DE10220990A1

DE10220990A1 - Verwendung von Sauerstoffträgern Hämoglobin, Myoglobin oder deren Derivaten zur kontrollierten Sauerstoffversorgung von Mikroorganismen, Zellen, Gewebe-Zellkulturen oder Organen und Verfahren zur verbesserten Substratproduktion bzw. Züchtung solcher Kulturen

Info

Publication number: DE10220990A1
Application number: DE2002120990
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Barnikol; Harald Poetzschke
Original assignee: SANGUIBIO TECH AG
Current assignee: SANGUI BIOTECH GMBH, 58455 WITTEN, DE
Priority date: 2002-05-11
Filing date: 2002-05-11
Publication date: 2003-11-27

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von künstlichen Sauerstoffträgern aus Hämoglobin oder Myoglobin, Derivaten oder Mischungen hiervon zur kontrollierten Versorgung von Zell- oder Gewebekulturen, Gewebe, Organen oder Mikroorganismen oder einer Kombination hiervon mit Sauerstoff bzw. ein Verfahren zur kontrollierten Bereitstellung von Sauerstoff für solche Substrate, vor allem in bioverfügbarer Form. Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Verfahren bzw. Verwendung zur Züchtung von Hautzellen bzw. großflächigen Hautbereichen, Organzellen und Organen, wie Herz, Leber, Niere, Lunge, Haar, Nerven, Darm oder zur verbesserten Produktion von Substraten in Fermentationsprozessen. Insofern kann erfindungsgemäß auch ein vorübergehend stillgelegtes Organ während eines chirurgischen Eingriffs oder auch ein exzidiertes für die Transplantation vorgesehenes Organ wirksam mit Sauerstoff versorgt werden. Erfindungsgemäß werden der oder die Sauerstoffträger in Mengen von 2 bis 200g/Liter Medium eingesetzt. In letzterem Fall sind Lidocain oder Heparin nicht erforderlich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von künstlichen Sauerstoffträgern aus Hämoglobin oder Myoglobin, Derivaten oder Mischungen hiervon vor allem aus vernetztem polymerem, insbesondere hyperpolymerem Derivaten hiervon, welche vorzugsweise mit einem Polyalkylenoxid kovalent verknüpft sind, zur kontrollierten Versorgung von Zell- oder Gewebekulturen, Gewebe, Organen oder Mikroorganismen oder einer Kombination hiervon mit Sauerstoff bzw. ein Verfahren zur kontrollierten Bereitstellung von Sauerstoff für solche Substrate, vor allem in bioverfügbarer Form. Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Verfahren bzw. Verwendung zur Züchtung von Hautzellen bzw. großflächigen Hautbereichen, Organzellen und Organen wie Herz, Leber, Niere, Lunge, Haar, Nerven, Darm oder zur verbesserten, vor allem erhöhten Produktion von Substraten wie Proteinen, Vitaminen in Fermentationsprozessen. Insofern kann erfindungsgemäß auch ein vorrübergehend stillgelegtes Organ, wie z. B. das Herz, während eines chirurgischen Eingriffs oder auch ein exzidiertes für die Transplantation vorgesehenes Organ wirksam mit Sauerstoff zur Aufrechterhaltung seiner Funktion wirksam versorgt werden. Der oder die Sauerstoffträger werden in Mengen von 2 bis 200 g/Liter Medium eingesetzt. In letzterem Fall Lidocain oder Heparin, nicht erforderlich.
Sauerstoffträger sowie künstliche Sauerstoffträger, hergestellt durch Modifikation natürlicher Sauerstoffträger wie Hämoglobin oder Myoglobin zur Versorgung eines lebenden Organismus mit Sauerstoff sind seit langem bekannt, vgl. DE 197 01 37, EP 97 100790, DE 44 18 937, DE 38 41 105, DE 37 14 351, DE 35 76 651. Die Hämoglobine oder Myoglobine werden auf bekannte Weise gewonnen und können vernetzt werden, wobei vernetzte (intramolekular), polymere und insbesondere hyperpolymere Produkte entstehen. Daneben können die natürlichen Sauerstoffträger, welche gegebenenfalls zuvor auch vernetzt werden können, auch mit Polyalkylenoxiden kovalent verknüpft werden, vgl. Harris J. M., Poly(Ethylen Glykol) Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York, 1992).
In der DE-A1 100 31 740 (WO 02/00230), DE-A1 100 31 744 und der DE-A1 100 31 742,1 werden modifizierte Sauerstoffträger bzw. besondere Verfahren zu deren Herstellung beschrieben, welche polymerisiert und mit Polyalkylenoxiden umgesetzt sind.
Die so hergestellten Träger werden als geeignet, insbesondere zur intravasalen oder biomedizinischen Anwendung, z. B. als Ersatz des Blutes, als Zusatz hierzu beschrieben, da solche Sauerstoffträger unter anderem eine besonders gute Plasmaverträglichkeit aufweisen. Ferner ist auch eine Anwendung in einer Nährlösung beschrieben. Hierbei ist jedoch nicht angegeben, unter welchen Bedingungen und vor allem zu welchem Zweck ein solcher Sauerstoffträger in Nährlösungen eingesetzt werden kann.
Allerdings ist bekannt, dass Hämoglobin und insofern auch künstliche Sauerstoffträger empfindlich gegenüber Oxidationsreaktionen sind, wobei das unwirksame Methämoglobin entsteht, das keinen Sauerstofftransport mehr zulässt. So wird in der EP-A 0 857 733 beschrieben, dass künstliche Sauerstoffträger zur Versorgung von lebenden Systemen oder in biomedizinischen Systemen erst dann eingesetzt werden sollen, wenn die Sauerstoffbindungsstellen zuvor mit einem Schutzliganden wie Kohlenmonoxid versehen wurden. Dieser Ligand wird vor der Anwendung nicht entfernt, sondern während er wirkt. Damit soll erreicht werden, dass die Funktion des Sauerstoffträgers allmählich, also nach und nach, je nach den jeweiligen Erfordernissen, freigegeben wird. Somit kommt es zum Beispiel bei der Anwendung an einem Patienten nicht zu einer unerwünschten temporären Überversorgung mit Sauerstoff (vgl. Spalte 5, Abs. 2 in der EP-A 857 733).
Im Unterschied zu lebenden Organismen bedarf es aber bei der Züchtung von Zellen, insbesondere Gewebezellen, bzw. der Versorgung von Substrat-produzierenden Zellen oder Mikroorganismen oder auch bei exzedierten für die Transplantation vorgesehenen Organen besonderer äußerer Bedingungen, die von denen im Organismus verschieden sein können. Vor allem werden dem Nährmedium Zusätze hinzugegeben, wie z. B. solche, die das Wachstum beeinflussen. Solche Zusätze sind beispielsweise Aminosäuren oder Wachstumsfaktoren. Ferner werden auch Monosaccharid oder Antibiotika hinzugefügt, um das Wachstum bzw. die Produktion einerseits zu beschleunigen und andererseits das Auftreten unerwünschter Zellen, zu unterdrücken. Diese Stoffe können jedoch auch die Wirksamkeit eines Sauerstoffträgers negativ beeinflussen. So ist bekannt, dass Metallionen wie Cu²⁺, Fe²⁺ und ähnliche und auch ETDA die Oxidation von Hämoglobin fördern, gewisse Alkohole sie hemmen. Die Anwendung des Schutzliganden Kohlenmonoxid hat zwar den Vorteil, dass eine Oxidation des Trägers unterbunden werden kann, allerdings ist, wie erwähnt, eine schnell eintretende oder auch gegebenenfalls gewünschte zeitliche Überversorgung mit Sauerstoff nicht möglich, da Kohlenmonoxid sehr fest an die Sauerstoffbindungsstellen ligandiert ist und nur langsam abgegeben wird.
