WO2003022047A1 - Verfahren zur konservierung von für die transplantation vorgesehenen organen und geweben - Google Patents

Verfahren zur konservierung von für die transplantation vorgesehenen organen und geweben Download PDF

Info

Publication number
WO2003022047A1
WO2003022047A1 PCT/DE2002/003329 DE0203329W WO03022047A1 WO 2003022047 A1 WO2003022047 A1 WO 2003022047A1 DE 0203329 W DE0203329 W DE 0203329W WO 03022047 A1 WO03022047 A1 WO 03022047A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
perfusion
transplantation
hyaluronate lyase
tissue
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/DE2002/003329
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter-Jürgen Müller
Albert Härtl
Jörg-Hermann Ozegowski
Norbert Presselt
Original Assignee
Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V., Friedrich-Schiller-Universität Jena filed Critical Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Publication of WO2003022047A1 publication Critical patent/WO2003022047A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Definitions

  • the field of application of the present invention is transplantation medicine and preventive measures or preconditioning, by means of which pathomechanisms are restricted which reduce the functionality of the transplanted organs.
  • the invention relates to a special preservation of the tissues intended for a transplantation, in particular organs such as the heart, liver, lungs and Pancreas.
  • the frequency of primary organ failure (5-15%) or organ dysfunction (approx. 30%) as well as other clinically relevant complications after transplantation is mainly due to the so-called ischemia-reperfusion damage (IRS). These endanger the success of surgical and internal interventions.
  • IFS ischemia-reperfusion damage
  • the organs and tissues intended for the transplant often show high interstitial pressure, which in turn can lead to circulatory disturbance of the transplant after successful transplantation. These circulatory disorders can lead to cell necrosis and ultimately to organ rejection.
  • the grafts are either kept refrigerated or perfused with special preservation solutions. Chilled storage of the grafts is generally less favorable than perfusion.
  • hyaluronidase Treatment of the isolated organs with hyaluronidase using commercially available preservation solutions (Rao et al. 1996, Hyaluronate level in donor organ washout effluents: a simple and predictive parameter of graft viability. Liver 16, 48 - 54 and Fischer JH, Jeschkeit S. Minimal amounts of hyaluronidase in HTK or UW solution substantially improve the recovery of preserved hearts.Transpl Int. 1996; 9 Suppl LS442-6) showed that the grafts showed a significantly better ingrowth tendency after treatment with hyaluronidase.
  • the enzyme hyaluronidase used is obtained from animal tissue, for example from cattle or sheep testicles.
  • glucosaminoglycan-cleaving activity is primarily characterized by the property of hydrolyzing hyaluronic acid.
  • hyaluronic acid chondroitin sulfate, dermatan sulfate and heparan sulfate
  • the glucosaminoglycans belong to the tissues of all vertebrates.
  • Hyaluronic acid has the property of forming water with a more viscous, bind hydrocolloid solutions or form poorly soluble polyelectrolyte complexes with basic proteins. It * consists of glucuronic acid and acetylated glucosamine, which are connected by ß- (l-3) -glycosidic bonds. These disaccharide units are in turn connected to one another by glycosidic ⁇ - (1-4) bonds.
  • hyaluronidases does not correctly describe three different types of hyaluronic acid-splitting enzymes (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluronidases. J. Biol. Chem. 236, pp. 333-339, 1961). It is the endohydrolases that hydrolytically cleave the ⁇ - (1-4) bonds. They include the majority of hyaluronidases from higher organisms, for example hyaluronidase from bovine testicles.
  • hyaluronate glycan hydrolases hyaluronoglucosan inidases / EC 3.2.1.35
  • Perfusion of transplants with a solution which contained low-molecular breakdown products of hyaluronic acid produced with this type of enzyme showed an effect which promotes the survival of experimentally transplanted liver and kidney (Kno Flach et. Al., 1999. nmunomodulatory functions of hyaluronate in the Lew- to-F344 model of chronic cardiac allograft rejection. Transplantation 1999, 67, 909).
  • Hyaluronate lyases are often of microbial origin. For example, they are found in Streptomycetes and other bacteria. Their common characteristic is their high specificity towards hyaluronic acid.
  • glucosaminoglycans are usually split to a negligible extent (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. Zbl Bakt 280, S.497-506, 1994 / Ohya T, Kaneko Y: Novel hyaluronidase from Streptomyces. Biochim Biophys Acta 198, pp.
  • hyaluronidases of animal origin especially bovine testicular hyaluronidase
  • reduce the damage caused by a heart attack Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and hyaluronidase - a coded, placebo-controlled animal study.
  • CCS 2210 calcium dobesilate
  • Bovine testicular hyaluronidase has a beneficial effect on collateral blood flow to ischemic tissue (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al .: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, S. 566-571, 1977 / Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al .: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion i ⁇ jury.
  • Electromechanical characteristics of the myocardium are disturbed due to the loss of contact between muscle cells (reentry phenomena), and tachycardias up to and including carnineal fever arise. Furthermore, edema causes increased extracellular pressure and disrupts the microcirculation of the myocardium due to an altered heart wall compliance.
  • bovine testicular hyaluronidase limits the cellular damage during myocardial ischemia (Waidenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al .: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin luvest 88, pp. 1622-1628, 1991).
  • Presselt et al. propose the treatment of atheromatous vascular diseases of humans and animals with hyaluronate lyase of microbial origin.
  • Injection products for intravenous and intraarterial applications are used for the treatment of cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarcts, cerebral thromboses, coronary arthromboses and cardiac infarcts.
  • the enzyme counteracts or dissolves atheromatous plaques.
  • Gottlieb (US 3,708,575) suggests treating human vascular diseases such as cardiac arrhythmias, thromboses, cardiac and cerebral infarcts with hyaluronidase from animal testicles (molecular weight 120,000 D) in high doses of 20,000 to 1,000,000 IU per injection.
