JPH02178233A - ヘモグロビン含有リポソームおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、酸素運搬機能およびメトヘモグロビン還元機
能の両者を同一リボソーム内に保持し、失血状態下の患
者血管内に投与する事により、低下した末梢組織への酸
素供給能の増加、循環体液量の代償的補充、末梢循環不
全、血清電解質バランスの是正等を目的とするヘモグロ
ビン含有リボソームおよびその製造法に関する。

〈従来の技術〉 １９５７年（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ｃｏｒｐｕｓｃｌ
ｅｓ。

Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｊｅｃ
ｔ　ｆｏｒ　Ｂ、　Ｓｃ。

Ｈｏｎｏｕｒｓ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　ＭｃＧｉｌ
ｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

Ｍｏｎｔｒｅａｌ、）および１９６４年（Ｓｅｍｉｐｅ
ｒｍｉａｂｌｅｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ、　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　　１４６：５２４　　）　　Ｃｈａｎｇ
。

Ｔ、Ｍ、Ｓのコロジオン膜へのヘモグロビン封入に関す
る研究報告以来、ナイロン膜やシリコン膜をはじめとし
て、ポリスチレン・エチルセルロース・デキストランス
テアレートなどの高分子および架橋タンパク質なと、多
くの人工膜を用いてヘモグロビンのマイクロカプセル化
が検討されてきた。

近年、マイクロカプセル化人工赤血球よりもはるかに本
物に近い人工赤血球が得られる可能性があるとして、リ
ボソームに関心が寄せられている。　　リボソームは内
部に水相を有する脂質２分子膜からできた小胞体を指し
、細胞膜モデルとしてばかりでなく、タンパク質、生体
高分子、ビタミン、ウィルス、塩類、薬剤・ホルモンな
どの生理活性物買を封入することのできるキャリアとし
て高く評価されている。　また、赤血球自体も脂質２分
子膜を主要な構造単位としている事からも、リボソーム
の人工赤血球としての有用性が期待される。　すでに、
日本国内においても、リボソーム型人工赤血球に関して
いくつか記載されている（特公昭５２−１５１７１８号
公報、特公昭５８−１８３８２５号公報、特公昭６１−
３７７３５号公報）。

また、アメリカ（特許Ｎｏ、４１３３８７４）・ヘルギ
ー（特許Ｎｏ、８５５４８１）イギリス（特許Ｎｏ、１
５７８７７６）およびカナダ（特許Ｎｏ、１０９５４４
４）については対応特許が成立している。

こうした一連のリボソーム型人工赤血球の調製は、一般
にリボソーム膜に内包させるヘモグロビン溶液を調製す
る工程と、調製されたヘモグロビン溶液をリボソーム化
する工程とに大別される。　前者の調製工程は、基本的
に以下のように概説することができる。

■ヒトもしくは動物の全血から赤血球のみを分離する。

■分離した赤血球を洗浄する。

■蒸留水もしくは低張緩衝液により溶血液を得る。

■赤血球細胞基質（赤血球膜成分など）を溶血液から除
去し、高純度ヘモグロビン溶液を得る。

■基質を含有しないヘモグロビン溶液中の電解質濃度を
正常な生体レベルに調整する。

一方、後者の調製については、特に確立された方法はな
く、数多くの報告がなされている。

以下に代表的な方法を列挙する。

（ａ）ガラスピーズ攪拌法 （ｇｌａｓｓ　ｂｅａｄ　ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）（ｂ）
コール酸除去法（ｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｍｏｖ
ａｌ）（ｃ）逆相蒸発法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ
　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）（ｄ）有機溶媒注入法（ｅ
ｔｈｅｒｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ｅ）フレンチプレス法 （ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ　ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）（
ｆ）Ｃａ”　　融合法（Ｃａ”　−１ｎｄｕｃｅｄ　ｆ
ｕｓｉｏｎ）（ｇ）クロロホルム−エーテル小球法 （ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｅｔｈｅｒ　　５ｐｈｅｒｕ
ｌｅｓ）（ｈ）光重合法（ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　）（ｉ）凍結−融解法（ｆｒｅｅｚｉＢ
−ｔｈａｗｉｎｇ）（ｊ）脱水−再水和法（ｄｅｈｙｄ
ｒａｔｉｏｎ−ｒｅｈｙｄｒａｔｆｏｎ） 〈発明が解決しようとする課題〉 酸素運搬体として使用されるヘモグロビンは、種々の条
件下で比較的容易に酸化を受けて、メトヘモグロビンに
変化する。　また、ヘモグロビンは、ヘム鉄（プロトヘ
ム■）が還元型の状態でのみ酸素運Ｉｉ２機能を保持す
るため、ヘモグロビンを用いる人工赤血球において、メ
ト化は重要な問題点となる。　従来のリボソーム型人工
赤血球は、製造過程および保存状態下ならびに投与後の
生体内酸化および不飽和脂質の過酸化反応に伴なうメト
ヘモグロビン生成を抑制するために、通常、メト化抑制
剤（＃化防止剤もしくは安定化剤）をその製造過程で添
加している。

