はそれぞれ６匹の動物を含む。
この動物には滅菌生理食塩水（３ヶ月齢および18ヶ月齢
の未処理の群）かまたは実施例ＩのSUV懸濁液のいずれ
かが静脈末端から注射された。この処理された動物に
は,1匹あたり0.5〜1g脂質が３日毎に６日間（総計３回
用量）注射された。未処理の動物には同期間で同量の滅
菌生理食塩水が与えられた。最後の注射後３日目（最初
の注射から９日目）にラットを採血により殺し，さらに
その血液を分析した。 この心臓を取り出し，冷生理食塩水（0.15M NaCl）で
洗浄し，細片した後すぐにホモジネートするか，または
ホモジネートするまで−70℃で凍結させた。この細片し
た組織は，ガラスホモゲナイザー中にてテフロンピスト
ンを使用し，約10倍容量の冷生理食塩水中にて約50スト
ロークでホモゲナイズさせた。 このホモジネートの一部から脂質を抽出し（Folc
k），全リン脂質およびコレステロールを，既に記述の
ように（Bartlett,Barenholz 1978），クロロホルムに
富む下層について測定した。このPCおよびSM含量を，既
報の方法（Yechil 1985a,Yavin）に従って，シリカゲル
HR板の１次元クロマトグラフィーまたはシリカゲル板の
２次元クロマトグラフィーのいずれかによる薄層クロマ
トグラフィー（TLC）によって測定した。 この脂質組成データを以下の表Ｉに示す。このPC/SM
比はSM1モル当りのPCのモル数で表し，このコレステロ
ール量は，標準法（Richards）によって決定されたDNA1
μｇ当りのナノモル数として表す。ホモジネートの単位
体積当りの全DNA含量は，時間やリポソーム処理にかか
わらず相対的に一定であった。全てのデータは６匹のラ
ットの平均値を表す。 この脂質組成のデータから,3ヶ月齢から18ヶ月齢の間
でPC/SMは半分以上減少し，コレステロールは３倍以上
増加していることがわかる。この年齢に関連した変化
は，リポソーム処理の９日後にて,18ヶ月齢のラットで
は完全に回復した。そして事実このPC/SMは３ヶ月齢ラ
ットにみられる通常の比よりも著しく高かった。 実施例III 心臓細胞および血清CPKに対する年齢およびSUV処理の効
果 実施例IIの３つの群の動物（３ヶ月齢,18ヶ月齢,SUV
処理した18ヶ月齢）からの血液試料を低速遠心し，血液
細胞を除去した。生じた血清分画，および実施例IIで調
製した各心臓細胞ホモジネートのCPK活性を分析した。
この酵素は，シグマ技術報告（Sigma Technical Bullet
in）No.45-UVに記述のように，シグマ（Sigma,セントル
イス,MO）から得たCPK分析キットを用いて測定した。こ
の結果を表IIに示す。ここで，心臓細胞の酵素活性は，
心臓細胞DNA1μｇ当りのmUを示し，血清の酵素活性は血
清1ml中のmUで示す。 このデータから，心臓細胞CPKおよび血清CPK（これは
主に筋肉組織から遊離した酵素を示す）は,3ヶ月齢から
18ヶ月齢までに２〜３倍に増加していることがわかる。
この増加は，リポソーム処理の９日後の心筋で完全に回
復しており，そして血清ではCPK活性が約８倍低下して
いた。 実施例IV 赤血球細胞中の脂質組成に対する年齢およびSUV処理の
効果 実施例IIIの血液細胞ペレットを冷生理食塩水に再懸
濁し,1000×ｇで５分間遠心し，リンパ球の淡黄色のコ
ートを除去し，赤血球細胞の画分を得た。この画分を冷
生理食塩水で２度洗浄し，さらに白血球細胞と血清混入
物を除去した。次いで，この細胞を冷生理食塩水中でゆ
るやかにホモジネートし，この赤血球の細胞膜を20,000
×ｇで20分間遠心して上澄みから分画した。この細胞膜
ペレット区分から脂質を抽出し，全リン脂質，コレステ
ロール，およびPCとSMを実施例IIに記述のように測定し
た。異なる３つの動物群に対するPCモル/SMモルで表示
したPC/SM比，および１μlDNA含量当りのコレステロー
ルのμモルで表示したコレステロール含量を，以下の表
IIIに示す。表Ｉ−IIと同様に，表IIIのデータ値は６匹
