DE2345029B2 - Wasserunlösliche Chelate von stickstoffhaltigen Proteinen, Enzymen, Peptiden, Lectinen, Antikörpern, Coenzymen, Antibiotika und ganzen Zellen mit wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Titan und deren Verwendung - Google Patents

Description

In den letzten 10 Jahren wurde mit beträchtlichem Forschungsaufwand versucht, Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Proteinen, insbesondere Enzymen, zu schaffen, deren Produkte die Eigenschaften der Proteine aufweisen, d. h. enzymatische Aktivität, und die wertvolle Hilfsmittel in der analytischen Chemie ■ und in der Biochemie darstellen. Viele der bekannten Verfahren zur Herstellung von Proteinen in wasserunlöslicher Form sind überaus kompliziert und erfordern eine Reihe von Verfahrensschritten zur Herstellung des festen Trägers. Diese Verfahren sind deshalb für großtechnische Zwecke unzweckmäßig oder teuer. Außerdem sind die Träger für Proteine, z. B. Enzyme, nicht generell wiederverwendbar oder regenerierbar, wenn die katalytische Aktivität des Proteins erschöpft ist. Zur Herstellung von wasserunlöslichen Enzympräparaten viurde beispielsweise die Adsorption an der Oberfläche von festen Trägern, wie synthetischen Polymeren, z. B. Nylon (langkettige Polyamide) oder Cellulose vorgeschlagen. Weiterhin wurde der Einschluß von Enzymen innerhalb der Matrix eines Gels oder anderer Polymerisate vorgeschlagen.

In der Zeitschrift Process Biochemistry, October 1971, S. 11, ist ein Verfahren zur Unlöslichmachung von Enzymen beschrieben, das auf der Aktivierung von Cellulose, Nylon oder Glasoberflächen mit Gaben von Titan oder anderen Übergangsmetallen beruht, die dann mit dem Enzym bei Berührung Chelate bilden. Bei diesem Verfahren ist es stets notwendig, vorher ein Trägermaterial zu aktivieren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, wasserunlösliche Chelate von stickstoffhaltigen Proteinen, Enzymen, Peptiden, Lectinen, Antikörpern, Coenzymen, Antibiotika und ganzen Zellen mit wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Titan zu schaffen. Fernei ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung der wasserunlöslichen Chelate bereitzustellen. Die wasserunlöslichen Chelate sollen einfach und billig ohne vorherige Aktivierung eines Trägermaterials herstellbar sein und die ursprünglichen biologischen Eigenschaften der stickstoffhaltigen Stoffe sollen in gewissem Umfang erhalten bleiben. Durch die Chelatbildung sollen die genannten stickstoffhaltigen Stoffe beispielsweise aus Lösungen abgetrennt werden können. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend wasserunlösliche Chelate von stickstoffhaltigen Proteinen, Enzymen, Peptiden, Lectinen, Antikörpern, Coen-

zymen, Antibiotika und ganzen Zellen mit wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Titan.

Die Chelate weisen in gewissem Umfang die biologischen Eigenschaften der nachstehend einfach als »stickstoffhaltige Stoffe« bezeichneten ursprünglichen Proteine, Enzyme, Peptide, Lectine, Antikörper, Coenzyme, Antibiotika oder ganzen Zellen auf. Unter biologischen Eigenschaften sind beispielsweise katalytisch« oder antibiotische Eigenschaften oder Antikörpereigenschaften zu verstehen. In bestimmten Fällen können die stickstoffhaltigen Stoffe wiedergewonnen werden, wenn die Immobilisierung umgekehrt wird.

Nach der vorliegenden Erfindung ist eine vorherige Aktivierung eines Trägermaterials für die Chelatbildung nicht mehr erforderlich. Enzyme und die anderen stickstoffhaltigen Stoffe können jetzt direkt auf ein Oxid von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Then gebunden v/erden, ohne daß Cellulose, Nylon oder Glas erforderlich ist Dementsprechend entfällt auch der Verfahrensschritt zu deren Aktivierung.

Bevorzugt sind die nachstehend einfach als »wasserhaltiges Oxid« bezeichneten wasserhaltigen Oxide oder Hydroxide von Zinn(II), Vanadin(III) und Titan(IV, III) und insbesondere wasserhaltiges Oxid von Zirkon.

Wie bereits erwähnt, besitzen die Chelate die ursprünglich in den stickstoffhaltigen Stoffen vorhandenen biologischen Eigenschaften und können daher für die gleichen Zwecke wie diese verwendet werden. Nachdem die biologische Aktivität des Chelatkomplexes im gewünschten Umfang benutzt worden ist, kann so der stickstoffhaltige Stoff leicht aus dem Chelatkomplex abgetrennt werden, indem eine Suspension des Chelats in einem wäßrigen Medium bei alkalischem pH-Wert mit einer wäßrigen Hydrogencarbonat- oder Carbonatlösung (beispielsweise wäßrige Lösung von Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat) oder einer wäßrigen Lösung von anderen Verbindungen, die zum Ersatz der Chelatkomponente geeignete Ionen, wie Phosphate, Molybdate oder Fluoride, enthalten, behandelt wird. Bei der Behandlung des Chelatkomplexes mit einer wäßrigen Hydrogencarbonat- oder Carbonatlösung wird die Chelatbildungsfähigkeit des wasserhaltigen Oxids desaktiviert. Jedoch kann diese Chelatbildungsfähigkeit anschließend leicht durch Behandlung mit einer Säure wieder hergestellt werden. 4 ^r>

Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Chelat zur Abtrennung des stickstoffhaltigen Stoffes in einem wäßrigen Medium mit einer anorganischen Säure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, zu behandeln, wobei die Säurekonzentration bzw. ^r>o die Azidität so gering ist, daß das wasserhaltige Oxid nicht gelöst wird. Durch diese Säurebehandlung wird das wasserhaltige Oxid regeneriert, d. h. in eine solche Form gebracht, daß es wiederum zur Chelatbildung mit dem stickstoffhaltigen Stoff fähig ist. «

Die Wahl zwischen den beiden Behandlungsmethoden hängt häufig davon ab, ob die Aufgabe darin besteht, den Chelatkomplex unter Erhaltung der biologischen Aktivität zu erneuern oder eine verbrauchte katalytische Oberfläche, die beispielsweise vorher ein ω immobilisiertes Enzym enthielt, zu erneuern.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Immobilisierung der stickstoffhaltigen Stoffe durch Chelatbildung, wobei als Mittel zur Immobilisierung die genannten wasserhaltigen Oxide verwendet werden, die gegebenenfalls nach dem Ausnutzen der Aktivität der organischen Substanz wiedergewonnen werden können. Die Chelatbildungsfähigkeit der wasserhaltigen Oxide kann entweder in dem Medium, in dem die Aktivität des Chelats eingesetzt wird, oder nach Abtrennung aus diesem Medium regeneriert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der wasserunlöslichen Chelate ist dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein stickstoffhaltiges Protein, Enzym, Peptid, Lectin, Antikörper, Coenzym, Antibiotikum oder ganze Zellen mit mindestens einem wasserhaltigen Oxid von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Titan in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines festen Metallchelats vermischt und gegebenenfalls das feste Chelat aus dem wäßrigen Medium abtrennt

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine wäßrige Lösung eines Zirkonsalzes, beispielsweise Chlorid oder Sulfat, oder eines Zinn-, Vanadin- oder Titansalzes, aus dem ein wasserhaltiges Oxid gebildet werden kann, oder eine wäßrige Lösung eines Gemisches dieser Salze mit einer Base, vorzugsweise mit Ammoniak oder Natriumhydroxid, versetzt, bis ein pH-Wert von 3 bis 8,5, vorzugsweise 6 bis 8, erreicht ist und das wasserhaltige Oxid oder Hydroxid des Metalls entstanden ist. Die Suspension des entstandenen wasserhaltigen Oxids wird anschließend mit dam stickstoffhaltigen Stoff in einem wäßrigen Medium (vorzugsweise in wäßriger Lösung) versetzt, wobei ein festes Chelat des stickstoffhaltigen Stoffes erhalten wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Chelat durch in-situ-Copräcipitation des wasserhaltigen Oxids in einem wäßrigen Medium, das den stickstoffhaltigen Stoff und ein geeignetes Metallsalz enthält, herzustellen, indem man das wäßrige Medium mit einer Base, vorzugsweise Ammoniak, versetzt. Das erstere Verfahren wird bevorzugt, da dabei die Berührung des stickstoffhaltigen Stoffes mit der Metallsalzlösung vermieden wird. Diese Metallsalzlösung kann nämlich je nach dem verwendeten Salz zu Beginn des Copräcipitationsverfahrens sehr stark sauer sein und dabei den Verlust der biologischen Aktivität des Stoffes verursachen.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich bei Raumtemperatur und einem pH-Wert des Reaktionsmediums, in dem das Chelat hergestellt wird, von 4 bis 8, vorzugsweise von 6 bis 8, durchführen. Das Vermischen des wasserhaltigen Oxids mit dem stickstoffhaltigen Stoff im wäßrigen Medium kann einige Stunden fortgesetzt werden. Im allgemeinen sind für eine maximale Retention der biologischen Aktivität des Stoffes Mischzeiten von '/2 bis 3 Stunden ausreichend. Je höher die anfängliche Konzentration des stickstoffhaltigen Stoffes im Verhältnis zum wasserhaltigen Oxid im Gemisch ist, desto besser ist die biologische Aktivität des erhaltenen Chelats.

Zum Erreichen der maximalen biologischen Aktivität des Chelats soll das Vermischen des stickstoffhaltigen Stoffes und des wasserhaltigen Oxids in Abwesenheit von Kohlendioxid, Carbonaten, Hydrogencarbonaten und bestimmten anderen Ionen, wie Citrat, vorgenommen werden. Diese Ionen können die Chelatbildung des stickstoffhaltigen Stoffes beeinträchtigen, da sie die Natur des wasserhaltigen Oxids modifizieren und eine wirksame Chelatbildung verhindern.