例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素す［−リウム、
硫酸第一鉄等の無機物質が知られている。　これらの抗
酸化作用は確実ではあるが、生体に対する毒性も強いた
め、臨床で使用される人工赤血球には好ましくない。　
一方、体内にも存在する還元型グルタチオン、アスコル
ビン酸（ビタミンＣ）等は、生体認容性の高いメト化抑
制物質として知られているが、抑制効率および効果の持
続時間または物性（物質自体の安定性・溶解性）等に問
題があり、いずれもヘモグロビンのメト化抑制剤として
不充分であった。

また、トコフェロール類（ビタミンＥ）は古くから非特
異的抗酸化作用を持ち、生体膜脂質の抗酸化が第一義的
作用であろうと言われ、実際に食品中の不飽和脂肪酸や
ビタミンＡ、カロチン等の酸化防止剤として用いられて
いる。

しかし、トコフェロール自体は脂溶性物質であるため、
不飽和脂質の過酸化反応は効率良く抑制するが、リボソ
ーム内水相で生ずるヘモグロビンのメト化を充分に抑制
することはできない。

同様に生体認容性に優れ、輸液剤として使用される糖類
もメト化抑制作用を持つことが知られている（特公昭６
０−１７８８２２号公報）。　これらは、前述の公開特
許公報にも記載されるように、充分なメト化抑制効果を
得るためには生体の血糖値に比較して高濃度に添加する
必要があり、生理的であるとは言い難い。

さらに、従来公知のメト化抑制剤の効果は、ヘモグロビ
ンがある種の環境下で酸化されるのを防ぐことにより発
現する。　　したがって、既に生じたメトヘモグロビン
濃度を減少させる効果は通常期待できない。

本発明の目的は、メトヘモグロビンの酵素的還元に必要
な生体内物質を同一リボソーム中にヘモグロビンと共に
内包させ、従来使用されているメト化抑制剤と異なり、
メトへそグロビンを還元することでメト化抑制機能を示
すヘモグロビン含有リボソームおよびその製造法を提供
することにある。

く課題を解決するための手段〉 本発明の第１の態様によれば、脂質からなるリボソーム
に、ヘモグロビン、メト化抑制前駆物質、および少なく
とも１種類以上の電子供与体を含む内容液をとりこんで
なるヘモグロビン含有リボソームが提供される。

リボソーム内容液はイノシトールヘキサリン酸のような
有機リン酸化合物を含むことができ、ｐＨは７．２〜８
．５がよい。

メト化抑制前駆物質がチトクロムｂ５゜ＮＡＤＨ−チト
クロムｂ５還元酵素またはＮＡＯＰＨフラビン還元酵素
であるのが好ましい。

電子供与体がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートま
たはこれらの誘導体であるのが好ましい。

ヘモグロビンに対する電子供与体の重量モル比が０．５
〜１０であるのがよい。

本発明の第２の態様によれば、洗浄血液を低張リン酸緩
衝液を添加して溶血させ、赤血球基質成分を除去し、低
張リン酸緩衝液に対して透析を行った後、限外濾過によ
り濃縮し、電子供与体を添加して混和させ、これをリボ
ソーム化することを特徴とするヘモグロビン含有リボソ
ームの製法が提供される。

また、低張リン酸緩衝液の代わりにＨＥＰＥＳ緩衝液ま
たはＴＥＳ　ＡＩ衝液を用いることも有用である。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

本発明のヘモグロビン含有リボソームは脂質からなるリ
ボソーム中に、酸素運搬体としてのヘモグロビン、ヘモ
グロビンのメト化抑制前駆物質および少なくとも１種の
電子供与体を含む内容液を内包する。　内容液のうちヘ
モグロビンおよびメト化抑制剤前駆物質は天然赤血球由
来のものであり、この他にメト化抑制前駆物質をメト化
抑制物質に転するための電子供与体を外部より添加する
。　内容液はさらに有機リン酸化合物を含んでいてもよ
い。

上記リボソーム内容液を調製する代表的方法について述
べる。　　まず、ストローマ・フリー皐ヘモグロビン（
Ｓｔｒｏｍａ　Ｆｒｅｅ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、以下
単にＳＦＨ溶液という）を調製する。　その調製工程を
第１図のフローチャートに示す。

第１図に示すように、原料用血液は正常人赤血球もしく
は期限切れ濃厚赤血球製剤等を用い、基本的な調製法に
ついては、すでに公知の方法を利用する事ができる。　
以下、フローチャートに従って各工程の概略を説明する
。