  • An isotonic sterile solution for example 10,000 IU / ml, is injected intravenously, intraarterially or intrathecally.
  • the enzyme was obtained from bovine testicles.
  • the bovine testicular hyaluronidase is mistakenly listed as glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase, although the description of the invention clearly shows that it is an enzyme from bovine testicles.
  • a hyaluronidase with the cleavage specificity of a lyase is not detectable in animal testicles.
  • the description of the invention shows that the enzyme is clearly the use of a hyaluronidase from animal testicles.
  • Esterase activity attributed to the enzyme also indicates a hyaluronidase and not a hyaluronate lyase.
  • the method used to measure the specific activity also relates to a regulation for the determination of hyaluronidases.
  • testicular hyaluronidases are limited due to the relatively low and very quickly diminishing effect after multiple use and due to the increasing risk of transmission of infectious material.
  • cleaning of the hyaluronidases from tissue macerates with a naturally high proportion of foreign proteins and lipoid compounds requires a high level of cleaning effort.
  • the relatively low activity of hyaluronidase from bovine tests is due to the pronounced inhibition of the enzyme by sulfated glucosaminoglycans, such as heparin or heparin-like glucosaminoglycans, which are present in the extracellular matrix of mammals.
  • the aim of the invention is to find a special extracorporeal treatment of grafts after removal or before the transplant (isolated graft), by means of which a complication-free or successful transplant is promoted.
  • This measure should be used in addition or together with the conventional preservation measures.
  • the invention is based on the object of finding an active ingredient for preservation which does not have the disadvantages mentioned of testicular hyaluronidase or hyaluronidases of animal origin and, moreover, can be easily produced in sufficient quantities. Due to its non-animal origin, the active ingredient should not pose any risk of possible infections.
  • microbial hyaluronate lyases or their enzymatically active fragments which, according to their cleavage mechanism, are assigned to the enzyme classification number EC 4.2.2.1, in particular those caused by the microorganism of the genus Streptococcus, preferably of the species Streptococcus agalactiae and especially from Streptococcus equisimilis
  • the hyaluronate lyases excreted in the culture fluid lead, among other things, to an intensive reduction in the interstitial pressure and a rapid restoration of the function of the transplant after the transplantation has been carried out.
  • the invention accordingly relates to a method for preserving animal and human tissues intended for transplantation, which is characterized in that said tissues are treated extracorporeally with solutions containing microbial hyaluronate lyase or an enzymatically active fragment thereof.
  • the enzymatic active ingredient cleaves hyaluronic acid after one
  • Elimination mechanism with the formation of unsaturated fission products the hyaluronic acid uronides.
  • hyaluronidases of animal origin E.C. 3.2.1.35/36 cleave the hyaluronic acid hydrolytically when water is added to form saturated cleavage products.
  • the hyaluronate lyases also differ from animal hyaluronidases by the amino acid sequences and the isoelectric points (P).
  • the promoting effect of the preservation according to the invention can be assumed to be caused by a combination of specific effects of hyaluronate lyase.
  • the improved lymph drainage as well as an improved immune status of the transplanted organs or tissues leads to a reduction in interstitial edema and prevention of occlusion or collapse of the lymphatic vessels.
  • the lymph flow in the ischemic tissue is maintained and the development of necrosis and scarring is inhibited.
  • the breakdown of thicker layers of swollen hyaluronic acid promotes the growing together of the organ or Tissue interfaces.
  • the hyalurate lyase may also influence the binding activity of the CD44 and Rhamm receptors in the blood, lymph and especially the immune cells via their specific cleavage products, the unsaturated hyaluronic acid uronides, so that the risk of rejection may be reduced.
  • hyaluronic acid cleavage products formed under the action of hyaluronate lyase, the unsaturated hyaluronic acid neuronides also have an intense angiogenic and radical-trapping effect.
  • hyaluronate lyase contains as an injection preparation, for example, an isotonic aqueous solution of a highly purified microbial hyaluronate lyase with concentrations between 10 and 250,000 IU / ml and auxiliaries customary in injection preparations.
  • the enzyme protein of hyaluronate lyase is advantageously used in the form of a storage-stable solid which generally contains stabilizing additives, for example filled into glass ampoules.
  • stabilizing additives for example filled into glass ampoules.
  • the use of freeze-dried active ingredient is particularly advantageous.
  • Sodium chloride, glucose, magnesium salts, polyvinylpyrrolidine, amino acids, albumins and their hydrolyzates or gelatin and their hydrolysates can be used as stabilizing additives, for example.
  • the enzyme activity of an ampoule after filling with physiological saline is between 10 and 250,000 IU / ml. Injections are used on smaller organs that are difficult to achieve perfusion.
  • Other formulations that can be used according to the invention are e.g. Perfusion solutions. As a rule, they contain only about 25% of the enzyme activities of the injection preparation.
  • the perfusion solution usually also contains salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium and potassium phosphates, sodium bicarbonate, magnesium salts, glucose, sodium pyruvate and complex-forming substances.
  • Perfusion can take place through the existing vascular connections or, in the case of larger organs, using a catheter. Perfusion is preferred for larger organs such as the heart or liver.
  • the transplants are immersed or rinsed in a solution which has hyaluronate lyase activity for a few minutes to several hours.
  • the rinsing or immersion solutions usually contain the same components as the perfusion solutions.
  • Rinses or dips are used in tissues, e.g. B. skin grafts, applied or in smaller organs often in connection with an injection.
  • the preservation takes place at temperatures of the transplant between about 1 ° C and the normal body temperature. In the case of the preservation according to the invention and also in the case of a combination of conventional and inventive preservation, temperatures of approximately 4 ° C. are preferred. However, a more intensive effect is achieved at higher temperatures. The effect can be clearly seen from the decrease in tissue tension.