のラットの平均値を示す。 これをみると，赤血球は,3ヶ月齢から18ヶ月齢の間に
PC/SMが約２倍低下し，そして18ヶ月齢でPC SUV処理す
ると，この比はほとんど７倍に増加した。同時にコレス
テロールは３ヶ月齢から18ヶ月齢の間に約30％増加し，
そしてリポソーム処理の９日後に約２倍低下した。 実施例Ｖ 赤血球細胞の浸透圧耐性に対する年齢およびSUV処理の
効果 実施例IIIで得た赤血球細胞試料の浸透圧耐性を標準
的な方法に従って測定した。簡単に言えば，洗浄し充填
された赤血球細胞約５μｌを10本のチューブに各々加え
た。この一部を遠心によりペレット化し，上澄みを除去
した。このペレット化した各細胞に,15〜150mMの塩濃度
の冷生理食塩水3mlを15mMずつ増やしつつ加えた。この
ペレット化した細胞を，加えた生理食塩水中で渦流をつ
くって速やかに再懸濁した。損傷のない細胞を除去する
べく遠心した後，この上ずみ画分を分光光度計にかけ，
遊離ヘモグロビン量を測定した。この遊離率は，細胞の
洗浄剤による溶解によって遊離した全ヘモグロビン量の
画分として計算した。各塩濃度での溶血率を表IVに示
す。 未処理の３ヶ月齢の動物からの細胞は，約75mMで50％
溶解し，約60mMでほぼ完全に溶解した。未処理の18ヶ月
齢の動物からの細胞は，浸透圧耐性がより小さく,90mM
以上の塩濃度で50％溶血し,75mM以上で完全に溶血し
た。リポソーム処理された18ヶ月齢の動物からの赤血球
は,75〜150mMの間の塩濃度で，若い動物（３ヶ月齢）と
ほぼ同じ浸透圧作用を示した。より低い濃度では，この
リポソーム処理された細胞は３ヶ月齢のラットの細胞よ
り高い浸透圧耐性を示し，これは，この処理された細胞
のPC/SM比が高い（表III）ことをおそらく反映してい
る。 実施例VI 培養心臓細胞再集合体に対する年齢およびSUV処理の効
果 心臓細胞の脂質組成の変化が実際に心筋細胞で起こっ
ていることを確認するため，培養された再集合心筋細胞
に対するリポソーム処理の効果もまた調べた。この細胞
が解離するまで，細片化された心臓組織をタンパク質分
解酵素（例えば，トリプシンまたはコラゲナーゼ）で分
解し，次いで，心筋細胞が再集合するまで，この細胞を
数日間培養することにより，培養再集合体が形成され得
る（Harary）。 本研究では，心臓は以下の各年齢のオスのウィスター
ラットから得た:3日齢の新生児;3ヶ月齢および18ヶ月
齢。次いで，各年齢群の心臓を公知方法（Jourdon）に
従って処理し，解離した心筋細胞懸濁液を得た。25ml培
養フラスコに10mlの細胞懸濁液（約５×10⁶細胞/ml）を
入れて，集合体が形成されるまで18〜24時間,37℃で回
転振盪機にてインキュベートすることにより，細胞再集
合体を形成した。この細胞を次にエーレンマイヤー（Er
lenmeyer）フラスコに移し，新鮮培地を加えた。各年齢
群に対し，細胞培養物の半分は処理せず，半分を実施例
Ｉのように調製されたPC SUVで処理した。細胞は，最終
濃度約１〜5mMの脂質濃度にて，第２の培地にSUVを加え
ることにより，リポソームで処理された。この細胞を，
回転振盪機で37℃にて，リポソーム存在下または非存在
下のいずれかでさらに４日間培養した。リポソームを含
む培地を24時間ごとに交換した。 ６日間のインキュベート期間の最後に，実施例IIに記
述のように，細胞を集め、冷生理食塩水で数回洗浄し，
そして冷生理食塩水中にホモジナイズした。PC/SM比お
よびコレステロールを測定するために，実施例IIに記述
のように，この細胞ホモジネートの一部から脂質を抽出
し，その残りから実施例IIIに記述のようにCPK活性およ
びDNA含量を調べた。その結果を以下の表Ｖに示す。こ
こでCPKを１μgDNA当たりの活性単位で表し;1μgDNA当
たりのμモルでコレステロールを，そしてPCモル/SMモ
ルでPC/SM比を表す。 このデータから，インビボのリポソーム処理で認めら
れる傾向と同じような，脂質組成およびCPKが年齢とリ
