WO2001045743A2 - Verwendung eines enzyms zur verbesserung der geweberesorption von arzneimitteln - Google Patents

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WO2001045743A2
WO2001045743A2 PCT/EP2000/012970 EP0012970W WO0145743A2 WO 2001045743 A2 WO2001045743 A2 WO 2001045743A2 EP 0012970 W EP0012970 W EP 0012970W WO 0145743 A2 WO0145743 A2 WO 0145743A2
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hyaluronate lyase
enzyme
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Jörg-Hermann Ozegowski
Peter-Jürgen Müller
Albert Härtl
Manfred Kietzmann
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Id Pharma Gmbh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts

Definitions

  • the invention relates to the use of a preparation which contains an active ingredient for improving the tissue absorption of one or more medicaments which are suitable for treatment.
  • Medicaments in the sense of the invention are, for example, analgesics, anesthetics, cancerostatics and cytotoxic compounds as well as all other medicinal substances which are administered subcutaneously or intramuscularly in human and veterinary medicine and reach their active site via tissue absorption and develop their effect there.
  • drugs that are based on
  • the passage of the agen-intestinal tract or the primary liver passage must be avoided, which are poorly absorbed gastrointestinally, in which a high initial plasma level or a formation of parasites, in particular local irritation or necrotization, are avoided and in which one is generally avoided rapid distribution in the tissue can be achieved.
  • the invention can also be used in oncology in the treatment of tumors. Another area of application is wildlife immobilization with anesthetics.
  • the tissue acts as a penetration barrier, which hinders tissue absorption. This results in a small spatial spread of the drugs in the tissue to be treated and a low speed of spread within the tissue.
  • Hyaluronidase is therefore a prototype for an active ingredient that improves the absorption of drugs. It will in medical practice hyaluronidases of animal origin, especially those obtained from the testes of cattle, are used. The hyaluronidase hydrolyzes the hyaluronic acid in the extracellular matrix and there is an accelerated spreading of the active substance in the interstitium or better and faster absorption of the active substance (Farrar GE: The Spreading Factor, Clin. Ther., 1989, 1 1, 705-
  • Hyaluronic acid plays an important role under various pathophysiological conditions. So with tumor diseases, for example lung, liver, breast,
  • the hyaluronic acid level in the tumor tissue is increased 9 to 18 times (Pauli, B.U. et al .: Hum. Pathol., 1988, 19, 628-639).
  • Hyaluronic acid is obviously involved in the processes of tumor growth and metastasis. Tumor cells are often surrounded by a hyaluronic acid coating that protects them from the immunological attack. Likewise, the cause of the occurring
  • Chemoresistance in solid tumors attributed to hyaluronic acid is based on the fact that a hyaluronic acid capsule of the tumor hinders the penetration of the chemotherapeutic agents.
  • testicular hyaluronidase itself has no anti-tumor activity. Rather, it enhances the effects of cancerostatics and therefore has the property of one
  • Cancerostatic agents such as mitomycin C, cis-platinum, vinblastine, melphalan and doxorubicin, which are used for the therapy of
  • testicular hyaluronidase Another area of application of testicular hyaluronidase is in veterinary medicine for immobilizing or immobilizing animals from a distance, e.g. B. by a
  • testicular hyaluronidases as absorption accelerators shorten the absorption time by up to about a third. However, this acceleration of absorption is often not sufficient in veterinary practice.
  • the use of testicular hyaluronidase is therefore more and more restricted due to the relatively low and very quickly diminishing effect after multiple use and due to the increasing risk of transmission of infectious material.
  • the cleaning of the hyaluronidases from tissue macerates with a naturally high proportion of foreign proteins and lipoid compounds requires a high level of cleaning effort. There is also evidence that the relatively low activity of the hyaluronidase
  • Cattle tests are due to the pronounced inhibition of the enzyme by sulfated glucosaminoglycans, such as heparin or heparin-like glycosaminoglycans, which are present in the extracellular matrix of mammals.
  • the invention is therefore based on the object of finding an active ingredient which does not have the mentioned disadvantages of testicular hyaluronidase or of hyaluronidases of animal origin or only has them to a lesser extent and, moreover, is simple to produce in sufficient quantities.
  • the active ingredient should be well tolerated and promote rapid absorption in parenteral, e.g. B. subcutaneous and intramuscular application, pharmaceutical pharmaceuticals via injection and
  • the dermal application and the application in the blood vessel system are not part of the present invention. Due to its non-animal origin, the active ingredient should not pose any risk of possible infections. The content of foreign material, especially foreign protein, should be so low that the effect does not wane even after repeated use. Furthermore, it should not or only to a small extent be inhibited by sulfated glycosaminoglycans. The sulfated glycosaminoglycans should only be broken down to a limited extent.
  • the invention relates to the use of a microbial hyaluronate lyase and / or a fragment produced from it as an active ingredient for improving the tissue absorption of
  • microbial hyaluronate lyases or their fragments which according to their cleavage mechanism are classified as lyases of the enzyme classification number EC 4.2.2.1, in particular those caused by the microorganism of the genus Streptococcus, preferably of the species Streptococcus agalactiae and especially from Streptococcus equisimilis during fermentation
  • Culture fluid excreted hyaluronate lyases lead to a very intensive absorption acceleration with subcutaneously or intramuscularly administered drugs.
  • These microorganisms are generally accessible, for example via the German Collection of Microorganisms (DSM Braunschweig).
  • the enzymatic active ingredient cleaves
  • Hyaluronic acid according to an elimination mechanism with the formation of unsaturated fission products.
  • hyaluronidases of animal origin (E.C.3.2.1.35 / 36) hydrolytically cleave the hyaluronic acid when water is added to form saturated cleavage products.