  • the active substance according to the invention is explained using the example of the enzyme from the generally accessible Streptococcus agalactiae, produced by biotechnical fermentation.
  • the purification processes listed below obtain the hyaluronate lyase as a highly purified enzyme for injection purposes or convert the purified hyaluronate lyase into a fragment with hyaluronate lyase activity using a protease which acts specifically.
  • the composition of the basal perfusion solution is: NaCl 118 mmol 1, KC1 4.7 mmol / 1, CaCl 2 2.5 mmol / 1, NaHPO 4 1.2 mmol / 1, NaHCO 3 24.9 mmol / 1, MgSO 4 1 , 6 mmol 1, glucose 5.5 mmol / 1, Na pyruvate 2.0 mmol / 1 and Na 2 EDTA 0.5 mmol / 1.
  • the hyaluronate lyase solution used is prepared as follows: An ampoule of hyaluronate lyase corresponding to 200,000 IU is dissolved in ice-cold distilled water (1 ml) and perfusion solution (4 ml) and immediately added to 1995 ml tempered and gassed perfusion solution, so that the concentration is 100 IU / ml , With this solution, the heart is perfused either before or after global ischemia. After the hearts have been removed, they are clamped in the perfusion apparatus and perfused for 15 min with a basal perfusion solution until stable action potentials are reached. The retransplation then takes place. The same procedure is used for hearts that have been perfused with a hyaluronate lyase-free perfusion solution. The interstitial pressure is measured with a pressure probe.
  • One rat heart is preserved by storing for 18 hours at temperatures from 0 ° to 1 ° C for 24 hours in a commercially available UW solution as well as in EuroFlush-Glutathione (EFG) solution in which 2000 IU / 1 hyaluronate lyase are dissolved.
  • EFG EuroFlush-Glutathione
  • a rat heart in UW solution and EFG solution without * hyaluronate lyase is preserved in the same way.
  • the edema formation in the frozen section is examined microscopically.
  • the edema formation during reperfusion is greatly reduced.
  • the coronary blood flow and the function of the implant reach approximately normal values within 5 days.
  • rat kidneys are stored between 0 - 4 degrees 5 hours after cooling without further manipulation or perfused with a pump at a constant 4 - 10 degrees with WU solution.
  • the UW solution contains 10,000 IU / 1 hyaluronate lyase.
  • the kidneys perfused with hyaluronate lyase take on early organ function, while the organ stored cold and the organ perfused without hyaluronate lyase show poor functional values even after several days after reperfusion.
  • rat liver Two rat liver are removed, with the portal vein and hepatic artery being pinched off.
  • UW solution at temperatures between 4 and 8 ° C, which in one case contains 4000 IU / 1 hyaluronate lyase, the organs are treated for 5 hours and then transferred to the bloodstream of host animals.
  • the organ perfused with hyaluronate lyase completely takes up its function within two days after transplantation, while the animal to which the organ not perfused with hyaluronate lyase did not survive.
  • One rat heart is preserved by storing for 8 hours at temperatures from 0 ° to 1 ° C for 24 hours in a commercially available UW solution.
  • 0.2 ml of a solution containing 100 IU / ml hyaluronate lyase is injected into a rat heart at three different locations. After reperfusion with the blood of host rats, the edema formation in the freezing cut is examined microscopically. Heart treated with hyaluronate lyase greatly reduces edema formation during reperfusion.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Für die Transplantation vorgesehene Organe oder Gewebe, beispielsweise von Herz, Leber oder Haut, besitzen häufig einen hohen interstitiellen Druck, der nach Transplantation die Mikroblutzirkulation des Transplantates stört und so zu ischämischen Zerstörungen, Nekrosen und als Spätfolge zu Narbenbildung bzw. einem negativen Behandlungsergebnis führen kann. Weitere, mehr oder weniger unbekannte Ursachen stören zusätzlich das Einwachsen von Transplantaten. Erfindungsgemäss wird durch eine Behandlung des Transplantats vor der Transplantation mit dem mikrobiellen Enzym Hyaluronatlyase bzw. einem aus diesem Enzym hergestellten aktiven Fragment der interstitiellen Druck wirksam abgesenkt. Durch das neue Konservierungverfahren wird eine komplikationsarme, erfolgreiche Transplantation gefördert.

Description

Verfahren zur Konservierung von für die Transplantation vorgesehenen Organen und Geweben
Das Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Transplantationsmedizin und präventive Maßnahmen bzw. Präkonditionierung, durch die Pathomechanismen eingeschränkt werden, welche die Funktionsfähigkeit der transplantierten Organe verringern Die Erfindung betrifft eine spezielle Konservierung der für eine Transplantation vorgesehenen Gewebe, insbesondere Organe wie Herz, Leber, Lunge und Bauchspeicheldrüse.
Die Häufigkeit von primärem Organversagen (5-15%) bzw. Organdysfunktion (ca. 30%) wie auch anderer klinisch relevanter Komplikationen nach Transplantation ist überwiegend durch die sogenannten Ischämie-Reperfüsionsschäden (IRS) bedingt. Diese gefährden den Erfolg chirurgischer und internistischer Eingriffe. Trotz etablierter Konservierungsverfahren zeigen die für die Transplantation vorgesehenen Organe und Gewebe häufig einen hohen interstitiellen Druck, der seinerseits nach erfolgreicher Transplantation zu Zirkulationsstörung des Transplantates führen kann. Diese Zirkulationsstörungen können sekundär zu Zellnekrosen und letzten Endes auch zur Organabstoßung führen. Hinzu kommen weitere Ursachen, die die Akzeptanz des Transplantates beeinflussen, insbesondere auch die immunologische Fragestellung. In der Praxis werden die Transplantate nach Entnahme aus dem entweder gekühlt aufbewahrt oder mit speziellen Konservierungslösungen perfundiert. Die gekühlte Auftewahrung der Transplantate ist aber generell ungünstiger als die Perfusion. Der Apparateaufwand und die Perfusionslösungen sind jedoch kostenintensiv. Handelsübliche Perfusionslösungen sind das glucosefreie Eurocollin, die relativ viskose UW (University of Wisconsin solution)-Lösung, welche sehr häufig für Leber-, Nieren- und Pankreastransplantationen eingesetzt wird. HTK und Celsior werden für für die Konservierung von Herzen eingesetzt (Muhlbacher F, Langer F, Mittermayer C. Preservation Solutions for transplantation.Transpl. Int. 1996, 442-446).