Die Erfindung betrifft insbesondere Chelate von Enzymen, wie Glucose-Oxidase, Glucose-Isomerase, Lactase, Catalase, Invertase, <x- und /?-Amy!ase, Pullulanase, Penicillin-Acylase, bakterielle Protease, Trypsin, Chymotrypsin, Glucoamylase, Dextranase, Glucosidase und Maxatase; von Lectinen, wie Concanavalin; von Hormon-freisetzenden Faktoren, wie »relea-

sing factor« des Follikel-stimulierenden Hormons, des luteinisierenden Hormons und des adrenocorticotropen Hormons; von Hormonen (Proteinen), wie das Folükelstimulierende Hormon und das luteinisierende Hormon, von Antikörpern in Antipneumococcenseren und verschiedenen y-Globulinen; von Antibiotika, wie Penicillin, Gramicidin D, Lathumycin, gewonnen aus dem Mikroorganismus S. lathumensis, Neomycin, Polymyxin, Streptomycin, Ampicillin und Chlora-nphenicol; von Ccenzyrnen, wie Nicotinamid-adenin-dinucleotid und reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid; und von ganzen Zellen, wie Bäckerhefe und Escherichia coli.

Es ist auch möglich, zwei oder mehr der vorgenannten Stoffe mit den wasserhaltigen Oxiden der Chelatbildung zu unterwerfen, beispielsweise eine Aminosäure und ein Enzym, wodurch es möglich wird, z. B. die enzymatische Aktivität des Endproduktes zu beeinflussen.

Mit Hilfe der Chelate ist es möglich, aus wäßrigen Medien ein Antibiotikum, z. B. Lathumycin, nach vorheriger Beseitigung von Substanzen, wie Kohlendioxid oder Metallcarbonaten, die mit den chelatbildenden Eigenschaften der wasserhaltigen Oxide konkurrieren oder diese modifizieren, abzutrennen. Dazu werden die das Antibiotikum enthaltenden Medien mit wasserhaltigem Zirkonoxid oder einem der anderen wasserhaltigen Oxide versetzt, oder diese Verbindungen werden in den genannten Medien gebildet, wobei ein Metallchelat des Antibiotikums ausfällt. Der das Antibiotikum enthaltende Chelatkomplex läßt sich abtrennen, und das Antibiotikum selbst kann auf die vorbeschriebene Weise x durch Behandlung des abgetrennten Komplexes mit einer wäßrigen Hydrogencarbonat- oder Carbonatlösung oder mit einer verdünnten bzw. schwachen Säure regeneriert werden. Dieses Verfahren läßt sich auch zur Abtrennung anderer stickstoffhaltiger Stoffe aus wäßrigen Medien anwenden.

Die Erfindung läßt sich auch zur Herstellung von antiseptischen Oberflächen mit einem Antibiotikum-Chelatkoinplex auf einem trockenen Träger, zur Herstellung von Antikörper-Chelatkomplexen für radioimmunologische Untersuchungen zur Herstellung von unlöslich gemachtem Concanavalin und für eine Reihe anderer Zwecke anwenden, bei denen unlöslich gemachte Enzyme vorteilhafterweise eingesetzt werden können. Diese wasserunlöslichen Enzympräparate haben den Vorteil, daß sie in kontinuierlichen Verfahren verwendet werden können.

Die wasserunlöslichen Chelate sind wertvolle Reagentien. Sie können beispielsweise in Enzymreaktoren für technische oder analytische Zwecke oder zur so Affinitätschromatographie und für verschiedene andere Zwecke eingesetzt werden.

Die Enzym-Chelatkomplexe weisen die folgenden speziellen Vorteile auf:

(a) Die wasserunlöslichen, immobilisierten Enzyme behalten die spezifische Aktivität des freien Enzyms in hohem Maße.

(b) Die Enzym-Chelatkomplexe besitzen im allgemeinen eine höhere Wärmestabilität als die wasserlöslichen Enzyme und können deshalb langer gelagert und in einem größeren Temperaturbereich eingesetzt werden.

(c) Die Trägermatrix des Enzyms kann regeneriert werden, wenn die Aktivität des Enzyms verbraucht ist oder so stark abgenommen hat, daß sie nicht mehr ausreichend ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

pH-Optimum zur Chelatbildung von Glucose-Oxidase mit wasserhaltigem Zirkonoxid

Jeweils 2,0 ml einer Lösung von Zirkontetrachlorid mit einem Gehalt von 1,53 g/ml werden langsam unter Rühren zur Ausfällung von wasserhaltigem Zirkonoxid mit einer 2,0-m Ammoniaklösung auf einen pH-Bereich von 4,5 bis 8,5 gebracht. Jede dieser Proben wird mit 500 μΐ einer Glucose-Oxidase-Lösung (0,0206 g Glucose-Oxidase mit einer Aktivität von 144 Einheiten/mg in 10 ml Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0) versetzt. Diese Proben werden 18 Stunden bei 4° C gerührt, anschließend zentrifugiert und sechsmal mit je 5 ml destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend werden die Proben mit jeweils 1 ml destilliertem Wasser versetzt und gründlich zu einer Suspension verrührt. 0,5 ml dieser Suspension werden entnommen und bei 120°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Außerdem werden jeweils Proben von 1,0 ml Volumen entnommen und mit destilliertem Wasser lOOfach verdünnt. Die Enzymaktivität der verdünnten Proben wird nach dem folgenden Test bestimmt: 2,5 ml einer ABTS-Lösung in 0,1 -m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit 0,5 mg/ml ABTS (ABTS = 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzothiazolin-(6)-suifonsäure], ein komplexer Farbstoff), 10 μΐ Peroxidase-Lösung in 0,1 -m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit 2 mg/ml Peroxidase und 500 μΐ einer lOprozentigen Glucoselösung werden vermischt. Die optische Dichte (Extinktion) bei 415 nm wird mehrere Minuten aufgezeichnet. Sodann werden 20 μΐ der Oxidsuspension zugesetzt, und der Extinktionsanstieg bei 26° C wird unter Verwendung eines Beckman DB-G Spektrophotometers, der mit einem Papierschreiber versehen ist, bei 26° C kontinuierlich aufgezeichnet.

Aktivität = -== r—Tr —-^ '-τ—:— (Einheiten/g trockenes ZrO₂

38 χ bestimmtes Gewicht des Oxids

1E bedeutet die Extinktionsänderung.

Tabelle I

pH-Wert der AE4\5lm\n Gewicht der Aktivität,
Chelat- 0,5-ml-Probe Einheiten,

bildung

60

65 pH-Wert der
Chelatbildung

JiT415/min Gewicht der Aktivität,

0,5-ml-Probe Einheiten, g

4,45	0,00599	0,0201	60	5,92	0,0320	0,0236	271
5,02	0,0199	0,0226	176	6,47	0,0353	0,0258	273
5.54	0.0244	0.0226	215	7,49	0,0318	0,0254	250

Beispiel 2

Optimale Rührzeit zur Chelatbildung
von Glucose-Oxidase mit wasserhaltigem Zirkonoxid

Zirkonoxidproben, die gemäß Beispiel 1 bei pH-Wert 6,0 gefällt wurden, werden mil jeweils 500 μΐ der Glucose-Oxidase-Lösung gemäß Beispiel 1 versetzt. Die einzelnen Gemische werden bei 4°C verschieden lang gerührt, zentrifugiert, gewaschen und schließlich gemäß Beispiel 1 auf ihre enzymatische Aktivität untersucht.

Tabelle Il	Δ E/min	Gewicht der	Aktivität,
Rührzeit,		0,5-ml-Probe	Einheiten, g
Stunden	0,0367	0,0236	310
0,5	0,0399	0,0226	353
1	0,0367	0,0218	336
2	0,0407	0,0232	351
3	0,0328	0,0206	318
5	0,0320	0,0236	271
18

Beispiel 3
Optimales Verhältnis Enzym/Zirkonoxid

Zirkonoxidproben, die gemäß Beispiel 1 bei pH-Wert 6,0 gefällt wurden, werden mit verschiedenen Mengen von Glucose-Oxidase-Lösung versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei 4° C werden die Proben zentrifugiert, gewaschen und gemäß Beispiel 1 auf ihre enzymatische Aktivität untersucht.

Tabelle IH	Λ f/min	Gewicht der	Aktivität,
Menge der		0,5-ml-Probe	Einheiten, g
Glucose-
Oxidase, mg	0,00119	0,0244	10
0,05	0,00252	0,0239	21
0,10	0,0170	0,0242	140
0,52	0,0367	0,0218	336
1,04	0,0971	0,0182	1070
2,08	0,162	0,0142	2280
4,16		Beispiel 4

Chelatbildung von Glucose-Oxidase
mit verschiedenen Metalloxiden

3,0 mg Glucose-Oxidase werden mit wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Vanadin(III) und Zinn(II) gemäß Beispiel 1 bei pH-Wert 6,0 der Chelatbildung unterzogen. Die Aktivität des Enzymchelats wird gemäß Beispiel 1 bestimmt.

Tabelle IV

Metall

Aktivität, Einheit, g

Zr (IV) 1340

Sn ÖD 1750

V (III) 9800*)

*) Es wird angenommen, daß die Metallionen in diesem Fall den Enzymtest stören, was zu falschen, hohen Ergebnissen führt.

Beispiel 5

Chelatbildung von Peroxidase
mit verschiedenen Metalloxiden

1,0 mg Peroxidase wird mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(III) bei pH-Wert 6,0 gemäß den vorstehenden Angaben für Glucose-Oxidase der Chelatbildung unterzogen. Nach dem Waschen wird die Aktivität des Enzymchelats folgendermaßen bestimmt: Die Suspension von Peroxidase in fester Phase wird 10Ofach verdünnt. 25 μΐ davon werden zu 2,5 ml einer ABTS-Lösung in 0,1-m Phosphatpuffer (0,5 g/Liter) vom pH-Wert 5,0 und 0,5 ml einer lOmillimolaren Wasserstoffperoxidlösung gegeben. Die Extinktion bei 415 nm wird bei 26⁰C aufgezeichnet. Standardwerte werden unter Verwendung von 2,5 ml ABTS-Lösung, 25 μΐ Wasserstoffperoxid in verschiedenen Konzentrationen (0- bis 2,5millimolar) und 0,5 ml der ursprünglichen Peroxidaselösung (lOOOfach verdünnt) erhalten.