■全血は、連続遠心機により血漿・白血球・血小板等を
除去し、さらに生理食塩水を用いて遠心洗浄を連続的に
行ない粗洗浄赤血球とする。

■粗洗浄赤血球は引き続き血漿分離器（例えば、孔径０
．４５μｍのセルロースアセテート膜）により、生理食
塩水を用いて繰り返し洗浄し、血漿・白血球・血小板等
を完全に除去した洗浄赤血球を得る。

■得られた洗浄赤血球に過剰量（およそ２〜３倍の容量
）の蒸留水もしくは低張緩衝溶液（例えばｐＨ＝７．４
前後）を添加して、洗浄赤血球溶血液とする。

■この洗浄赤血球溶血液は、前述の血漿分離器さらに血
漿成分分１！を器（例えば、孔径０．１μｍのセルロー
スアセテート膜）を連続的に通過させて赤血球膜残渣の
除去と溶血液の無菌化を行なう。

■上記の操作により得られた溶血液は、低分子量物Ｘ（
分画分子量：　１０，０００以下）の除去ならびに水素
イオン濃度（ｐＨ７，２〜８．５）および電解質濃度の
主通化を目的とした透析処理を行なった後、ヘモグロビ
ン濃度がおよそ４０〜６０ｇ／ｄｊ！の範囲内になるよ
うに限外濾過（分画分子量；　１０，０００以下）を用
いて濃縮する。

本発明に使用するＳＦＨ溶液を含む内容液は、上述の工
程で得られたヘモグロビン分画に少なくとも１種の電子
供与体を添加して調製される。　このヘモグロビン分画
にはヘモグロビンおよびメト化抑制前駆物質が含まれて
いる。

メト化抑制前駆物質としてチトクロムｂ５、ＮＡＤ）Ｉ
−チトクロムｂ５還元酵素、ＮＡＤＨ−フラビン還元酵
素ならびに（カタラーゼ／スーパーオキシドジスムター
ゼ／グルタチオンパーオキシラーゼ）などの活性酸素除
去物質も含まれている。

上記低張緩衝溶液としては、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ
緩衝液、ＴＥＳ緩衝液などを用いることができる。

また、電子供与体としては、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートもしくはこれらの誘導体
として知られている３−アセチルピリジンアデニンジヌ
クレオチド（３−アセ゛チルピリジン−ＤＰＮ）、チオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオ−ＤＰＮ
）　　３−ピリジンアルデヒドＤＰＮ１ニコチンアミド
ヒボキサンチンジヌクレオチド（デアミノ−ＤＰＮ）等
を代表的に挙げることができる。

本発明の目的であるメト化抑制効果を効率良く発現させ
るためには、電子供与体はいずれも還元型として溶液中
に存在する必要がある。

そのため、これらの電子供与体はリボソーム化する直前
の添加が好ましいが、目的によっては初期の段階で添加
することもできる。　この場合には添加後の透析・限外
濾過による損失を考慮し、透析液に同濃度の電子供与体
を添加するなどの適当な方法を講する必要がある。

一方、電子供与体の還元型と酸化型の存在比率は溶液の
水素イオン濃度と密接に関連し、天然赤血球の構成成分
である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドお
よび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フェートについては、弱アルカリ性条件下（ｐＨ８〜９
）で最も安定となる。　また、ヘモグロビンの自動酸化
速度はｐＨの低下と共に増大することから、ＳＦＨ溶液
すなわち内容液のｐＨは７．２〜８．５の範囲内に調整
することが好ましい。　特に、本発明の適用を失血状態
下の患者を対象とした場合には末梢組織における代謝性
アシド−シスの是正という点の有用性も期待できる。

前述の電子供与体の添加量は、選択する個々の物質なら
びに目的とする効果の持続時間等により若干具なるが、
通常ヘモグロビンに対する重量モル比としては、およそ
０．５〜１０、特に医薬品として大量に調製する場合に
は価格等も考慮し、ヘモグロビンに対する重量モル比と
して０．５〜３の範囲内での添加が好ましい。

電子供与体の添加方法は特に限定されず、ＳＦＨ溶液中
に均等に混和することのできる方法であれば、試薬形態
（結晶・凍結乾燥品・水溶液等）も自由に選択すること
ができるが、ヘモグロビンのメト化防止という観点から
４℃前後の低温に維持することが好ましい。　また、同
様の目的で従来公知の予防的抗酸化剤もしくは安定化剤
をＳＦＨ溶液中に混在させることも可能である。

内容液にはさらに有機リン酸化合物を添加しておいても
よい。　その代表例としては、イノシトールヘキサリン
酸、グルコース−６−リン酸、アデニントリホスフェー
ト、アデニンジホスフェート°などを挙げることができ
、これらはヘモグロビンのアロステリック因子としてヘ
モグロビンと酸素との親和性を変化させて、末梢組織へ
の酸素運搬能を増加させる機能を持つ。