Analog sind auch bei lebenden zeitweilig in ihrer Körperfunktion reduzierten Organismen wie solche während eines chirurgischen Eingriffs oder während einer Explantation, besondere Bedingungen hinsichtlich der Funktionserhaltung der Organe erforderlich, welche anders sind als bei lebenden Organismen, die sich nicht in einem solchen Zustand befinden.
Die in den Anmeldungen DE-A 100 31 744, DE-A 100 31 742 und DE-A 100 31 740 beschriebenen Produkte weisen durch spezielle Herstellungsverfahren besonders günstige Eigenschaften auf hinsichtlich ihrer Verträglichkeit mit dem Blutplasma des menschlichen Organismus.
In für die Züchtung vorgesehenen Zellen bzw. bei für die Substratproduktion vorliegenden Organismen oder Zellen oder exzidierten Organen liegt normalerweise kein Blutplasma vor, so dass die für den menschlichen Organismus festgestellten Bedingungen nicht genutzt werden können.
Vielmehr ist es beim Züchten von Zellen und der Substratproduktion erforderlich, dass keine Wechselwirkung mit den Oberflächen der Zellmembranen erfolgt.
Darüber hinaus ist bekannt, dass Hämoglobin oder Myoglobin selbst für bestimmte Zellen wie z. B. Nervenzellen toxisch sein kann.
Daher wurden bisher besondere Vorrichtungen zum Züchten von Zellen und insbesondere Gewebezellen eingesetzt, wie beispielsweise in der US-A 5773,285, WO 9640859 oder in EP-A 1 115 113 beschrieben. Durch besondere Kanäle und Filterelemente werden besondere Verteilungssituationen für das Nährmedium geschaffen, wobei dem zu züchtenden Gewebe eine bestimmte Form und Oberfläche verliehen werden kann.
Zur extrakorporalen Zellzüchtung werden dabei den Nährmedien Zusätze wie Glukose, Insulin, gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, Aminosäuren, Antibiotika zugesetzt. Gemäß der US-A 5,773,285 wird das Nährmedium mit einer Gasmischung aus O₂ und CO₂ äquilibriert, wobei die Verweildauer des Gases durch besondere apparatetechnische Konstruktionen erhöht sein soll. Das Gas muss zuvor sterilisiert werden.
WO/01/01774 beschreibt eine spezielle Zusammensetzung zur Konservierung von für die Transplantation vorgesehener Organe, nämlich des Herzens, wobei neben einer speziellen Kombination von Elektrolyten zwingend Proteine, ein vom Schwein abgeleitetes PEG- (Polyethylenglykol-)kovalent gebundenes Hämoglobin sowie ein kardiovaskulär wirksames Mittel, nämlich Heparin oder Lidocain vorhanden sein muss.
Ein besonderes Problem für eine ausreichende Sauerstoffversorgung bei der Zellzüchtung bzw. bei der Substratproduktion, z. B. in Fermentern, stellt der notwendige Gebrauch einfacher wässriger Nährmedien dar. Sauerstoff ist darin so wenig löslich, dass selbst eine sehr starke Perfusion sowie eine Äquilibrierung des Nährmediums mit reinem Sauerstoff den Zellen nicht ausreichend Sauerstoff anbieten können. Die Äquilibrierung mit Sauerstoff hat dazu noch einen entscheidenden Nachteil zur Folge, nämlich, dass der Sauerstoff dann hochgespannt einen Sauerstoffpartialdruck von rund 700 mm Hg besitzt. In dieser Form hat Sauerstoff eine starke oxidative Toxizität und damit Schädigung für die zu züchtenden oder produzierenden Zellen. Bei Organismen während eines chirurgischen Eingriffs liegt zwar normalerweise Plasma vor, jedoch aufgrund des Eingriffs, insbesondere am Herzen, in reduzierter Menge, so dass auf diese Eigenschaft der o. g. Sauerstoffträger nicht zwingend zurückgegriffen werden kann, um während des Eingriffs das Organ ausreichend zur Aufrechterhaltung seiner Funktion zu versorgen.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, zur Züchtung von Zellkulturen z. B. zur Herstellung von Gewebe, Organen, Mikroorganismen bzw. bei der Substratproduktion durch Zellen oder Mikroorganismen und auch bei der funktionellen Organerhaltung derartige Bedingungen bereitzustellen, dass in der Nährlösung ein beschleunigtes, jedoch kontrolliertes Wachstum der gewünschten Spezies bzw. eine erhöhte Stoffproduktion bzw. ausreichende Funktionserhaltung möglich ist, ohne dass auf aufwendige Apparaturen zurückgegriffen werden müsste, ferner ohne dass eine Einschränkung auf bestimmte Zellarten erforderlich wäre, wobei den produzierenden/wachsenden Zellen Sauerstoff in bioverfügbarer Form, d. h. untoxisch und in ausreichender Menge zugänglich sein soll.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass man dem Medium, mit dem das Organ versorgt wird bzw. dem Nährmedium einen oder mehrere Sauerstoffträger, in einer Konzentration von 2 bis 200 g/L, d. h. 0.2 bis 20 Gew.%, zusetzt. Der oder die Sauerstoffträger sind bevorzugt vernetzt, polymerisiert und/oder pegyliert d. h. mit einem Polyalkylenoxid kovalent verknüpft. Ganz besonders bevorzugt sind die Sauerstoffträger solche, die sowohl vernetzt, polymerisiert und insbesondere auch pegyliert sind. Es zeigte sich, dass mittels derartiger Substanzen hier keine Wechselwirkung mit den Oberflächen der Zellmembranen erfolgt, wenn diese Träger oder auch ein Gemisch derartiger Träger in der genannten Konzentration eingesetzt werden. Somit werden die Zellen oder Gewebe mit einer für ein beschleunigtes Wachstum oder erhöhte Substratproduktion in Fermentationsprozessen ausreichenden nicht toxischen Menge an Sauerstoff kontrolliert versorgt. Andererseits können exzidierte zur Transplantation vorgesehene Organe wirksam in ihrer Funktion erhalten werden, wenn der Sauerstoffträger, insbesondere ein oder mehrere der bevorzugten, in der angegebenen Menge vorhanden sind. Dabei sind Heparin oder Lidocain nicht erforderlich. Darüber hinaus kann auch ein Organ während eines chirurgischen Eingriffs, insbesondere das Herz, wirksam in seiner Funktonalität erhalten werden, wenn man ein Medium, enthaltend den oder die Sauerstoffträger in den angegebenen Mengen wie beschrieben, als eine Infusionslösung, vorzugsweise zusammen mit den nachfolgend beschriebenen Zusatzstoffen bereitstellt und dem Patienten während des Eingriffs verabreicht.