Bekannt ist, daß die Perfusion von Wirtstieren nach der Transplantation mit dem Enzym Hyaluronidase den interstitiellen Druck erniedrigt. (Johnsson, et al. 1999. Hyaluronidase ameliorates rejection-induced edema. Transplant Int. 1999; 12, 235, Johnsson et al. 2000, Monitoring of intragraft pressure of rejecting organs. Transplantation 70, 1575 -1580, Johnsson C, Hallgren R, Lindbom LO, Tufveson G. Edema treatment during cardiac allograft rejectionJ Heart Lung Transplant 1999 18, 1238-1242)
Auch die Behandlung der isolierten Organe mit Hyaluronidase unter Verwendung handelsüblicher Konservierungslösungen (Rao et al. 1996, Hyaluronate level in donor organ washout effluents: a simple and predictive parameter of graft viability. Liver 16, 48 - 54 und Fischer JH, Jeschkeit S. Minimal amounts of hyaluronidase in HTK or UW solution substantially improve the recovery of preserved hearts.Transpl Int. 1996;9 Suppl LS442-6) ergaben, dass die Transplantate nach der Behandlung mit Hyaluronidase eine signifikant bessere Einwachstendenz aufweisen. Das dabei eingesetzte Enzym Hyaluronidase wird aus tierischem Gewebe, beispielsweise aus Rinder- oder Schafshoden gewonnen. Es besitzt glukosaminoglykanspaltende Aktivität und ist vor allem durch die Eigenschaft charakterisiert, Hyaluronsäure zu hydrolysieren. Zu den Glukosaminoglykanen gehören neben der Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat, diese kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokolloider Lösungen zu binden oder mit basischen Proteinen schwerlösliche Polyelektrolytkomplexe zu bilden. Sie * besteht aus Glukuronsäure und azetyliertem Glukosamin, die durch ß-(l-3)-glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische ß-(l-4)-Bindungen verbunden.
Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht korrekt drei unterschiedlich wirkende Typen hyaluronsäurespaltender Enzyme (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluronidases. J. Biol. Chem. 236, S.333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, die die ß-(l-4)- Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese Hyaluronat-Glycanhydrolasen (Hyaluronoglucosan inidasen / E.C. 3.2.1.35) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glukosaminoglykane. Die Perfusion von Transplantaten mit einer Lösung, welche mit diesem Enzymtyp hergestellte niedermolekulare Abbauprodukte der Hyaluronsäure enthielt, zeigte einen für das Überleben von experimentell transplantierter Leber und Niere fördernden Effekt (Kno flach et. al., 1999. nmunomodulatory functions of hyaluronate in the Lew-to-F344 model of chronic cardiac allograft rejection. Transplantation 1999, 67, 909). Einen weiteren Typ stellt die Endo-ß-Hyaluronoglucuronidase (E.C. 3.2.1.36) aus dem Blutegel dar, welche die ß-(l-3)-Bindung hochspezifisch spaltet. Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1.), spaltet Hyaluronsäure in der ß-(l-4)-Bindung nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glukuronsäure. Es enstehen die sogenannten Hyaluronsäureuronide. Hyaluronatlyasen sind häufig mikrobieller Herkunft. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre hohe Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glukosaminoglykane werden in der Regel in einem vernachlässigbaren Ausmaß gespalten (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. Zbl Bakt 280, S.497-506, 1994 / Ohya T, Kaneko Y: Novel hyaluronidase from Streptomyces. Biochim Biophys Acta 198, S.607-609, 1970 / Gase K, Ozegowski JH, Malke H: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase - completion of the sequence and expression analysis. Biochim Biophys Acta 1398(1), S.86-98, 1998). Allgemein ist bekannt, dass Hyaluronidasen tierischer Herkunft, speziell die bovine testikuläre Hyaluronidase, den Schaden reduzieren, der durch einen Herzinfarkt entsteht (Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and hyaluronidase - a coded, placebo- controlled animal study. J Cardiovasc Pharmacol 16, S.286-291, 1990). Hyaluronidase aus Rinderhoden hat einen förderlichen Effekt auf den kollateralen Blutfluß in das ischämische Gewebe (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al.: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, S.566-571, 1977 / Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al.: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia- reperfusion iηjury. J Surg Res 58, S.205-210, 1995). Es wird vermutet, daß eine Behandlung mit Hyaluronidase tierischer Herkunft die postischämische Genesung der Herzfunktion durch eine Vergrößerung des Herz-Lymph- Volumens verbessert (Yotsumoto G, Moriyama Y, Yamaoka A et al.: Experimental study of cardiac lymph dynamics and edema formation in ischemia/reperfusion injury — with reference to the effect of hyaluronidase. Angiology 49, S.299-305, 1998). Durch die Fähigkeit der Hyaluronsäure, Wasser zu binden, trägt ihre interstitielle Akkumulation zum interstitiellen Ödem im infarzierten Herzmuskelgewebe bei. Interstitielle Ödeme beeinflussen wahrscheinlich auch die Funktionen der
Transplantate. So werden elektromechanische Charakteristiken des Myokards aufgrund des Kontaktverlustes zwischen Muskelzellen (Reentry-Phänomene) gestört und es entstehen Tachykardien bis hin zum Karninerflirnmern. Desweiteren verursachen Ödeme erhöhten extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Myokards durch eine veränderte Herzwand-Compliance.