次に上述した内容液を内包するためのリポソームについ
て説明する。

生体膜モデルやドラッグデリバリ−システム（Ｄ、Ｄ、
Ｓ）として使用されるリボソームは、形態的に見て大き
く３ｆ！類に分けられる。

脂質の膜が幾重にも袋状になフている多重層リボソーム
（＋ｕｌｔｆｌａｍｅｌｌａｒ　　ｌｆｐｏｓｏｍｅ、
ｏｒｖｅｓｉｃｌｅ、ＭＬＶ　）一つの層に囲まれた小
さい小単層リボソーム（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｍｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ。

ｓｍａｌ　ｕｎｉｌａｍｅＬＩａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ、
５ＵＶ）単層であるがサイズの大ぎい大単層リボソーム
（ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ
、ＬＵＶ　）の３　ｆｌである。

通常、本発明には、直径０．１〜１．０μｍの単層リボ
ソームを使用するのがよい。

リボソームを構成する脂質としては、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ｐｓ）　　ホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥ）　　ホスファチジ
ルイノシトール（ＰＩ）　　　リゾホスファチジルコリ
ン（ＬＰＣ）、ガングリオシド（Ｇ）、カルシオリビン
（ＣＬ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）　シミリストイル
ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホ
スファチジルコリン（ＤＳＰＣ）　　ホスファチジン酸
（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）および
これらを常法にしたがって水素添加した物が挙げられる
。　上述の脂質は水中で熱力学的に安定なミセルの形成
に不可欠な成分であり、これらを組み合わせて使用する
こともできる。

これらの脂質以外にコレステロール（ＣＨＯＬ）、ジセ
チルホスフェイト（ＤＣＰ）、ステアリルアミン（ＳＡ
）等が添加されることもある。　コレステロールはリボ
ソームの形成・膜の安定化を目的として通常添加される
他に、リボソーム膜の透過度を調節するためにも使用で
きる。　同様に、ジセチルホスフエイト（−）、ステア
リルアミン（＋）等の電荷付与物質についても、リボソ
ームの生体内挙動の調節に使用できるが、これらはすべ
てのリボソーム形成に不可欠というものではない。

一方、リボソームの形成とは異なる観点から、トコフェ
ロール同族体も添加される。　前述したようにトコフェ
ロール（ビタミンＥ）は、非特異的な抗酸化作用を持つ
生体成分で古くから食品中の不飽和脂肪酸やビタミンＡ
、カロチンなどの酸化防止剤として使用されてきたが、
本発明においても酸化防止剤として、リボソーム膜ある
いはヘモグロビンの安定性に寄与する。　特に、不飽和
脂質を含有するリボソームでは、重要な構成成分となる
。

Ｊボソームの調製にあたっては、前述したように種々の
方法が知られているが、人工赤血球として用いるリボソ
ームに特別な調製方法があるわけではない。　　しかし
、内包するヘモグロビンは、温度・光・水素イオン濃度
・溶存ガス、金属イオン（Ｃｕ”　ｅｔｃ、　）等によ
り容易に酸素運搬機能のないメトヘモグロビンに酸化さ
れる。　したがって、この点を留意して、すでにり、Ｄ
、Ｓ等の分野で公知の方法により調製される。　例えば
、ガラスピーズ攪拌法、コール酸除去法、逆相蒸発法、
フレンチプレス法、Ｃａ”ゝ融合法、パールボンピング
法、脱水−再水和法等を使用することができる。

〈作用〉 本発明のリボソーム内容液に含まれるＳＦＨ溶液には、
天然赤血球由来のＮＡＤＨ−チトクロームｂ５還元酵素
系およびＮＡＯＰＨ−フラビン還元酵素系から選ばれた
少なくとも１種の電子受容体も混在しており、ＳＦＨ溶
液調製時にまたはその後に外部から添加した還元型ＮＡ
Ｄ　（Ｐ）　Ｈは、前述の還元酵素系の補酵素（電子供
与体）として利用される。　各酵素系の還元型基Ｘ＜チ
トクロームｂ５およびフラビン）は、ヘモグロビンの酸
化により生ずるメトヘモグロビンを非酵素的に還元し、
酸素運搬能を有するヘモグロビンに戻す機能を持つ。　
このため、生体内で酸素運搬能を低下させる要因となる
メトヘモグロビン生成を抑制し、結果的に酸素運搬能を
安定化する作用を示す。　また、疎水性の脂質・２分子
膜（リボソーム）は、目的とする酵素反応の至適条件を
維持する作用を有する。

〈実施例〉 以下、本発明の実施例に基づいて具体的に説明する。

（実施例１） 調製の各工程は冷蔵状態（＋４℃）に維持し、無菌的環
境下で実施した。　また、試薬・器具類は滅菌処理を行
ない、重金属イオン・無機イオン等の残留のない無菌超
純水（１５ｍｅｇΩ・ｃｍ　ａｔ２５℃以上）を調製に
使用した。