Tabelle V

Metall

Aktivität, Einheiten*)/mg

Zr(IV) 81

Sn (II) 69

V (III) 36

*) 1 Einheit = 1 μΜοΙ oxidiertes H₂O₂ pro Minute bei 25 C und pH-Wert 5,0.

Beispiel 6

Chelatbildung von Dextranase
mit verschiedenen Metalloxiden

3,0 mg Dextranase («-l.e-Glucan-e-glucanohydrolase) werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(III) gemäß Beispiel 1 der Chelatbildung unterzogen. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Aktivität der Proben folgendermaßen bestimmt: 25 μΐ Dextranase/Metalloxid werden zu 1,0 ml einer 0,5prozentigen Dextranlösung in 0,2 m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 gegeben und 30 Minuten bei 25° C inkubiert. Eine Probe von 500 μΐ wird entnommen und zu 2,5 ml des unten angegebenen Reagens gegeben, 10 Minuten auf 100° C erwärmt und abgekühlt Sodann wird die Extinktion bei 570 nm (rot) gemessen. Das Reagens enthält 0,25 g 3,5-DinitrosaIicylsäure, 75 g Natriumkaliumtartrat und 50 ml 2 n-Natriumhydroxid. Diese Reagentien werden mit destilliertem Wasser auf 250 ml aufgefüllt und in einer dunklen Flasche aufbewahrt.

Tabelle VI

Metall

Aktivität, Einheiten*)/g

Zr(IV)
Sn αϊ)

van)

17
29

*) 1 Einheit = Aktivität von 1 μ& des freien Enzyms.

Beispiel 7
Elution von Dextranase aus Zirkonoxid

Zirkonoxidproben (pH-Wert 7,0, Standardmenge) werden hergestellt und mit 2,5 ml (1,8 mg/ml) Dextranase-Lösung versetzt. Anschließend werden die Gemische 2 Stunden bei 4° C gerührt. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen der Überstände werden die Feststoffe mit jeweils 10 ml Wasser 1 Stunde bei 4⁰C gerührt, zentrifugiert, und die Waschwässer werden entfernt. Sodann werden 10 ml einer 1,0-m Kaliumfluoridlösung oder 10 ml einer 0,5-m Dinatriumhydrogenphosphatlösung zugesetzt, und die Proben werden 1 Stunde bei 4° C gerührt. Nach dem Zentrifugieren werden die Eluate entfernt und zusammen mit den Waschwässern und den ursprünglichen Überständen auf ihre Dextranase-Aktivität untersucht. Die lösliche Dextranase wird in Gegenwart von Fluorid bestimmt, um sicherzustellen, daß es die Enzymaktivität nicht hemmt.

Tabelle VIl

Dextranase-Aktivität*)

überstand O O

Wasser O O

Phosphat 24

Fluorid 0

*) In Prozent der Aktivität des freien Enzyms.

Beispiel 8

Chelatbildung von /}-GIucosidase
mit verschiedenen Metalloxiden

2,15 mg jJ-Glucosidase werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(III) gemäß Beispiel 1 der Chelatbildung unterzogen. Nach 6maligem Waschen mit jeweils 5,0 ml Wasser wird die Aktivität der Enzymchelate gemäß dem nachstehend beschriebenen Test bestimmt

20 μΐ der Enzym/Metalloxid-Suspension werden zu 5,0 ml einer auf 37° C vorerwärmten Lösung von o-Nitrophenyl-0-D-glucopyranosid (2,4 mg/ml in 0,005-m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0) gegeben. Die Proben werden unter Rühren 30 Minuten bei 37° C inkubiert Danach wird die Reaktion zum Stillstand gebracht, indem 500^1-Proben entnommen werden und mit einem gleichen Volumen einer 0,2-m Natriumcarbonatlösung versetzt werden. Die Extinktion bei 420 nm wird abgelesen und die Menge des durch das Enzym freigesetzten o-Nitrophenols an Hand einer Eichkurve bestimmt Die Aktivität des löslichen Enzyms wird auf ähnliche Weise bestimmt

Tabelle VIII

Metall

Aktivität*),
Einheiten/g

Zr (IV) 202 Aktivität des

Sn (Π) 72 löslichen Enzyms

V (ΏΪ) 76 = 49 Einhe.itenAng

*) 1 Einheit = 1 μΜοΙ freigesetztes o-Nhophenol pro Minute bei 37°C und pH-Wert 5,0.

Beispiel 9

Chelatbildung von «-Chymotrypsin
mit verschiedenen wasserhaltigen Metalloxiden

1,87 mg «-Chymotrypsin werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(III) gemäß Beispiel 1 der Chelatbiidung unterzogen. Nach 6maligem Waschen mit je 5,0 ml Wasser wird die Aktivität des Enzymchelats folgendermaßen bestimmt: 200 μΐ

ίο Enzym/Metalloxid-Suspension werden zu 800 μΐ eines 0,1-m Boratpuffers vom pH-Wert 8,0 gegeben und auf 37° C erwärmt. Diese Lösung wird mit 1 ml Casein-(Hammarsten)-Lösung(l gCasein + 1,1 ml5prozentige Calciumchloridlösung in 100 ml 0,1-m Boratpuffer) gegeben. Die Proben werden 20 Minuten bei 37° C unter Rühren inkubiert. Anschließend werden 3,0 ml einer 5prozentigen (Gew7Vol.) wäßrigen Trichloressigsäurelösung zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Nach dem Zentrifugieren wird die Extinktion des Überstandes bei 280 nm abgelesen und die Aktivität der Proben anhand einer Standardkurve, die auf Grund der bekannten Aktivität des löslichen Enzyms erhalten ist, bestimmt.

^r> Tabelle IX

Metall

Aktivität,CU_cas/g*)

Zr(IV) 1,40 Aktivität des

Sn (II) 1,33 löslichen Enzyms

V (III) 8,82 276 CU^/mg

*) 1 CU_cas ist die Chymotrypsinmenge, die unter den genannten Bedingungen bei 280 nm pro Minute einen Extinktionsanstieg von 1,00 hervorruft.

40

45

Beispiel 10

Chelatbildung von Trypsin mit verschiedenen
wasserhaltigen Metalloxiden

2,06 mg Trypsin werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(IIi) gemäß Beispiel 1 der Chelatbildung unterzogen. Nach 6maligem Waschen mit je 5,0 ml Wasser wird die enzymatische Aktivität der Proben folgendermaßen bestimmt: Proben der Enzym/Metalloxid-Suspension (20 bis 200 μΐ) werden entnommen und mit auf 37° C vorerwärmtem 0,05-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 auf 1,0 ml aufgefüllt Sodann werden die Proben jeweils mit 1,0 ml einer auf 37°C vorerwärmten Caseinlösung (1 Prozent [Gew7Vol.] in 0,05-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6) versetzt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert Sodann wird die Reaktion durch Zusatz von 3,0 ml einer 5prozentigen (Gew/Vol.) Trichloressigsäurelösung in Wasser zum Stillstand gebracht Die Proben werden zentrifugiert und die Extinktion bei 280 nm der Überstände wird abgelesen. Anhand einer Eichkurve, die mit bekannten Konzentrationen des löslichen Enzyms erhalten wurde, werden die Aktivitäten der Proben festgestellt

	X	11	23	45	029
: Tabelle		Aktivität,TUcas"
Metall
■)/g

Zr(IV)
Sn (H)
V (III)

0,87
2,42
13,1

Aktivität des löslichen Enzyms = l,19TU_cas/mg

*) 1 TUcas i^st die Trypsinmenge, die unter den genannten Bedingungen eine solche Menge an in Trichloressigsäure löslichen Hydrolyseprodukten freisetzt, daß die Extinktion ,„ bei 280 nm in 1 Minute um 1,00 ansteigt.

Beispiel 11

Chelatbildung von Glucoamylase mit verschiedenen wasserhaltigen Metalloxiden

3,0 mg rohe, dialysierte Glucoamylase («-1,4-Glucanglucohydrolase) werden mit den wäßrigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vandin(lII) gemäß Beispiel 1 der Chelatbildung unterzogen. Nach ömaligem Waschen mit jeweils 5,0 ml Wasser wird die Aktivität des Enzymchelats auf folgende Weise bestimmt:

25 μΐ Glucoamylase/Metalloxid-Suspension werden zu 5,0ml einer lprozentigen Stärkelösung in 0,2-m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 gegeben und 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Eine 25^1-Probe wird entnommen und zu 1,0 ml einer Lösung, die 0,5 g/Liter ABTS (vgl. Beispiel 1), 250 μΐ Peroxidase pro Liter und 100 mg Glucose-Oxidase pro Liter enthält, gegeben, und 30 Minuten bei 26° C inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 415 nm abgelesen. Eine Eichkurve wird unter Verwendung von Glucose-Standardlösungen verschiedener Konzentration (0 bis 1 millimolar) erhalten.

Tabelle XI

Metall

Aktivität, Einheiten*)/g

Zr (IV) 10,8

Sn (II) 15,8

V (III) 15,5

*) 1 Einheit = 1 μΜοΙ aus Stärke freigesetzte Glucose pro Minute bei 37"C und pH-Wert 5,0.

Beispiel 12

Chelatbildung verschiedener Enzyme mit wasserhaltigem Titanoxid

Ammoniumhydroxid (0,880x20 verdünnt) wird zu 500 μΐ Titantetrachlorid in Wasser (50 Prozent Gew./ Vol.) vom pH-Wert 7,0 (Proben 1 und 2) oder vom pH-Wert 4,5 (Probe 3) gegeben. Die Proben 2 und 3 werden mit jeweils 1,5 ml Glucoamylase (roh, gegen Wasser dialysiert, etwa 10 mg/ml) versetzt, während zu Probe 1 1,5 ml Peroxidaselösung gegeben werden. Alle drei Proben werden anschließend mit Wasser auf 10 ml aufgefüllt und über Nacht gerührt. Anschließend werden sie 12mal mit je 10 ml 0,1-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,0 gewaschen.