  • the hyaluronate lyase also differs from the animal hyaluronidases by the amino acid sequences and the isoelectric point
  • the invention relates to the use of microbial hyaluronate lyase and the active fragments produced from it.
  • microbial hyaluronate lyases which are an enzyme group that has not previously been used to accelerate absorption, not only increase the tissue absorption of drugs in parenteral, for example subcutaneous and intramuscular, application, but that in comparative application of equally large activities, the microbial Hyaluronate lyases bring about a very rapid onset of improved absorption, whereas testicular hyaluronidase could only be detected after a longer delay phase.
  • the enzyme activity supplied to the tissue sectors to be treated during treatment or injection is 10-250,000 IU.
  • the total activity that must be introduced into the tissue sector to be treated during a perfusion can be considerably higher, for example between 10 and several million IU.
  • hyaluronate lyase from Streptococcus equisimilis is increased by sulfated glycosaminoglycans such as for example, the sulfated hyaluronic acid or hepan, much less inhibited
  • sulfated glycosaminoglycans such as for example, the sulfated hyaluronic acid or hepan
  • the microbial hyaluronate lyases are used for their inventive use in the form of galenical formulations. They contain as an injection preparation, for example, an isotonic aqueous solution of a highly purified microbial hyaluronate lyase with concentrations between 10 and 250,000 lU / ml and common excipients in injection preparations should be used, a drug must also be contained.
  • the enzyme protein of hyaluronate lyase is advantageously used in the form of a storage-stable solid which generally contains stabilizing additives and is filled, for example, in glass ampoules
  • freeze-dried active ingredient is particularly advantageous.
  • active ingredient sodium chloride, glucose, magnesium salts,
  • the enzyme activity of an ampoule after filling with physiological saline solution is between 10 and 250,000 lU / ml formulation
  • the preparation of the microbial hyaluronate lyases used in the injection formulation can be carried out as follows, for example with regard to the sequence and selection of the cleaning steps, in a manner which does not limit the scope of the invention
  • the invention is illustrated using the example of the enzyme from the generally accessible Streptococcus agalacttae.
  • the hyaluronate lyase formed has an isoelectric point of approximately 8.6 and a molar mass of approximately 116,000 D and acts as an endoglycanase
  • the enzyme has the advantageous property that it is inhibited by sulfated glycosaminoglycans, such as sulfated hyaluronic acid
  • the hyaluronate lyase is obtained as a highly purified enzyme for injection purposes or the purified hyaluronate lyase is reacted with the specific protease to form the fragment by the purification processes listed below.
  • the specific protease for example, can be used without restricting the invention, for example the acidic metalloprotease M02 (DD 270924) that come from the microorgan
  • Streptomyces hygroscopicus AP40 can be obtained.
  • This protease has a molecular weight of about 14,000 kD and an isoelectric point between 3.85 to 4.0
  • the fermentation of the microorganism takes place in a stirred fermenter while maintaining a constant pH at an acidity of pH 6.5 to 7.5.
  • the lactic acid formed during the fermentation is neutralized by adding dilute sodium hydroxide solution.
  • the medium consists of inorganic salts, yeast hydrolyzate, either casein peptone or soy peptone and glucose.
  • the cells are separated.
  • the cell mass is removed by microfiltration through filter modules with a pore size of, for example, 0.45 ⁇ m, discarded-tm * d ⁇
  • the culture filtrate is concentrated and cleaned in an ultrafiltration device.
  • the cut-off limit of the ultrafilter module is around 80,000 D.
  • a pre-cleaned enzyme solution is produced which is subjected to known cleaning methods.
  • the culture filtrate is concentrated and cleaned in an ultrafiltration device
  • the exclusion limit of the ultrafilter module is between 30 and 50 kD.
  • a pre-cleaned enzyme solution is created which has to be subjected to further cleaning steps before it can be used as an injection preparation.
  • the cleaning steps and the use of pyrogen-free excipients ensure that the injection preparation is pyrogen-free
  • the enzyme After increasing the ionic strength by adding ammonium sulfate to a saturation of 40%, the enzyme is adsorbed on phenylsepharose. Desorption then takes place with a neutral, buffered aqueous solution which contains 25% ammonium sulfate, based on 100% saturation. The solution is dialyzed Q-Sepharose (Pharmacia) is added to remove impurities. This is followed by specific adsorption onto a dye, for example aminophenyloxamic acid The final cleaning can be carried out together with the determination of the molecular weight in the form of molecular weight chromatography on Superdex (Pharmacia)
  • Streptococcus equisimilis As an enzyme generator, the cleaning step is eliminated by adsorption on the dye.
  • This enzyme acts as an exoglycanase, its isoelectric point is between 4.5 and 4.8 and it is only used to a lesser extent than the enzyme from Streptococcus agalacttae by sulfated glycosaminoglycans inhibited
  • the fragment is digested or proteolytically digested
  • Partial degradation of the holoenzyme with a cleavage-specific protease which cleaves the peptide bond preferably at the C-terminal side of the aromatic amino acids, is produced.
  • the partial digestion of the holoenzyme to the fragment takes place with immobilized or also with non-immobilized specific protease.
  • the reaction with immobilized is advantageous Protease that targeted digestion and without contamination by the
  • Protease itself can be carried out.
  • an inactivation step of the protease the separation of the protease protein and a high purification must take place after digestion.
  • the highly purified enzyme or the enzyme fragment show only specific precipitation after immunization in rabbits. All are monoclonal antibodies detectable bands stained in the plot
  • the holoenzyme has a specific activity of approximately 400,000 lU / mg and the specific activity of the fragment is approximately between 400,000 and 800,000 lU / mg.
