DE19743899A1 - Verfahren zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität von mikrobieller Hyaluronidase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität von mikrobieller Hyaluronidase. Hyaluronidasen sind Polysaccharidasen, die hochmolekulare Hyaluronsäure in Oligo- bzw. Disaccharide spalten. Anwendung findet die Erfindung bei der technischen oder therapeutischen Verwendung von mikrobiellen Hyaluronidasen, wie zur Bearbeitung hyaluronsäurehaltiger Werkstoffe und im therapeutischen Bereich zur Förderung der Gewebepentration von Wirkstoffen in der Medizin um deren enzymatische Wirkung zu steigern, insbesondere wenn diese Hyaluronidasen in nur geringen Enzymdosierungen eingesetzt werden.

Im Gegensatz zu den Inhibitoren von Hyaluronidasen sind bisher nur zweiwertige Metallionen, insbesondere Mg⁺⁺-Ionen, als aktivierende Agentien beschrieben worden (Sting, R.; P. Schaufuss and H. Blobel: ZBL Bakt. Hyg. 272 (1990) 276-282; Ozegowski, J.-H., E. Günther and W. Reichardt: ZBL 280, 1994, 497-506). Dabei ist aber nicht bekannt, ob der aktivierende Einfluß der Metallionen auf Konformationsänderungen am Substrat Hyaluronsäure beruht oder ob diese Metallionen das Enzym selbst aktivieren. Hinzu kommt, daß der aktivierende Einfluß von Metallionen leicht durch chelatbildende Agentien und Kolloide unterbunden werden kann, so daß eine beabsichtigte Aktivierung durch diese Metallionen aufgehoben wird.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, die enzymatische Aktivität von mikrobiellen Hyaluronidasen zu erhöhen, ohne diese aktivierende Enzymwirkung durch Chelatbildner und Kolloide wieder zu beeinträchtigen.

Überraschend wurde gefunden, daß ein Pigment aus einem Mikroorganismus der Art Streptococcus agalactiae, vorzugsweise ein nichtzyklisches Triterpen, die enzymatische Aktivität mikrobieller Hyaluronidasen erhöht. Diese Wirkung wird im Gegensatz zur Anwendung von Metallionen durch Chelatbildner und Kolloide nicht aufgehoben oder beeinträchtigt.

Das Pigment wird aus einem Mikroorganismus der Art Streptococcus agalactiae gewonnen und in gelöster wäßriger Form der vorzugsweise gereinigten mikrobiellen Hyaluronidase zugesetzt.

Vorteilhafterweise wird der Mikroorganismus in einem flüssigem Submersmedium, welches organische komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, bei Temperaturen von 25°C-37°C und pH-Werten zwischen pH 8,0 und pH 6,0 unter Zusatz von sulfatierten Polysacchariden für eine Dauer von 12-24 h fermentiert. Nach dem Abtöten des Mikroorganismus wird dieser abgetrennt und das Pigment aus dem Überstand durch Neutralsalzfällung ausgefällt, proteolytisch und mutanolytisch behandelt sowie einer Eisessigextraktion unterworfen.

Das Pigment wird vorzugsweise in einem basischen Puffer im pH-Bereich von pH 8,0 bis pH 11,0 aufgelöst und in dieser Form der Hyaluronidase­ lösung in einer Konzentrationen von 0,5 nMol-20 nMol zugesetzt. Konzentrationsabhängig kommt es durch diese Zugabe zu einer Steigerung der enzymatischen Aktivität der Hyaluronidase um den Faktor 10.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Das Diagramm in der Zeichnung stellt dabei die Aktivierung von Hyaluronidase durch das Pigment, d. h. die Abhängigkeit der Hyaluronsäurekonzentration von der Inkubationszeit dar. Die Kurvenverläufe zeigen diese Abhängigkeit für Endkonzentrationen von 0,25 nMol bis 2,0 nMol im Vergleich zur nichtaktivierten Hyaluronidaselösung.

Der pigmentbildende Stamm B 3402 von Streptokokken der serologischen Gruppe B wird in einem Submersmedium, bestehend aus 1% pankteatischen Pepton und 2% Hefeextrakt, unter konstantem pH-Wert und einem Glukosespiegel von 2% in einem gerührten Fermentor mit einem Arbeitsvolumen von 2 l bei 37°C für 18 h und konstantem pH-Wert unter geregelter Dosage gezüchtet. Nach Beendigung der Fermentation werden die Streptokokken durch Sterilfiltration entfernt und das Pigment bei 40%iger Ammoniumsulfatsättigung (240 g Ammoniumsulfat/l) ausgefällt.