Durch Abbau der Hyaluronsäure begrenzt bovine testikuläre Hyaluronidase den zellulären Schaden während der myokardialen Ischämie (Waidenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al.: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin luvest 88, S.1622-1628, 1991).
Presselt et al. (WO 00/39290) schlagen die Behandlung atheromatöser Gefäßkrankheiten von Mensch und Tier mit Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft vor. Injektionspräparate für intravenöse und intraarterielle Applikationen werden für die Behandlung von Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebralen Infarkten, zerebralen Thrombosen, Koronartlrrombosen und kardialen Infarkten eingesetzt. Das Enzym wirkt der Entstehung atheromatöser Plaques entgegen bzw. löst diese auf.
Gottlieb (US 3,708,575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herzarrhythmien, Thrombosen, kardiale und zerebrale Infarkte mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU pro Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathekal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird die bovine testikuläre Hyaluronidase als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfϊndungsbescl reibung eindeutig hervorgeht, daß es sich um ein Enzym aus Rinderhoden handelt. Eine Hyaluronidase mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Aus der Erfindungsbeschreibung geht hervor, daß es sich bei dem Enzym eindeutig um die Anwendung einer Hyaluronidase aus Tierhoden handelt. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase und nicht auf eine Hyaluronatlyase hin. Auch bezieht sich die angewendete Methode zur Messung der spezifischen Aktivität auf eine Vorschrift zur Bestimmung von Hyaluronidasen.
Der Einsatz testikulärer Hyaluronidasen ist aus Gründen der relativ geringen und bei mehrfacher Anwendung sehr schnell nachlassenden Wirkung sowie aufgrund der zunehmenden Gefahr der Übertragung von infektiösem Material eingeschränkt. Darüber hinaus erfordert die Reinigung der Hyaluronidasen aus Gewebemazeraten mit einem naturgemäß hohen Anteil an Fremdproteinen und lipoiden Verbindungen einen hohen Reinigungsaufwand. Es gibt außerdem Hinweise, daß die relativ geringe Wirkung der Hyaluronidase aus Rindertestes auf die ausgeprägte Inhibition des Enzyms durch sulfatierte Glukosaminoglykane, wie Heparin oder heparinähnliche Glukosaminoglykane, die in der extrazellulären Matrix von Säugern vorhanden sind, zurückzuführen ist.
Die Erfindung hat zum Ziel, eine spezielle extrakorporale Behandlung von Transplantaten nach der Entnahme bzw. vor der Transplantation (isoliertes Transplantat) zu finden, durch welche eine komplikationsarme bzw. erfolgreiche Transplantation gefördert wird. Diese Maßnahme soll zusätzlich oder zusammen mit den herkömmlichen Konservierungsmaßnahmen angewendet werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, einen Wirkstoff für die Konservierung aufzufinden, der die angeführten Nachteile der testikulären Hyaluronidase bzw. von Hyaluronidasen tierischer Herkunft nicht aufweist und darüber hinaus auf einfachem Weg in ausreichenden Mengen herstellbar ist. Es soll bei Anwendung des Wirkstoffs auf Grund seiner nicht- tierischen Herkunft keine Gefährdung durch eventuelle Infektionen entstehen. Erfϊndungsgemäß wurde gefunden, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen bzw. ihre enzymatisch aktiven Fragmente, die nach ihrem Spaltmechanismus als Lyasen der Enzymklassifikationsnummer E.C. 4.2.2.1 zugerechnet werden, insbesondere die durch den Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt der Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis, bei Feπnentation in die Kulturflüssigkeit exkretierte Hyaluronatlyasen, unter anderem zu einer intensiven Reduktion des interstitiellen Druckes und einer schnellen Wiederherstellung der Funktion des Transplantates nach durchgeführter Transplantation führen. Die erfindungsgemäße Konservierung der isolierten Transplantate vor der Transplantation mit mikrobieller Hyaluronatlyase mit der Zielstellung, eine komplikationsfreies Einwachsen und schnellen Funktionsaufnahme des Transplantates bei möglichst geringer Schädigung zu erreichen, wurde bisher noch nicht beschrieben. Die extrakorporale Anwendung von Hyaluronatlyase am isoliertem Transplantat unterscheidet sich dadurch von allen anderen Anwendungen der Hyaluronatlyase, die zur Prophylaxe oder Therapie an lebenden Menschen und Tieren bisher vorgeschlagen wurde. Sie führt zu einem wesentlich verbesserten Transplationsergebnis .
Die Erfindung betrifft dementsprechend ein Verfahren zur Konservierung von zur Transplantation vorgesehenen tierischen und menschlichen Geweben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass besagte Gewebe extrakorporal mit Lösungen enthaltend mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein enzymatisch aktives Fragment davon behandelt werden.