（１）ＳＦＨ溶液の調製 輸血朋限切れ濃厚赤血球１５ｆＬ（２００ｍＩｌＸ７５
ｂａｇｓ）は連続遠心機を用いて生理食塩水で洗浄し、
混在する血小板・白血球等の血漿成分を除去した粗洗浄
赤血球を得た６　さらに、孔径０．４５μｍの血漿分離
器を用いて生理食塩水洗浄を行ない、この洗浄赤血球５
℃に対して低張リン酸緩衝液として（１０ｍＭ、／ｐ）
１７．４）を１０℃添加して溶血させた。　孔径０．４
５μｍの血漿分離器および孔径０．１μｍの血漿成分分
離器を用いて赤血球膜成分の除去ならびに無菌濾過を行
ない、ヘモグロビン濃度８　（Ｗ／Ｖ）％の赤血球膜除
去ヘモグロビン溶液約１２ＩＬを回収した。

得られた溶液はホローファイバー型ダイアライザー（Ｔ
ＥＲＵＭＯ，ＴＡＦ−１０Ｗ）を用いて１０ｍＭ。

リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析を行なった後
、限外濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０（Ｗ／
Ｖ）％の赤血球膜除去へモグロヒ゛ン溶ン夜（ＳＦＨ：
Ｓｔｒｏｍａ　Ｆｒｅｅ　Ｈｅｍｏｇｉｏｂｉｎ）約１
．８１Ｌを調製した。

（２）ＳＦＨへの試薬添加 上述（１）の工程を経て調製したＳＦＨ５０ｍ℃に電子
供与体として還元型β−ＮＡＤＨ・Ｎａ２（ＢＭＹ、ｇ
ｒａｄｅ　ｌｌ７９８％凍結乾燥試薬）をヘモグロビン
に対する重量モル比（ＮＡＤＨ−Ｎａ２／Ｈｂ）が等し
くなるように添加し、溶解・混和して内容液を得た。

（３）ＳＦＨのリボソーム化 水素添加率９０％の精製飽和ホスファチジルコリン（Ｅ
ＰＣ）　　コレステロール（Ｃｈｏｌ）　　　ミリスチ
ン酸ナトリウム（ＭＡ）の均一混合粉末（日木精化、ブ
レソーム／ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＭＡ−７：１０：２．
４（モル比））９．’Ｏｇと上述（２）で調製した内容
液５０ｍｊ２をワーリング・ブレンダー（ＷＡＲＩＮＧ
　Ｃｏ、、Ｂｌｅｎｄｅｒ　７０１０５）で攪拌混合し
た。　この懸濁液はバール細胞破砕器（ＰＡＲＲ［：ｏ
、　）に入れ、ヘリウムガスで１００ｋｇ／ｃｍ２に加
圧して３０分間放置後、この圧力を維持した状態でパー
ル細胞破砕器の細隙ノズルから吐出させてリボソーム化
を行なった。

（４）ヘモグロビン封入リボソームの精製上述（３）の
加圧吐出後に得られた溶液は約１０倍容の生理食塩水を
用いて希釈・懸濁液とした後、遠心分＠　（１７，ＯＱ
Ｏｒｐｍ　　ｘ３０ｍｉｎ　　ａｔ４℃）を行なった。

　効率よくヘモグロビンを封入しているリボソームは遠
心処理により沈殿物として回収された。　　リボソーム
化されずに残存する遊離ヘモグロビンおよび原料脂質残
渣を含む上溝はデカンテーションで除去した。

以上の洗浄操作を上清中の遊離ヘモグロビンが肉眼的に
認められなくなるまで繰り返し行なった後、０．４μｍ
の二ニークリボアメンプラン（ポリカーボネート）を用
いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去した。

　最終的に生理食塩水を用いてヘモグロビン濃度が１０
％となるように調整し、精製したヘモグロビン封入リボ
ソーム懸濁液約４０ｍ℃を回収した。

（実施例２） （１）ＳＦＨ溶液の調製 ＳＦＨ溶液の基本的調製方法は、実施例１の（１）　に
準じて行なったが、本実施例では以下の点を考慮して、
１００１Ｍ−ＨＥＰＥＳ”　　（もしくは１０ｍＭ４Ｅ
Ｓ”）　緩衝液（ｐＨ７，４ａｔ　３７℃）を調製に使
用した。