Dies war nicht zu erwarten, da der Stand der Technik angab, dass insbesondere künstliche Sauerstoffträger allgemein in Nährlösungen in Organen im lebenden Organismus unter normalen Bedingungen einsetzbar seien, wobei jedoch andere Bedingungen vorliegen, wie beispielsweise bezüglich der intakten vegetativen Regelung. Es war daher überraschend, dass nur durch erfindungsgemäß beschriebene Mengen tatsächlich eine kontrollierte Sauerstoffbereitstellung und somit ein schnelleres Wachsen der Zellen oder Kulturen bzw. Substratproduktion oder auch eine zuverlässige funktionelle Organerhaltung erzielt wird, zumal der ermittelte Bereich des dann vorliegenden Sauerstoff-Partialdrucks viel geringer ist als unter Einleitung von reinem Sauerstoff in ein Medium bzw. Nährmedium; letzterer schädigt oxidativ. Somit ist erfindungsgemäß eine physiologische, mit bioverfügbarem (unter kleinem Partialdruck stehenden) Sauerstoff ohne die geringste schädigende Wechselwirkung mit den zu züchtenden oder produzierenden Zellen möglich.
Ferner war nicht zu erwarten, dass bei Wahl der vernetzten und pegylierten Träger entgegen der Feststellung in der DE-A-100 31 740 (WO 02/00230) gerade diejenige Fraktion als Lieferant für Sauerstoff entweder durch erleichterte Diffusion und/oder durch Konvektion hier besonders gut wirksam ist, welche intravasal als Additiv eingesetzt wurde. Insbesondere war es auch überraschend, dass solche, vor allem künstliche Sauerstoffträger, deren Eigenschaften so beschaffen sind, dass eine intravasale Anwendung möglich ist oder dass ein Einsatz in einer Nährlösung in einzelnen Organen erfolgen soll, geeignet sind zur extrakorporalen Kultivierung von Mikroorganismen und die Züchtung von Zellen, Gewebe oder zur Herstellung von z. B. Organen oder Substraten oder der Erhaltung von exzidierten oder unter reduzierten Bedingungen befindlichen Organen, wobei, wie erwähnt, gänzlich andere Bedingungen vorliegen, geeignet sind.
Der Sauerstoffträger ist bevorzugt mit einem Vernetzer vernetzt, polymerisiert.
Der Sauerstoffträger, welcher Hämoglobin oder Myoglobin oder Mischungen hiervon, bevorzugt Hämoglobin oder auch Hämoglobin-Myoglobin-Mischungen, sein kann, kann auch mit einem Polyalkylenoxid kovalent verknüpft sein, welches ausgewählt ist aus Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, oder einem Copolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid oder einem Ester, Ether oder Esteramid hiervon. Besonders bevorzugt werden Sauerstoffträger eingesetzt, die mit einem Polyethylenoxid bzw. geeigneten Derivat hiervon verknüpft sind. Es ist ferner bevorzugt, wenn das kovalent angeknüpfte Polyalkylenoxid eine Molare Masse von 200 bis 5000 g/mol aufweist.
Ganz besonders bevorzugt sind der oder die Träger wie beschrieben vernetzt polymerisiert und mit einem Polyalkylenoxid kovalent verknüpft (pegyliert), wie in DE-A1 100 31 740 (WO 02/00230), DE-A1 100 31 744 und der DE-A1 100 31 742,1 beschrieben.
Besonders geeignete Sauerstoffträger sind Hämoglobine bzw. wie oben beschrieben modifizierte Hämoglobine mit einem Molekulargewicht von 65 000 bis, insbesondere von 70 000 bis 15 000 000 g/mol, insbesondere 80 000 bis 15 000000, wobei solche mit einem Molekulargewicht von 700 000 bis 10 000 000, bevorzugt 700 000 bis 5 000 000 g/mol, besonders bevorzugt sind, oder auch Myoglobine bzw. modifizierte Derivate hiervon mit einem Molekulargewicht von 15 000 g/ Mol bis 5 000 000 g/Mol, bevorzugt 100 000 bis 3 000 000 oder auch 200 000 bis 3 000 000 oder Mischungen von Hämoglobin- und Myoglobin- Sauerstoffträgern wie angegeben. Dabei kann das Verhältnis von Hämoglobin- zu Myoglobin-Sauerstoffträger oder Derivaten hiervon von 20 : 1 bis 1 : 20, insbesondere 10 : 1 bis 1 : 10 betragen. Ebenso kann das Verhältnis von natürlichem zu modifiziertem Sauerstoffträger 20.1 bis 1 : 20, vor allem 10.1 bis 1.10 betragen.
Ganz besonders bevorzugt weisen die erfindungsgemäß eingesetzten Sauerstoffträger der beschriebenen Art, vor allem die pegylierten bzw. vernetzt pegylierten, einen Partialdruck p50 von weniger als 26 Torr, insbesondere 13 bis 22 und bevorzugt 15 bis 20 Torr auf. Der Sauerstoffpartialdruck p50 ist dabei der Druck, bei dem der Träger hälftig Sauerstoff gebunden hat. Darüber hinaus sollte der Träger auch eine genügend große Kooperativität aufweisen, welche als sog. Hillscher Index quantifiziert werden kann. Der Normalwert des Blutes beträgt 2,6. Es hat sich gezeigt, dass die Kooperativität des erfindungsgemäß eingesetzten Trägers nicht kleiner als 2,0 sein sollte.
Der oder die erfindungsgemäß eingesetzte(n) Sauerstoffträger sind dann wirksam, wenn eine Konzentration von 0,2 bis 20 Gew.%, insbesondere 1 bis 18 Gew.%, vor allem 3 bis 15 Gew.%, insbesondere 4 bis 15 Gew.% und besonders 5 bis 10 Gew.% im für die Zellzüchtung bzw. Substratproduktion bzw. Organerhaltung vorgesehenen Medium vorliegt. Demnach liegen im Medium 2 bis 200 g/Liter bzw. 10 bis 180 oder 30 oder 40 bis 150 bzw. 50 bis 100 g /Liter an Sauerstoffträger vor.
Der oder die Sauerstoffträger können, falls erforderlich, kurz vor der Anwendung extern mit Sauerstoff in an sich bekannter Weise über geeignete Austauscher mit Sauerstoff gesättigt und den Zellen zugeführt werden. Es können auch verschiedene Sauerstoffträger der genannten Art als Mischung zugesetzt werden, wie oben beschrieben. So können beispielsweise solche mit einem mittleren Molekulargewicht von 70 000 bis, besonders 80 000 bis 10 000 000, besonders 1000000, g/Mol aus Schweinehämoglobin mit einem aus Myoglobin hergestellten Sauerstoffträger mit einem Molekulargewicht von 15 000 bis 5 000 000, vor allem 100 000 bis 1000000 g/Mol zusammen eingesetzt werden.