  • at least one of the stabilizers for example albumin, preferably ovalbumin, and inorganic Added salts
  • proteases are used for digestion, which cleave the C-terminal peptide bond of aromatic amino acids.
  • the metalloprotease MO / 2 which is derived from the culture filtrate of Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) MO / 2 is a metalloenzyme with Co ++ in the active center (DD 270 924).
  • the proteases are preferably used in a purified form.
  • the protease MO / 2 is purified, for example, by chromatography on phenylsepharose, DEAE -Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S100 with an enrichment factor of 20
  • the specific activity is included
  • the molecular weight of the enzyme was determined by SDS gel electrophoresis and molecular weight chromatography on Sephadex G50 superfine, amounts to 14,000 to 15,000 D.
  • the protease MO / 2 is an endopeptidase with an isoelectric point at 3.85 and one at 3.92.
  • the enzyme hydrolyzes natural polypeptides such as casein, hemoglobin and bovine serum , Albumin and ovalbumin
  • protease MO / 2 An advantage of using protease MO / 2 is that the enzyme cleaves proteins very specifically or has a very low general digestive activity towards proteins. The enzyme cleaves almost exclusively only the peptide bonds of the C-terminal residue from the aromatic amino acids. It has an esterolytic activity towards N-Benzoyl-L-prohne-nitroanilide and pronounced milk-falling
  • the protease MO / 2 is bound to suitable insoluble immobilization supports and is used in this form to cleave the holoenzyme.
  • the galenic formulation containing the active ingredient can be applied by injection or perfusion.
  • the use of one or more drugs, the tissue absorption of which is to be increased by separate application of the active ingredient according to the invention, can take place, for example, within about 10 minutes before or after
  • the active substance formulation is supplied. Another possibility of use is that the active substance and medicament are present together in the perfusion or injection formulation. One or more medicaments can be added to the active substance formulation shortly before use by mixing the formulation, or combinations of active substance are used and drugs within one
  • the active ingredient formulation can be brought into solid form by freeze-drying in ampoules. Before application, the solid is dissolved in physiological saline solution to form an isotonic injection or perfusion formulation
  • the finished formulations are prepared, for example, by the high-purity solution of the hyaluronate lyases being added and filled with the addition of medicaments, stabilizers, auxiliaries.
  • the liquid mixture can, if appropriate, also be dried, preferably freeze-dried, so that the combination is in solid form
  • the solid Before application, the solid is dissolved in physiological saline to form an isotonic injection or perfusion formulation
  • xylacine and 180 ml of ketamine are dissolved in 1.8 ml of saline.
  • 150 international units (IU) of hyaluronate lyase are added to this solution and mixed homogeneously in the solution, filtered and filled into ampoules. The resulting mixture is used for immobilization of a wild animal with 150 kg body mass provided The results are shown in Fig 1
  • Fig. 1 shows the cumulative representation of the amount of ketamine entering the perfusate in mg after subcutaneous injection of 200 mg of ketamine (2 ml in a 10% injection solution) on the insulated perfused cattle udder without the addition of a resorption accelerator and with the addition of a testicular hyaluronidase A and two biotechnologically produced hyaluronate lyases (B from Streptococcus agalacttae and C from Streptococcus equisimilis) in a perfusion period of 0 - 10 minutes.
  • the curves show median values from 6 experiments each.
  • Group testicular hyaluronidase A, n 5, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 to the control group without addition

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Abstract

Die Anmeldung bezieht sich auf die Verwendung einer mikrobiellen Hyaluronatlyase oder eines aus ihr herstellbaren aktiven Fragments als Wirkstoff zur Verbesserung der Geweberesorption von Arzneimitteln in menschlichen und tierischen Geweben.

Description

Verwendung eines Enzyms zur Verbesserung der Geweberesorption von
Arzneimitteln
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Präparats, welches einen Wirkstoff zur Verbesserung der Geweberesorption von einem oder mehrerer behandlungsgerecht anzuwendender Arzneimittel enthält. Arzneimittel im Sinne der Erfindung sind beispielsweise Analgetika, Anästhetika, Cancerostatika und cytotoxische Verbindungen sowie alle anderen Arzneistoffe, die in der Human- und Veterinärmedizin subkutan oder intramuskulär verabreicht werden und über Geweberesorption ihren Wirkort erreichen und dort ihre Wirkung entfalten. Es handelt sich dabei beispielsweise auch um Arzneimittel, bei denen auf
Grund ihrer chemischen/biochemischen Labilität die Passage des agen-Darm-Traktes oder die primäre Leberpassage umgangen werden muss, die nur schlecht gastrointestinal absorbiert werden, bei denen ein hoher Anfangsplasmaspiegel oder eine Paravasatbildung, insbesondere lokale Reizungen oder Nekrotisierungen vermieden und bei welchen ganz allgemein eine schnelle Verteilung im Gewebe zu erreichen ist. Die Erfindung kann auch in der Onkologie bei der Behandlung von Tumoren eingesetzt werden. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Wildtierimmobilisierung mit Anästhetika.
Bei allen diesen Anwendungen wirkt das Gewebe als Penetrationsbarriere, durch welche die Geweberesorption behindert wird. Dadurch wird eine geringe räumliche Ausbreitung der Arzneimittel im zu behandelten Gewebe sowie eine geringe Ausbreitungsgeschwindigkeit innerhalb des Gewebes bewirkt.