Der enzymatische Wirkstoff spaltet, anders als testikuläre Hyaluronidasen bzw. andere Hyaluronidasen tierischer Herkunft, Hyaluronsäure nach einem
Eliminierungsmechanismus unter Bildung von ungesättigten Spaltprodukten, den Hyaluronsäure-Uroniden. Im Gegensatz dazu spalten Hyaluronidasen tierischer Herkunft (E.C. 3.2.1.35/36) die Hyaluronsäure hydrolytisch bei Anlagerung von Wasser unter Bildung gesättigter Spaltprodukte. Die Hyaluronatlyasen unterscheiden sich von tierischen Hyaluronidasen weiterhin durch die Aminosäuresequenzen sowie die Isoelektrischen Punkte ( P). Zum fördernden Effekt der erfϊndungsgemäßen Konservierung kann vermutet werden, dass sie durch eine Kombination von spezifischen Wirkungen der Hyaluronatlyase hervorgerufen werden. Möglicherweise führt der verbesserte Lymphabfluß als auch ein verbesserter hnmunstatus der transplantierten Organe oder Gewebe zu einer Reduktion interstitieller Ödeme und Verhinderung der Okklusion bzw. den Kollaps der Lymphgefäße. Der Lymphfluß im ischämischen Gewebe wird aufrechterhalten und so die Entwicklung von Nekrosen und Narbenbildung gehemmt. Der Abbau von dickeren Schichten von gequollener Hyaluronsäure fördert das Zusammenwachsen der Organbzw. Gewebegrenzflächen. Möglicherweise beeinflußt die Hyaluratlyase über ihre spezifischen Spaltprodukte, den ungesättigten Hyaluronsäure-Uroniden, auch die Bindungsaktivität der Rezeptoren CD44 und Rhamm der Blut-, Lymph- und besonders der Immunzellen, so dass möglicherweise die Gefahr der Abstoßung verringert wird.
Die unter ihrer Einwirkung der Hyaluronatlyase gebildeten Spaltprodukte der Hyaluronsäure, die ungesättigten Hyaluronsäueuroniden, besitzen außerdem eine intensive angiogene und radikalfangende Wirkung.
Es existieren im Gewebe bzw. Organen auch keine Inhibitoren, die die Aktivität der mikrobiellen Hyaluronatlyase hemmen könnten. Bekannt ist, dass im Gegensatz zur Aktivität der testikulären Hyaluronidase die Aktivität von Hyaluronatlyase aus Streptococcus equisimilis durch sulfatierte Glukosaminoglykane, wie beispielsweise der sulfatierten Hyaluronsäure oder Heparin, kaum inhibiert wird. Die mikrobiellen Hyaluronatlyasen werden für ihre erfinderische Verwendung in Form von galenischen Formulierungen eingesetzt. Sie enthalten als Injektionspräparat beispielsweise eine isotonische wässrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase mit Konzentrationen zwischen 10 und 250.000 IU/ml und in Injektionspräparaten übliche Hilfsstoffe. Das Enzymprotein der Hyaluronatlyase wird vorteilhaft in Form eines lagerstabilen Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, beispielsweise in Glasampullen abgefüllt, eingesetzt. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von gefriergetrocknetem Wirkstoff. Als stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidin, Aminosäuren, Albumine und deren Hydrolysate oder Gelatine und deren Hydrolysate eingesetzt werden.
Die Enzymaktivtät einer Ampulle liegt nach Auffüllen mit physiologischer Kochsalzlösung zwischen 10 und 250.000 IU/ml. Injektionen werden bei kleineren Organen, die schwer einer Perfusion zugänglich sind, angewendet Andere erfindungsgemäß verwendbare Formulierungen sind z.B. Perfusionslösungen. Sie enthalten in der Regel nur etwa 25% der Enzymaktivitäten des Injektionspräparats. In der Perfusionslösung sind in der Regel neben Glukose auch Salze wie Kochsalz, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natrium- und Kaliumphosphate Natriumbicarbonat, Magnesiumsalze, Glukose, Natriumpyruvat und komplexbildende Substanzen vorhanden. Die Perfusion kann durch die vorhandenen Gefäßanschlüsse oder bei größeren Organen mittels eines Katheters erfolgen. Die Perfusion wird bevorzugt bei größeren Organen, wie dem Herzen oder der Leber angewendet.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Transplantate in einer Lösung, welche Hyaluronatlyaseaktivität aufweist, für wenige Minuten bis zu mehreren Stunden eingetaucht bzw. gespült. Die Spül- bzw. Tauchlösungen enthalten in der Regel die gleichen Bestandteile wie die Perfusionslösungen. Spülungen bzw. Tauchungen werden bei Geweben, z. B. Hauttransplantaten, angewendet oder bei kleineren Organen oftmals in Verbindung mit einer Injektion. Die Konservierung erfolgt bei Temperaturen des Transplantates zwischen etwa 1°C und der normalen Kö ertemperatur. Bei erfindungsgemäßer als auch bei Kombination von herkömmlicher und erfindungsgemäßer Konservierung werden Temperaturen von ca. 4°C bevorzugt. Eine intensivere Wirkung wird jedoch bei höheren Temperaturen erreicht. Die Wirkung ist an der Abnahme der Gewebespannung deutlich wahrzunehmen. Ohne die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres enzymatisch aktiven Fragmentes aus einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird der erfindungsgemäße Wirkstoff am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptococcus agalactiae, hergestellt durch biotechnische Fermentation, erläutert. Diese Hyaluronatlyase besitzt einen Isoelektrischen Punkt von etwa EP = 8,6 sowie eine Molmasse von etwa 116.000 D und wirkt als Endoglycanase. Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder die gereinigte Hyaluronatlyase mit einer spezifisch wirkenden Protease zu einem Fragment mit Hyaluronatlyase-Aktivität umgesetzt. Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease MO/2 eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus gewonnen werden kann (DD 270924). Diese Protease besitzt eine Molmasse von etwa 14 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen D? = 3,85 bis 4,0. Beispiel 1
Männliche Weiße Neuseelandkaninchen werden durch zervikale Dislokation betäubt, durch Thorakotomie das Herz entnommen und mit der Aorta an einem Perfusionsapparat befestigt. Die Perfusion erfolgt retrograd nach der Langendorff-Methode mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei konstanter Temperatur (37°C), konstantem Druck (60 rrrmHg) und ständiger Carbogen-Begasung. Die Zusammensetzung der basalen Perfusionslösung ist: NaCl 118 mmol 1, KC1 4,7 mmol/1, CaCl2 2,5 mnιol/1, NaHPO4 1,2 mmol/1, NaHCO3 24,9 mmol/1, MgSO4 1,6 mmol 1, Glukose 5,5 mmol/1, Na- Pyruvat 2,0 mmol/1 und Na2EDTA 0,5 mmol/1.