Bestimmung der Enzymchelat-Präparate
der Proben 2 und 3

Der Bernfield-Test wird angewendet, um die Geschwindigkeit der Glucosebildung aus Stärke unter Katalyse der als Chelat in fester Phase vorliegenden Glucoamylase festzustellen.

50 μΐ des in fester Phase suspendierten Enzyms werden mit Wasser auf 1 ml verdünnt und zu 9 ml einer lprozentigen Stärkelösung in 0,1-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,0 gegeben. Die Reagensgläser werden 40 Minuten bei 45°C inkubiert und anschließend rasch abgekühlt. 1-ml-Proben werden zu jeweils 1 ml einer lprozentigen (Gew7Vol.) wäßrigen 3,5-Dinitrosalicylsäurelösung gegeben und 4 Minuten in ein siedendes Wasserbad getaucht. Anschließend wird abgekühlt und die Extinktion bei 520 nm abgelesen. Die Glucose-Standardlösungen (0 bis 1000 μg/ml) werden auf die gleiche Weise analysiert. Ein Wert für das Trockengewicht wird durch Trocknen von 5 ml der ursprünglichen Suspension in einem Trockenofen bestimmt, wobei vorher der Puffer durch Waschen mit Wasser entfernt wird. Die Ergebnisse werden nach folgender Gleichung berechnet:

... . _ 10 χ Gewicht der freigesetzten Glucose/ml)

4Ö

χ 180 χ

Gewicht des Enzyms in fester Phase

Die Ergebnisse
zusammengestellt

sind in folgender Tabelle XII

Probe 1

Die Suspension der Peroxidase in fester Phase wird 50fach verdünnt 25 μΐ davon werden zu 2,5 ml ABTS (O^ g/Liter) ir. 0,1 -m Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,0

und O^ ml Wasserstoffperoxid (2,5xlO-³m) gegeben. Die Extinktion bei 415 nm wird zu verschiedenen Zeitpunkten abgelesea Standardwerte werden unter Verwendung von 2,5 ml ABTS-Lösung, 25 μΐ Wasserstoffperoxidlösung mit verschiedenen Konzentrationen (0 bis 6 χ ΙΟ-⁴ m) und 04 ml Peroxidaselösung (10μg/mί) erhalten. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle XII aufgeführt

Tabelle XII

pH-Wert der
Chelatbildung

Enzym

Aktivität, Aktivität während der

μ/g Chelatbildung,

Einheiten

Aktivität des Chelats in Prozent der ursprünglichen Aktivität

1 7,0 Peroxidase 1,44XlO⁵*) 1,51XlO⁶

2 7,0 Glucoamylase 2,04XlO³⁺) 4,42XlO¹

3 4,5 Glucoamylase 2,46 X 1O¹⁺) 4,42 X 10¹ *) μΜοΙ freigesetztes Wasserstoffperoxid pro Minute bei 37 C und pH-Wert 5,0.

⁺) μΜοΙ freigesetzte Glucose pro Minute bei 4OC und pH-Wert 5,0.

8,69
2,77
3,34

In einem weiteren Experiment werden Glucose-Oxidase, Dextranase und Glucoamylase an wasserhaltiges Titanoxid unter verschiedenen Bedingungen gekuppelt.

Titanchlorid (500 μΐ, etwa 50 Prozent [Gew7Vol.] in 6 n-HCl) weiden mit NH₄OH (0,880, 20fach verdünnt) oder NaOH (0,1 n) auf pH-Wert 5,0 neutralisiert. Sodann werden Glucose-Oxidase (Boehringer, GOD I, 5 mg in 500 μΐ Wasser), Glucoamylase (aus Aspergillus niger, etwa 6 mg/ml, gegen Wasser dialysiert) bzw. Dextranase (Koch-Light Laboratories Ltd., 3 mg in 500 μΐ Wasser) zugesetzt. Die Gemische werden jeweils Tabelle XIII
Glucose-Oxidase/TiO₂

mit Wasser auf 10 ml aufgefüllt und 18 Stunden bei 4° C gerührt. Die Feststoffe werden zentrifugiert und 12mal mit je 5 ml Wasser oder 5 ml 0,1 -m Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,0 gewaschen.

Für Glucose-Oxidase wird die Kupplung nach demselben Verfahren bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt. Auch die Rührzeiten und die Konzentration der Glucose-Oxidase werden verändert. Die Ergebnisse finden sich in folgenden Tabellen XIII und XIV.

Kupplungs	pH-Wert der	Spezifische	-	Enzym/Oxid-	Aktivität	Spezifische Aktivität	48	Erhaltene	Gebundenes Protein	Prozentsatz der
dauer	Kupplung	Aktivität, frei		Verhältnis			40,5	Aktivität		erhaltenen
Stunden			μg/mg TiO2		-		μ/mg TiO2	Aktivität
'/2	5,0	Einheiten/	40	Einheiten/g TiOi Einheiten/mg Protein	36	Einheiten/	15,6	%
1	5,0	mg Protein	40	750	-	TiO2	23,4
2	5,0	Glucose-Oxidase 75,4	40	950	36	750	-	25
3	5,0	Glucose-Oxidase 75,4	40	1030	34	770	29,4	51
4	5,0	Dextranase	40	1060	41,5	20	-	33
5	5,0	Glucoamilase	40	1065	36	2.5	30	3.3
18	5,0	40	1080	35	35,5
18	5,0	10	1140	31,5	7,5
18	5,0	20	300	26,5	21,4
18	5,0	40	770	-	31,4
18	5,0	80	1100	33,5	53,4
18	5,0	120	1680	35,5	67,0
18	5,0	160	1780	35,0	-
18	4,75	40	2050	37,5	28,4
18	5,65	40	950	32,5	31,0
18	7,05	40	1100		32,9
18	7,75	40	1150	Ursprünglich	30,7
18	8,50	40	1150	vorhandene	32,3
Tabelle XIV			1050	Aktivität
Enzym	Spezifische		Einheiten/
	Aktivität,	Prozentsatz der	TiO2
	gekuppelt	erhaltenen spezi	3000
	Einheiten/	fischen Aktivität	1500
	rag Protein	%	60
48		73.5
36	64
-	48
	-
_

Beispiel 13 Adsorption von Glucoamylase an Zirkonoxid

3,06 g Zirkontetrachlorid werden in 20 mi 1 n-Salz· säure gelöst Diese Lösung wird langsam unter Rühren mit etwa 30 ml 2 η-Ammoniak versetzt, um das Oxid bei pH-Wert 5,0 auszufällen. Das erhaltene Präparat wird mit 10 ml Glucoamylase-Lösung (1,0092 g Glucoamylase Gist-Brocades N. V.) in 50 ml destilliertem Wasser versetzt Die erhaltene Suspension wird 18 Stunden bei 4⁰C gerührt, zentrifugiert und 3mal mit destilliertem

10

Wasser gewaschen. Die Enzymaktivität wird unter Verwendung von pNPG (p-Nitrophenyl-a-D-glucopyranosid) bestimmt 10-ml-Proben (etwa 0,5 g Z1O2) werden 15 Minuten bei 30⁰C mit 25 ml einer 0,2prozentigen pNPG-Lösung in Acetatpuffer vom pH-Wert 4,7 vermischt Die Reaktion wird durch Zugabe einer 5prozentigen Natriumcarbonatlösung beendet Die Extinktion wird bei 400 nm abgelesen und daraus die Aktivität der Enzymprobe nach folgender Gleichung bestimmt:

Aktivität =

IE/15 min, 30° C χ Verdünnungsfaktor 0,1 χ Gew. der Probe = pNPG-Einheiten/g

(Eine Einheit ist die Glucoamyiasemenge, die bei 400 nm innerhalb von 15 Minuten bei 30°C einen Extinktionsanstieg von 0,1 hervorruft)
Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

Lösliches Enzym
Suspension

Prozent Adsorption

272OpNPG Einheiten/g 408pNPG Einheiten/g,

bezogen auf trockenes Z1O2 75

b) Umsetzung von Stärke durch immobilisierte
Glucoamylase-Suspension nach Lyophilisation
(2 g lyophilisiertes Material pro 50 ml Substrat)

Tabelle XVl

25 Zeit

Beispiel 14

Umsetzung von Stärke durch an wasserhaltiges Zirkonoxid gebundene Glucoamylase

18,36 g Zirkontetrachlorid werden in 120 ml 1 n-Salzsäure gelöst. Diese Lösung wird unter Rühren mit 200 ml 2 n-Natriumhydroxidlösung in einer Portion versetzt, wobei ein dichter, flockiger Niederschlag von wasserhaltigem Zirkonoxid entsteht. Nach 18stündiger Inkubation bei 4° C mit einer Lösung von 3 g Glucoamylase in 150 ml destilliertem Wasser wird die Suspension zentrifugiert und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivität beträgt 51OpNPG-Einheiten, berechnet auf 1 g trockenes ZrO₂. Der Prozentsatz der Adsorption beträgt 84 Prozent.

a) Umsetzung von Stärke durch immobilisierte Glucoamylase-Suspension

Tabelle XV

30

Jj

40

45

50

% Umsetzung

Die ersten
24 Stunden

Die weiteren
24 Stunden*)

94

94

100 ml Stärkelösung mit 100 g feuchter

Suspension

50 ml Stärkelösung mit 80 g feuchter

Suspension

*) Nach der ersten Umsetzung wird die Suspension zentrifugiert und gewaschen. Neues Substrat wird zugesetzt.

Umsetzung

Die ersten 24 Stunden
Die zweiten 24 Stunden

66
63

c) Umsetzung von Stärke durch immobilisierte

Glucoamylase nach dem Trocknen der Suspension

bei 20° C (2,5 g trockenes Material

pro 50 ml Substrat)

Beim anschließenden Eintauchen in Wasser bricht das trockene Material zu kleineren körnigen Teilchen.

Tabelle XVIl

Zeit

% Umsetzung

3,5 Tage 23

6 Tage*) 42

. *) Zwischen den beiden Versuchen wird weder Substrat zugesetzt, noch werden die Feststoffe gewaschen.