ポソーム処理に相関する一般的傾向がわかる。CPK活性
は，動物の年齢が増しても，リポソーム処理により著し
く減少する。３ヶ月齢から18ヶ月齢の間に起こるコレス
テロールの約２倍の増加は、３ヶ月齢から18ヶ月齢の間
に起こるPC/SMが約２分の１に低下することと同様に，
リポソーム処理により事実上回復した。 実施例VII 呼吸ストレス耐性に対する年齢およびSUV処理の効果 動物が密閉した部屋にいると，部屋の中の空気中の酸
素がしだいに呼吸により吐き出された二酸化炭素にかわ
り，動物が漸進的に呼吸ストレス下におかれ，脈拍およ
び呼吸割合が上がり，血液中のpHが上昇し，血圧が下が
る。動物がこのようなストレスに耐え得る（正の血圧を
維持できる）時間は，動物の呼吸ストレス耐性を測定す
る１つの標準的な方法である。当然のことながら，この
試験では若い動物ほど一般的にストレス耐性が大きい。 本実施例では,15〜18ヶ月齢の３匹のオスのサブララ
ットを，実施例IIの手順，即ち６日間に３回の注射に従
って,PC SUVで処理した。同齢の他の３匹のラットには
同量の滅菌生理食塩水を注射した。最初の注射の９日後
に，密閉した600mlの室でこの動物の呼吸機能を調べ
た。この動物に麻酔をかけ，ポンプを使って１分間に15
回“強制”呼吸をさせた。試験中に動物の血圧（１本の
外肢の），心電図（ECG）を追跡し，血中酸素レベルお
よび二酸化炭素レベル,CPKレベル，およびpHの分析のた
めに，動脈の血液試料を５分ごとに採取した。動物の血
圧が０になると実験をやめ，通常の空気で呼吸させた。 未処理の動物の血圧が０になるのに要する平均時間
は，約35〜45分間であった。処理した動物の平均耐久性
は約55〜65分であった。それゆえ、リポソーム処理によ
り，酸素の減少や二酸化炭素の蓄積による呼吸ストレス
に耐える動物の能力が約50〜60％高められた。未処理の
動物は，約25分間にわたって基礎となる血中CPKレベル
を維持した後，試験終了まで酸素活性が急激に増加し
た。処理された動物では，血中CPKは最初の40〜45分間
実質的に変化しなかった。その後，血中CPKは未処理動
物の血中CPKの約10分の１の割合で，残りの試験期間に
わたって徐々に増加した。 試験期間の関数として，血中の酸素レベル，二酸化炭
素レベル，およびpHのレベルは，両動物群では同じであ
り，このことは，処理動物で見られた呼吸ストレス耐性
の増加が血中の酵素レベル，二酸化炭素レベルの違いに
よるものではなかったことを示す。 実施例VIII 寿命に対するSUV処理の効果 この研究では，動物の寿命に対するリポソーム処理の
効果を調べる。試験したラットは30ヶ月齢のオスのスプ
ラギュー−ダウレイラットであった。スプラギュー−ダ
ウレイラットは通常約24〜30ヶ月齢で死ぬので，このラ
ットはすでに寿命に達している。６匹のラットの試験群
のそれぞれに，実施例Ｉのように調製したPC SUVをリポ
ソーム脂質0.5〜1gの用量で静脈末端から注射し,1週間
後に同様に投与し，それ以後実験動物が自然死するまで
２ヶ月ごとに与えた。この処理期間中，実験動物に任意
にえさを与え，動物の感染を避けるために，通常の予防
措置をおこなった。同齢のオスのラットの第２対照群に
同じ投与計画で同様にして滅菌生理食塩水を注射した。 この対照群の６匹の動物のうち,2匹は32ヶ月（処理を
始めて２ヶ月）で死亡,3匹は34ヶ月，そして１匹は40ヶ
月で死に，平均寿命は約34ヶ月であった。この処理ラッ
トのうち,2匹は44ヶ月,1匹は45ヶ月，そして３匹は48ヶ
月で死に，平均寿命は46ヶ月であった。 実施例IX 生殖能力に対するSUV処理の効果 オスのラットの生殖機能は年とともに減退することが
知られている。もし30ヶ月齢かそれ以上の年齢のオスと
若くて繁殖力のあるメスとを一緒に飼育するならば，同
じメスが比較的若いラットと一緒に飼育されたときより
も，生まれてくる子の数も子を生むメスの数も少ない。 生殖機能に対するリポソーム処理の効果を調べるため
に,34〜36ヶ月齢の各10匹のラット群を，実施例IIに記
述の卵PC SUVで処理した。対照群は同じように滅菌生理
食塩水で処理した。この最初の注射から９日後に，この
動物を５〜６ヶ月齢のメスのスプラギュー−ダウレイラ
ット３匹とかごの中に入れた。オス１匹とメス３匹とを
１週間,3週間，または約７週間にわたって一緒に飼育し
た。１週間で未処理のオスと接触した３匹のメスのうち
約１匹だけが子をつくった。７週間後，この割合は，未
処理のオスと接触した３匹のメスのうち約２匹に増加し
た。いずれの場合でも，子の数は10匹に達しなかった。
処理したオスでは,1週間の接触で３匹のメスのうち約２
匹が子をつくり，実際には,3週間の接触ですべてのメス
が子をつくった。子の数は通常10〜14匹であった。 本発明の種々の実施態様をここに記述するものの，本
発明からはずれることなく，様々な変更や修正がなされ
得ることは明らかである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−84028（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−265232（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−147228（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−210013（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−132921（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−152632（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 260，Ｎｏ．16 （1985） Ｐ．9123− 9131 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 260，Ｎｏ．16 （1985） Ｐ．9132− 9136

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．心筋細胞の年齢に関する変化を処置するために静脈
   内に投与するリポソーム組成物であって、該組成物はホ
   スファチジルコリンを含有する脂質成分を含むリポソー
   ムから本質的になり、該リポソームは少なくとも75モル
   ％のホスファチジルコリンからなり、実質的にスフィン
   ゴエミリンを含まず、そして、該ホスファチジルコリン
   は、少なくとも転移温度に関して、より若い年齢の被験
   体の心臓細胞のホスファチジルコリンのアシル鎖成分に
   特有のアシル鎖組成を有する、組成物。 ２．前記ホスファチジルコリンが卵ホスファチジルコリ
   ンである、特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 ３．前記処置の間に、前記リポソームのホスファチジル
   コリンが、細胞のスフィンゴミエリンまたはコレステロ
   ールと交換される、特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載の組成物。 ４．前記リポソームが10モル％を下まわるコレステロー
   ルを含有する、特許請求の範囲第１項から第３項のいず
   れかに記載の組成物。 ５．前記リポソームが主として0.02〜0.08ミクロンのサ
   イズの単層小胞である、特許請求の範囲第１項から第４
   項のいずれかに記載の組成物。 ６．前記リポソームのホスファチジルコリンのアシル鎖
   成分が、より高年齢の平均的な被験体の心臓細胞のホス
   ファチジルコリンのアシル鎖成分よりも、より短い炭素
   鎖長を有するか、またはより高い不飽和度を有するか、
   あるいはその両方である、特許請求の範囲第１項から第
   ５項のいずれかに記載の組成物。