Die verwendete Hyaluronatlyaselösung wird wie folgt hergestellt: Eine Ampulle Hyaluronatlyase entsprechend 200.000 IU wird in eiskaltem destillierten Wasser (1 ml) und Perfusionslösung (4 ml) gelöst und sofort in 1995 ml temperierte und begaste Perfusionslösung gegeben, so daß die Konzentration 100 IU/ml beträgt. Mit dieser Lösung wird das Herz entweder vor oder nach der globalen Ischämie perfundiert. Nach der Entnahme der Herzen werden diese in die Perfusionsapparatur eingespannt und für 15 min mit basaler Perfusionslösung bis zum Erreichen stabiler Aktionspotentiale perfundiert. Anschließend erfolgt die Retransplation. In gleicher Weise wird mit Herzen verfahren, die mit einer hyaluronatlyasefreie Perfusionslösung perfundiert wurden. Der interstitielle Druck wird mit einer Drucksonde gemessen.
Beispiel 2
Jeweils ein Rattenherz wird durch Aufbewahren für 18 Stunden bei Temperaturen von 0° bis 1 °C für 24 Stunden in handelsüblicher UW-Lösung sowie in EuroFlush-Glutathione (EFG)-Lösung, in der 2000 IU/1 Hyaluronatlyase gelöst sind, konserviert. Zum Vergleich wird ein Rattenherz in UW-Lösung und EFG-Lösung ohne* Hyaluronatlyase in gleicher Weise konserviert. Nach Reperfusion mit dem Blut von Wirtsratten wird die Ödembildung in Gefrierschnitt mikroskopisch untersucht. In den Herzen, konserviert mit den Hyaluronatlyase enthaltenden Lösungen, ist die die Ödembildung während der Reperfusion stark reduziert. Der koronare Blutfluß und die Funktion des Implantats erreicht innerhalb von 5 Tagen annähernd Normalwerte.
Beispiel 3
Entnommene Rattennieren werden 5 Stunden nach Abkühlung ohne weitere Manipulation zwischen 0 - 4 Grad gelagert oder mittels einer Pumpe konstant bei 4 - 10 Grad mit WU- Lösung perfundiert. Die UW-Lösung enthält 10.000 IU/1 Hyaluronatlyase. Nach Transplantation nehmen die mit Hyaluronatlyase perfundierten Nieren die frühzeitige Organfunktion auf, während das kalt gelagerten Organ und das ohne Hyaluronatlyase perfundierte Organ auch nach mehreren Tagen nach der Reperfusion schlechte Funktionswerte aufweisen. Beispiel 4
Zwei Rattenleber wird entnommen, wobei Pfortader und Leberarterie abgeklemmt werde. Durch Tauchen in UW-Lösung bei Temperaturen zwischen 4 und 8°C , welche in einem Fall 4000 IU/1 Hyaluronatlyase enthält, werden die Organe 5 Stunden behandelt und anschließend an den Blutkreislauf von Wirtstieren übertragen. Das mit Hyaluronatlyase perfundierte Organ nimmt nach Transplantation seine Funktion im Verlauf von zwei Tagen vollständig auf, während das Tier, welchem das nicht mit Hyaluronatlyase perfundierte Organ implantiert wurde, nicht überlebte.
Beispiel 5
Jeweils ein Rattenherz wird durch Aufbewahren für 8 Stunden bei Temperaturen von 0° bis 1 °C für 24 Stunden in handelsüblicher UW-Lösung konserviert. In ein Rattenherz wird an drei verschiedenen Stellen jeweils 0,2 ml einer Lösung injiziert, welche 100 IU/ml Hyaluronatlyase enthält. Nach Reperfusion mit dem Blut von Wirtsratten wird die Ödembildung in Gefriersclinitt mikroskopisch untersucht. Mit den Hyaluronatlyase behandelten Herz ist die Ödembildung während der Reperfusion stark reduziert.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Konservierung von zur Transplantation vorgesehenen tierischen und menschlichen Geweben, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Gewebe extrakorporal mit Lösungen enthaltend mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein enzymatisch aktives Fragment davon behandelt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei Temperaturen zwischen 1°C und 37°C, bevorzugt bei Temperaturen von ca. 4°C drachgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymhaltigen Lösungen durch Injektion in besagtes Gewebe eingebracht werden
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymhaltigen Lösungen durch Perfusion in besagtes Gewebe eingebracht werden
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Gewebe in die enzymhaltigen Lösungen eingetaucht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Gewebe um Nieren handelt und die Konservierungzeiten durch Perfusion oder •Tauchen bis zu 48 Stunden betragen
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Gewebe um Herz oder Lungen handelt und die Konservierungzeiten durch Perfusion oder Tauchen bis zu acht Stunden betragen.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem Gewebe um Pankreas oder Leber handelt und die Konservierungzeiten durch Perfusion und/oder Tauchen bis zu 24 Stunden betragen.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hyaluronatlyase um eine Enzym aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt der Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis, handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein enzymatisch aktives Fragment einer mikrobiellen Hyaluronatlyase, aus letzterer erhältlich durch Umsetzung mit einer spezifisch wirkenden Protease, bevorzugt mit der sauren Metalloprotease MO/2.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Injektion eine isotonische wässrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon mit Konzentrationen zwischen 10 und 250.000 IU/ml unter Zusatz von in Injektionspräparaten üblichen Hilfsstoffen verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfusionslösung bzw. Tauchlösung bis zu 70.000 IU/ml einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon nebst Hilfstoffen enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Konservierung durch Injektion zusätzlich zu Perfusion oder Tauchen durchgeführt wird.