Anmerkung:

Das Substrat wir hergestellt durch Zugabe von bakterieller o-Amylase (Gist-Brocades N. V.; 1 g 4400 BAU/g pro 500 g Stärke) zu einer 30prozentigen Sta'rkelösung. Die Suspension wird in etwa 1 Stunde auf 90 C erwärmt. Nach 15minütiger Kochdauer wird die Suspension filtriert. Der Prozentsatz der Umsetzung beträgt 18,6 Prozent.

Beispiel 15

Elution von Glucoamylase
von wasserhaltigem Zirkonoxid

Proben von wasserhaltigem Zirkonoxid werden

bo hergestellt. Eine Glucoamylase-Lösung wird zugesetzt und die Proben werden 18 Stunden bei 4° C gemäß Beispiel 14 gerührt. Sodann werden die Proben zentrifugiert und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die Rückstände werden mit verschiedenen Pufferlösungen oder anderen Lösungen in einem Verhältnis von 1 :1 gemäß nachstehender Tabelle XVIIl versetzt. Die Gemische werden 1 Stunde bei etwa 30 bis 35⁰C gerührt. Nach dem Zentrifugieren werden die Überstän-

030 130/140

de entfernt und die Rückstände auf ihre Glucoamylase- Aktivität getestet Die Aktivität der ursprünglichen Lösung beträgt 482pNPG pro g, berechnet auf trockenes ZrO₂.

Tabelle	XVIII	Aktivität des Rück stands in pNPG Ein heiten/g ZiO2	Erhaltene Aktivität im Rückstand in % der ursprünglichen Suspension
Probe	Pufferlösung	482	100
1	Wasser	410	84,5
2	Phosphatpuffer 0,1 m, pH-Wert 5,0	418	85
3	Phosphatpuffer 0,1 m, pH-Wert 6,9	534	100
4	Acetatpuffer 0,005 m, pH-Wert 5,0	244	51
5	Di-Na H-phosphat 0,5 m

Beispiel 16

Herstellung und Wirkung von an Zirkonoxid

gebundener Glucoamylase in granulierter Form

unter Ausnutzung der ionogenen Eigenschaften

des wasserhaltigen Zirkonoxids

9,18 g Zirkontetrachlorid werden in 60 ml 1 n-Salzsäure gelöst. Diese Lösung wird mit 60 ml Amberlite IRC-50 (Kationenaustauscherharz) versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 85 ml 2 n-Natriumhydroxidlösung zugegeben, um die Suspension auf den pH-Wert / ,4 zu bringen. Sodann wird die Suspension filtriert und der Rückstand gewaschen. Das Harz wird über Nacht bei 4°C mit einer Glucoamylase-Lösung (2 g Glucoamylase in 80 ml destilliertem Wasser) inkubiert. Anschließend wird die Suspension abfiltriert und der Rückstand gewaschen. Der Rückstand wird bei Raumtemperatur mit einem Substrat gemäß Beispiel 14 inkubiert.

Die am Harz erhaltene Glucoamylase-Aktivität beträgt 28,5 Prozent der ursprünglichen Aktivität.

Tabelle XIX

Flüssigkeit der Chelatbildung unterzogen. Die Proben werden zentrifugiert und die Coenzymkonzentration der Überstände auf Grund ihrer Absorption bei 260 nm (pH-Wert 7,0) bestimmt

Tabelle XX

Metall

Prozentsatz des
gelierten NAD

Prozentsatz des
chelierten NADH

Zr(IV)
Sn (II)
V (III)

94,0
91,7
98,3

90,5
93,1
89,4

Beispiel 18

Inkubationszeit

% Umsetzung

Die ersten 3 Tage
Die zweiten 3 Tage
Die dritten 3 Tage

79
79
69

Chelatbildung von Concanavalin A
mit verschiedenen Metalloxiden

16,05 mg festes Concanavalin A (entspricht 2,02 mg Protein) werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(II) und Vanadin(IH) gemäß Beispiel 1 in einem Gesamtvolumen von 10,0 ml Flüssigkeit der Chelatbildung unterzogen. Nach dem Zentrifugieren

■τ, der Proben wird der Proteingehalt der Überstände spektrophotometrisch bei 280 nm bestimmt

Während der Inkubation wird eine leichte Veränderung des pH-Wertes beobachtet (von 7,4 bis 6,5). Die immobilisierte Glucoamylase wird nach jedem Versuch gewaschen und mit neuem Substrat versetzt (50 ml Substrat pro 30 ml immobilisierte Glucoamylase).

Beispiel 17

Chelatbildung der Coenzyme

Nicotinamid-adenin-dinucleotid und reduziertes

Nicotinamid-adenin-dinucleotid mit verschiedenen

wasserhaltigen Metalloxiden

2,08 mg Nicotinamid-adenin-dinucleotid und 2,08 mg reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Dinatriumsalz werden mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn(il) und Vanadin(!ü) gemäß Beispie! ! in !0,0 m!

Tabelle XXI	Prozentsatz des chelierten Proteins
Metall	93,5 98,7 92,5
Zr (IV) Sn (II) V (III)

Beispiel 19

Herstellung von immobilisierten Hefezellen
und Nachweis der Atmung in den Zellen

Wasserhaltiges Zirkonoxid, das durch Zusatz von 2,0 η-Ammoniak zu Zirkontetrachlorid (2,0 ml, 15,3 Gew^Vol.) bis zum pH-Wert 7,0 hergestellt ist, wird mit einer Suspension von Hefezellen (200 mg in 1,0 ml Wasser) versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten leicht

gerührt Anschließend wird es 1 Stunde stehengelassen. Nach dieser Zeit hat sich der Niederschlag auf etwa die Hälfte seines ursprünglichen Volumens gesetzt, wobei ein klarer und im Vergleich zu einem Kontrollversuch, in dem kein Oxid vorhanden ist, offensichtlich zellfreier Überstand erhalten wird. Das Gemisch wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand entfernt Das feste Produkt wird dreimal mit je 5,0 ml destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wird es in 5,0 ml auf 26° C erwärmten 0,2-m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 resuspendiert Die Suspension wird bei 26° C zu 15,0 ml Acetatpuffer gegeben, der sich in einem thermostatisierten Gefäß einer Sauerstoffelektrode befindet Die Elektrodenanregung wird aufgezeichnet und mit den Ergebnissen eines anderen Experiments verglichen, bei dem die Sauerstoffelektrode sich in einem bei 25° C equilibrierten, gerührten and belüfteteii Gefäß mit 20 ml 0,2-m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 befindet Der Papierschreiber wird so eingestellt, daß sich mit dieser Lösung eine Ablesung von 100 Prozent ergibt. Eine Suspension von Bäckerhefe (200 mg in 1 ml Puffer) wird zugesetzt und die Elektrodenanregung aufgezeichnet Dieses Experiment wird anschließend unter Verwendung von 100 mg Hefe wiederholt

Tabelle XXII

Zeit, bis der Schreiber 0% erreicht

Minuten

200 mg Hefe
100 mg Hefe
Immobilisierte Hefe
Ohne Hefe (Kontrolle)

20
29

keine merkliche Sauerstoffaufnahme

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß immobilisierte Hefe eine meßbare Sauerstoffaufnahme zeigt.

Beispiel 20

Adsorption von Bakterienzellen
durch wasserhaltiges Zirkonhydroxid

Eine frische Kultur von Escherichia coli (etwa 10 ml) wird 30 Minuten zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand entfernt und das Zellenmaterial in 2,0 ml 0,9prozentiger Kochsalzlösung resuspendiert. Anschließend wird nochmals 30 Minuten zentrifugiert Der Überstand wird wiederum entfernt und das Zellenmaterial in 2,0 ml Kochsalzlösung suspendiert. Eine 100-μΙ-Probe wird aus dieser Suspension entnommen und mit Kochsalzlösung auf 1 ml aufgefüllt. Diese Probe dient als Leerwert.

Die restliche Suspension wird zu einer Probe von Zirkonhydroxid vom pH-Wert 7,0 (hergestellt auf übliche Weise aus 2,0 ml Zinntetrachlorid) gegeben. Das Gemisch wird auf 10,0 ml aufgefüllt und bei Raumtemperatur 2 Stunden leicht geschüttelt. Sodann werden die Probe und der Leerwert 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Extinktionen der Überstände bei 600 nm werden bestimmt und miteinander verglichen.

Tabelle XXIII

Leerwert 0,216

Probe 0,022

Adsorption der Zellen = 94,6%

Versuch, die Zellen von Zirkonhydroxid
zu entfernen

Die gemäß dem vorstehenden Versuch erhaltene Probe mit an Zirkonhydroxid fixierten Zellen wird in drei Teile geteilt Es werden folgende Versuche zur Freisetzung dieser Zellen in die Lösung unternommen:

1. 3 ml der Suspension werden entnommen und mit 0,9prozentiger Kochsalzlösung auf 10 ml aufgefüllt Sodann wird 1 Stunde Kohlendioxid durchgeleitet und der Überstand wird auf die Anwesenheit von Zellen untersucht.

2. 3 ml Suspension werden entnommen. Sodann werden 5 ml 0,1-m Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung bis zu einem Volumen von 10,0 ml zugesetzt. Nach 1 stündigem Rühren wird der Überstand untersucht

3. 4 ml Suspension werden entnommen. Sodann werden 5 ml 0,1-m Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung bis zu einem Volumen von 10,0 ml zugesetzt. Anschließend wird 1 Stunde Kohlendioxid durchgeleitet, und der Überstand wird untersucht.

Tabelle XXIV

Probe Nr.

0,015

0,24

0,066

Anmerkung:

Bei der Prüfung der Überstände unter

dem Mikroskop lassen sich keine Zellen

nachweisen.