Das ausgefällte Pigment wird über Filterhilfe abgetrennt und auf der Filterhilfe mit einem Liter molarer Essigsäure und 5 l dest. Wasser gewaschen. Danach wird es von der Filterhilfe durch Lösen in 100 ml 0,01 normaler NaOH eluiert. Die verbliebenen unlöslichen Bestandteile werden durch Zentrifugation bei 5000 U/min abgetrennt und das Pigment durch Zugabe von konzentrierter Essigsäure bei pH 3,5 gefällt.

Das gefällte Pigment wird abgetrennt und in 25 ml 0,1 molarem Trispuffer bei pH 9,0 angelöst. Danach wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 M HCL auf pH 8,0 abgesenkt. Es werden 80 000 E Trypsin zugesetzt und für 6 h bei 37°C inkubiert. Danach wird das Pigment wiederum durch Zugabe von Essigsäure bei pH 3,5 gefällt und mehrmals mit 0,01 molarer Essigsäure gewaschen. Anschließend wird das Pigment erneut in 25 ml 0,1 molarem Trispuffer pH 8,5 gelöst und dieser Lösung 10 000 E Mutanolysin zugesetzt. Diese Lösung wird für 10 h bei 37°C inkubiert. Danach wird sie durch Zugabe von 0,25 ml 10%ige Natriumdodecylsulfatlösung auf eine Natriumdodecylsulfatkonzentration von 0,1% eingestellt. Die verbliebenen unlöslichen Bestandteile werden entfernt und die Pigmentlosung in einem Dialyseschlauch gegen 500 ml einer 2%igen Triton X 100 Lösung und anschließend mehrfach gegen 500 ml eines 0,01 molaren Trispuffers pH 9,5 dialysiert. Zur Fällung des gelösten Pigmentes wird durch Zugabe von 1 molarer Essigsäure der pH-Wert auf pH 3,5 angesäuert. Das dabei ausgefallene Pigment wird durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ml konzentrierter Essigsäure erhitzt. Dabei löst sich das Pigment. Die rotgefärbte heiße Essigsäurelösung des Pigmentes wird klar filtriert, abgekühlt und lyophilisiert. Es wird ein schwarz-rotes Pigmentpulver erhalten. Die Molmasse des Pigmentes wurde massenspektroskopisch zu 605 g/Mol bestimmt. 6 µg dieses Pigmentpulvers, gelöst in einem Liter, entsprechen einer 10 n molaren Lösung. Zur Hyaluronidaseaktivierung werden 0,1 µg einer gereinigten Hyaluronidase aus Streptococcus agalactiae mit einer spezifischen Aktivität von 5000 E/mg in 0,1 molarem Acetatpuffer pH 6,0 bei Raumtemperatur gelöst. Dieser Lösung wird das Pigment in den Konzentrationen zugesetzt bis die Lösung das Pigment in Endkonzen­ trationen von 0,25 nMol bis 2,0 nMol enthält. Anschließend wird die Hyaluronidaseaktivität in den einzelnen Konzentrationsbereichen in bekannter Weise durch Trübungsmessung bestimmt. Durch die Zugabe des Pigmentes kommt es zu einer Aktivitätssteigerung der Hyaluronidase, wie in der Figur für unterschiedliche Endkonzentrationen zwischen 0,25 nMol und 2,0 nMol im Vergleich zur nichtaktivierten Hyaluronidaselösung gezeigt.

Claims (4)

1. Verfahren zur Erhöhung der enzymatischen Aktivität von mikrobieller Hyaluronidase, dadurch gekennzeichnet, daß der Hyaluronidase in wäßrigen Lösungen ein Pigment aus einem Mikroorganismus der Art Streptococcus agalactiae, vorzugsweise ein nichtzyklisches Triterpen, in gelöster wäßriger Form zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Pigment in einem basischen Puffer im pH-Bereich von pH 8,0 bis pH 11,0 aufgelöst und der Hyaluronidase zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gelöste Pigment der Hyaluronidase in einer Konzentrationen von 0,5-20 nMol zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung des Pigments der Mikroorganismus in einem flüssigem Submersmedium, welches organische komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, bei Temperaturen von 25°C-37°C und pH-Werten zwischen pH 8,0 und pH 6,0 für eine Dauer von 12-24 h fermentiert wird, daß der Mikroorganismus nach dem Abtöten abgetrennt wird und daß das Pigment aus dem Überstand durch Neutralsalzfällung ausgefällt, proteolytisch und mutanolytisch behandelt sowie einer Eisessigextraktion unterworfen wird.