Um die Geweberesorption nach subkutaner oder intramuskulärer Applikation von pharmazeutischen Wirkstoffen, die durch Injektion oder Perfusion eingebracht werden können, zu beschleunigen, hat man bereits versucht, spezielle Wirkstoffe der Infusions- oder Injektionsformulierung zuzusetzen, die durch ihre Eigenschaften die Ausbreitung von applizierten Pharmaka im Gewebe verbessern bzw. die Geweberesorption erhöhen. Hierzu gehört beispielsweise das Dimethylsulfoxid.
Die meisten subkutan oder intramuskulär verabreichten Arzneimittel gelangen über den Interzellularraum in die Kapillaren, weshalb die Beschaffenheit der interzellulären Grundsubstanz eine wesentliche Rolle spielt. Da die Dichte des Kapillarnetzes ein entscheidender Faktor der Stoffaufnahme in Geweben ist, können Veränderungen dieses Kapillarnetzes (z. B. bei Adipositas durch subkutane Ausbildung von schlecht durchbluteten Fettgewebe) zu einer Verlangsamung der Resorption führen.
Allgemein ist bekannt, dass die Zuführung von Hyaluronidasen (E.C.3.2.1.35/36) in das
Gewebe die Penetration von Arzneimitteln verbessert. Hyaluronidase stellt damit einen Prototyp für einen Wirkstoff dar, der die Resorption von Arzneimitteln verbessert. Es werden in der medizinischen Praxis Hyaluronidasen tierischer Herkunft, insbesondere solche, die aus den Testes von Rindern gewonnen werden, angewendet. Die Hyaluronidase hydrolysiert die Hyaluronsäure in der extrazellulären Matrix und es kommt zu einer beschleunigten Ausbreitung des Wirkstoffs im Interstitium bzw. zu einer besseren und schnelleren Absorption des Wirkstoffs (Farrar G. E.: The Spreading Factor, Clin. Ther., 1989, 1 1 , 705-
706; Farr C, Menzel J., Seeberger J. and Schweigle B.: Clinical Pharmacology and Possible Application of Hyaluronidase with Reference to Hylase "Dessau", Wien. Med. Wochenschr. 1997, 147, 347-355; Menzel E. J. and Farr C: Hyaluronidase and its Substrate Hyaluronan: Biochemistry, Biological Activities and Therapeutic Uses, Cancer Lett. 1998, 131 , 3-11 ; Nicoll J. M. et al.: Retrobulbar Anesthesia: The Role of Hyaluronidase. Anesth. Anaig. 1986,
65, 1324-1328; Lewis-Smith P. A.: Adjunctive Use of Hyaluronidase in Local Anaesthesia, Br. J. Plast. Surg., 1986, 39, 554-558).
Die Hyaluronsäure spielt unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle. So ist bei Tumorerkrankungen, beispielsweise Lungen-, Leber-, Brust-,
Harnblasen- und anderen Tumoren, der Hyaluronsäurespiegel im Tumorgewebe um das 9- bis 18-fache erhöht (Pauli, B. U. et al.: Hum. Pathol., 1988, 19, 628-639). Die Hyaluronsäure ist offensichtlich an den Prozessen des Tumorwachstums und der Metastasierung beteiligt. Tumorzellen sind häufig mit einer Hyaluronsäure-Umhüllung umgeben, die sie vor dem immunologischen Angriff schützt. Ebenso wird die Ursache der auftretenden
Chemoresistenz bei soliden Tumoren der Hyaluronsäure zugeschrieben. Sie beruht darauf, dass eine Hyaluronsäurekapsel des Tumors die Penetration der Chemotherapeutika behindert.
Es zeigte sich, dass durch die Anwendung des Enzyms Hyaluronidase, gewonnen aus
Rindertestes, der interzelluläre Kontakt aufgebrochen und die interstitiellen Geweberäume erweitert werden. Durch die Erweiterung der interstitiellen Tumormatrix erhöhte sich die Penetration der Cancerostatika in das Tumorgewebe und die Chemoresistenz wurde reduziert. Die testikuläre Hyaluronidase hat selbst keine Antitumorwirkung. Sie verstärkt vielmehr die Wirkung von Cancerostatika und besitzt deshalb die Eigenschaft eines
"Chemosensitizer". Durch eine kombinierte Anwendung mit bekannten Cancerostatika werden austherapierte Tumorerkrankungen wieder einer Chemotherapie zugänglich oder die Cancerostatika-Dosierungen können verringert werden. Hyaluronidase verstärkt bei simultaner klinischer Anwendung die Wirksamkeit verschiedener Cancerostatika, wie Mitomycin C, cis-Platin, Vinblastin, Melphalan und Doxorubicin, die zur Therapie von
Harnblasen-, Kopf- und Nacken- sowie anderen Tumoren eingesetzt werden. Auch verbessert sich die Erfolgsrate der Radiotherapie bei Tumorerkrankung (Baumgartner: Cancer Letters, 1998, 131 , 85-99, Muckenschnabel et al.: Cancer Letters, 1998, 131 , 71-84). In der Tumortherapie wird zur Zeit testikuläre Hyaluronidase boviner Herkunft in Kombination mit einer Reihe von Cancerostatika intensiv präklinisch und klinisch erprobt. Bisherige Befunde belegen, dass nach kombinierter Anwendung von Hyaluronidase und Cancerostatika die Chemoresistenz einiger solider Tumoren gegenüber Chemotherapeutika durchbrochen wird und die Tumoren wieder einer Chemotherapie zugänglich werden. Des weiteren konnte unter der Wirkung von Hyaluronidase eine Sensibilisierung des Tumors gegenüber der Strahlentherapie beobachtet werden.