Beispiel 21

Immobilisierung und Nachweis der Atmung
bei Zellen von Escherichia coli

1 Liter Nährmedium, das Escherichia coli-Zellen enthält, wird in zwei Teile geteilt und bei hoher Geschwindigkeit (3000 U/min) 20 Minuten zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand abdekantiert, und die am Boden des Zentrifugiergefäßes gesammelten Zellen mit 10 ml 0,9prozentiger, normaler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wieder zentrifugiert und von der Kochsalzlösung befreit Anschließend werden die Inhalte der beiden Zentrifugiergefäße in jeweils 10 ml Kochsalzlösung resuspendiert 5-ml-Proben werden gemäß Beispiel 19 auf ihr Verhalten gegenüber der Sauerstoffelektrode geprüft, mit der Ausnahme, daß anstelle des Puffers 0,9prozentige Kochsalzlösung verwendet wird. Die restlichen beiden 5-ml-Proben werden zu den üblichen Proben von wasserhaltigem Zirkonoxid (pH-Wert 7,0, Standardmenge) gegeben und 5 Minuten leicht gerührt. Man läßt den Niederschlag

absetzen und zentrifugiert 1 Minute bei geringer Geschwindigkeit Der Überstand wird entfernt und der verbleibende Feststoff in Kochsalzlösung bei einem Gesamtvolumen von 5 ml resuspendiert Auch von dieser Probe wird das Verhalten gegenüber der Sauerstoffelektrode festgestellt

Tabelle XXV

Zeit, bis der Schreiber 0% erreicht

Minuten

Tabelle XXVI

Probe

Freie Zellen (0,5 ml)
Freie Zellen (1,0 ml)

Immobilisierte Zellen
(0,05 ml)

Aktivität

0,144 Einheiten
0,286 Einheiten (auf

das Volumen

korrigiert

0,230 Einheiten

Freie Zellen 7

Immobilisierte Zellen 25

Beispiel 22

Bestimmung der Aktivität

der alkalischen Phosphatase

von immobilisierten E. coli-Zellen

5 mi einer Suspension von E. coli-Zellen in 0,9prozentiger Kochsalzlösung wird gemäß Beispiel 21 immobilisiert Nach dem Absetzen des Niederschlags wird eine 0,5-ml-Probe des Überstands entnommen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase in dieser Probe wird untersucht. Der Rest des Überstands wird ;ntfernt und das verbleibende feste Material in einem Gesamtvolumen von 10 ml Kochsalzlösung resuspendiert. Eine 0,05-ml-Probe davon wird entnommen und auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase untersucht, wobei die Probe mit Puffer auf ein Volumen von 2,0 ml aufgefüllt wird.

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird folgendermaßen bestimmt:

1 ml 1-m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,8 wird in einer Spektrophotometerzelle von 10 ml Schichtdicke mit 0,5 ml einer 0,04-m Lösung von p-Nitrophenylphosphat versetzt und im thermostatisierten Küvettenhalter eines Beckmann DB-G-Spektrophotometers auf 37° C erwärmt. Anschließend werden unter raschem Umrühren 0,5 ml der auf 37⁰C vorerwärmten Bakteriensuspension zugesetzt, und das Auftreten des freien p-Nitrophenolations wird direkt bei 420 nm verfolgt. Die Aktivität von einer Einheit der alkalischen Phosphatase entspricht der Freisetzung von 1 Mikromol p-Nitrophenol/ Stunde unter den angegebenen Testbedingungen.

Beispiel 23

Chelatbildung eines Peptid-Antibiotikums

mit verschiedenen Metalloxiden und
antibakterielle Aktivität der erhaltenen Chelate

2,0 η-Ammoniaklösung wird langsam zu 2,0-mI-Proben von Lösungen von Zirkontetrachlorid, Titantetrachiorid, Titantrichlorid, Vanaciintrichlorid und Zinndichlorid (jeweils 0,65 m in destilliertem Wasser, mit Ausnahme des Titantetrachlorids, das in 1 n-Salzsäure gelöst ist) unter Rühren zugesetzt, wobei die wasserhaltigen Oxide oder Hydroxide der genannten Metalle ausfallen. Es wird jeweils eine Probe vom pH-wert 5,0 und eine vom pH-Wert 7,0 gewonnen. Jede der 12 Proben wird mit 5,0 ml einer Lösung von Lathumycin (Antibiotikum, das vom Mikroorganismus Streptomyces lathumensis gebildet wird, Gist-Brocades N. V., Delft, Holland) in destilliertem Wasser (1,02 mg/ml) versetzt und mit destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 10 ml aufgefüllt. Nach 2stündigem Rühren bei 20⁰C werden die Gemische zentrifugiert. Sodann wird die

Extinktion der Überstände bei 350 nm gemessen. Zum Vergleich wird die Extinktion einer Kontrollprobe gemessen, die aus 5,0 ml Lathumycin-Lösung besteht, die mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt ist. Die Menge des gelierten Antibiotikums wird berechnet. Die Niederschläge werden dreimal mit je 5 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die Menge des durch diesen Waschvorgang entfernten Antibiotikums wird UV-spektroskopisch bestimmt. Auf diese Weise erhält man die Menge des mit den Oxiden eine Chelatbindung eingegangenen Lathumycins. Anschließend werden die Proben auf ihre antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen untersucht.

Tabelle XXVlI

Probe Nr. Metallion

pH-Wert der	Extinktion des	Cheliertes Lathu	Njch dem Waschen
Cl.clatbildung	Überstands	mycin	verbliebenes Lathu
			mycin
		mg	mg
7,11	0,22	4,8	4,0
5,08	0,51	4,4	2,5
7,09	1,33	3,2	0,4
5,09	1,43	3,0	0,7
5,06	2,82	1,1	0,6
7,07	0,49	4,4	2,4
4.91	1,02	3,6	2,6

1	Zr(IV)
2	Zr(IV)
3	Ti(IV)
4	Ti(IV)
5	Ti (III)
6	Ti (III)
7	V (III)
8	V (III)

23

lorlscl/Liiiü

Probe Nr.	Metallion	pH-Werl der	Extinktion des	Cheliertes Lathu-	Nach dem Waschen
		Chelatbildung	Überstands	mycin	verbliebenes Lathu-
					mycin
				mg	mg
9	Sn(II)	-	-	-	-
10	Sn(II)	5,03	0,17	4,8	3,9
11	Kontrolle	7,10	3,50	-	-
12	Kontrolle	5,02	3,55	-	-

Untersuchung der antibakteriellen Wirkung der Antibiptikum/Metalloxid-Chelate

Unter Verwendung gleicher Volumina der Proben und von doppelt starken Nähragar werden Suspensionen hergestellt. Die Vertiefungen von Agarplatten werden mit den Suspensionen der Antibiotikum/Metalloxid-Chelate versehen. Die Platten werden sodann mit den Mikroorganismen Escherichia coli, Streptococcus faecaiis, Staphylococcus pyogenes und Pseudomonas aeringinosa inoculiert. Lathumycin ist von diesen Mikroorganismen nur gegen S. faecaiis und S. pyogenes

Tabelle XXVIII

aktiv.

π In folgender Tabelle haben die Abkürzungen GUA, GUNA, Gi *und Dim die folgenden Bedeutungen:

GUA Wachstum bis zur Vertiefung und darüber 2» GUNA Wachstum bis zur Vertiefung, aber nicht

darüber
GI* Wachstum gehemmt bis χ mm von der

Vertiefung

Dim Wachstum über der Vertiefung vermin- >> dert

Probe

E. coli

S. faecaiis

S. pyogenes	Ps. aeringinosa
GI 5	GUA
GI 7	GUA
Dim	GUA
GI 7	GUA
GUA	GUA
GI 7	GUA
GI 5	GUA
GI 5	Dim
GUNA	GUA

10

11

12

GUA
GUA
GUA
GUA

GUA

GUA

GUA

Dim

GUA

GUA

GUNA GUNA Dim GUNA

GUA GI 3 GUNA GI 5 GUNA

GI 5

GI 7

GUA

Beispiel 24

pH-Optimum für die Chelatbildung von Lathumycin

mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon,

Zinn und Vanadin

Die wasserhaltigen Oxide der drei vorgenannten Metalle werden gemäß Beispiel 23 in einem pH-Bereich von 6,2 bis 7,7 ausgefällt. Die Proben werden jeweils mit

1,OmI einer Lösung von Lathumycin (1,02 mg/ml) ir destilliertem Wasser versetzt Anschließend wird mi destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen vor 10,0 ml aufgefüllt. Nach 2stündigem Rühren bei 26° C werden die Gemische zentrifugiert und die Menge de; chelierten Lathumycins wird gemäß Beispiel 2: bestimmt.

Tabelle XXIX	pH-Wert der Chelat	Extinktion	Prozent Chelat
Metallion	bildung		bildung
	6,22	0,08	88,5
Zr(IV)	6,88	0,07	89,9
Zr(IV)	7,65	0,10	85,7
Zr(IV)	6,14	0,12	83,6
Sn (II)	6.83	0,04	94,7
Sn (II)

	Fortsetzung	23 45	I-')	029	26
25	Metallion
			Prozent Chelat-
Sn(II)	pH-Wert der Chelat-	Extinktion	bildung
V (III)	bildung		84,9
V (III)	7,78	0,11	68,3
Kontrolle	6,31	0,22	87,0
Kontrolle	7,25	0,09	-
Kontrolle	7,16	0,73	-
Bei s ρ ie! 25	6,78	0,69	—
5,47	0,70	1.0 ml oder mit 5,0 ml der Lat
entweder mit

Chelatbildung von Lathumycin

mit wasserhaltigen Metalloxiden

bei verschiedenen Konzentrationen

Bei pH-Wert 7,0 gemäß Beispiel 4 gefällte wasserhal- -'< > tige Oxide von Zirkon(IV) und Zinn(II) werden

Tabelle XXX

sung gemäß Beispiel 23 versetzt und anschließend mit destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10,0 ml aufgefüllt. Nach 2stündigem Rühren bei 26° C werden die Proben zentrifugiert, und der Prozentsatz der Chelatbildung von Lathumycin wird berechnet.