Die Sauerstoffträger, insbesondere die künstlichen Derivate, der beschriebenen Art können hergestellt sein wie im oben genannten Stand der Technik beschrieben, der hier inkorporiert ist. Insbesondere bevorzugt sind solche, die hergestellt sind wie in der DE-A 100 31 740 (WO 02/00230), DE-A 100 31 742 und DE-A 100 31 744 beschrieben. Hierzu werden an die mit einem Vernetzer vernetzten Hämoglobin- oder Myoglobinmoleküle Polyalkylenoxide mäßig hohen Molekulargewichtes kovalent gebunden. Einzelheiten des Verfahrens zur Herstellung solcher künstlicher Sauerstoffträger sind oben beschrieben, (z. B. in der DE-A 100 31 740), hierin inkorporiert und lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Als Hämoglobin (oder Myoglobin)-Ausgangsmaterial zur Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Sauerstoffträger eignet sich monomeres, natives oder mit gewissen Effektoren, z. B. der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins (Myoglobins) wie beispielsweise Pyridoxal-5'- Phosphat oder 2-Nor-2-Formyl-Pyridoxal-5'-Phosphat, chemisch umgesetztes und modifiziertes Myoglobin oder Hämoglobin vom Menschen, vom Schwein, oder vom Rind. Bevorzugt ist humanes und insbesondere Schweine-Hämoglobin.
Das Hämoglobin oder Myoglobin kann gegebenenfalls auch durch Karbonylierung desoxygeniert sein.
Die Vernetzung monomeren, nativen oder mit Effektoren verknüpften Hämoglobins oder Myoglobins mit etlichen Vernetzern sind bekannt und in der Literatur vielfach beschrieben vgl. die oben genannten Anmeldungen. Beispielhaft seien angeführt als Vernetzer: Divinylsulfon, Epichlorhydrin, Butadiendiepoxid, Hexamethylendiisocyanat, den Dialdehyden Glyoxal und Glutardialdehyd sowie den Diimidoestern Dimethylsuberimidat, Dimethylmalonimidat und Dimethyladipimidat. Ferner sind auch Umsetzungen mit Dialdehyden, beispielsweise Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutardialdehyd, Adipindialdehyd und Suberdialdehyd, und Glyoxal, aber auch mit strukturell komplexeren Verbindungen bekannt, die durch oxidative Ringöffnung der zyklischen Halbazetal- und Halbketalstrukturen der Zuckermoleküle in Monosacchariden und Oligosacchariden erfolgen, oder die durch Umsetzung mit den Dialdehyden o-Adenosin und o-ATP, entstanden durch ringöffnende Oxidation der Ribose in Adenosin und in Adenosintriphosphat, hergestellt sind. Es können dabei unterschiedliche Molekulargewichte erhalten werden, vgl. EP 0 201 618. Jeweils bezogen auf monomeres Hämoglobin/Myoglobin werden molare Verhältnisse der verwendetem Vernetzer - insbesondere der bifunktionellen Vernetzter - von 3- bis 60-fach, bevorzugt 6- bis 35-fach, eingesetzt. Bezüglich Glutardialdehyd wird bevorzugt zwischen einem 7- und 10-fachen molaren Überschuss am Glutardialdehyd eingesetzt. Chemisch nicht stabile Verknüpfungen, insbesondere die Schiffschen Basen, die bei der Reaktion von funktionellen Aldehydgruppen mit Aminogruppen der Hämoglobine entstehen, werden in bekannter Weise reduktiv durch Reaktion mit geeigneten Reduktionsmitteln, wie z. B. Natriumborhydrid, in einem hinreichenden molaren Überschuss, bezogen jeweils auf monomeres Hämoglobin, bevorzugt 2- bis 100-fach, insbesondere bevorzugt 5- bis 20-fach, unter geeigneten bekannten Bedingungen stabilisiert.
Die genannten Verfahren sind bekannt und hierin inkorporiert.
Bevorzugt werden bifunktionelle Vernetzer zur Vernetzung der Hämoglobine/Myoglobine gewählt, z. B. Butandiepoxid, Divinylsulfon, ein Diisocyanat, insbesondere Hexamethylendiisocyanat, Zyklohexyldiisocyanat und 2,5-Bisisocyanatobenzolsulfonsäure, ein Di-N- Hydroxysuccinimidylester, ein Diimidoester, oder ein Dialdehyd, insbesondere Glyoxal, der analog reagierende Glykolaldehyd, oder Glutardialdehyd. Besonders bevorzugt ist Glutardialdehyd.
Die Umsetzung mit dem Polyalkylenoxid, welche an sich, insbesondere aber zusätzlich, d. h. vor oder nach oder während der Vernetzung erfolgen kann, ist ebenfalls in den oben genannten Anmeldungen beschrieben und hierin inkorporiert. Es wird im wesentlichen mit einem Polyalkylenoxid oder einem Derivat hiervon umgesetzt wie z. B. Polyethylenoxid, Polypropylenoxid, oder Kopolymere aus Ethylenoxid und Propylenoxid.
Insbesondere bevorzugt ist das Polyalkylenoxid-Derivat ein Ether, ein Ester, oder ein Esteramid mit einem kurzkettigen aliphatischen organische Rest ist.
Das kovalent angeknüpfte Polyalkylenoxid hat bevorzugt eine Molare Masse zwischen 200 und 5000 g/mol, vorzugsweise zwischen 500 und 2000 g/mol.
Zur kovalenten Anknüpfung der Polyalkylenoxide werden bevorzugt solche Derivate der Polyalkylenoxide verwendet, die ein verknüpfendes Agens mit einer funktionellen Gruppe bereits kovalent gebunden enthalten, welche eine direkte chemische Reaktion mit Amino-, Alkohol-, oder Sulfhydryl-Gruppen der Hämoglobine unter Bildung kovalenter Anknüpfungen der Polyalkylenoxide ergeben - beispielsweise Polyalkylenoxide mit reaktiven N-Hydroxysuccinimidylester-, Epoxid-(Glycidylether-), Aldehyd-, Isocyanat-, Vinylsulfon-, Jodazetamid-, Imidazolylformat-, Tresylatgruppen, u. a. Viele solche monofunktionell aktivierte Polyethylenglykole sind kommerziell erhältlich.
Es ist ferner bevorzugt, wenn im erfindungsgemäß eingesetzten die Anzahl der angeknüpften Polyalkylenoxide zwischen 1 und 40, insbesondere 4 bis 15, Moleküle Polyalkylenoxid pro Molekül des Hämoglobinmonomeren beträgt.
Die kovalente Anknüpfung des Polyalkylenoxids kann wie geschildert zuerst und erst anschließend die Vernetzung wie beschrieben erfolgen. Schließlich kann eine kovalente Anknüpfung eines Polyalkylenoxids auch sowohl zunächst vor der Vernetzung, als auch zusätzlich nach der Vernetzung erfolgen. Auf und Weiterverarbeitung können auch bei diesen Alternativen unverändert wie beschrieben durchgeführt werden.
Die Bedingungen der Anbindungen des Polyalkylenoxids sind in den oben genannten deutschen Anmeldungen im einzelnen dargelegt und daher hier inkorporiert.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Sauerstoff-transportierenden Mittel können auch vor der kovalenten Vernetzung des Hämoglobins chemisch nicht reagierende Effektoren der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins/Myoglobins zu dessen Reaktionslösung hinzu gegeben werden. Als Effektoren der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins/Myoglobins eignen sich insbesondere 2,3-Bisphosphoglycerat, Inositolhexaphosphat, Inositolhexasulfat oder Mellitsäure, wobei 2,3-Bisphosphoglycerat besonders geeignet ist.
Die Bedingungen für den Einsatz solcher nicht reaktiver Effektoren sind wie erwähnt in der DE-A 100 31 742 beschrieben.
Besonders bevorzugt werden Sauerstoffträger erfindungsgemäß eingesetzt, welche hergestellt wurden (vgl. DE 100 31 744), indem hoch gereinigtes Hämoglobin oder auch Myoglobin