■緩衝液自体がヘモグロビンの酸化を促進しない。

■添加試薬（ピリジンヌクレオチド類）に対する安定性
が高い。

■目的とする酵素活性を阻害しない。

■生体に対する安全性が高い。

■ｐＨ７，４（３７℃）における緩衝能が高い。

申ＨＥＰＥＳ：２−　［４−）１ｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ
ｌ−１−ｐｉｐｅｒａｘｉｎｙｌ）］ｅｔｈａｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃ　　ａｃｉｄ中ＩＥＳ　：Ｎ−［Ｔｒｉｓ
　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌ］−
２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　　ａｃ
ｉｄ（２）ＳＦＨ溶液への試薬添加 前述の方法で得られたＳＦＨ５０ｍｊ２に電子供与体と
して還元型β−ＮＡＤＰｔ（−Ｎａ４（ＢＭＹ、９８％
凍結乾燥試薬）をヘモグロビンに対する重量モル比（Ｎ
ＡＯＰＨ−Ｎａ４／Ｈｂ　　）が等しくなるように５ｍ
ｊ２のＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、／ｐ８７　、　４
　）に溶解し、ＳＦＨ中で均一になるように添加・混合
した。

（３）ＳＦＨのリボソーム化 水素添加率９０％の精製飽和ホスファチジルコリン（Ｅ
ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）　　　ミリスチン
酸ナトリウム（ＭＡ）の均一混合粉末（日木精化、プレ
ソーム／ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＭＡ＝７：１０：２．４
（モル比））９．０ｇと上述（２）で調製したＳＦＨ５
０ｍＪｌ！をワーリング・ブレンダー（ＷＡＲＩＮＧ　
Ｃｏ、、Ｂｌｅｎｄｅｒ　７０１０５）で攪拌を行ない
、全体が均一になるまで混合した。　こうして得られた
懸濁液はフレンチプレス細胞破砕機（大苗製作所）を用
いて６００　ｋ　ｇ　／　ｃ　ｍ　”の加圧・吐出処理
を繰り返しく１０回）行ない、ＳＦＨ封入リボソームを
調製した。

（４）ヘモグロビン封入リボソームの精製上述（３）の
加圧・吐出後に得られた溶液は、実施例１の（３）に準
じて精製した。

（実施例３） （１）ＳＦＨ溶液の調製 ＳＦＨ溶液の調製は、１０　ｍＭ−ＨＥＰＥｓ　（もし
くは１０　ｍＭ−ＴＥＳ）緩衝液（ｐＨ７，４ａｔ　３
７℃）を用いた実施例２の（１）と同様に行なった。

（２）ＳＦＨ溶液への試薬添加 前述の方法で得られたＳＦＨ４５ｍｆｔに、この溶液中
のヘモグロビンとモル比が等しくなるように電子供与体
として還元型β−ＮＡＯＰＨ・Ｎａ４（ＢＭＹ、９８％
凍結乾燥試薬）およびイノシトール−６−リン酸ナトリ
ウム（ＳＩＧＭＡ　Ｃｏ、　）ならびにグルコース−６
−リン酸ナトリウムを前述のｍ街液５ｍｆｔに溶解し、
この溶液をＳＦＨ中で均一になるように添加・混合した
。

（３）ＳＦＨのリボソーム化 パール細胞破砕器を用いた実施例１の（３）に記載した
方法によりリボソーム化を行なった。

（４）ヘモグロビン封入リボソームの精製上述（３）の
加圧・吐出後に得られた溶液は、実施例１の（３）に準
じて精製した。

［ＳＦＨ分析例−■（残存蛋白質）］ 実施例に記載した方法で調製したＳＦＨ溶液に含まれる
蛋白質成分の全体像を把握する目的でドデシル硫酸ナト
リウム添加ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）を行なった。

第２ａ図に洗浄赤血球ならびに第２ｂ図に調製したＳＦ
Ｈの蛋白質分析例を示した。　両者を比較すると、最終
的に調整されたＳＦＨ溶液中にヘモグロビン以外の天然
赤血球由来蛋白質成分が残存することがわかる。　これ
らのＳＦＨ残存蛋白質成分の分子量分画は、およそ１０
．０００〜７０，０００の範囲にあり、透析・限外濾過
工程で使用したダイアライザーの分画分子量（約ａ、ｏ
ｏｏ〜１０，０００）以下の低分子量物質は完全に除去
されていた。

［ＳＦＨ分析例−！！（残存酵素活性）］実施例に記載
した方法で調製したＳＦＨのＮＡＤＨ依存型メトヘモグ
ロビン還元酵素活性を外部から還元型ＮＡＤＨを添加し
て分光学的に検討を行なった。　洗浄赤血球を対照とし
て、ＳＦＨで得られたＮＡＤＨ−メトヘモグロビン・レ
ダクターゼ活性値ならびに単位ヘモグロビン当たりの比
活性を表１に示した。　また、ＳＦＨについては測定系
への試料添加量を変化させて、この酵素活性の濃度依存
性も比較したが、いずれも顕著な変化は認められなかっ
た。

こうした一連の検討から、ＳＦＨの調製操作は目的とす
る酵素の基本的機能に影響を与えていないものと解釈さ
れた。

１（ｂ：デオキシヘモグロビン　、　　Ｈｂ（＋２ニオ
キンへ干グ叩ン　、　　ｍｅｔＨｂ：メトヘモグロビン
［ヘモグロビン経時酸化率の測定コ ヘモグロビンの経時酸化は３７℃インキュベーション開
始時の可視領域（４６０ｎｍ〜７００ｎｍ）における吸
収スペクトル（ｏｘｙＨｂ）を基点（酸化率＝０％）と
して、一定時間ごとに吸収スペクトルを測定した。　測
定終了時にフェリシアン化カリウムもしくは亜硝酸ナト
リウムを添加し得られた吸収スペクトル（ｍｅｔＨｂ）
を終点（酸化率工１００％）として、ｏｘｙＨｂならび
にｍｅｔＨｂの特異吸収帯における各測定時間までの吸
光度変化量からヘモグロビン酸化率を算出した（第３図
および表２参照）。

■試薬顛末添加ＳＦＨをコントロールとして、実施例１
に記載した還元型ＮＡＤＨ添加ＳＦＨの３７℃・好気的
条件下におけるヘモグロビンの経時的酸化率を比較した
。　第４図に示したように、還元型ＮＡＤＨ添加はヘモ
グロビンの経時的酸化を効率良く抑制することを確認し
た。

■試薬顛末添加ＳＦＨをコントロールとして、実施例２
に記載した還元型ＮＡＯＰＨ添加ＳＦＨの３７℃・好気
的条件下におけるヘモグロビンの経時的酸化率を比較し
た。　第５図に示したように、還元型ＮＡＯＰＨ添加は
ヘモグロビンの経時的酸化を効率良く抑制することを確
認した。　しかし、還元型ＮＡＯＰＨの抑制効果は比較
的早期（低下し、以後は急速にヘモグロビンの酸化が進
行した。　この効果持続時間は、還元型ＮＡＯＰＨ添加
量に依存する傾向を示した。

■試薬顛末添加ＳＦＨをコントロールとして、実施例３
に記載した還元型ＮＡＯＰＨならびにグルコース−６−
リン酸ナトリウム添加ＳＦＨの３７℃・好気的条件下に
おけるヘモグロビンの経時的酸化率を比較した。　第６
図に示したように、グルコース−６−リン酸の添加は還
元型ＮＡＯＰＨの効果持続時間を顕著に延長させ、上述
■の問題点を改善した。　一方、ＩＨＰの添加はヘモグ
ロビンの酵素運搬効率を向上させる以外に、第７図に示
したように還元型ＮＡＯＰＨの酸化抑制作用を増強（延
長）させた。

ＥＳＦＨ封入リボソームの特性値コ 実施例に記載したＳＦＨ封入リボソームの物理・化学的
特徴を表３に示した。　最終的に得られた個々のリボソ
ームは２〜７枚の脂質２分子膜構造を有する平均粒径２
４８ｎｍの閉鎖小球状形態を持ち、調製した懸濁液の可
視吸光度スペクトル（第８図）から、封入したＳＦＨが
リボソーム中においてもオキシへそグロビンの状態を保
持している事がわかる。

また、ヘモグロビンに対し強力な酸化作用を有するフェ
リシアン化カリウムを用いて、脂質２分子膜のバリアー
能について検討を行なった。　対照としてリボソーム化
を行なっていないＳＦＨに過剰量のフェリシアン化カリ
ウムを添加した場合、ヘモグロビンは添加直後に完全に
酸化されてメトヘモグロビンとなった。

方、実施例に記載したリボソーム化処理により封入され
たＳＦＨにおいては、第９図に示したようにフェリシア
ン化カリウムによるヘモグロビン酸化は顕著に抑制され
た。

〈発明の効果〉 本発明のリボソーム型人工赤血球は、３７℃におけるヘ
モグロビンの経時的自動酸化ならびに外因性酸化物（フ
ェリシアン化カリウム・ニトログリセリン・ツェナセチ
ン・メナジオン・アミノフェノール・サルファ剤および
その代謝物）等によるメトヘモグロビン生成を顕著に抑
制する機能を保持している。

これらの機能発現は基本的に、ヘモグロビンと同様の原
料用天然赤血球由来の残存成分が関与している。　すな
わち、第２図に示したように、本発明に使用するＳＦＨ
溶液の電気泳動像では、ヘモグロビン以外の微量蛋白質
成分が混在し、その後の検討により天然赤血球酵素とし
て知られるメトヘモグロビン還元酵素活性もＳＦＨ溶液
中に残存している事を確認し得た（表１）。

この還元酵素反応は、補酵素として還元型ＮＡ　Ｄ　Ｈ
（ｄａｌｔｏｎ：６６５）　、　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ（
ｄａｌｔｏｒ＋ニア４５）を必要としている。　一方、
ＳＦＨ溶液の調製過程では低分子量物質の除去・各種イ
オン濃度の調整およびヘモグロビンの濃縮等を目的とし
て透析・限外濾過を行なっており、低分子量物質である
補酵素類はこうした処理操作の段階でＳＦＨ溶液中から
容易に除去され、前述の酵素反応は見かけ上、阻害され
た状態と成る。