Metallion

Lathumycinmenge

pH-Wert der Chelatbildung Extinktion

Prozent Chelatbildung

Zr (IV)
Zr(IV)
Sn (II)
Sn (II)
Kontrolle

5,0
1,0
5,0
1,0
1,0

6,87 6,88 7,26 6,83 7,16

0,32	91,2
0,07	89,9
0,34	90,7
0,04	94,7
0,73	-

Beispiel 26

Entfernung von Lathumycin aus den Chelaten

mit verschiedenen wasserhaltigen Metalloxiden durch Natriumhydrogencarbonat

Etwa 5 mg des Antibiotikums Lathumycin (cyclisches Peptid) werden gemäß Beispiel 23 bei pH-Wert 7,0 mit den wasserhaltigen Oxiden von Zirkon und Zinn(H) der Che'atbildung unterzogen, wobei die Menge der Chelate ebenfalls gemäß diesem Beispiel bestimmt wird. Die Niederschläge werden anschließend einmal mit 10 ml destilliertem Wasser und sodann zweimal mit je 10 ml 0,1-m Natriumhydrogencarbonatlösung von 26° C gewaschen. Die Menge des entfernten Antibiotikums wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt

Tabelle XXXI

Menge des chelierten Lathu- Zirkonoxid Zinn(II)-mycins oxid

mg 4,7 4,6

Waschen mit Wasser

pH-Wert 5,37 5,44

Extinktion 0,28 0,50

Menge 0,4 0,7

1. Waschen mit Hydrogencarbonat

pH-Wert 8,18 8,13

Extinktion 3,00 1,40

Menge 4,2 2,0

Menge	des	chelierten	Lathu-	Zirkonoxid	Zinn(II)-
mycins					oxid
mg				4,7	4,6

2. Waschen mit Hydrogencarbonat

pH-Wert	des	8,81	8,67
Extinktion	mg	0,42	0,84
Menge		0,6	1,2
Gesamtmenge	entfernten 4,7 ± 0,5	3,9
Lathumycins,
	Beispiel 27

Regeneration der Chelatbildungsfähigkeit

des Oxids nach Behandlung

von Lathumycin/Metalloxid-Chelat

mit Natriumhydrogencarbonatlösung

In zwei Proben werden jeweils 5 mg des Peptid-Antibiotikums Lathumycin gemäß Beispiel 23 mit wasserhaltigem Zirkonoxid der Chelatbildung unterzogen. Anschließend wird es gemäß Beispiel 26 durch Waschen mit Natriumhydrogencarbonat entfernt.

Eine der beiden Proben wird mit 0,2 n-Ammoniaklösung und 0,1 η-Salzsäure bis zum Erreichen des pH-Werts 7,0 versetzt Dazu werden 5,0 ml Lathumycin-Lösung (1,02 mg/ml) sowie destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10,0 ml gegeben.

Die andere Probe wird mit 2,0 ml 0,5 n-Salzsäure versetzt Die erhaltene Suspension wird 15 Minuten bei 26°C gerührt Sodann wird 2,0 η-Ammoniaklösung zur

Wiederausfällung von Zirkoniumionen in Lösung und zur Einstellung des pH-Werts auf 7,0 zugesetzt. Sodann werden 5,0 ml Lathumycin-Lösung und destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10,0 ml zugegeben.

Beide Proben werden sodann 2 Stunden bei 26° C gerührt, und der Prozentsatz der Chelatbildung des Antibiotikums wird gemäß Beispiel 23 berechnet.

Tabelle XXXII

Nicht behan- Mit Säure delte Probe behandelte Probe

Ursprünglich cheliertes	4,7	4,7
Lathumycin, mg
Durch Hydrogencarbonat	4,7 ± 0,5	4,7
entfernte Menge, mg
Zweite Chelatbildung
pH-Wert	7,05	7,11
Extinktion	3,50	0,57
Prozentsatz	0	83,5
Menge, mg	0	4,3

Beispiel 29

Die Extinktion einer Kontrollprobe bei pH-Wert 6,84 mit 0,102 mg/ml beträgt 0,70.

Beispiel 28

Bildung von Lathumycin-Chelat

aus einer mit Phosphat gepufferten Lösung

des Antibiotikums

75 g Zirkonchlorid werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird gerührt und tropfenweise bis zum Erreichen vom pH-Wert 7,0 mit 2,0 η-Ammoniaklösung versetzt. Sodann wird die Suspension bis zu einem Gesamtvolumen von 500 ml mit Wasser versetzt.

Ein Gemisch aus 10 ml der auf diese Weise erhaltenen Suspension von wasserhaltigem Zirkonoxid und 10 ml einer Lathumycin-Lösung (200 mg Lathumycin pro Liter), die mit 0,05-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gepuffert ist, wird bei 26° C 18 Stunden in einem Wasserbad geschüttelt. Eine 10-ml-Probe wird zentrifugiert. Die Konzentration des Lathumycins in der überstehenden Flüssigkeit wird durch Messen einer 2,5-ml-Probe, die mit 0,3 ml 1-m Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) vermischt wird, in einem Spektrophotometer gemessen. Der Niederschlag wird mit 0,1-m Natriumhydrogencarbonatlösung (Gesamtvolumen 10 ml) behandelt und 2 Stunden bei 26⁰C geschüttelt. Das im Überstand freigesetzte Lathumycin wird gemäß der vorstehenden Beschreibung nach dem Zentrifugieren gemessen.

Der Kontrollwert für Lathumycin wird auf die gleiche Weise unter Verwendung einer 1:1 mit Wasser verdünnten Lathumycin-Lösung erhalten.

Es werden die Spektren der Kontroilösung (1), der überstehenden Flüssigkeit nach der Chelatbildung (2) und der überstehenden Flüssigkeit nach der Behandlung mit Natriumhydrogencarbonat (3) gemessen. Aus den Spektren läßt sich berechnen, daß 73 Prozent des Lathumycins mit Zirkonhydroxid cheliert werden, und daß sich aus dem Chelat 92 Prozent des Antibiotikums durch Behandlung mit Hydrogencarbonat gewinnen lassen.

Chelatbildung von Lathumycin

mit einer sterilisierten Probe einer Suspension

von wasserhaltigem Zirkonoxid

Ein ähnlicher Versuch wie in Beispiel 28 wird durchgeführt, wobei die Suspension von Zirkonhydroxid vorher 30 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert ist. Die Spektren zeigen, daß 59 Prozent des Lathumycin mit κι dem hitzesterilisierten wasserhaltigen Zirkonoxid der Chelatbildung unterzogen sind, wobei 96 Prozent durch Behandlung mit Hydrogencarbonat gewonnen werden können.

i) B e i s ρ i e 1 30

Untersuchung der Wirkung von

Kohlendioxid auf die Adsorption von Lathumycin

an wasserhaltigem Zirkonoxid

>o Proben von Zirkonhydroxid wurden durch Zusatz einer 2,0 η Ammoniaklösung zu 2,0 ml einer Lösung von Zinntetrachlorid (15,3 Prozent Gew7Vol. in destilliertem Wasser) bis zum pH-Wert 7,0 hergestellt. Die Proben werden auf die nachstehend beschriebene Weise

2i behandelt. Die Wirkung dieser Behandlung auf die Adsorption von Lathumycin wird auf übliche Weise durch Extinktionsmessung bestimmt. Die verwendete Lösung von Lathumycin enthält 0,1005 g in 100 ml Fermentationsmedium.

1. Die Probe wird mit 5 ml Lathumycin-Lösung versetzt und mit Fermentationsmedium auf ein Gesamtvolumen von 20 ml gebracht. Anschließend wird das Gemisch 1 Stunde bei 26°C gerührt,

D wonach die Extinktion des Überstandes abgelesen

wird.

2. Die Probe wird mit 10 ml Fermentationsmedium versetzt, und Kohlendioxid wird 2 Stunden durch das Gemisch geperlt. Anschließend werden 5 ml Lathumycin-Lösung zugesetzt, und das Gemisch wird gemäß 1. behandelt.

3. Die Probe wird mit· 5 ml Lathumycin-Lösung versetzt und mit Fermentationsmedium auf ein Gesamtvolumen von 20 ml aufgefüllt. Sodann wird 2 Stunden Kohlendioxid durchgeperlt, und die Adsorption des Lathumycin wird bestimmt.

4. 5 ml Lathumycin-Lösung werden mit 10 ml Fermentationsmedium versetzt, und Kohlendioxid wird 2 Stunden durch die Lösung geperlt Anschließend wird die Lösung zum Zirkonhydroxid gegeben und gemäß 1. behandelt

5. Diese Probe wird gemäß 4. behandelt, mit der Ausnahme, daß 2 Stunden Sauerstoff durch die Lösung geperlt wird (mit einer ähnlichen Ge-

-,-> schwindigkeit wie das CO₂), bevor die Zugabe zum Zirkonhydroxid erfolgt

6. Diese Probe wird gemäß 5. behandelt, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert der Lösung mit 1 η Salzsäure auf 3,5 eingestellt wird, bevor der

to Sauerstoff durchgeperlt wird.

7. Diese Probe wird gemäß 6. behandelt wobei der pH-Wert auf 4,4 eingestellt wird.

8. Diese Probe wird gemäß 6. behandelt wobei der pH-Wert auf 4,9 eingestellt wird

b5 9. Diese Probe wird gemäß 6. behandelt, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert mit 1 η Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt wird, bevor Sauerstoff durchgeperlt wird und daß nach dem

Durchperlen der pH-Wert wieder auf 7,0 eingestellt wird.

10. Diese Probe wird gemäß Beispiel 25 behandelt mit der Ausnahme, daß nach dem D.irchperlen des Sauerstoffs der pH-Wert auf 7,0 eingestellt wird.

Ergebnisse

Kontrolle: 5 m! Lathumycin-Lösung + 15 ml Fermentationsmedium weisen bei 349 nm eine Extinktion von 1,70 auf.