a) zunächst desoxygeniert wird;
b) anschließend kovalent mit einem Effektor der Sauerstoffbindung umgesetzt wird;
c) dann die Lösung mit einem nicht chemisch reaktiven Effektor versetzt wird; und sodann
d) das Hämoglobin mit Glutardialdehyd in einer inversen Konzentrationsgradienten-Reaktion, bezogen auf die Konzentration des Vernetzers und des zu vernetztenden Hämoglobins, stabil kovalent miteinander vernetzt wird, anschließend die Lösung mit Wasser verdünnt wird, und sodann
e) ein Polyethylenoxid kovalent angeknüpft wird
f) das erhaltene Produkt in bekannter Weise aufgearbeitet wird.

Ganz besonders bevorzugt erfolgt hier die Vernetzung mit Glutardialdehyd, wie z. B. in Pötzschke H. und Barnikol W. (1992), Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology 20: 287-291, oder wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
Effektoren, die chemisch bzw. nicht chemisch reagieren, sind oben bzw. ebenfalls in der oben genannten Druckschrift DE-A 100 31 744 oder DE-A 100 31 742 erläutert.
Das Molekulargewicht der wie geschildert hergestellten Sauerstoffträger liegt im vorgenannten Bereich.
Insbesondere können die so hergestellten Sauerstoffträger wie beschrieben auch gereinigt werden wie, z. B. chromatographisch (z. B. durch präparative Volumenausschluss-Chromatographie) durch Zentrifugation, Filtration oder Ultrafiltration gereinigt, in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts aufgetrennt und nachfolgend weiterverarbeitet werden, vgl. z. B. DE-A 100 31 740 bzw. WO 02/00230.
Vor dem erfindungsgemäßen Einsatz kann, sofern erforderlich, der oder die Sauerstoffträger auf bekannte Weise oxygeniert werden.
Es ist bevorzugt, wenn der erfindungsgemäß eingesetzte Sauerstoffträger aus Hämoglobin vom Rind, Schwein oder vom Menschen, stammt. Bevorzugt ist Schweinehämoglobin, aber auch Humanhämoglobin. Dabei wird das Ausgangsmaterial je nach zu züchtender bzw. produzierender Zelle/Organismus/Organ gewählt.
Der Sauerstoffträger kann auch Myoglobin bzw. das wie oben beschrieben modifizierte Produkt hiervon sein oder Mischungen hiervon mit Hämoglobin-Derivaten. Dabei ist Schweinehämoglobin, insbesondere Humannhämoglobin bevorzugt.
Auf die erfindungsgemäße Weise wird überraschenderweise ein schnelleres Wachstum bzw. Substratproduktion oder funktionelle Organerhaltung durch kontrollierte Bereitstellung einer hierfür ausreichenden nicht toxischen Menge an Sauerstoff bei der Substratproduktion durch Zellen oder Mikroorganismen und auch der Züchtung von Zellen, Organismen und Gewebeteilen, wie z. B. tierischen oder menschlichen Ursprungs oder zur Züchtung von Zellen, Gewebe zur Behandlung von krankem Gewebe/Zellen wie beschriebenen erzielt.
Besonders bevorzugte Sauerstoffträger oder Mischungen hiervon zum Einsatz bei der Substratproduktion und der Züchtung von Zellen, Gewebe, Kulturen, Organen und Erhaltung ihrer Funktionalität sind solche, welche zum einen mit Glutardialdehyd vernetzt und mit einem Polyethylenoxid mit einem Molekulargewicht von 1500 bis 2000 g/Mol pegyliert sind und ein Gesamtmolekulargewicht von 300 000 bis 15 000 000, insbesondere 700 000 bis 10 000 000 bezogen auf Hämoglobin oder 100 000 bis 3 000 000 oder auch 200 000 bis 1 000 000 g/Mol bezogen auf Myoglobin, aufweisen.
Die Medien bzw. Nährmedien auf wässriger Basis können dabei hierfür geeignete Zusatzstoffe, insbesondere 0 bis 20%, bezogen auf das Volumen, vorzugsweise 0,1 bis 20, insbesondere 0,1 bis 15%, enthalten. Diese sind vorzugsweise ausgewählt aus Glukose, für die jeweilige Anwendung natürliche Aminosäuren also die für Menschen bzw. Bakterien oder Pilze, Insekten natürlichen Aminosäuren, weiterhin Insulin, jeweils in für die betreffende Anwendung physiologischer Konzentration, ferner auch geeignete bekannte Antibiotika, Gewebefaktoren sowie natürliche und/oder künstliche Puffersubstanzen wie TRIS, Bicarbonat, Phosphat sowie physiologisch verträgliche Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalzium- Magnesiumchloid ebenfalls in für die jeweilige Anwendung geeigneter, insbesondere physiologischer Konzentration, oder Mischungen hiervon.
Kalium-Kalzium-Magnesiumchlorid, Natriumhydrogen-(bi)carbonat, Natriumcitrat, Natriumlactat, also die bekannten Elektrolyten können z. B. in physiologischer Konzentration oder auch Vielfachen hiervon, z. B. bis zum 10fachen, aber auch in Mengen von 0,1 bis 30 Gew.%, insbesondere 0,5 bis 15 Gew.%, vor allem 0,8 bis 8 Gew.% vorliegen, wobei hierfür insbesondere Natriumchlorid geeignet ist. Die Elektrolyten können auch im Gemisch vorliegen. Die Puffersubstanzen können so eingesetzt werden, dass ein pH-Wert wie angegeben, vor allem aber von 7,4 vorliegt.
Glukose kann z. B. in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.%, Insulin in Mengen von bis zu 25 IE/ml, die für die jeweilige Anwendung bekannten natürlichen Aminosäuren, also die für den Menschen oder für die jeweiligen Tiere bekannten Aminosäuren z. B. 0 oder 0,01 bis zu 5 Gew.%, oder auch Gewebefaktoren, wie Interleukine in physiologischen Mengen bis zur 10fachen Menge hiervon vorliegen.
So können Infusionen, welche für den Einsatz bei der Aufrechterhaltung der Organfunktion während eines chirurgischen Eingriffs, insbesondere am Herzen, hergestellt werden, indem der oder die Sauerstoffträger in der angegebenen Menge, bevorzugt zwischen 5 und 150 g/Liter, insbesondere 30 bis 120 g/L, zusammen mit physiologischer Natriumchloridlösung und Glukose sowie Insulin in physiologischer Konzentration bis zum 5-Fachen hiervon, in Wasser eingesetzt werden.
Dabei werden insbesondere Säugetiere, vor allem Menschen behandelt.
Medien (Perfusionen) zur Aufrechterhaltung der Funktion exzidierter Organe, welche von Säugetieren, vor allem Menschen oder Schweinen stammen können, weisen bevorzugt neben Natriumchlorid in einer Menge zwischen 8 und 15 g/Liter, sowie Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Glucose und Insulin in jeweils physiologischer Dosierung und ggf auch Aminosäuren wie oben beschrieben, in Wasser auf. Der oder die Sauerstoffträger werden hier bevorzugt in einer Menge von 5 bis 150 g/Liter Medium, insbesondere 30 bis 150 und vor allem 35 bis 100 g/Liter eingesetzt.
Insbesondere hat sich gezeigt, dass der oder die erfindungsgemäß eingesetzte Sauerstoffträger über einen weiten pH-Bereich, nämlich von 5,5 bis 9, insbesondere 6,5 bis 8 wirksam ist für ein beschleunigtes kontrolliertes Zellwachstum bzw. Substratproduktion bzw. insbesondere auch bei der Organfunktionserhaltung, wobei hier vor allem ein pH-Wert von 7,4 vorliegen kann, der mittels des Mediums bzw. der Infusion/Perfusion eingestellt wird.
Der oder die dem Medium zugesetzten Sauerstoffträger geben den Sauerstoff wie erwähnt durch Diffusion ab, so dass eine in Züchtung befindliche Zelle, Gewebe, Gemisch hiervon, Organbestandteil oder zum Organ sich entwickelndes Gewebeteil selbst ausreichende Blutgefäße bilden kann. Dies erfolgt im angegebenen Konzentrationsbereich. Dieser wird während des Verfahrens kontrolliert durch und gegebenenfalls der Sauerstoffträger zugesetzt, um im erfindungsgemäßen Bereich zu bleiben.
Bei exzidierten zur Transplantation vorgesehenen Organen ist dieser Konzentrationsbereich besonders wichtig, da weder eine Über- noch eine Unterdosierung erfolgen darf. So werden zum Funktionserhalt von Herz, Leber, Niere, Lunge insbesondere in den dafür geeigneten Transportboxen Medien verwendet, enthaltend bevorzugt 5 bis 150 g/Liter Medium oder die oben genannten für Perfusionen genannten bevorzugten Bereiche an Sauerstoffträger, insbesondere diejenigen, welche gemäß der wie in DE-A1 100 31 740 (WO 02/00230), DE-A1 100 31 744 und der DE-A1 100 31 742,1 hergestellt sind und hierunter besonders diejenigen mit einem mittleren Molekulargewicht von 700 000 bis 5 000 000 g/Mol (Hämoglobine) bzw. 100 000 bis 1 000 000 g/Mol (Myoglobine) aufweisen.
Bei unter reduzierten, Stress-Bedingungen befindlichen Organen wie einer vorrübergehenden Stilllegung z. B. während eines chirurgischen Eingriffs, im lebenden Organismus wie einem Herzen, werden Infusionen der oben beschriebenen Art verabreicht. Der oder die Sauerstoffträger, welche ebenfalls bevorzugt die zuvor für den Organerhalt beschriebenen sein können, sind besonders bevorzugt in einer Menge von 10 bis 80 g/Liter im Infusionsmedium erhalten, so dass während der Verabreichung im Gewebe ein mittlerer Sauerstoffpartialdruck von etwa 30 mmHg vorliegt, der weder zu hoch ist, um eine oxidative, schädliche Überversorgung zu bedingen noch zu niedrig, um eine Hypoxie zu ermöglichen.
Die gezüchteten Zellen/Organismen/Organteile können humanen oder tierischen Ursprungs sein.
Bevorzugt werden die folgenden Zellen, Organismen bzw. Organteile gezüchtet: Hautzellen, Leberzellen, Herzzellen, Nierenzellen, Hautgewebeflächen, Haarzellen, Darmzellen oder Nervenzellen bzw. daraus erhältliche Organteile oder Organe.
Darüber hinaus können auch Zellen oder Gewebe zur Behandlung von erkranktem Gewebe auf die erfindungsgemäße Weise gezüchtet werden.
Es handelt sich insbesondere um für Menschen, aber auch andere Säuger geeignete Zellen, Organe, wie z. B. Schweine, oder andere Haustiere.
Sofern Organe oder derartige Gewebestrukturen gezüchtet werden sollen, können hierfür auch bekannte Vorrichtungen gewählt werden wie z. B. in der oben erwähnten EP-A 1 1 55 113 (DE 199 11 326) beschrieben. Dort wird ein 3-Kammer-System eingesetzt, wobei in der einen Kammer das zur Züchtung vorgesehenen Substrat, in der 2. Kammer das Nährmedium sowie der erfindungsgemäß eingesetzte Sauerstoffträger im angegebenen Konzentrationsbereich vorliegen, und in der 3. Kammer das verbrauchte Nährmedium vorliegt. Insbesondere ist die Substrat-Kammer in der Mitte angeordnet und weist entsprechende Leitungen zu den Zu- und/oder Ableitungskammern auf.
Zur Substratproduktion werden hierfür bekannte Zellen bzw. Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilze oder Insektenzellen, je nach gewünschtem Substrat gewählt. Damit können Proteine, Vitamine wie z. B. Vitamin C, Säuren wie Zitronensäure, Enzyme wie Proteasen, Glukosidasen in erhöhter Ausbeute hergestellt werden. Besonders bevorzugt kann eine Baculovirus vermittelte Expression in Insektenzellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, vor allem Glycoproteinen erfindungsgemäß vorgenommen werden. Geeignete Insektenzellen sind beispielsweise die bekannte Spodorptera frugiperda Sf9 Zelllinie oder auch Lepidopterm Zellinien. Daneben sind noch weitere bekannte Zelllinien wählbar, wie Trichoplusia ni cell line TN-5B1-4.
In derartigen Fermentationsprozessen werden die oben beschriebenen Nährmedien zusammen mit dem oder den Sauerstoffträgern gewählt.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert:

I. Sauerstoffträger

Beispiel 1

Zur Züchtung von Zellen oder Gewebe bzw. Substratproduktion sowie zur Funktionserhaltung explantierter wie auch vorrübergehend stillgelegter Organe kann ein Sauerstoffträger eingesetzt werden, der wie folgt erhalten wurde (vgl. DE 100 31 742):
Schweinehämoglobin, in einer Konzentration von 330 g/L gelöst in einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mM NaHCO₃ und 100 mM NaCl, wurde bei 4°C durch Rühren der Lösung unter ständig erneuertem, reinen Stickstoff über der Lösung desoxygeniert. Anschließend wurden 4 mol Natrium-Ascorbat (als 1-molare Lösung in Wasser) pro Mol (monomeren) Hämoglobins zugegeben und 6 h reagieren lassen. Die Lösung wurde mit 0,5- molarer Milchsäure auf einen pH-Wert von 7,1 titriert, 1,1 Mol Pyridoxal-5'-Phosphat je Mol Hämoglobin zugegeben und für 16 h reagieren lassen. Nun wurde mit 0,5-molarer Natronlauge ein pH-Wert von 7,8 eingestellt, 1,1 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01- molarer Natronlauge) zugegeben und für eine Stunde reagieren lassen. Jetzt wurde mit 0,5- molarer Milchsäure ein pH von 7,3 eingestellt, zunächst 1,1 Mol 2,3-Bisphosphoglyzerat pro Mol Hämoglobin und nach 15 min Reaktionszeit 8 Mol Glutardialdehyd je Mol Hämoglobin, gelöst in 1,8 L reinem Wasser je Liter Hämoglobinlösung zur Vernetzung des Hämoglobins innerhalb 5 Minuten zugegeben und 2,5 h reagieren lassen. Nach Titration mit 0,5-molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7, 8 folgte eine Zugabe von 15 Mol Natriumborhydrid (als 1-molare Lösung in 0,01-molarer Natronlauge) je Mol Hämoglobin für 1 h. Es erfolgte eine Zugabe von 2 Liter Wasser je Liter ursprünglicher Hämoglobinlösung. Der pH-Wert betrug dann 9,3 und es folgte direkt eine Zugabe von 4 Mol Methoxy-Succinimidylpropionat-Polyethylenglykol des Molekulargewichts 2000 g/Mol für 2 h. Die Stickstoffatmosphäre über der Lösung wurde durch reinen Sauerstoff ersetzt.
Nach 1 h wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation (20000 g für 15 min) abgetrennt. Anschließend erfolgte ein Wechsel des Elektrolyten durch eine Volumenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25-Gel, Pharmacia, D) zu einer wässrigen Elektrolyt-Lösung der Zusammensetzung 125 mM NaCl, 4,5 mM KCl und 20 mM NaHCO₃.
Die Ausbeute betrug 77%; die Ausbeute für Molekulargewicht größer 700 000 g/Mol ist 28%. Messungen der Charakteristik der Sauerstoffbindung unter physiologischen Bedingungen (eine Temperatur von 37°C, ein Kohlendioxid-Partialdruck von 40 Torr und ein pH-Wert von 7,4) ergaben für das Produkt einen p50-Wert von 22 Torr und einen n50-Wert von 1,95.

Beispiel 2

Für die Züchtung von Zellen/Gewebe bzw. Substratproduktion wird wie folgt hergestellter Sauerstoffträger eingesetzt:
Die Synthese der vernetzten Schweinehämoglobine erfolgte (leicht modifiziert) gemäß den Vorschriften aus Dinkelmann S. ("Präparation und in vitro Charakterisierung eines künstlichen Sauerstoffträgers auf der Basis von Schweinehämoglobin und seine Evaluierung im Kleintier", Dissertation, Fachbereich Medizin, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz 1997) und Domack U. ("Entwicklung und in vivo-Evaluation eines künstlichen Sauerstoffträgers auf Basis von Rinderhämoglobin", Dissertation, Fachbereich Chemie, Johannes Gutenberg- Universität Mainz 1997): Konzentriertes, desoxygeniertes Schweinehämoglobin gelöst in einem wässrigen Elektrolyten der Zusammensetzung 50 mmol/L NaHCO₃ und 100 mmol/L NaCl wurde bei Raumtemperatur mit dem 14-fachen molaren Überschuss an Glutardialdehyd umgesetzt. Natriumcyanoborhydrid, im 10-fachen molaren Überschuss zum (monomeren) Hämoglobin zugesetzt, reduzierte die bei der Vernetzung entstandenen Schiffschen Basen und stabilisierte die kovalente Vernetzung. Die erhaltene Lösung der vernetzten Hämoglobine wurde in drei Teile (A, B und C) geteilt und unterschiedlich weiter verarbeitet.
Teil A blieb unverändert, die Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung (gemäß Pötzschke H. et al. (1996): "Vernetzte globuläre Proteine - eine neue Klasse halbsynthetischer polymerer Moleküle: Charakterisierung ihrer Struktur in Lösung am Beispiel hyperpolymeren Hämoglobins und Myoglobins mittels Volumenausschluß-Chromatographie, Viskosimetrie, Osmometrie und Lichtstreuung", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 1419-1437, sowie Pötzschke H. et al. (1996): "Ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung Molarer Massen breit verteilter Polymerer mit Hilfe der Gel-Chromatographie und der Viskosimetrie am Beispiel Hämoglobin-Hyperpolymerer", Macromolecular Chemistry and Physics 197, 3229-3250) unter Anwendung der Volumenausschluss-Chromatographie mit dem Gel Sephacryl S-400 HR (Pharmacia Biotech, Freiburg, D) ergab für das vernetzte Schweinehämoglobin (Abb. 1 zeigt ein Chromatogramm) einen Modalwert der Molekulargewichtsverteilung von 520 kg/mol.
Die Polymeren des Anteils B wurden mit monofunktionell aktivem mPEG-SPA-1000 (Shearwater Polymers Europe, Enschede, NL) kovalent verknüpft: Zunächst wurde Natriumhydrogencarbonat als Festsubstanz bis zu einer Endkonzentration von 150 mmol/L zur Lösung der vernetzten Hämoglobine addiert, anschließend erfolgte die Zugabe von mPEG-SPA-1000 im 12-fachen molaren Überschuss (bezogen auf die Hämoglobin-Monomeren) ebenfalls als Festsubstanz. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde wurde Lysin im 60-fachem molaren Überschuss (bezogen auf Hämoglobin) zugegeben und reagierte mit noch aktiven mPEG-SPA- 1000-Molekülen.

Teil C

Mit der Lösung der vernetzten Hämoglobine wurde genauso verfahren wie für Teil B beschrieben, jedoch unter Verwendung von mPEG-SPA-2000 (Shearwater Polymers Europe, Enschede, NL).
Anschließend erfolgte ein Lösungsmitteltausch in den drei Lösungen A, B und C (mit Hilfe einer Ultrafiltration, "Ultraminisette 10 kDa", Pall Gelman Sciences, Roßdorf, D, oder einer Volumenausschluss-Chromatographie am Gel "Sephadex G-15 M", Pharmacia Biotech, Freiburg, D) zu einer Lösung in einem wässrigen Elektrolyten (StLg) der Zusammensetzung: 125 mM NaCl, 4,5 mM KCl und 3 mM NaN₃.
Alternativ kann auch natürliches Hämoglobin oder Myoglobin, auf bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugation und fraktionierte Ultrafiltration gewonnen und gereinigt, eingesetzt werden als solches oder im Gemisch oder im Gemisch mit oben beschriebenen modifizierten Produkten.
Diese(r) Träger ist besonders geeignet.

Beispiel 3

Humanes natürliches Hämoglobin wurde zentrifugiert und ultrafiltriert und gereinigt. Hiervon wurden 7 Gew.% in 100 ml Wasser, enthaltend 0,9 Gew. Natriumchlorid sowie 5 Gew.% Glukose und 20 IE/ml Insulin gelöst.

Beispiel 4

Käufliches natürliches Humanmyoglobin (z. B. von Sigma, D) wurde gelchromatographisch gereinigt. Dieses kann erfindungsgemäß als solches oder auch modifiziert wie oben beschrieben eingesetzt werden.

Beispiel 5

10% eines nicht modifizierten Humanhämoglobins gemäß Beispiel 3 und 5 Gew.% eines wie in Beispiel 2 beschriebenen modifizierten Produktes wurden in 100 ml gereinigtem Wasser, enthaltend 0.9 Gew.% Natriumchlorid, 0,2 Gew.% Natriumbicarbonat, 1 Gew.% Glukose, gegeben. Die Lösung ist sofort gebrauchsfertig.

Beispiel 6

6 Gew.% eines mit Polyethylenglykol modifizierten Humanmyoglobins, hergestellt wie Beispiel 2, Lösung A beschrieben, wurde in 100 ml gereinigtes Wasser, enthaltend 0,9 Gew.% Natriumchlorid sowie 5 Gew.% Glukose, 20 IE/ml, gegeben.
Die Lösung ist sofort gebrauchsfertig und insbesondere auch haltbar.

II: Anwendungsbeispiel

Die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellten Sauerstoffträger wurden in üblichen Fermentationsprozessen in einer Konzentration von je 50 g/Liter eingesetzt. Die Medien enthielten Wasser, sowie Insektenzellen. Die Träger wurden mit Hilfe eines Umlaufs, in dem ein Gasaustauscher als künstliche Lunge eingeschaltet war, fortlaufend mit Sauerstoff beladen. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz der künstlichen Sauerstoffträger und somit durch das kontrollierte Versorgen der Zellen mit Sauerstoff konnte die Ausbeute an Substraten erheblich erhöht werden.

Claims

1. Verwendung von Sauerstoffträgern aus Hämoglobin, Myoglobin oder deren Derivaten oder Mischungen zur kontrollierten Sauerstoffversorgung einer oder mehrerer Gewebe- oder Zellkulturen, Mikrorganismen oder Zellen zur beschleunigten Züchtung solcher Kulturen, Zellen, Gewebes, Mikroorganismen oder eines daraus sich entwickelnden Organs oder zur verbesserten Substratproduktion oder Sauerstoffversorgung von Organen, wobei die Versorgung von exzidierten Organen in Abwesenheit von Heparin, Lidocain erfolgt.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine kontrollierte Sauerstoffversorgung von Mikroorganismen oder Zellen zur Substratproduktion in Fermentationsprozessen erfolgt.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen oder Zellen mit den Sauerstoffträgern zur Produktion von Proteinen, Vitaminen, Enzymen, Säuren versorgt werden.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Insektenzellen, Bakterien oder Pilze mit Sauerstoff versorgt werden.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Transplantation vorgesehene exzidierte Organe mit Sauerstoff versorgt werden.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Herz, Lunge, Niere, Leber mit Sauerstoff versorgt werden.

7. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass unter Stress befindliche während eines chirurgischen Eingriffs vorrübergehend stillgelegte Organe mit Sauerstoff versorgt werden.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Zellkulturen zur Züchtung von Organen mit den Sauerstoffträgern versorgt werden.

9. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Züchtung Zellen/Gewebe für die Behandlung von erkranktem Gewebe mit Sauerstoffträgern versorgt werden.

10. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Züchtung vorgesehenen Zellen/Gewebe humanen oder tierischen Ursprungs sind.

11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Hautzellen, Haarzellen, Herzzellen, Muskelzellen, Leberzellen, Nierenzellen, Nervenzellen oder Darmzellen mit Sauerstoff versorgt werden.

12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Sauerstoffträger aus vernetztem Hämoglobin oder Myoglobin oder Mischungen hiervon eingesetzt werden, die hergestellt werden durch Vernetzung eines Hämoglobins/Myoglobins mit einem für Proteine geeigneten Vernetzter.

13. Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Sauerstoffträger zusätzlich mit einem Polyalkylenoxid oder Derivat hiervon umgesetzt sind.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin menschlichen oder tierischen Ursprungs ist.

15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Hämoglobin oder Myoglobin mit einem Vernetzter, ausgewählt aus Butandiepoxid, Divinylsulfon, Diisocyanat, insbesondere Hexamethylendiisocyanat, Zyklohexyldiisocyanat und 2,5-Bisisocyanatobenzolsulfonsäure, Di-N-Hydroxysuccinimidylester, Diimidoester, oder Glyoxal, Glykolaldehyd, Glutardialdehyd vernetzt ist.

16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Hämoglobin-Sauerstoffträger ein Molekulargewicht von 80 000 bis 15 000 000 g/mol und der Myoglobin-Sauerstoffträger ein Molekulargewicht von 15 000 bis 5 000 000 g/Mol aufweist.

17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Sauerstoffträger in einer Menge von 2 bis 200 g/L Medium eingesetzt werden.

18. Verfahren zur kontrollierten Versorgung von menschlichen oder tierischen Zellen, Geweben, sich zu Organen entwickelnden Geweben, Mikroorganismen oder Mischungen hiervon, oder von exzidierten oder unter Stress befindlichen Organen, mit einer für ein beschleunigtes Wachstum, für die funktionelle Organerhaltung oder eine beschleunigte Substratproduktion ausreichenden nicht toxischen Menge an Sauerstoff, dadurch gekennzeichnet, dass man dem die Zellen, Gewebe, Mikroorganismus, oder Mischungen hiervon oder den die Organen enthaltenden bzw. damit zu versorgendem Medium einen oder mehrere künstliche Sauerstoffträger, ausgewählt aus Hämoglobin, Myoglobin und Derivaten oder Mischungen hiervon in einer Konzentration von 2 bis 200 g/l so zusetzt, dass diese Konzentration während des gesamten Prozesses aufrecht erhalten bleibt.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Sauerstoffträger solche aus vernetztem oder vernetztem und mit einem Polyalkylenoxid verknüpften Hämoglobin oder Myoglobin oder Mischungen hiervon sind.

20. Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Hämoglobin-Sauerstoffträger ein Molekulargewicht von 80 000 bis 15 000 000 g/ Mol bzw. der oder die Myoglobin-Sauerstoffträger ein Molekulargewicht von 15 000 bis 5 000 000 g/Mol aufweisen.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Sauerstoffträger ein oder mehrere Träger eingesetzt werden, die hergestellt werden durch Desoxygenierung, anschließende kovalente Umsetzung mit einem Effektor der Sauerstoffbindung und nachfolgende Umsetzung, mit einem nicht chemisch reaktiven Effektor, Vernetzung des Hämoglobins mit Glutardialdehyd in einer inversen Konzentrationsgradienten-Reaktion, bezogen auf die Konzentration des Vernetzers und des zu vernetzenden Hämoglobins, nachfolgende Verdünnung und kovalente Verknüpfung mit einem Polyethylenoxid und anschließende Beladung mit Sauerstoff durch Begasung in an sich bekannter Weise.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Sauerstoffträger in einer Konzentration von 2 bis 200 g/l Medium zugesetzt wird.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Hautzellen, großflächige Hautgewebeteile, Herzzellen, Nierenzellen, Haarzellen, Darmzellen, Bakterien, Pilze, Insektenzellen, Herz, Leber, Lunge oder Niere mit Sauerstoff versorgt werden.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass als die Zelle(n), Kulturen, Mikroorganismen, Organe enthaltendes oder damit zu versorgendes Medium ein wässriges Medium, enthaltend einen oder mehrere Zusatzstoffe, ausgewählt aus Puffersubstanzen, einem oder mehreren physiologisch verträglichen Salzen, Glukose, Insulin, Aminosäuren, Antibiotika und Gewebefaktoren eingesetzt wird.