一般に酵素反応の発現には、酵素−基質もしくは酵素−
補酵素とが解離しうる状態で弱い複合体を形成する必要
が有る。　このため、還元型ＮＡＤＨを添加した安定化
ヘモグロビン溶液を代用血液として生体に投与した場合
、循環血流中で速やかに希釈され、還元型ＮＡＤＨの有
効性を安定に維持することが困難となる。　さらに、酸
素運搬機能に関与するヘモグロビンも、循環血流中から
急速に代謝・排泄されるため代用血液としての有用性は
臨床上期待できない。

本発明においては、ＳＦＨ溶液中の不純物として従来取
り扱われてきた原料赤血球由来の微量成分（特に酵素蛋
白質）を利用し、補酵素および基質類等のＳＦＨ調製過
程で除去された低分子量物質のみを添加してヘモグロビ
ンのメト化抑制に有用なメトヘモグロビン還元酵素系を
再構成したＳＦＨ溶液をリボソーム化することにより、
生体内における前述の問題点を改善した。　　リボソー
ム化はメトヘモグロビン還元系の反応至適条件維持、外
部環境からヘモグロビン等の有用蛋白質成分の保護、酸
素−基質もしくは酵素−補酵素の複合体の形成頻度を増
大し、結果としてメトヘモグロビン還元能の安定性なら
びに効率を向上させる効果を持つ。　また、微量の蛋白
質が多成分混在するＳＦＨ溶液の抗原性および免疫系へ
の影響を緩和する可能性も期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いるＳＦＨ溶液を調製する工程を示
すフローチャートである。 第２ａ図および第２ｂ図はそれぞれＳＦＨ溶液調製過程
における洗浄赤血球およびＳＦＨ溶液中の蛋白質５ＤＳ
−ＰＡＧＥによる分析例を示す図である。 第３図はヘモグロビンの酸化率、を吸収スペクトルによ
り測定したグラフである。 第４図は還元型ＮＡＤＨを添加したＳＦＨにおけるヘモ
グロビンの経時的酸化率を示すグラフである。 第５図は還元型ＮＡＯＰＨを添加したＳＦＨにおけるヘ
モグロビンの経時的酸化率を示すグラフである。 第６図は還元型ＮＡＯＰＨおよびＧｌｕ−６−リン酸を
添加したＳＦＨにおけるヘモグロビンの経時的酸化率を
示すグラフである。 第７図は還元型ＮＡＯＰＨおよびＧｌｕ−６−リン酸に
よるヘモグロビン酸化抑制にＩＨＰのおよぼす影響を示
すグラフである。 第８図は調製直後のＳＦＨ封入リボソーム懸濁液で得ら
れた可視部吸収スペクトル図である。 グロビン酸化に対するリボソーム化処理ならびに電子供
与体［ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈ（ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍ）
　］添加ＳＦＨ封入リボソームの酸化抑制効果を示すグ
ラフである。 同

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）脂質からなるリボソームに、ヘモグロビン、少な
   くとも１種類以上の電子供与体、および該電子供与体か
   らの電子を受け取つてヘモグロビンのメト化を抑制する
   電子受容体を含む内容液をとりこんでなるヘモグロビン
   含有リボソーム。
2. （２）内容液はさらに有機リン酸化合物を含む請求項１
   に記載のヘモグロビン含有リボソーム。
3. （３）電子受容体がチトクロムｂ５、ＮＡＤＨ−チトク
   ロムｂ５還元酵素、およびＮＡＯＰＨ−フラビン還元酵
   素からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項
   １または２に記載のヘモグロビン含有リボソーム。
4. （４）電子供与体がニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
   ートまたはこれらの誘導体である請求項１〜３のいずれ
   かに記載のヘモグロビン含有リボソーム。
5. （５）前記脂質中にはさらにトコフェロール同族体を含
   むものである請求項１に記載のヘモグロビン含有リボソ
   ーム。
6. （６）前記内容液中には、さらに還元型グルタチオンお
   よび／またはアルコルビン酸を含むものである請求項１
   または２に記載のヘモグロビン含有リボソーム。
7. （７）ヘモグロビンに対する電子供与体の重量モル比が
   ０．５〜１０である請求項１〜６のいずれかに記載のヘ
   モグロビン含有リボソー ム。
8. （８）洗浄血液を低張リン酸緩衝液を添加して溶血させ
   、赤血球基質成分を除去し、低張リン酸緩衝液に対して
   透析を行った後、限外濾過により濃縮し、電子供与体を
   添加して混和させ、これをリボソーム化することを特徴
   とするヘモグロビン含有リボソームの製法。
9. （９）低張リン酸緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液またはＴＥ
   Ｓ緩衝液である請求項８に記載のヘモグロビン含有リボ
   ソームの製法。