Tabelle	XXXIII	% Adsorption des
Probe Nr	Extinktion 349 nm	Lathumycins
		86,5
1	0,23	11.2
2	1,51	17,7
3	1,40	35,2
4	1,10	52,4
5	0,81	84,7
6	0,26	88,0
7	0,24	87,0
8	0,22	27,6
9	1,23	54,7
10	0,77

Beispiel 31

Elution von Lathumycin aus wasserhaltigem
Zirkonoxid durch verschiedene Lösungen

Proben von Zirkonoxid (pH-Wert 7,0, Standardmenge) werden hergestellt und mit 2,0 ml Lathumycin-Lösung (0,1 mg/ml) und mit destilliertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10,0 ml versetzt. Die Gemische werden anschließend 2 Stunden bei 22° C gerührt und zentrifugiert. Die Überstände werden entfernt und die Menge des adsorbierten Lanthumycins berechnet. Die Rückstände werden mit den nachstehend angegebenen Pufferlösungen und anderen Lösungen bis zu einem Gesamtvolumen von 10,0 ml versetzt. Diese Gemische werden 1 Stunde bei 22° C gerührt und zentrifugiert. Sodann werden die Extinktionen abgelesen und die Mengen des entfernten Lathumycins berechnet.

Tabelle XXXIV

Elutionsmittel

Adsorbierte Menge Lathumycinkonzen- Entfernte Menge*) tration des Eluats

mg/ml

1.	Glycin 1,0 m	1,78	0,107	0,86	1,07
2.	Na-mo!ybdat 1,0 m	1,76	0,159	1,27	1,59
3.	K-fluorid 1,0 m	1,77	0,182	1,46	1,82
4.	Di-Na-H-phosphat 0,5 m	1,76	0,182	1,46	1,82
5.	Phosphatpuffer 0,1 m pH 7,0	1,77	0,184	1,47	1,84
6.	Phosphatpuffer 0,1 m pH 7,4	1,77	0,200	1.60	2,00
7.	Phosphat/Citrat 0,1 m pH 5,0	1,77	0,193	1,54	1,93
8.	Phosphatpuffer 0,05 m pH 7,6	1,77	0,145	1,16	1,45
9.	Tris-Puffer 1,0 m pH 8,8	1,77	0,190	1,52	1,90
*)A	= Eluatkonzentration X 8
B	= Eluatkonzentration X 10

Beispiel 32

Adsorption des Lathumycins an
getrocknetem wasserhaltigen Zirkonoxid

Auf übliche Weise werden zwei Proben von Zirkonhydroxid (pH-Wert 7,0, Standardmenge) hergestellt Eine Probe wird in einem Vakuumexsiccator bei Raumtemperatur getrocknet, während die andere gefriergetrocknet wird. Nach dem Pulverisieren der Produkte werden 2,0 ml Lathumycin-Lösung (1,0 mg/ml) und destilliertes Wasser bis zu einem bo Gesamtvolumen von 10,0 ml zugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei 22° C werden die Proben zentrifugiert. Die Extinktionen der Überstände werden bestimmt und daraus die Aufnahme an Antibiotikum berechnet.

b5 Lathumycin-Aufnahme

an vakuumgetrocknetem Oxid 11 Prozent

Lathumycin-Aufnahme

an gefriergetrocknetem Oxid 17 Prozent.

Beispiel 33 Herstellung von einigen Antibiotikum-Zirkonoxid-Komplexen

und Untersuchung ihrer antibakteriellen Wirkung

Proben von Zirkonoxid (pH-Wert 7,0, Standardmenge} werden mit Lösungen verschiedener Antibiotika (jeweils 1,0 mg/ml) versetzt, und die Gemische werden 2

Tabelle XXXV

Stunden bei 22° C gerührt Anschließend werden sie zentrifugiert Nach dem Entfernen der Überstände werden die festen Materialien dreimal mit je 100 ml Wasser gewaschen. Sodann-wird in 3,0 ml Wasser resuspendiert und die antibakterielie Aktivität durch einfachen Lochtest an Agarplatten untersucht Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.

Probe

Escherichia coli

Streptococcus faecalis Staphylococcus pyogenes Pseudomonas
aeruginosa

Neomycin	GUNA	GUNA	GUNA	GUA
Polymyxin	GI 2	GUNA	GUNA	GUNA
Streptomycin	GI 8	GUNA	GI 7	GUA
Ampicillin	GUA	GUNA	GUNA	GUA
Chloramphenicol	GI 11	GI 5	GI 5	GUA
Penicillin	GUA	GUNA	Dim	Dim

GUA Wachstum bis zur Vertiefung und darüber.

GUNA Wachstum bis zur Vertiefung, aber nicht darüber.

GIx Wachstum gehemmt bis χ mm von der Vertiefung.

Dim Wachstum über der Vertiefung vermindert.

Beispiel 34

Unlöslichmachen von Aminosäuren an wasserhaltigem Zirkonoxid

1,3 m Lösungen von Lysin und Glutaminsäure werden hergestellt und mit 2,0 m Natriumhydroxidlösung auf den pKWert 7,0 eingestellt. Verschiedene Mengen dieser Lösungen werden zu Proben von wasserhaltigem Zirkonoxid (etwa 4 ml) gegeben, die durch Zusatz von 2,0 m Ammoniaklösung zu jeweils 2,0 ml (0,65 m) Zirkontetrachloridlösungen bis zum pH-Wert 7,0 auf übliche Weise hergestellt werden. Man erhält Proben mit einem Verhältnis von Aminosäure zu Zirkonoxid von 6:1 bis 0,2:1. Das Gesamtvolumen wird durch Zusatz von destilliertem Wasser auf 10,0 ml gebracht Anschließend werden die Proben 2 Stunden bei 22° C gerührt Sodann wird zentrifugiert, und die Überstände werden entfernt. Die Mengen des adsorbierten Lysins bzw. der Glutaminsäure werden durch spektrophotometrische Messung des Überstandes bei 280 ηπ bestimmt Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.

Tabelle XXXVI	Adsorbierte Glut	Adsorbierte
Molverhältnis	aminsäuremenge	Lysinmenge
Aminosäure: ZrOa	38	62,1
6	71	64,6
3	78	70,1
2	85	74,0
1	>85	80,2
0,5	>85	81,7
0,2

B e i s ρ i e 1 35

Unlöslichmachcn von Dextranase an wasserhaltigem Zirkonoxid und an Zirkonoxid/Lysin

Zwei Proben von Zirkonoxid werden auf übliche Weise hergestellt (Standardmenge, pH-Wert 7,0). Eine der Proben wird mit 3,0 ml (13 m) Lysin versetzt und mit destilliertem Wasser auf 10,0 ml aufgefüllt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 22° C gerührt, zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Beide Proben werden sodann mit 2,5 ml Dextranase-Lösung (2 mg/m!) versetzt. Die Gemische werden sodann 2 Stunden bei 4° C gerührt Anschließend wird zentrifugiert, die Überstände werden entfernt, und die Proben dreimal mit je 5,0 ml destilliertem Wasser gewaschen.

Bei beiden unlöslichen Proben bleibt ein beträchtlicher Teil der Aktivität des löslichen Enzyms erhalten Für das an Zirkonoxid allein gebundene Enzym beträgt der Wert 61 Prozent und für das an Zirkonoxid/Lysir gebundene Enzym beträgt er 85. Prozent (im Maximum pH-Wert etwa 5,0).

030 130/141

Claims (16)

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliche Chelate von stickstoffhaltigen Proteinen, Enzymen, Peptiden, Lectinen, Antikörpern, Coenzymen, Antibiotika und ganzen Zellen mit wasserhaltigen Oxiden von Zirkon, Zinn, Vanadin oder Titan.

2. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das wasserhaltige Oxid von Zr(IV), Sn(II), V(III), Ti(IV) oder Ti(IIl) ableitet

3. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das stickstoffhaltige Enzym Glucose-Oxidase, Glucose-Isomerase, Lactase, Catalase, κ- oder /J-Amylase, Pullulanase, Penicillin-Acylase, bakterielle Protease, Trypsin, Chymotrypsin, Glucoamylase, Dextranase oder Glucosidase ist

4. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch I bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das stickstoffhaltige Lectin Concanavalin ist

5. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das stickstoffhaltige Coenzym Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid ist.

6. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das stickstoffhaltige Antibiotikum Penicillin, Gramicidin D, Lathumycin, Neomycin, Polymyxin, Streptomycin, Ampicillin jo oder Chloramphenicol ist.

7. Wasserunlösliche Chelate nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ganzen Zellen Bäckerhefe oder Escherichia coli sind.

8. Verfahren zur Herstellung der wasserunlösli- i^r> chen Chelate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein stickstoffhaltiges Protein, Enzym, Peptid, Lectin, Antikörper, Coenzym, Antibiotikum oder ganze Zellen mit mindestens einem wasserhaltigen Oxid von Zirkon, Zinn, 4» Vanadin oder Titan in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines festen Metallchelats vermischt und gegebenenfalls das feste Chelat aus dem wäßrigen Medium abtrennt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wasserhaltiges Oxid verwendet, das hergestellt wurde durch Zusatz einer Base zu einer wäßrigen, das Metallsalz bzw. ein Metallsalzgemisch enthaltenden Lösung bis zu einem pH-Wert von 3 bis 8,5.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserhaltige Oxide verwendet, die durch Zusatz von Ammoniak oder Natriumhydroxid als Bau: aus den entsprechenden Metallsalzen hergestellt worden sind.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserhaltige Oxide verwendet, die bei einem pH-Wert von 6 bis 8 hergestellt worden sind.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn- bo zeichnet, daß man das Chelat durch in situ-Copräcipitation des wasserhaltigen Oxids in einem wäßrigen Medium, das das stickstoffhaltige Protein, Enzym, Peptid, Lectin, Antikörper, Coenzym, Antibiotikum oder die ganzen Zellen und das Metallsalz enthält, durch Zusatz einer Base herstellt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Base Ammoniak oder

Natriumhydroxid verwendet

14. Verfahren nach Anspruch 8, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chelatbildung bei Raumtemperatur und einem pH-Wert des Reaktionsmediums, in dem das Chelat gebildet wird, von 4 bis 8, vorzugsweise 6 bis 8, durchführt

15. Verwendung der wasserunlöslichen Chelate nach Anspruch 1 bis 7 in Enzyrnreaktoren für technische oder analytische Zwecke oder zur Affinitätschromatographie.

16. Ausführungsform nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das aus dem wäßrigen Medium abgetrennte Chelatl mit einer wäßrigen Hydrogencarbonat- oder Cairbonatlösung oder mit einer schwachen verdünnten Säure behandelt