Auch bei der Behandlung von Paravaten, die häufig bei Injektionen, z. B. von Zytostatika entstehen können, wird die Unterspritzung mit Hyaluronidase in Konzentrationen von bis zu 6 mal 150 IE empfohlen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der testikulären Hyaluronidase liegt in der Veterinärmedizin bei der Ruhigstellung bzw. Immobilisierung von Tieren aus der Distanz, z. B. durch ein
Geschoss mit Injektionskopf, welcher ein Anästhetikum enthält. Hier kommt es darauf an, die aus Distanz intramuskulär bzw. subkutan verabreichten Anästhetika möglichst schnell zur Wirkung zu bringen (H. Wiesner: Tierärztl. Prax. 1998, 26, G 225 - G 233). Die veterinärmedizinische Distanzimmobilisierung stellt hohe Anforderungen an einen geeigneten Wirkstoff zur Resorptionsbeschleunigung. Dtrrctr den Einsatz des Wirkstoffs muss eine besonders hohe Geschwindigkeit der Immobilisierung des Tieres erreichbar sein. Die Immobilisierungsgeschwindigkeit steht in einem direktem Zusammenhang mit der Distribution des Wirkstoffes im Gewebe.
Für die Distanzimmobilisierung werden zahlreiche Anästhetika mit unterschiedlichen
Wirkungsweisen und Kombinationsmöglichkeiten angeboten, welche nachfolgend genannte
Forderungen erfüllen müssen: geringe Humantoxizität gute Löslichkeit Kompatibilität mit anderen Anästhetika gute Gewebeverträglichkeit rasche Resorption und schneller Wirkungseintritt große therapeutische Breite
Sedation, Muskelrelaxation, Analgesie ausreichende Wirkungsdauer kein Auftreten von Exzitationen bei der An- und Abflutung von Narkosen
Antagonisierbarkeit, kurze Aufwachphasen Zulassung für lebensmittelliefernde Tiere
Diese Anforderungen werden von der Hellabrunner Mischung (HM) mit Xylacin und Ketamin als Anästhetika weitgehend erfüllt.
Bei der Immobilisation von Wildtieren ist eine schnelle Resorption der Anästhetika von großer Bedeutung. Testikuläre Hyaluronidasen als Resorptionsbeschleuniger verkürzen die Resorptionszeit bis zu etwa einem Drittel. Diese Resorptionsbeschleunigung ist jedoch in der veterinärmedizinischen Praxis häufig nicht ausreichend. Der Einsatz der testikulären Hyaluronidase ist deshalb aus Gründen der relativ geringen und bei mehrfacher Anwendung auch sehr schnell nachlassenden Wirkung und auf Grund der zunehmenden Gefahr einer Übertragung von infektiösem Material immer weiter eingeschränkt. Darüber hinaus erfordert die Reinigung der Hyaluronidasen aus Gewebemazeraten mit einem naturgemäß hohen Anteil an Fremdproteinen und lipoiden Verbindungen einen hohen Reinigungsaufwand. Es gibt außerdem Hinweise, dass die relativ geringe Wirkung der Hyaluronidase aus
Rindertestes auf die ausgeprägte Inhibition des Enzyms durch sulfatierte Glucosaminoglykane, wie Heparin oder heparinähnliche Glykosaminoglykane, die in der extrazellulären Matrix von Säugern vorhanden sind, zurückzuführen ist.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, einen Wirkstoff aufzufinden, der die angeführten Nachteile der testikulären Hyaluronidase bzw. von Hyaluronidasen tierischer Herkunft nicht oder lediglich in geringerem Maß aufweist und darüber hinaus auf einfachem Weg in ausreichenden Mengen herstellbar ist. Der Wirkstoff soll gut verträglich sein und eine schnell wirkende Resorptionsförderung bei parenteraler, z. B. subkutaner und intramuskulärer Applikation, von pharmazeutischen Arzneimitteln über Injektion und
Perfusion schaffen. Die dermale Anwendung und die Anwendung im Blutgefäßsystem sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Es soll bei Anwendung des Wirkstoffs auf Grund seiner nichttierischen Herkunft keine Gefährdung durch eventuelle Infektionen entstehen. Der Gehalt an Fremdmaterial, insbesondere an Fremdprotein, soll so gering sein, dass selbst nach mehrmaliger Anwendung die Wirkung nicht nachlässt. Weiterhin soll er nicht oder nur in geringem Maße durch sulfatierte Glykosaminoglykane gehemmt werden. Die sulfatierten Glykosaminoglykane sollen nur in einem begrenzten Maße abgebaut werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer mikrobiellen Hyaluronatlyase und/oder eines aus ihr hergestellten Fragmentes als Wirkstoff zur Verbesserung der Geweberesorption von
Arzneimitteln in menschlichen und tierischen Geweben. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen bzw. ihre Fragmente, die nach ihrem Spaltungsmechanismus als Lyasen der Enzymklassifikationsnummer E.C. 4.2.2.1 zugerechnet werden, insbesondere die durch den Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt der Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis bei Fermentation in die Kulturflüssigkeit exkretierte Hyaluronatlyasen, zu einer sehr intensiven Resorptionsbeschleunigung bei subkutan oder intramuskulär verabreichten Arzneimitteln führen. Diese Mikroorganismen sind allgemein zugänglich, beispielsweise über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM Braunschweig). Der enzymatische Wirkstoff spaltet anders als die testikuläre Hyaluronidasen bzw. andere Hyaluronidasen tierischer Herkunft, die
Hyaluronsäure nach einem Eiiminierungsmechanismus unter Bildung von ungesättigten Spaltprodukten. Im Gegensatz dazu spalten Hyaluronidasen tierischer Herkunft (E.C.3.2.1.35/36) die Hyaluronsäure hydrolytisch bei Anlagerung von Wasser unter der Bildung gesättigter Spaltprodukte. Die Hyaluronatlyase unterscheidet sich von den tierischen Hyaluronidasen weiterhin durch die Aminosäuresequenzen sowie dem isoelektrischen Punkt
(IP).
Dem gemäß betrifft die Erfindung die Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase und der aus ihr hergestellten aktiven Fragmente.
Überraschend hat sich gezeigt, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen, die eine bisher nicht für die Resorptionsbeschleunigung eingesetzte Enzymgruppe darstellen, nicht nur die Geweberesorption von Arzneimitteln bei der parenteralen, beispielsweise bei der subkutanen und intramuskulären, Applikation steigern, sondern dass bei vergleichender Applikation gleich großer Aktivitäten die mikrobiellen Hyaluronatlyasen eine sehr schnell einsetzende verbesserte Resorption bewirkt, während bei testikulärer Hyaluronidase eine solche erst nach einer längeren Verzögerungsphase nachzuweisen war.
Darüber hinaus zeigte sich bei der Verwendung von Hyaluronatlyasen zusammen mit Anästhetika eine deutlich schneller eintretende Resorption als bei testikulärer Hyaluronidase
(Abb. 1). Die bei einer Behandlung bzw. Injektion den zu behandelnden Gewebesektoren zugeführte Enzymaktivität liegt bei 10 - 250.000 IU. Die Gesamtaktivität, die bei einer Perfusion in den zu behandelnden Gewebesektor eingebracht werden muss, kann noch wesentlich höher liegen, beispielsweise zwischen 10 und mehreren Millionen IU.
Im Gegensatz zur Aktivität der testikulären Hyaluronidase wird die Aktivität von Hyaluronatlyase aus Streptococcus equisimilis durch sulfatierte Glykosaminoglykane, wie beispielsweise der sulfatierten Hyaluronsäure oder Hepaπn, viel weniger inhibiert Diese ebenfalls überraschende Eigenschaft der Hyaluronatlyasen ist für die Resorptionsbeschleunigung in Geweben von Vorteil, da keine Gewebe-Inaktivatoren auf der Basis sulfatierter Glykosaminoglykane die Hyaluronatlyaseaktivitat inhibieren und somit die Resorptionsforderung im Gewebe unterdrucken konnten
Die Anwendung der mikrobiellen Hyaluronatlyasen zeigte keine negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand von Versuchstieren
Die mikrobiellen Hyaluronatlyasen werden für ihre erfinderische Verwendung in Form von galenischen Formulierungen eingesetzt Sie enthalten als Injektionspräparat beispielsweise eine isotonische wäßrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase mit Konzentrationen zwischen 10 und 250 000 lU/ml und in Injektionspraparaten übliche Hilfsstoffe Weiterhin kann, sofern Wirkstoff und Arzneimittel zusammen angewendet werden sollen, noch ein Arzneimittel enthalten sein Das Enzymprotein der Hyaluronatlyase wird vorteilhaft in Form eines lagerstabilen Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält und beispielsweise in Glasampullen abgefüllt ist, eingesetzt
Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von gefriergetrocknetem Wirkstoff Als stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natπumchloπd, Glukose, Magnesiumsalze,
Polyvinylpyrrolidin, Aminosäure, Albumine und deren Hydrolysate oder Gelatine und deren Hydrolysate eingesetzt werden
Die Enzymaktivtat einer Ampulle liegt nach Auffüllen mit physiologischer Kochsalzlosung zwischen 10 und 250 000 lU/ml Formulierung
Die Herstellung der in den Injektionsformulierung eingesetzten mikrobiellen Hyaluronatlyasen können beispielsweise hinsichtlich Reihenfolge und Auswahl der Reinigungsschritte in einer den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkenden Weise wie folgt durchgeführt werden
Ohne die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres Fragmentes auf einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird die Erfindung am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptococcus agalacttae erläutert Die gebildete Hyaluronatlyase besitzt einen Isoelektrischen Punkt von etwa 8,6 sowie eine Molmasse von etwa 116 000 D und wirkt als Endoglycanase Das Enzym hat die gunstige Eigenschaft, dass es durch sulfatierte Glykosaminoglykane, wie beispielsweise auch sulfatierte Hyaluronsäure, inhibiert wird Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder die gereinigte Hyaluronatlyase mit der spezifisch wirkenden Protease zu dem Fragment umgesetzt Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease M02 (DD 270924) eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus
Streptomyces hygroscopicus, AP40 gewonnen werden kann Diese Protease besitzt eine Molmasse von etwa 14 000 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen 3,85 bis 4,0
Die Herstellung der hochreinen Hyaluronatlyase und des hochgereinigten Fragments in einer galenischen Formulierung geeignet zur Injektion kann beispielhaft in Bezug auf die
Reihenfolge als auch die Auswahl der Reinigungsschritte in einer nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränkenden Weise wie nachfolgend durchgeführt werden
Die Fermentation des Mikroorganismus, z B eines der oben genannten, erfolgt in einen gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung bei einer Acidität von pH 6,5 bis 7,5 Die wahrend der Fermentation gebildete Milchsäure wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge neutralisiert Das Medium besteht aus anorganischen Salzen, Hefehydrolysat wahlweise Kaseinpepton oder Sojapepton sowie Glukose Nach etwa 20-stundιger Fermentation werden die Zellen separiert Die Zellmasse wird durch Mikrofiltration durch Filtermodule mit einer Porenweite von beispielsweise 0,45 μm abgetrenπt-tm*d~verworfen
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt Die Ausschlussgrenze (cut off) des Ultrafilter-Moduls egt bei 80 000 D Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlosung, die an sich bekannten Reinigungsmethoden unterworfen wird Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt Die
Ausschlußgrenze des Ultrafilter-Moduls liegt zwischen 30 bis 50 kD Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlosung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden muss, bevor es als Injektionspräparat verwendet werden kann Durch die Reinigungsschritte und Anwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird Pyrogenfreiheit des Injektionspraparats erreicht
Nach Erhöhung der lonenstarke durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40 % wird das Enzym an Phenylsepharose adsorbiert Anschließend erfolgt die Desorption mit einer neutralen gepufferten wäßrigen Losung, die 25 % Ammoniumsulfat, bezogen auf 100 % Sättigung, enthalt Die Losung wird nach einem Dialyseschπtt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt Anschließend erfolgt eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, z B Aminophenyloxaminsaure Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) erfolgen
Bei Verwendung von Streptococcus equisimilis als Enzymbildner entfallt der Reinigungsschritt durch Adsorption an den Farbstoff Dieses Enzym wirkt als Exoglycanase, sein Isoelektrischer Punkt hegt zwischen 4,5 und 4,8 und es wird nur in einem geringeren Maß als das Enzym aus Streptococcus agalacttae durch sulfatierte Glykosaminoglykane gehemmt
Erfindungsgemäß wird das Fragment durch Teilverdauung bzw einem proteolytischen
Teilabbau des Holoenzyms mit einer spaltspezifisch wirkenden Protease, welche die Peptidbindung bevorzugt an der C-terminalen Seite der aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt Die Teilverdauung des Holoenzyms zu dem Fragment erfolgt mit immobilisierter oder auch mit nicht-immobilierter spezifischer Protease Vorteilhaft ist an der Umsetzung mit immobilisierter Protease, dass die Verdauung gezielt und ohne Kontamination durch die
Protease selbst durchgeführt werden kann Im Fall der direkten Umsetzung mit zugesetzter Protease muß nach der Verdauung ein Inaktivierungsschπtt der Protease, die Abtrennung des Proteaseproteins und eine Hochreinigung erfolgen Das hochgereinigte Enzym oder das Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Prazipitation Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Plot angefärbt
Das Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400 000 lU/mg und die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt etwa zwischen 400 000 und 800 000 lU/mg Zur Stabilisierung werden dem Enzym bzw Fragment mindestens einer der Stabilisatoren, beispielsweise Albumin, bevorzugt Ovalbumin, und anorganische Salze zugesetzt
Ohne die Erfindung dadurch einzuschränken, soll beispielhaft ein Weg zur Gewinnung des Fragmentes beschrieben werden Erfindungsgemäß werden Proteasen zur Verdauung eingesetzt, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spalten In einem bevorzugten Ausfuhrungsbeispiel wird die Metalloprotease MO/2 eingesetzt, die aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) hergestellt wird MO/2 ist ein Metalloenzym mit Co++ im aktiven Zentrum (DD 270 924) Die Proteasen werden bevorzugt in gereinigter Form eingesetzt Die Reinigung der Protease MO/2 erfolgt beispielsweise durch Chromatografie an Phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S100 mit einem Anreicherungsfaktor von 20 Die spezifische Aktivität liegt bei
0,25 Kunitz Units/mg (U/mg), das Reaktionsmaximum bei einer Aciditat von pH = 4,2 und das Reaktionstemperaturmaximum bei 65 °C Das Molekulargewicht des Enzyms, bestimmt durch SDS Gelelektrophorese und Molekulargewichtschromatografie an Sephadex G50 superfine, betragt 14 000 bis 15 000 D Die Protease MO/2 ist eine Endopeptidase mit einem Isoelektrischen Punkt bei 3,85 und einem bei 3,92 Das Enzym hydrolysiert natürliche Polypeptide wie Kasein, Hämoglobin, Bovineserum, Albumin und Ovalbumin
Vorteilhaft an der Anwendung der Protease MO/2 ist, dass das Enzym Proteine sehr spezifisch spaltet bzw eine sehr geringe allgemeine Verdauungsaktivitat gegenüber Proteinen besitzt Das Enzym spaltet fast ausschließlich nur die Peptidbindungen des C- terminalen Restes von den aromatischen Aminosäuren Es besitzt eine esterolytische Aktivität gegenüber N-Benzoyl-L-prohne-nitroanilid und ausgeprägte milchfallende
Eigenschaften Die Eigenschaften der Milchfallung, die an der Bildung eines langzeitstabilen Kaseingels nachweisbar ist, vergleichbar mit dem Gel, welches bei der Milchfallung mit dem sehr spezifisch wirkenden Labenzym auftritt, sind als weiterer Hinweis auf die begrenzte, für die Erfindung sehr vorteilhafte Aktivität der Protease MO/2 zu werten, die Bindungen des Holoenzyms spezifisch zu spalten, ohne zu einem Abbau der Fragmente zu fuhren
In einer weiteren Ausfuhrung der Erfindung wird die Protease MO/2 an geeignete unlösliche Immobilisierungssupporte gebunden und in dieser Form zur Spaltung des Holoenzyms eingesetzt Vorteilhaft an dieser Vorgehensweise ist, dass auf diese Weise der Übergang gelöster Protease in die Losungen der Fragmente verhindert wird
Die Apphzierung der wirkstoffhaltigen galenischen Formulierung kann durch Injektion oder durch Perfusion erfolgen Die Anwendung eines oder mehrerer Arzneimittel, deren Geweberesorption durch ein separates Applizieren des erfindungsgemaßen Wirkstoffes erhöht werden soll, kann beispielsweise innerhalb von etwa 10 Minuten vor oder nach
Zufuhrung der Wirkstoffformulierung erfolgen Eine andere Möglichkeit der Anwendung besteht dann, dass Wirkstoff und Arzneimittel zusammen in den Perfusions- oder Injektionsformulierung vorliegen Die Zugabe eines oder mehrerer Arzneimittel zu der Wirkstoffformulierung kann kurz vor der Anwendung durch Mischen der Formulierung erfolgen, oder es kommen Kombinationen von Wirkstoff und Arzneimittel innerhalb einer
Fertigformulierung zum Einsatz
Die Wirkstoffformulierung kann durch Gefriertrocknen in Ampullen zur festen Form gebracht werden Vor dem Applizieren wird der Feststoff in physiologischer Kochsalzlosung zu einer isotonischen Injektions- oder Perfusionsformulierung gelost Die Fertigformulierungen werden beispielsweise dadurch hergestellt, dass die hochreine Lösung der Hyaluronatlyasen unter Zusatz von Arzneimitteln, Stabilisatoren, Hilfsstoffen steπlfilt- πert und abgefüllt wird Die Flussigmischung kann gegebenenfalls auch getrocknet, bevorzugt gefriertrocknet, werden, so dass die Kombination in fester Form vorliegt
Vor der Applizierung wird der Feststoff in physiologischer Kochsalzlösung zu einer isotonischen Injektions- oder Perfusionsformulierung gelöst
Das folgende Ausfuhrungsbeispiel dient zur Erläuterung der Erfindung, soll diese jedoch in keiner Weise einschränken
Es werden 225 mg Xylacin und 180 ml Ketamin in 1,8 ml Kochsalzlösung gelöst Zu dieser Lösung v/erden 150 Internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyase hinzugegeben und in der Lösung homogen durchmischt, steπlfiltπert und in Ampullen abgefüllt Das entstehende Gemisch ist zur Distaπzimmobilisieruπg eines Wildtieres mit 150 kg Körpermasse vorgesehen Die Ergebnisse sind in Abb 1 dargestellt
Abb. 1 zeigt die kumulative Darstellung der in das Perfusat gelangenden Ketaminmenge in mg nach subkutaner Injektion von 200 mg Ketamin (2 ml in einer 10 %ιgen Injektioπslösung) am i- soliert perfundierten Rindereuter ohne Zusatz eines Resorptionsbeschleunigers und mit Zusatz einer testikulären Hyaluronidase A und zwei biotechnologisch hergestellten Hyaluronatlyasen (B aus Streptococcus agalacttae und C aus Streptococcus equisimilis) im Perfusionszeitraum von 0 - 10 Minuten Die Kurven zeigen Medianwerte von je 6 Versuchen Gruppe testikuläre Hyaluronidase A, n=5, * p<0,05, ** p<0,01 zur Kontrollgruppe ohne Zusatz
EPO - DG 1
1 0. . 2001
®

Claims

Patentansprüche
1 Verwendung einer mikrobiellen Hyaluronatlyase oder eines aus ihr herstellbaren aktiven Fragments als Wirkstoff zur Verbesserung der Geweberesorption von Arzneimitteln in menschlichen und tierischen Geweben
2 Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein Fragment davon als galenisches Präparat, enthaltend übliche pharmazeutische Hilfsstoffe, angewandt wird
3 Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein Fragment davon als Perfusions- oder Injektionspraparat angewandt wird
4 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das den Wirkstoff enthaltende Präparat in die zu behandelnden Gewebe oder in ihre unmittelbare Nähe gebracht wird
5 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
Konzentration des Enzyms bzw seines Fragments in dem Injektionspraparat zwischen 10 bis 250 000 lU/ml liegt
6 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtkonzentration des Enzyms bzw seines Fragments in der Perfusionsflussigkeit bis zu
10 Millionen IU betragen kann
7 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein Fragment davon in direkter Kombination mit einem Arzneimittel angewandt wird
8 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein Fragment davon getrennt von der Zufuhrung eines Arzneimittels angewendet wird
9 Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Arzneimittel Analgetika, Cancerostatika oder Anästhetika eingesetzt werden
10. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das wirkstoffhaltige Präparat durch Auflösen hochreiner, lyophil getrockneter Hyaluronatlyase hergestellt wird.
11. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das wirkstoffhaltige Präparat vor, nach bzw. zeitlich parallel mit dem Arzneimittel in den zu behandelten Gewebesektor eingebracht wird.
12. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff
Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.
13. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt Streptococcus equisimilis oder Streptococcus agalactiae, gewonnen wird.
14. Verwendung gemäß Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus der Gattung Streptococcus für die Dauer von 12 bis 24 Stunden in einem gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung im Aciditätsbereich von pH 6,5 bis pH 7,5 durch Dosage mit verdünnten Laugen bei Temperaturen zwischen 16 °C und 38 °C unter Verwendung eines Kulturmediums, welches anorganische Salze, Hefehydrolysat, wahlweise Sojapepton oder Kaseinpepton und Glucose enthält, unter Entstehung einer Hyaluronatlyase enthaltenden Kulturlösung fermentiert wird.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein von mikrobiellen Zellen befreites Kulturfiltrat erhalten wird, indem nach der Fermentation die Mikroorganismen durch Mikrofiltration über ein Mikrofiltermodul mit einer Porenweite zwischen 0,15 und 0,8 μm, bevorzugt 0,3 bis 0,5 μm, aus der Kulturlösung entfernt werden.
16. Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein vorgereinigtes Rohenzymkonzentrat erhalten wird, indem nach der Fermentation die von den mikrobiellen Zellen befreite Kulturlösung durch Ultrafiitration mit einer Ausschlußgrenze des UF- Membranmoduls kleiner als 80.000 D konzentriert und anschließend mit an sich bekannten Methoden gereinigt wird.
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