PCT/DE2002/003329 2001-09-06 2002-09-05 Verfahren zur konservierung von für die transplantation vorgesehenen organen und geweben WO2003022047A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2001143606 DE10143606A1 (de) 2001-09-06 2001-09-06 Verfahren zur Konservierung von für die Transplantation vorgesehenen Organen und Geweben
DE10143606.8 2001-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003022047A1 true WO2003022047A1 (de) 2003-03-20

Family

ID=7697866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2002/003329 WO2003022047A1 (de) 2001-09-06 2002-09-05 Verfahren zur konservierung von für die transplantation vorgesehenen organen und geweben

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10143606A1 (de)
WO (1) WO2003022047A1 (de)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2073435C1 (ru) * 1993-04-30 1997-02-20 Московская государственная академия прикладной биотехнологии Способ консервирования интактных клеток печени
EP0890637A1 (de) * 1997-07-10 1999-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Verfahren zur Rekonstruktion von tierischen Organen
WO2001045743A2 (de) * 1999-12-22 2001-06-28 Id Pharma Gmbh Verwendung eines enzyms zur verbesserung der geweberesorption von arzneimitteln
WO2002059289A1 (de) * 2001-01-23 2002-08-01 Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. Verwendung von mikrobieller hyaluronatlyase zur bindegewebserweichung

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4152212A (en) * 1976-02-25 1979-05-01 Biorex Laboratories Limited Process for the purification of glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase
EP1140199B1 (de) * 1998-12-23 2003-07-23 Esparma GmbH Hyaluronatlyase als penetrationsförderer in topischen mitteln
US6689349B1 (en) * 1998-12-23 2004-02-10 Esparma Gmbh Skin protection agents containing a fragment mixture produced from hyaluronic acid by hydrolysis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2073435C1 (ru) * 1993-04-30 1997-02-20 Московская государственная академия прикладной биотехнологии Способ консервирования интактных клеток печени
EP0890637A1 (de) * 1997-07-10 1999-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Verfahren zur Rekonstruktion von tierischen Organen
WO2001045743A2 (de) * 1999-12-22 2001-06-28 Id Pharma Gmbh Verwendung eines enzyms zur verbesserung der geweberesorption von arzneimitteln
WO2002059289A1 (de) * 2001-01-23 2002-08-01 Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. Verwendung von mikrobieller hyaluronatlyase zur bindegewebserweichung

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE WPI Week 199739, Derwent World Patents Index; AN 1997-423209, XP002227420 *
JOHNSON ET AL: "Hyaluronidase ameliorates rejection-induced edema", TRANSPLANT INT., vol. 12, 1999, pages 235 - 243, XP002227419 *
RODIG H ET AL: "COMPLEMENTARY CHARACTERIZATION OF A HYALURONIC ACID SPLITTING ENZYME FROM STREPTOCOCCUS AGALACTIAE", ZENTRALBLATT FUER BAKTERIOLOGIE, URBAN U. FISCHER, JENA, DE, vol. 289, 1999, pages 835 - 843, XP000929956, ISSN: 0934-8840 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10143606A1 (de) 2003-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8258117B2 (en) Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues
DE60102359T2 (de) Verfahren und zusammensetzung für organ- und gewebekonservierung sowie für hypothermischen blutersatz
DE60122896T2 (de) Konservierungs- und lagerungsmedium für biologische materialien
DE3688710T2 (de) Isolierung und pharmazeutische Verwendung von Hyaluronidase und diese enthaltende pharmazeutische und tierärztliche Präparate.
KR20010029692A (ko) 동물의 세포 또는 장기의 보존제 및 그 보존방법
DE3617752C2 (de)
AU2001268882A1 (en) Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues
JPH0768082B2 (ja) 臓器保存用溶液
DE102005031532A1 (de) Lagermedium für Zellen
GB2144630A (en) Pharmaceutical composition containing chitosan
Olbricht et al. Cathepsin B and L in nephron segments of rats with puromycin aminonucleoside nephrosis
US5166048A (en) Protection of human corneal endothelial cells
US3682776A (en) Preservation of organs,tissues,and foodstuffs by means of biological protease inhibitors
JP3140797B2 (ja) 安定化コンドロイチナーゼａｂｃ、その保存方法及び治療剤
WO2003022047A1 (de) Verfahren zur konservierung von für die transplantation vorgesehenen organen und geweben
EP3454652B1 (de) Lösung zur konservierung, zum transport und zur anwendung von stammzellen
JPH0822801B2 (ja) 臓器保存用溶液
Clermont et al. Lymph lysosomal enzyme acid phosphatase in hemorrhagic shock.
WO2004110479A1 (de) Hyaluronatlyase enthaltendes mittel zur behandlung des akuten myokardinfarktes bzw. symptomen darauf sowie zur behandlung von postinfarktioneller myokarditis und myokardischämie
DE10211457A1 (de) Verwendung von Hyaluronatlyase zur Behandlung von Myokardinfarkten
JP4590041B2 (ja) 臓器保存剤
JPS6127901A (ja) 生体を保存する方法
US6313104B1 (en) Organoprotective solutions
JP2022104327A (ja) 血小板の活性化剤
SK10232001A3 (sk) Roztoky na ochranu orgánov

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AU BA BG BR CA CN CU CZ DZ GE HR HU ID IL IN IS JP KR LT MA MX NO NZ PL PT RO RU SD SG SI SK US YU

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP