WO2002059289A1 - Verwendung von mikrobieller hyaluronatlyase zur bindegewebserweichung - Google Patents

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WO2002059289A1
WO2002059289A1 PCT/DE2002/000209 DE0200209W WO02059289A1 WO 2002059289 A1 WO2002059289 A1 WO 2002059289A1 DE 0200209 W DE0200209 W DE 0200209W WO 02059289 A1 WO02059289 A1 WO 02059289A1
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WO
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enzyme
connective tissue
hyaluronate lyase
fragment
microbial
Prior art date
Application number
PCT/DE2002/000209
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg-Hermann Ozegowski
Peter-Jürgen Müller
Albert Härtl
Waltraud Hertel
Original Assignee
Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V., Friedrich-Schiller-Universität Jena filed Critical Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Publication of WO2002059289A1 publication Critical patent/WO2002059289A1/de

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02001—Hyaluronate lyase (4.2.2.1)

Definitions

  • the invention relates to the use of microbial hyaluronate lyase to soften connective tissue (Textus connectivus) in humans or mammals. It is particularly intended for permanent shape correction of the connective tissue or the connective tissue structure in humans or mammals without the need for a surgical intervention.
  • the application areas are in the medical and veterinary field as well as in cosmetics.
  • the invention can be used in the medical correction of ear shapes, in the reduction of the extent of scars, in the balloon dilation of narrowed arteries or in the treatment of cellulite.
  • Reasons for a human or veterinary treatment with the aim of achieving a permanent form correction can lie, for example, in the correction of a form deviation of the appearance or the form of internal organs and structures from the average of the normal variety of forms.
  • the shape deviation to be corrected may lie in the range of the normal variety of shapes as well as a result of an illness or injury. Such shape corrections can also support other treatment measures.
  • Appearances that move within the normal range of shapes are often protruding and deformed ears and excessive wrinkling, which are to be changed by the connective tissue structures present in the subcutis.
  • shape corrections with cosmetic relevance can. a. as a result of benign connective tissue growths such as keloids and scars.
  • benign connective tissue growths such as keloids and scars.
  • scars develop after injuries or are caused by acne. Hypertrophic scarring in particular is perceived as very unpleasant, so that such corrections can significantly increase the well-being and quality of life of people and contribute to a more secure appearance in public.
  • the unevenness of the skin surface which is characteristic of cellulite, can be attributed to the reticulated connective tissue strands that stabilize the fatty tissue, which due to their greater tensile strength lead to the visible indentation of the fatty tissue and dents in the epidermis.
  • the symptoms mentioned do not represent a disease state in the normal form, but are subjectively considered by those affected to be disadvantageous.
  • the correction of the shape of elastic cartilages, for example the ears, or of loose connective tissue is known and is achieved without surgery only by long-term mechanical pressure.
  • the shape of the auricle and the position of the auricles relative to the head in infants can be corrected with the help of pressure bandages. Pressure bandages are also used to reduce scar bulges.
  • active shape correction of connective tissue structures can be used to eliminate life-threatening illnesses in a sustainable manner.
  • This is e.g. B. the expansion of the reduced h nenlumens of narrowed arteries with a balloon catheter and subsequent insertion of a stent the case.
  • expansion cracks are often formed in the vein wall, which over the course of a few months trigger a growth stimulus to form a neointima that overgrows the stent. This creates a new secondary constriction in the same place where the primary constriction was expanded.
  • the reason for the crack formation is the brittleness of the vein wall, which is not stretched but blown up by the balloon catheter.
  • a person's appearance which is cosmetically relevant or subjectively perceived as disadvantageous, can be connected with the fact that the adipose tissue that is closely connected to the connective tissue or the skin and adipose tissue is held in an unfavorable form by the connective tissue.
  • Glycosaminoglycans are present in the connective tissue, as well as in the intracellular matrix in general. They create the turgor of the tissue due to their negative charges, and the strength of the connective tissue is closely related to them.
  • WO 99/47112 proposes a treatment with niacinamide to break down excess fat.
  • the patent specifications JP 9.221.406, US 5,972,340, US 5,591,437 and US 5,705,170 specify pharmaceutical formulations based on plants which are intended to bring about local fat loss and at the same time combat cellulite.
  • US 5,945,109 uses cosmetic products that have aromatase or an inhibiting or an anti-estrogen effect.
  • the fat build-up is reduced by a glucose-6-phosphate dehydrogenase inhibitor.
  • topically applied cosmetic products are said to have scars softened by urea and according to US 5,789,445 by benzoyl peroxide.
  • No. 5,873,728 proposes 9-cis retinoic acid esters and amides for the treatment of acne Velaris, cystic acne, hyperpigmentation, psoriasis, dermal and epidermal hypoplasia and keratoses, skin folds and a variety of other pathological conditions of the skin. In recent times, enzymatic drugs have also become more important.
  • 4,645,668 describes the injection of a pharmacologically acceptable solution of one or more of the enzymes, such as collagenase, elastase, papain, plasminogen activator, mast cell protease or lysosomal hydrolases, in combination with the enzyme hyaluronidase (EC 3.1.2.35/ 36) published.
  • the specified hyaluronidase is obtained without exception from mammalian testis. An effect against cellulite, skin folds and neoplastic fibrosis is stated.
  • Hyaluronidase is known to promote the spread of other compounds, including digestive enzymes, in the connective tissue as a "spreading enzyme". The digestive enzymes are primarily supposed to break down collagen.
  • Collagen is present in the intercellular matrix of all connective tissue.
  • hyaluronidases does not quite correctly describe three differently acting hyaluronic acid-cleaving enzyme types (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, 1961). It is the endohydrolases that hydrolytically cleave the ⁇ - (1-3) bonds. They include the majority of hyaluronidases from higher organisms, for example hyaluronidase from bovine testicles.
  • the hyaluronate glycan hydrolases (EC 3.2.1.35/36) also cleave to a limited extent other glycosaminoglycans.
  • Another type is the endo-ß-hyaluronidase from the leech, which cleaves the ß- (l-4) -binding highly specifically.
  • Hyaluronidases from animal testicles are used to make animal or human tissue more permeable.
  • Bovine testicular hyaluronidase serves as an absorption accelerator for subcutaneously administered drugs and for the faster regression of edema.
  • EP 0 193 330 B1 the inventors describe the preparation and use of a special endo-ß-glucuronidase with a molecular weight of 28,500 D from a leech for stimulating the flow of physiological fluids in eye diseases
  • This enzyme is specific for hyaluronic acid and differs from a known endo-ß-glucuronidase from the leech (Hirudo medicinalis) due to its higher stability at higher temperatures and extreme pH values.
  • hyaluronidase (EC 3.1.2.35 / 36) applied, which cleaves acidic glycosaminoglycans according to a hydrolytic mechanism.
  • the enzyme is obtained from mammals, in particular from the testes of cattle.
  • Gottlieb (US 3,708,575) suggests vascular diseases in humans, such as cardiac arrhythmias, thromboses, cerebral infarcts, cerebral thromboses and heart attacks, in particular of atherosclerosis, with hyaluronidase from animal testicles (molar mass 120,000 D) in high doses of 20,000 to 1,000. 000 IU to be treated by injection.
  • An isotonic sterile solution for example 10,000 IU / ml, is injected intracorporeally.
  • the enzyme was obtained from bovine testicles.
  • the enzyme in the title of the patent is mistakenly listed as glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase, although the description of the invention clearly shows that it is a hyaluronidase from bovine testicles. However, an enzyme with the cleavage specificity of a lyase is not detectable in animal testicles. An esterase activity attributed to the enzyme also indicates a hyaluronidase, since this enzyme has non-specific activity.
  • the activity determination method used also refers to a regulation for the determination of hyaluronidase.
  • Hyaluronidase from animal material has also been proposed in formulations for lowering nasal allergies (GB 1,098,957) and combating allergies and autoimmune diseases (GB 1,179,787).
  • the enzyme was produced from animal testes in accordance with GB 1,060,513 and referred to as “hyaluronate lyase”. According to the state of knowledge at the time (H. Greiling, HWD Guatemalanite, T. Eberhard: Z. Physiol.
  • hyaluronic acid-cleaving enzymes obtained from animal material are a hydrolytic hyaluronidase and not, as claimed, a hyaluronate lyase.
  • holoenzyme of a microbial hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae was proposed as a penetration enhancer for drugs and cosmetically active substances (WO 0.038.732 AI).
  • An enzyme fragment of a microbial hyaluronate lyase is described in DE 19.860.542 AI.
  • hyaluronidase of animal origin Disadvantageous in the medical application of hyaluronidase of animal origin; such as when changing the position of the auricle, however, is that the enzyme carries, due to its animal origin, the risk of transmission of viruses and other infectious material. Since commercially available hyaluronidase is mostly obtained from animal material (bovine testicles), there is a risk of BSE infection. Another disadvantage is that in the production of hyaluronidase to remove impurities in the form of ingredients from the animal material, a relatively large amount of cleaning is required. In addition, hyaluronidase from animal tissue is inactivated by the body's own sulfated mucopolysaccharides and non-specific inhibitors contained in the serum. The effect of hyaluronidases of animal origin is very limited.
  • the invention is therefore based on the object of describing the use of a preparation which is inexpensive to manufacture and can be used as universally as possible for many cosmetic or medical treatments, with a highly active and very well biocompatible active ingredient with the shortest possible treatment time for softening connective tissue which is free of potentially pathogenic material of animal origin Origin and has no negative effects when used as a parenteral or epicutaneous injection, in a catheter liquid or as a topically epidermal formulation, for example in conjunction with a plaster.
  • the object is achieved in that, depending on the type of connective tissue to be deformed, application-specific pharmaceutical formulations are proposed which contain the microbial enzyme hyaluronate lyase as holoenzyme (EC 4.2.2.1) and / or an enzyme fragment thereof with an enzyme activity of 100 IU / ml to 5,000. 000 IU / ml and optionally pharmaceutically, medically and / or cosmetically active agents, as well as stabilizers and / or auxiliaries.
  • holoenzyme EC 4.2.2.1
  • an enzyme fragment thereof with an enzyme activity of 100 IU / ml to 5,000. 000 IU / ml
  • optionally pharmaceutically, medically and / or cosmetically active agents as well as stabilizers and / or auxiliaries.
  • the invention is based on the surprising result that the use of the pharmaceutical formulations which contain said microbial enzyme have a known effect of hyaluronidase of animal origin, to soften connective tissue or to reduce its turgor, in that the formulations correspond to the spatial position and the extent of the connective tissue structures to be treated, depending on the application, either directly to the connective tissue or its surroundings.
  • an advantageous way of delivering the enzyme is to inject a formulation in the form of an injection solution into the connective tissue.
  • a formulation in the form of an injection solution into the connective tissue.
  • one or more or a plurality of injections can be placed in the connective tissue or in the vicinity of the connective tissue structure to be softened. It has been found that many intracutaneous or subcutaneous flat injections of the enzyme into the skin tissue and into the subcutaneous tissue can effectively soften the underlying connective tissue.
  • a formulation in the form of a catheter solution is introduced into the lumen of body cavities and organ openings.
  • the enzyme fragment can be used in further formulations together with other active substances and / or medicaments and / or substances with cosmetic relevance, the purpose of the known use of the holoenzyme hyaluronate lyase being to accelerate the transport of medicaments through the skin (WO 0.038.732 AI), but not within the scope of the present invention.
  • Another advantageous application of the invention are formulations as an aqueous solution, as an aqueous solution thickened with a hydrocolloid, as a paste, as an ointment, as a gel or as a foam.
  • the enzyme or its fragment can also be used in conjunction with a flexible carrier layer e.g. B. in the form of a plaster or a bandage on the skin area in question.
  • the use both with regard to the sequence and the selection of the cleaning steps takes place in a manner which does not restrict the invention.
  • the microorganism is fermented in a stirred fermenter while maintaining a constant pH. After about 20 hours of fermentation, the cells are separated. The cell mass is discarded. The culture filtrate is concentrated and purified in an ultrafiltration device. The result is a pre-cleaned enzyme solution which is subjected to further cleaning steps before it can be used, for example, as a catheter solution.
  • the cleaning steps and the use of pyrogen-free additives ensure that the preparation is free of pyrogens.
  • the enzyme is adsorbed on phenyl sepharose; then desorption takes place.
  • the solution is after a dialysis step to remove impurities with Q-Sepharose (Pharmacia). This is followed by a specific adsorption on a dye, for example aminophenyloxamic acid.
  • the final cleaning can be carried out together with the determination of the molecular weight in the form of molecular weight chromatography on Superdex (Pharmacia).
  • the enzyme fraction will be used to prepare the fragment in the following way:
  • a specifically cleaving protease is prepared in a manner known per se, for example
  • Protease MO / 2 (DD 270 924), for example, can be used as a specific protease.
  • the immobilized protease is e.g. B. at pH 7.5 and a temperature of 37 ° C with an aqueous hyaluronate lyase solution. After digestion is complete, the fragment is precipitated with ammonium sulfate and obtained in high purity by molecular weight chromatography. The highly purified enzyme or enzyme fragment shows only a specific precipitation after immunization in the rabbit. All detectable bands are stained in the blot with monoclonal antibodies.
  • the purified and concentrated holoenzyme has a specific activity of approximately 400,000 IU / mg; the specific activity of the fragment is in the range between 400,000 IU / mg and 800,000 IU / mg.
  • the high-purity enzyme solution or fragment-containing fractions can, as already mentioned, be used as an injection or catheter solution after concentration with partial water removal and optionally with the addition of stabilizers, auxiliaries or pharmacologically active substances and sterile filtration, the high-purity enzyme or fragment solution after sterile filtration for example with the addition of 5 mM magnesium chloride and 1% egg albumin can also be freeze-dried.
  • the freeze-dried enzyme or fragment can be dissolved with saline as an isotonic catheter solution.
  • the freeze-dried enzyme is preferably used in thickened aqueous solutions together with gel formers or hydrocolloids or as a paste, ointment, cream or as a gel or foam in a manner known per se.
  • these can also contain pharmaceuticals or other active substances.
  • the intended softening of the connective tissue or the connective tissue structure is shown as a drop in the turgor in the tissue, combined with a reduced mechanical resistance to the action of force.
  • These deforming forces are used in a targeted manner to achieve the desired change in shape, with the forces depending on the type of treatment either acting briefly, in the range of hours or also in the long term up to several weeks, continuously or fluctuatingly.
  • pressure or elastic bandages, as well as adhesive strips etc. under mechanical tension are advantageously used here. For example, protruding scars can be pressed with plasters on or even below the relief of the surrounding body surface.
  • Arteries to be dilated with a balloon catheter are treated with hyaluronate lyase, in particular by injection from the outer vein wall.
  • the balloon is then dilated in a manner known per se, and the treatment can be concluded by placing a stent.
  • This treatment of drug softening with subsequent stretching can advantageously prevent cracks in the vein walls as the cause for the rapid regrowth of the stretched area or the stent that has been placed (see drawing).
  • the enzyme or enzyme fragment can be taken up via openings, pores or caverns in solid surfaces, which bring about the shaping forces on the skin, in that the strength of these surfaces is greater than the compressive strength of the tissue to be treated.
  • catheter solutions for balloon dilatation the enzyme or enzyme fragment is fed in via the surface of the balloon facing the arterial wall before the pressure is applied.
  • Catheter solutions are also used when softening connective tissue adjacent to body cavities and correcting their shape.
  • the strands of connective tissue are stretched primarily by pressure of the fatty tissue on the connective tissue network.
  • the stretching effect can be achieved through measures such as massage, active or passive muscle movements, sports and the like. a., are supported.
  • the drawing shows the elasticity of a blood vessel treated by an inventive formulation and an untreated blood vessel, each with an outer diameter of 4 mm, which were expanded with a balloon catheter.
  • the functions embody the dependence of the elongation in mm on the balloon pressure (atm) of the balloon catheter.
  • the fermentation is carried out in a stirred fermentor with a gross filling volume of 30 l.
  • the working volume is 20 1.
  • a generally available strain of the species Streptococcus agalactiae is used for inoculation.
  • the trunk preservation is carried out with a cryopreserve (mast diagnostics).
  • a ball, covered with stock material, is placed in an agar slant tube with bacterial agar and brought into contact with the agar surface by movement (culture A).
  • the rolled ball is then placed in 3 ml of a heart-brain broth (culture B) for sterile control. Both cultures are cultivated as stand cultures for 24 h at 37 ° C.
  • the inoculation is carried out by washing off the agar slant tube Culture A with the culture solution of Culture B.
  • the steep breast bottles are cultivated with shaking (150 rpm) at 37 ° C for 24 h.
  • Second pre-culture Second pre-culture:
  • 2 x gel 1 of a culture medium consisting of 20 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 pancreatic peptone, 1.75 g / 1 Na acetate, 7 g / 1 Na hydrogen carbonate (extra dissolved), 7 g / 1 Di-Na hydrogen phosphate x 2H 2 O and 3.5 g / 1 Na dihydrogen phosphate are adjusted to pH 6.2 before sterilization with 20% H 2 SO 4 . After autoclaving, the pH is around 7.0. A solution with 6.0 g / 1 glucose solution is autoclaved separately. 100 ml of this is added before inoculating the second preculture. The inoculation is carried out by adding 50 ml of the first preculture (inoculation with 5% v / v). The cultivation is carried out with slow shaking at approx. 45 rpm at 32 ° C for 24 hours.
  • the medium of the main culture consists of 20 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 pancreatic peptone and 25 g / 1 glucose.
  • the glucose is specially autoclaved.
  • the inoculation is carried out with one liter of the second pre-culture.
  • the fermentation parameters are 34 ° C, pH 7.0, aeration via head space (25 1 / min air) and stirring speed 150 rpm.
  • the pH is kept constant by titration with a 40% sodium hydroxide solution. Glucose is added manually so that the glucose concentration does not drop below 5 g / 1. After 11 hours, cultivation was stopped.
  • the proteins precipitating at this concentration are separated off by clear filtration using a filter aid and the clear concentrate is applied to a 2.5 x 20 cm phenyl Sepharose column previously equilibrated with 40% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5. After washing with a 35% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5, the hyaluronate lyase is eluted with a 25% phosphate-buffered ammonium sulfate solution pH 6.5. The eluted fractions are combined and adjusted to a saturation of 80% by adding solid ammonium sulfate.
  • the precipitate is collected and dissolved in 100 ml of 0.03 M Tris buffer pH 8.2 and dialyzed against the same buffer.
  • the dialyzed crude hyaluronate lyase solution is then passed through an equilibrated Q-Sepharose column of 2.2 x 15 cm.
  • the hyaluronate lyase is in the run.
  • the run is saturated to 80% by adding solid ammonium sulfate.
  • the precipitated protein is collected, dissolved in 0.05 M Tris buffer pH 8.7 and freed of ammonium sulfate on a Sephadex G 10 column.
  • the hyaluronate lyase-containing solution thus equilibrated is applied to an appropriately equilibrated affinity column (0.8 cm ⁇ 10 cm) of N- (p-aminophenyl) oxamic acid agarose and eluted with 0.1 M NaCO 3 solution pH 9.7.
  • the eluted fractions containing hyaluronate lyase are combined and precipitated by saturation to 80% with ammonium sulfate.
  • the precipitate is collected, dissolved in 1 ml 0.1 M Tris buffer pH 7.5 and applied to a Superdex 200 column (16 x 60).
  • the hyaluronate lyase protein band at 116,000 D is collected and dialyzed against 0.02 M Tris buffer pH 7.5, which contains 0.005 M MgCl 2 . 10 mg hyaluronate lyase with a specific activity of 400,000 IU / mg are obtained. A 1% concentration of ovalbumin is added to the dialyzed hyaluronate lyase solution and the solution is dried lyophilically. Due to the different water content, enzyme solutions between 20,000 IU / ml and approx. 4,000,000 IU / ml are obtained.
  • the fragment was precipitated by saturation on 80% ammonium sulfate, collected and purified by molecular weight chromatography.
  • the active fragment fractions are pooled, dialyzed against 0.05 M Tris buffer and lyophilized with the addition of albumin.
  • the fragment has a specific activity of 460,000 IU / mg.
  • Activity determination for hyaluronate lyase or the fragment a) Optical test at 232 nm A stock solution for hyaluronic acid (30 mg / 100 ml) is prepared and stored at 4 ° C.
  • 200 ⁇ l of hyaluronic acid stock solution are added to 1.8 ml of 0.1 M acetate buffer pH 6.0 and the reaction is started with 2 to 4 U / ml (50 ml) of hyaluronate lyase.
  • the final volume is 2050 ⁇ l.
  • Hyaluronate lyase shows a linear increase in absorbance at 232 nm, from whose increase the activity can be calculated.
  • a hyaluronate lyase solution is diluted from a stock solution (50,000 U / ml) 1:50, 0.5 ml of hyaluronate lyase solution is added to 0.5 ml of 0.1 M acetate buffer pH 6.0 and diluted in the form of a geometric series, after which 0.5 ml of a hyaluronic acid solution is added to each dilution. 2 mg / ml 0.1 M acetate buffer pH 6.0, this mixture is then incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • the enzyme reaction is stopped by diluting each with 2 ml of a 2.5% cetyltrimethylammonium bromide solution in 2 After 20 minutes at room temperature, the turbidity is measured in each dilution at 600 nm in 1 cm cuvettes and the amount of hyaluronic acid cleaved is determined using a calibration curve 5 international units (IU) hyaluronate lyase cleave 16 ⁇ g hyaluronic acid / min.
  • IU international units
  • White New Zealand rabbits (Charles River Germany) are kept individually in cages (0.5 x 1 m) at room temperatures of 20 ° C plus / minus 2 ° C and supplied with standard feed (ssniff rabbit keeping) and drinking water ad libitum , The animals receive a total of six sc injections into the ears. The injections were given three times a week (Mondays, Wednesdays and Fridays). The injection area is marked with color. The animals were injected with 0.45 ml of 0.9% NaCl solution in the right ear (control ear) and 0.45 ml of hyaluronate lyase solution into the left ear (therapy ear).
  • An activity of 10,000 IU per kg body weight is injected into the therapy ear with each injection.
  • the injection volume is alternately injected into the inner and outer ear like a string of pearls and in several depots across the ear.
  • the enzyme solution is made immediately before injection.
  • General behavior and cartilage tension are assessed by two people. Assessment takes place before each injection up to the 13th day after the last injection.
  • the catheter solution consists of an isotonic aqueous solution, to which highly purified enzyme protein of the holoenzyme and / or the fragment or defined mixtures of both active enzyme species are added in such amounts that the enzyme activities are between 5,000 and 1,000,000 IU / ml.
  • the enzyme proteins are advantageously used in the form of a freeze-dried solid, which generally contains stabilizing additives.
  • Stabilizing additives can be, for example, sodium chloride, glucose, magnesium salts, polyvinylpyrrolidone, amino acids, albumin and its hydrolysates or gelatin and its hydrolysates.
  • a coronary artery with an outer diameter of 4 mm is removed from a slaughtered domestic pig and tissue residues are removed from the blood vessel.
  • the blood vessel is cut into 5 cm pieces. All the pieces of the vessel were then stored in physiological saline for one hour.
  • a tube piece was filled with 0.5 ml of a solution of hyaluronate lyase with an activity of 100,000 IU / ml, closed and incubated under physiological saline for 1 hour at room temperature. The control remained in physiological saline.
  • the elongation (diameter in mm) was determined depending on the balloon pressure (atm).
  • the drawing shows the extensibility as a function of the balloon pressure in the case of a piece of vessel treated by an inventive formulation and an untreated piece of vessel.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung des mikrobiellen Enzyms Hyaluronatlyase (E.C.4.2.2.1) und/oder eines Enzymfragment desselben zur Erweichung von Bindegewebe, insbesondere zur Formkorrektur von Bindegewebe und Bindegewebestrukturen. Die das Enzym oder Enzymfragment enthaltene Formlierung weist eine Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5.000.000 IU/ml auf und enthält gegebenenfalls pharmazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel wie auch Stabilisatoren und/oder Hilfsstoffe. Das Enzym oder Enzymfragment ist insbesondere zur Anwendung im medizinischen und veterinärmedizinischen Bereich sowie in der Kosmetik vorgesehen, um ohne operativen Eingriff Formkorrekturen von Bindegewebe bzw. von Bindegewebestrukturen bei Mensch oder Säugetier zu bewirken (z.B. medikamentöse Korrektur von Ohrformen, Ballondilatation von verengten Arterien, Cellulite- und Narbenbehandlung).

Description

Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase zur Bindegewebserweichung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase zur Erweichung von Bindegewebe (Textus connectivus) bei Mensch oder Säugetier. Sie ist insbesondere für eine bleibende Formkorrektur des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur bei Mensch oder Säugetier ohne erforderlichen operativen Eingriff vorgesehen. Die Anwendungsgebiete liegen im medizinischen und veterinärmedizinischen Bereich sowie in der Kosmetik. Beispielsweise kann die Erfindung bei der medikamentösen Korrektur von Ohrformen, bei der Reduzierung des Ausmaßes von Narben, bei der Ballondilatation von verengten Arterien oder bei der Cellulitebehandlung Verwendung finden.
Gründe für eine human- oder veterinärmedizinische Behandlung mit dem Ziel, eine bleibende Formkorrektur zu erreichen, können beispielsweise in der Korrektur einer Formabweichung des Erscheinungsbildes bzw. der Form innerer Organe und Strukturen vom Durchschnitt der normalen Formenvielfalt liegen. Dabei kann die zu korrigierende Formabweichung sowohl im Bereich der normalen Formenvielfalt liegen als auch infolge einer Krankheit oder Verletzung entstanden sein. Derartige Formkorrekturen können auch andere Behandlungsmaßnahmen unterstützen.
Erscheinungen, die sich im Rahmen der normalen Formenvielfalt bewegen, sind häufig abstehende und deformierte Ohren sowie übermäßige Faltenbildung, welche durch die in der Unterhaut vorhandenen Bindegewebestrukturen verändert werden sollen. Auch bei der Zucht von Tieren existieren allgemein anerkannte Merkmale, wie hängende oder aufrechtstehende Ohren, welche im Fall einer Abweichung als korrekturbedürftig empfunden werden. Des weiteren können Formkorrekturen mit kosmetischer Relevanz u. a. im Ergebnis gutartiger Bindegewebewucherungen, wie Keloide und Narben, durchgeführt werden. Narben entstehen beispielsweise nach Verletzungen oder werden durch Akne hervorgerufen. Insbesondere hypertrophe Narbenbildung wird als sehr unangenehm empfunden, so dass derartige Korrekturen das Wohlbefinden und die Lebensqualität des Menschen wesentlich erhöhen können sowie zu einem sichereren Auftreten in der Öffentlichkeit beitragen.
Die für Cellulite charakteristischen Unebenheiten der Hautoberfläche sind auf die das Fettgewebe stabilisierenden, netzförmig verknüpften Bindegewebestränge zurückzuführen, welche auf Grund ihrer größeren Zugfestigkeit zu den sichtbaren Einziehungen des Fettgewebes und zu Dellen in der Oberhaut führen. Die genannten Erscheinungen stellen bei normaler Ausprägung zwar keinen Krankheitszustand dar, werden aber von den Betroffenen subjektiv als nachteilig betrachtet. Die Formkorrektur von elastischen Knorpeln, beispielsweise der Ohren, oder von lockerem Bindegewebe ist bekannt und wird ohne Operationen nur durch langeinwirkenden mechanischen Druck erreicht. So können die Ohrmuschelform sowie die Stellung der Ohrmuscheln zum Kopf bei Säuglingen mit Hilfe von Druckverbänden korrigiert werden. Druckverbände werden auch angewendet, um Narbenwulste zu verkleinern. In anderen Fällen können durch eine aktive Formkorrektur von Bindegewebestrukturen lebensbedrohende Krankheitszustände auf eine nachhaltige Weise beseitigt werden. Dies ist z. B. bei der Erweiterung des verringerten h nenlumens von verengten Arterien mit einem Ballonkatheter und nachfolgenden Einsetzen eines Stents der Fall. Bei Anwendung dieser Methode kommt es häufig zur Bildung von Expansionsrissen in der Aderwand, die im Lauf einiger Monate durch einen Wachstumsreiz die Bildung einer Neointima auslösen, die den Stent überwuchert. Dadurch entsteht an derselben Stelle, an welcher die primäre Verengung aufgeweitet wurde, eine neue sekundäre Verengung. Grund für die Rissbildung ist die Sprödigkeit der Aderwand, die durch den Ballonkatheter nicht gedehnt, sondern gesprengt wird. Kosmetisch relevantes bzw. subjektiv als unvorteilhaft empfundenes Aussehen eines Menschen kann damit zusammenhängen, dass das mit dem Bindegewebe in enger Verbindung stehende Fettgewebe bzw. das Haut- und Fettgewebe durch das Bindegewebe in einer ungünstigen Form festgehalten wird. Im Bindegewebe, wie auch ganz allgemein in der intrazellulären Matrix, sind Glycosaminoglycane vorhanden. Sie erzeugen auf Grund ihrer negativen Ladungen den Turgor des Gewebes, und die Festigkeit des Bindegewebes steht mit ihnen in engem Zusammenhang.
So treten besonders bei Frauen häufig mit Cellulite bezeichnete, sichtbare Unebenheiten der Oberhaut an Körperstellen auf, die vorwiegend mit dickeren Schichten von Fettgewebe bedeckt sind. Es gibt zahlreiche Versuche, das Ausmaß von Cellulite durch mechanische, kosmetische oder auch medikamentöse Behandlungen zu verringern. Die Behandlungen haben generell das Ziel, den Fettabbau zu stimulieren bzw. die Fettbildung zu inhibieren. Hierzu wird in DE 19 718 848 AI eine kosmetische Komposition vorgeschlagen, die Molke, Meersalz und Orangenöl enthält.
Im WO 99/47112 wird eine Behandlung mit Niacinamid zum Abbau von Fettüberschuss vorgeschlagen. In den Patentschriften JP 9.221.406, US 5.972.340, US 5.591.437 und US 5.705.170 werden pharmazeutische Formulierungen auf Pflanzenbasis angegeben, die einen lokalen Fettabbau bewirken sollen und gleichzeitig Cellulite bekämpfen. Das US 5.945.109 setzt kosmetische Produkte ein, die Aromatase bzw. eine -inhibierende bzw. eine Antiöstrogen- Wirkung haben. Im FR 2.761.888 wird der Fettaufbau durch einen Glukose-6-phosphatdehydrogenaseinhibitor verringert. Die Patentschrift US 5.523.090 gibt Xanthin, Inositolphosphat und alpha-Hydroxysäuren sowie die US 5.667.793 Xanthin in Verbindung mit pflanzlichen Extrakten enthaltende kosmetische Präparaten an, um den lokalen Fettabbau zu stimulieren. Nach dem US 5.587.396 wird sowohl der Wasserverlust durch die Haut reduziert als auch die Inhibition der Fettsynthese durch pharmazeutische Formulierungen, die Milchsäure, Retinoide wie Vitamin A, Palmitat und Cerebroside enthalten, gefördert. Eine kosmetische Komposition, die Inositolphosphat und Phytinsäure enthält, wird im US 5.536.499 beschrieben. Das US 5.529.769 schlägt eine Behandlung mit Betulinsäure und Ascorbinsäure zur Verhinderung von Cellulite vor. Narben sollen nach US 4.694.021 in topisch angewendeten kosmetischen Produkten durch Harnstoff und gemäß US 5.789.445 durch Benzoylperoxid erweicht werden. US 5.873.728 schlägt 9-cis Retinsäureester und -amide für die Behandlung von Akne Velaris, cystische Akne, Hyperpigmentation, Psoriasis, dermale und epidermale Hypoplasia und Keratosen, Hautfalten sowie eine Vielfalt von weiteren pathologischen Zuständen der Haut vor. In neuerer Zeit gewinnen auch enzymatische Medikamente an Bedeutung. In der Patentschrift US 4.645.668 wird die Injektion einer pharmakologisch zulässigen Lösung eines oder mehrerer der Enzyme, wie Kollagenase, Elastase, Papain, Plasminogen- Aktivator, Mastzellen-Protease oder lysosomale Hydrolasen, in Kombination mit dem Enzym Hyaluronidase (E.C. 3.1.2.35/36) publiziert. Die angegebene Hyaluronidase wird ausnahmslos aus Testis von Säugetieren gewonnen. Es wird eine Wirkung gegen Cellulite, Hautfalten und neoplastische Fibrosis angegeben. Über Hyaluronidase ist bekannt, dass es als "spreading enzyme" die Ausbreitung von anderen Verbindungen, darunter auch von Verdauungsenzymen im Bindegewebe fördert. Die Verdauungsenzyme sollen vor allem Kollagen abbauen. Kollagen ist in der interzellulären Matrix aller Bindegewebe vorhanden. Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht ganz korrekt drei unterschiedlich wirkende hyaluronsäurespaltende Enzymtypen (J. Ludowieg: The mechanism of hyaluronidases, JBC 236, 333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, welche die ß-(l-3)-Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Die Hyaluronat- Glycanhydrolasen (E.C. 3.2.1.35/36) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glycosaminoglycane. Einen weiteren Typ stellt die Endo-ß-Hyaluronidase aus dem Blutegel dar, welche die ß-(l-4)-Bindung hochspezifisch spaltet. Hyaluronidasen aus Tierhoden werden eingesetzt, um tierisches bzw. menschliches Gewebe durchlässiger zu machen. Hyaluronidase aus Rinderhoden dient als Resorptionsbeschleuniger subkutan verabreichter Arzneimittel und zur schnelleren Rückbildung von Ödemen. Gute Wirkungen wurden bereits in den 60er Jahren mit hochdosierter, intravenös verabreichter Rinderhoden-Hyaluronidase „Dessau" bei akuter Tendovaginitis und Paratenonitis crepitans, bei der intravenösen Behandlung des plantaren Fersensporns und in der Dermatologie erzielt. So kam es bei progressiver Sklerodermie, bei zirkumskripter Sklerodermie und bei Keloiden nach Hyaluronidase-Behandlung zu einer wesentlichen Verringerung der Beschwerden. Im EP 0 193 330 Bl beschreiben die Erfinder die Herstellung und Anwendung einer speziellen Endo-ß-glucuronidase mit einer Molmasse von 28.500 D aus einem Blutegel zur Stimulierung des Flusses physiologischer Flüssigkeiten bei Augenkrankheiten. Dieses Enzym ist spezifisch für Hyaluronsäure und unterscheidet sich von einer bekannten Endo- ß-glucuronidase aus dem Blutegel (Hirudo medicinalis) durch eine höhere Stabilität bei höheren Temperaturen und extremen pH- Werten. Bei den zuletzt genannten Verfahren werden Hyaluronidase (E.C. 3.1.2.35/36) angewendet, welches saure Glycosaminoglycane nach einem hydrolytischen Mechanismus spaltet. Das Enzym wird aus Säugetieren, insbesondere aus den Testes von Rindern, gewonnen. Nachteilig ist bei ihrer Anwendung, dass eine generelle Gefahr der Übertragung von infektiösen Material aus den Tieren besteht. Seit den 60er Jahren gibt es Literaturhinweise, dass Rinderhoden-Hyaluronidase zur therapeutischen Beeinflussung arterieller Gefäßerkrankungen beim Menschen, insbesondere zur Durchblutungsverbesserung der peripheren Gefäße eingesetzt werden kann (z. B. Thurnherr und Koch, zitiert bei Wolff: Behandlungsergebnisse mit intravenösen Magnesium comp./Hylase-Mischinjektionen bei Arteriopathien vom Beckentyp im Stadium II. Z. ärztl. Fortbild., 66, 1972, 446 - 447).
In den 70er Jahren wurde versucht, die Spätfolgen des Herzinfarktes im Tiermodell mit Hyaluronidasen zu beeinflussen. Ziel der Studien war eine Verkleinerung der kardialen Nekroseareale bedingt durch die beschleunigte Gefäßneubildung nach dem Infarkt und eine Verbesserung der periphären Durchblutung.
Gottlieb (US 3.708.575) schlägt vor, Gefaßkrankheiten des Menschen, wie Herz- arrythmien, Thrombosen, zerebrale Infarkte, zerebrale Thrombosen und Herzinfarkte, insbesondere von Atherosklerose, mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU per Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intrakorporal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird das Enzym im Titel der Patentschrift als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung eindeutig hervorgeht, dass es sich um eine Hyaluronidase aus Rinderhoden handelt. Ein Enzym mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase, da dieses Enzym unspezifische Wirkung besitzt. Auch die angewendete Aktivitätsbestimmungsmethode bezieht sich auf eine Vorschrift zur Hyaluronidasebestimmung.
Hyaluronidase aus tierischem Material wurde auch in Formulierungen zur Senkung nasaler Allergien (GB 1.098.957) und Bekämpfung von Allergien und Autoimmunkrankheiten (GB 1.179.787) vorgeschlagen. Das Enzym wurde nach GB 1.060.513 aus tierischen Hoden hergestellt und als „Hyaluronatlyase,, bezeichnet. Nach dem damaligen Erkenntnisstand (H. Greiling, H.W. D. Stuhlsatz, T. Eberhard: Z. Physiol. Chemie, 1965, 340, 243 sowie GB 1.060.513) zitierten Stand der Wissenschaft handelt es sich aber bei dem aus tierischen Material gewonnenen hyaluronsäurespaltenden Enzymen um eine hydrolytisch wirkende Hyaluronidase und nicht, wie behauptet, um eine Hyaluronatlyase. Außerdem wurde das Holoenzym einer mikrobiellen Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae als Penetrationsverstärker von Arzneimitteln und kosmetisch wirksamen Substanzen vorgeschlagen (WO 0.038.732 AI). Ein Enzymfragment einer mikrobiellen Hyaluronatlyase wird in DE 19.860.542 AI beschrieben. Bekannt ist weiterhin, dass durch die Injektion des Enzyms Hyaluronidase eine schnelle und reversible Beeinflussung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels des Ohres, welches teilweise aus elastischen Knorpel besteht, bewirkt wird. Nach Fixierung in eine bestimmte Form oder Lage wird eine irreversible Formveränderung der Ohrmuschelform oder der Ohrenstellung des Menschen erreicht (Dr. H. Sudhoff, HNO-Klinik der Ruhr- Universität Bochum im St. Elisabeth-Krankenhaus Bochum).
Nachteilig bei der medizinischen Anwendung der Hyaluronidase tierischer Herkunft; wie beispielsweise bei der Veränderung der Stellung der Ohrmuschel, ist jedoch, dass das Enzym auf Grund seiner tierischen Herkunft die Gefahr einer Übertragung von Viren und anderem infektiösen Material in sich trägt. Da handelsübliche Hyaluronidase meistens aus tierischem Material (Rinderhoden) gewonnen wird, besteht die Gefahr einer BSE- Infektion. Weiterhin ist nachteilig, dass bei der Herstellung der Hyaluronidase zur Entfernung von Verunreinigungen in Form von Inhaltstoffen aus dem tierischen Material ein relativ großer Reinigungsaufwand betrieben werden muss. Darüber hinaus wird Hyaluronidase aus tierischem Gewebe durch körpereigene sulfatierte Mukopolysaccharide und im Serum enthaltene unspezifische Inhibitatoren inaktiviert. Dadurch wird die Wirkung der Hyaluronidasen tierischen Ursprungs sehr begrenzt.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Verwendung eines aufwandgering herstellbaren sowie möglichst universell für viele kosmetische bzw. medizinische Behandlungen verwendbaren, hochaktiven und sehr gut bioverträglichen Wirkstoff mit möglichst kurzer Behandlungszeit zur Erweichung von Bindegewebe zu beschreiben, welcher frei von potenziell pathogenen Material tierischer Herkunft ist und keine negativen Wirkungen bei der Anwendung als parenterales oder epikutanes Injektionspräparat, in einer Katheterflüssigkeit oder als topisch epidermale Formulierung, beispielsweise in Verbindung mit einem Pflaster, besitzt.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass je nach Art der zu verformenden Bindegewebe anwendungsspezifische pharmazeutische Formulierungen vorgeschlagen werden, die das mikrobielle Enzym Hyaluronatlyase als Holoenzym (E.C. 4.2.2.1) und/oder ein Enzymfragment derselben mit einer Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5.000.000 IU/ml sowie gegebenenfalls pharmazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel, wie auch Stabilisatoren und/oder Hilfsstoffe, enthalten. Diese Formulierungen können entsprechend der zweckbestimmten Verwendung bei den zu verformenden Bindegewebestrukturen auf sehr unterschiedliche Weise, insbesondere in Form eines Injektionspräparats, einer Katheterlösung oder topisch/epidermal wirkend, zur Anwendung kommen und sind deshalb für viele medizinische bzw. kosmetische Behandlungen einsetzbar. Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Ergebnis, dass die Verwendung der pharmazeutischen Formulierungen, welche das besagte mikrobielle Enzym enthalten, eine an sich bekannte Wirkung von Hyaluronidase tierischer Herkunft aufweisen, Bindegewebe zu erweichen bzw. sein Turgor zu verringern, indem die Formulierungen entsprechend der räumlichen Lage und des Ausmaßes der zu behandelnden Bindegebestrukturen je nach Anwendung entweder unmittelbar dem Bindegewebe oder dessen Umgebung zugeführt werden.
Damit sind diese Formulierungen, die keine Hyaluronidase enthalten, ebenfalls für die Verwendung geeignet, Bindegewebe und Bindegewebestrukturen unter dem Einfluss von Kräften ohne erforderliche operative Einwirkung formen zu lassen. Vorteilhaft ist dabei, dass keine hyaluronsäurespaltenden Enzyme aus tierischen Quellen sowie andere Enzyme, wie beispielsweise Kollagenasen oder Protease angewendet werden und dass das mikrobielle Enzym auf biotechnisch/fermentativen Weg gewonnen werden kann und somit keinerlei potenziell pathogenes Material tierischer Herkunft enthält. Überraschend wurde ferner festgestellt, dass die pharmazeutischen Formulierungen mit Hyaluronatlyase eine noch höhere Wirkung bei der Erweichung des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur aufweist als vergleichbare Wirkstoffe, die auf Hyaluronidasen aus Rinderhoden bestehen. Darüber hinaus wird die Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten Hyaluronatlyase bzw. ihres Fragments nicht durch körpereigene Inhibitoren beeinflusst, wie das bei Hyaluronidasen der Fall ist. Eine vorteilhafte Möglichkeit der Zuführung des Enzyms besteht darin, eine Formulierung in Form einer Injektionslösung in das Bindegewebe zu injizieren. Beispielsweise können eine oder mehrere bzw. einer Vielzahl von Injektionen in das Bindegewebe oder in die Nachbarschaft der zu erweichenden Bindegewebestruktur gesetzt werden. Es wurde gefunden, dass durch viele intrakutane oder subkutane flache Injektionen des Enzyms in das Hautgewebe und in die Unterhaut ein wirksame Erweichung des darunter liegenden Bindegewebes erreicht werden kann. Bei einer anderen vorteilhaften Anwendung wird eine Formulierung in Form einer Katheterlösung in das Lumen von Körperhöhlen und Organöffnungen eingeführt. Dort kann sie verbleiben oder sie wird als Spülflüssigkeit wieder nach außen befördert. Überraschend wurde auch gefunden, dass bei der Erweichung von nahe der Oberhaut gelegenen Bindgeweben, die beispielsweise bei der Ausprägung von Cellulite, Narben und Hautfalten von Bedeutung sind, eine Formulierung in der Form wirksam zur Anwendung kommen kann, welche das Enzym bzw. Enzymfragment topisch/epidermal auf die Oberhaut aufbringt. Bei dieser Anwendung penetriert die Hyaluronatlyase oder ihr Fragment durch die Epidermis und erweicht die darunter gelegenen Bindegewebestrukturen. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass das Enzymfragment eine noch bessere Wirkung bei der Erweichung von oberhautnahen Bindegewebebereichen bewirkt als das gleichaktive Holoenzym.
Das Enzymfragment kann in weiteren Formulierungen zusammen mit anderen Wirkstoffen und/oder Arzneimitteln und/oder Substanzen mit kosmetischer Relevanz angewendet werden, wobei die an sich bekannte Verwendung des Holoenzyms Hyaluronatlyase, eine Beschleunigung des Transports von Arzneimitteln durch die Haut zu bezwecken (WO 0.038.732 AI), jedoch nicht zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zählt. Eine weitere vorteilhafte Anwendung der Erfindung sind Formulierungen als wässrige Lösung, als mit einem Hydrokolloid angedickte wässrige Lösung, als Paste, als Salbe, als Gel oder als Schaum. Das Enzym bzw. dessen Fragment kann auch in Verbindung mit einer flexiblen Trägerschicht z. B. in Form eines Pflasters oder einer Binde auf die betreffende Hautpartie aufgebracht werden.
Die Verwendung sowohl hinsichtlich der Reihenfolge als der Auswahl der Reinigungsschritte erfolgt in einer die Erfindung nicht einschränkender Weise. Die Fermentation des Mikroorganismus erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH- Konstanthaltung. Nach etwa 20-stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird verworfen. Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen wird, bevor sie beispielsweise als Katheterlösung verwendet werden kann. Durch die Reinigungsscliritte und der Anwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird eine Pyrogenfreiheit des Präparates gewährleistet. Das Enzym wird an Phenylsepharose adsorbiert; anschließend erfolgt eine Desorption. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Daran schließt sich eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, beispielsweise Aminophenyloxaminsäure, an. Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) erfolgen.
Die Enzymfraktion wird in folgender Weise zur Herstellung des Fragmentes eingesetzt werden:
Eine spezifisch spaltende Protease wird in an sich bekannter Weise, beispielsweise an
Sepharose gebunden. Als spezifisch wirkende Protease kann beispielsweise die Protease MO/2 (DD 270 924) eingesetzt werden. Die immobilisierte Protease wird z. B. bei pH 7,5 und einer Temperatur von 37 °C mit einer wässrigen Hyaluronatlyaselösung gemischt. Nach abgeschlossener Verdauung wird das Fragment mit Ammoniumsulfat gefallt und durch Molekulargewichtschromatografie in hochreiner Form gewonnen. Das hochgereinigte Enzym bzw. Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt. Das gereinigte und konzentrierte Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg; die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt im Bereich zwischen 400.000 IU/mg und 800.000 IU/mg. Die hochreine Enzymlösung bzw. fragmenthaltigen Fraktionen können, wie bereits erwähnt, nach Konzentrierung unter teilweiser Wasserentfernung und gegebenenfalls unter Zusatz von Stabilisatoren, Hilfsstoffen oder pharmakologisch aktiven Substanzen und Sterilfiltration als Injektions- oder Katheterlösung eingesetzt werden, wobei die hochreine Enzym- bzw. Fragmentlösung nach Sterilfiltration beispielsweise unter Zusatz von 5 mM Magnesiumchlorid und 1 % Eieralbumin auch gefriergetrocknet werden kann. Das gefriergetrocknete Enzym bzw. Fragment kann mit Kochsalzlösung als isotonische Katheterlösung gelöst werden.
Für topisch/epidermale Anwendungen wird das gefriergetrocknete Enzym vorzugsweise in eingedickten wässrigen Lösungen zusammen mit Gelbildnern oder Hydrokolloiden oder als Paste, Salbe, Creme bzw. als Gel oder Schaum in an sich bekannter Art verwendet. Diese können neben der Verwendung des Fragments auch Arzneimittel oder sonstige Wirkstoffe enthalten. Die bezweckte Erweichung des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur stellt sich dar als ein Abfall des Turgors im Gewebe, verbunden mit einem verringerten mechanischen Widerstand gegenüber einer Krafteinwirkung. Diese verformenden Kräfte werden zielgerichtet auf die angestrebte Formänderung eingesetzt, wobei die Kräfte je nach Behandlungsart entweder kurzzeitig, im Bereich von Stunden oder auch langfristig bis zu mehreren Wochen kontinuierlich oder fluktuierend einwirken. In der Praxis kommen hier vorteilhaft Druck- bzw. elastische Verbände, wie auch unter mechanischer Spannung stehende Klebestreifen etc. zur Anwendung. Beispielsweise können hervorstehende Narben mit Pflastern auf oder sogar unter das Höhenrelief der umgebenden Körperoberfläche gedrückt werden.
Arterien, die mit einem Ballonkatheter gedehnt werden sollen, werden insbesondere durch Injektion von der äußeren Aderwand mit Hyaluronatlyase behandelt. Anschließend erfolgt die Ballondilatation auf an sich bekannte Weise, wobei die Behandlung durch das Setzen eines Stents abgeschlossen werden kann. Vorteilhaft können durch diese Behandlung der medikamentösen Erweichung mit anschließender Dehnung Risse in den Aderwänden als Ursache für das schnelle Wiederzuwachsen der gedehnten Stelle bzw. des gesetzten Stents vermieden werden (vgl. Zeichnung).
Das Enzym bzw. Enzymfragment kann über Öffnungen, Poren oder Kavernen in festen Oberflächen aufgenommen werden, welche die formenden Kräfte auf die Haut bewirken, indem die Festigkeit dieser Oberflächen größer ist als die Druckfestigkeit des zu behandelnden Gewebes.
Bei Katheterlösungen für die Ballondilatation wird das Enzym bzw. Enzymfragment über die der Arterienwand zugewandte Oberfläche des Ballons vor der Druckausübung zugeführt. Katheterlösungen werden auch angewandt, wenn an Kö erhohlräume angrenzende Bindegewebe zu erweichen und ihre Form zu korrigieren sind.
Bei der Cellulitebehandlung erfolgt eine Dehnung der Bindegewebestränge vor allem durch Druck des Fettgewebes auf das Bindegewebenetz. Die dehnende Wirkung kann durch Maßnahmen, wie Massage, aktive oder passive Muskelbewegungen, Sport u. a., unterstützt werden.
Die Erfindung soll nachstehend anhand mehrerer Ausführungsbeispiele erläutert werden. Die Zeichnung (Ausführungsbeispiel 9) zeigt die Dehnbarkeit eines durch eine erfmdungs- gemäße Formulierung behandelten sowie eines unbehandelten Blutgefäßes mit jeweils einem Außendurchmesser von 4 mm, die mit einem Ballonkatheter aufgeweitet wurden. Die Funktionen verkörpern dabei die Abhängigkeit der Dehnung in mm vom Ballon- druck (atm) des Ballonkatheters.
Ausfuhrungsbeispiel 1 :
Die Fermentation wird in einem gerührten Fermentor mit einem Bruttofüllvolumen von 30 1 durchgeführt. Das Arbeitsvolumen beträgt 20 1. Zur Beimpfung wird ein allgemein verfügbarer Stamm der Art Streptococcus agalactiae eingesetzt. Die Stammkonservierung erfolgt mit einer Kryokonserve (Mast-Diagnostica). Eine Kugel, bedeckt mit Stammmaterial, wird in ein Agarschrägröhrchen mit Keimzahlagar gegeben und durch Bewegung mit der Agaroberfläche in Berührung gebracht (Kultur A). Anschließend wird zur Sterilkontrolle die abgerollte Kugel in 3 ml einer Herz-Hirn-Bouillon gegeben (Kultur B). Beide Kulturen werden 24 h bei 37 °C als Standkulturen kultiviert.
Erste Vorkultur:
2 x je 50 ml eines Kulturmediums, welches 5 g/1 Caseinpepton und 10 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) enthält, werden in zwei 100 ml Steilbrustflaschen gefüllt und bei pH 7,0 sterilisiert. Zusätzlich zu den 50 ml Kulturmedium wurden jeweils 5 ml Eagle-Medium kurz vor Beimpfung zugesetzt.
Die Beimpfung erfolgt mit einer Abschwemmung des Agarschrägröhrchen Kultur A mit der Kulturlösung von Kultur B. Die Steilbrustflaschen werden unter Schütteln (150 rpm) bei 37 °C über 24 h kultiviert. Zweite Vorkultur:
2 x jel 1 eines Kulturmediums, bestehend aus 20 g/1 Hefe-Extrakt, 10 g/1 pankreatischem Pepton, 1,75 g/1 Na-acetat, 7 g/1 Na-hydrogencarbonat (extra gelöst), 7 g/1 Di-Na-hydro- genphosphat x 2H2O und 3,5 g/1 Na-Di-hydrogenphosphat, werden auf pH 6,2 vor Sterilisieren mit 20 % H2SO4 eingestellt. Nach dem Autoklavieren liegt der pH bei etwa 7,0. Eine Lösung mit 6,0 g/1 Glucoselösung wird separat autoklaviert. Davon werden 100 ml vor Beimpfen der zweiten Vorkultur zugesetzt. Die Beimpfung erfolgt durch Zugabe von 50 ml der ersten Vorkultur (Beimpfung mit 5 % v/v). Die Kultivierung erfolgt unter langsamem Schütteln bei ca. 45 rpm bei 32 °C für 24 Stunden.
Hauptkultur:
Das Medium der Hauptkultur besteht aus 20 g/1 Hefe-Extrakt, 10 g/1 pankreatisches Pepton und 25 g/1 Glucose. Die Glucose wird extra autoklaviert. Die Beimpfung erfolgt mit einem Liter der zweiten Vorkultur. Die Fermentationsparameter betragen 34 °C, pH 7,0, Belüftung über Kopfraum (25 1/min Luft) und Rührgeschwindigkeit 150 rpm. Der pH- Wert wird durch Titration mit einer 40 % Natronlaugelösung konstant gehalten. Glucose wird manuell so zugegeben, dass die Glucosekonzentration nicht unter 5 g/1 sinkt. Nach 11 Stunden ward die Kultivierung abgebrochen.
Ausfuhrungsbeispiel 2:
50 1 Kulturlösung einer Fermentation der Art Streptococcus agalactiae mit einem Hyaluronatlyase-Aktivität von 400 IU/ml werden durch Sterilfiltration in einem 0,2 μm Filter von den Lebendzellen befreit. Die klare Kulturfiltratlösung wird anschließend durch Ultrafiltration bei einem cut off von 60.000 D zu einem Kulturkonzentrat von 2 1 einge- engt. Diesen 2 1 Kulturkonzentrat werden 480 g festes Ammoniumsulfat zugesetzt. Die bei dieser Konzentration ausfallenden Proteine werden durch eine Klarfiltration unter Verwendung eines Filterhilfsmittels abgetrennt und das klare Konzentrat auf eine zuvor mit 40 %iger phosphatgepufferter Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 equilibrierte Phenylsepha- rose-Säule von 2,5 x 20 cm aufgetragen. Nach Wäsche mit einer 35 %igen phosphat- gepufferten Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 wird die Hyaluronatlyase mit einer 25 %igen phosphatgepufferten Ammoniumsulfatlösung pH 6,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen werden vereinigt und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80 % eingestellt. Das ausgefallene Präzipitat wird gesammelt sowie in 100 ml 0,03 M Trispuffer pH 8,2 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Anschließend wird die dialysierte Rohhyaluronatlyaselösung über eine equilibrierte Q-Sepharosesäule von 2,2 x 15 cm gegeben. Die Hyaluronatlyase befindet sich im Durchlauf. Der Durchlauf wird durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf 80 % gesättigt. Das ausfallende Protein wird gesammelt, in 0,05 M Trispuffer pH 8,7 gelöst und über eine Sephadex G 10-Säule vom Ammoniumsulfat befreit. Die so equilibrierte hyaluronatlyasehaltige Lösung wird auf eine entsprechend equilibrierte Affinitätssäule (0,8 cm x 10 cm) von N-(p-Amino- phenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,1 M NaCO3 -Lösung pH 9,7 eluiert. Die eluierten hyaluronatlyasehaltigen Fraktionen werden vereinigt und durch Sättigung auf 80 % mit Ammoniumsulfat gefällt. Das gefallene Präzipitat wird gesammelt, in 1 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,5 gelöst und auf eine Superdex 200-Säule (16 x 60) aufgetragen. Die Hyaluronatlyase-Proteinbande bei 116.000 D wird gesammelt und gegen 0,02 M Trispuffer pH 7,5, welcher 0,005 M MgCl2 enthält, dialysiert. Es werden 10 mg Hyaluronatlyase mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 IU/mg erhalten. Der dialysierten Hyaluronatlyase- lösung wird Ovalbumin in einer Konzentration von 1 % zugesetzt und die Lösung lyophil getrocknet. Durch unterschiedlichen Wassergehalt werden Enzymlösungen zwischen 20.000 IU/ml und ca. 4.000.000 IU/ml erhalten.
Das Holoenzym besitzt einen isoelektrischen Punkt im Bereich von IP = 8,6 und eine Molmasse im Bereich von 116 kD.
Ausführungsbeispiel 3 :
10 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37 °C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g fixierter MO/2-Proteasesepharose zugesetzt, an die eine proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/g gebunden wurden. Nach 15 Minuten wird die Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80 % ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment gesammelt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molge- wichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hatte eine spezifische Aktivität von 600 000 IU/mg.
Ausführungsbeispiel 4:
4 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Tris-HCL- Puffer pH 7,8 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37 °C gebracht. Dieser Lösung werden 80 μg der Protease MO/2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Kunitz- Einheiten/mg zugefügt und das Gemisch für 30 Minuten bei 37 °C verdaut. Zum Stoppen der Reaktion werden dem Gemisch 10 μl 0,1 M EDTA pH 7,0 zugesetzt. Danach wird das Gemisch auf eine 3 ml Affinitätssäule von N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,05 M Na CO3; pH 9,7 eluiert. Das Fragment wurde durch Sättigung auf 80 % Ammoniumsulfat gefällt, gesammelt und durch Molekulargewichtschromatografie gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 460 000 IU/mg.
Ausführungsbeispiel 5:
Aktivitätsbestimmung für Hyaluronatlyase bzw. des Fragments: a) Optischer Test bei 232 nm Es wird eine Stammlösungen für Hyaluronsäure (30 mg/100 ml) hergestellt und bei 4 °C aufbewahrt.
Der Standardtestansatz erfolgt in 3 ml-Quarzküvetten (d = 1 cm) bei einer Wellenlänge von 232 nm und einer Temperatur von 26 °C. Zu 1,8 ml 0,1 M Azetatpuffer pH 6,0 werden 200 μl Hyaluronsäure-Stammlösung gegeben und die Reaktion mit 2 bis 4 U/ml (50 ml) Hyaluronatlyase gestartet. Das Endvolumen beträgt 2050 μl.
Hyaluronatlyase zeigt eine lineare Zunahme der Extinktion bei 232 nm, aus deren Anstieg sich die Aktivität berechnen lässt.
Dabei wird ein Extinktionskoeffizient von ε = 6,0 x 103 1 x mol^cm"1 für das gebildete Δ4'5- ungesättigte Uronid zugrundegelegt (J. Ludowig: The mechanism of hyaluronidases. JBC 236, 333-339 (1991)). b) Optischer Test bei 600 nm auf Mikroplatten
Bestimmung der Lyaseaktivität nach D. Gerlach, W. Köhler „Hyaluronatlyase von Streptococcus pyogenes. II. Charakterisierung der Hyaluronatlyase"(E.C. 4.2.99.1.) Zbl. BaktHyg., I. Abt. Orig. A 221, 296-302 (1972). Eine Hyaluronatlyase-Lösung wird aus einer Stammlösung (50.000 U/ml) durch Verdünnen 1:50 hergestellt. 0,5 ml Hyaluronatlyaselösung werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg/ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2 ml einer 2,5 %igen Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung in 2 %iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1 cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespaltener Hyaluronsäure bestimmt. 5 internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyase spalten 16 μg Hyaluronsäure/min.
Ausführungsbeispiel 6:
10 mg Hyaluronatlyase des Holoenzyms werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37 °C gebracht. Dieser Lösung werden 0,25 g einer spezifisch spaltenden Proteasesepharose mit einer proteolytischen Aktivität von 0,1 Kunitz-Einlieiten mg zugesetzt. Nach 15 Minuten wird die unlösliche Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80 % ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment abgetrennt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molge- wichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert.
Ausführungsbeispiel 7:
Weiße Neuseeländer-Kaninchen (Charles River Deutschland) werden einzeln in Käfigen (0,5 x 1 m) bei Raumtemperaturen von 20 °C plus/minus 2 °C gehalten und mit Standard- rutter (ssniff Kaninchen-Haltung) und Trinkwasser ad libitum versorgt. Die Tiere erhalten insgesamt sechs s.c. Injektionen in die Ohren. Die Injektionen wurden dreimal pro Woche (montags, mittwochs und freitags) gesetzt. Der Injektionsbereich wird mit Farbe markiert. Die Tiere bekamen in das rechte Ohr (Kontrollohr) 0,45 ml 0,9 %ige NaCl-Lösung und in das linke Ohr (Therapieohr) 0,45 ml Hyaluronatlyase-Lösung injiziert. In das Therapieohr werden mit jeder Injektion eine Aktivität von 10.000 IU pro kg Körpergewicht injiziert. Das Injektionsvolumen wird alternierend in das Innen- und Außenohr ähnlich einer Perlschnur und jeweils in mehreren Depots quer zum Ohr gespritzt. Die Enzymlösung wird unmittelbar vor der Injektion hergestellt. Das Allgemeinverhalten und die Ohrknorpelspannung werden von zwei Personen beurteilt. Die Beurteilung findet vor jeder Injektion bis zum 13. Tag nach der letzten Injektion statt.
Das Allgemeinverhalten der Tiere wird erfahrungsgemäß durch die wiederholte Behandlungen mit 0,9 %iger NaCl-Lösung und 10.000 IU/kg Körpergewicht nicht erkennbar beeinträchtigt. Im Injektionsbereich werden kaum lokale Reaktionen beobachtet. Vereinzelt kann es zu geringfügige Blutungen oder leichter Rötung der Haut im Injektionsbereich kommen.
Nach der zweiten Injektion ist ein Nachlassen der Knorpelspannung im Vergleich zum Kontrollohr festzustellen. Diese Schwäche in der Ohrknorpelspannung besteht bis etwa zum 13. Tag nach der letzten Injektion. Sie ist erkennbar an einem deutlich verringerten Widerstand der Injektionsstelle gegenüber dem Abknicken des Ohres. Bei einem der Versuchstiere wird das Ohr in geknickter Anordnung durch einen Verband mit Heftpflaster fixiert. Das Ohr verbleibt drei Wochen in der geknickten Lage. Nach Entfernung des Verbandes verbleibt das behandelte Ohr in der geknickten Lage.
Ausführungsbeispiel 8:
Die Katheterlösung besteht aus einer isotonischen wässrigen Lösung, welcher hochgereinigtes Enzymprotein des Holoenzyms und/oder des Fragmentes oder definierte Mischungen beider aktiven Enzymspezies in solchen Mengen zugesetzt werden, dass die Enzymaktivitäten zwischen 5.000 bis 1.000.000 IU/ml betragen. Die Enzymproteine werden vorteilhafter Weise in Form eines gefriergetrockneten Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, eingesetzt. Stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, Albumin und dessen Hydrolysate oder Gelatine und seine Hydrolysate sein. Ausfυhrungsbeispiel 9:
Einem geschlachteten Hausschwein wird ein Herzkranzgefäß mit einem Außendurchmesser von 4 mm entnommen und das Blutgefäß von Geweberesten befreit. Das Blutgefäß wird in Stücke von jeweils 5 cm geschnitten. Anschließend wurden alle Gefäßstücke in physiologischer Kochsalzlösung eine Stunde gelagert. Zur enzymatischen Behandlung wurde ein Gefäßstück mit 0,5 ml einer Lösung von Hyaluronatlyase mit einer Aktivität von 100.000 IU/ml gefüllt, verschlossen und unter physiologischer Kochsalzlösung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kontrolle verblieb in physiologischer Kochsalzlösung. Mit einem medizinischen Ballonkatheter mit einer Ballonlänge von 4 cm und einem Durchmesser im gefalteten Zustand von etwa 4 mm, versehen mit einer Vorrichtung zur Druckmessung, wurden von den Gefäßstücken die Dehnung (Durchmesser in mm) in Abhängigkeit vom Ballondruck (atm) bestimmt. In der Zeichnung ist die Dehnbarkeit in Abhängigkeit vom Ballondruck bei einem durch eine erfindungsgemäße Formulierung behandelten sowie einem unbehandelten Gefäßstück dargestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1) oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon zur Erweichung von Bindegewebe, insbesondere zur Formkorrektur von Bindegewebe und Bindegewebestrukturen, in Mensch und Tier.
2. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym als Formulierung verabreicht wird, welche das Enzym und/oder ein Enzymfragment desselben mit einer Enzymaktivität von 100 IU/ml bis 5.000.000 IU/ml sowie gegebenenfalls pharmazeutisch, medizinisch und/oder kosmetisch wirksame Mittel, wie auch Stabilisatoren und/oder Hilfsstoffe, enthält.
3. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.
4. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym aus dem Mikroorganismus ausgewählt aus Streptococcus agalactiae und Streptococcus equisimilis gewonnen wird.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment der Hyaluronatlyase eine Molmasse im Bereich von 84 kD bis 86 kD aufweist.
6. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in Form einer isotonischen, sterilen Injektionslösung vorliegt und durch parenterale oder epicutane Injektionen in das zu erweichende Bindegewebe oder in die Nähe des Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur eingebracht wird.
7. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym als isotonische und sterile Katheterlösung vorliegt, die durch das operativ geöffnete Innere eines Hohlorgans oder durch natürliche Organöffnungen in die Umgebung des zu erweichenden Bindegewebes bzw. der Bindegewebestruktur zugeführt wird.
8. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym zur topisch/epidermalen Anwendung als Formulierung in fester Form, als wässerige Lösung, als eine mit einem HydrokoUoid oder Gelbildner angedickte wässerige Lösung, als Paste, als Salbe, als Creme, als Gel bzw. als Schaum, vorliegt.
9. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym als eine wässrige Injektionslösung vorliegt, die für über die zu behandelnde Hautfläche verteilte epikutane Injektionen in das Hautgewebe vorgesehen ist.
10. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym als Formulierung eingesetzt wird und diese zur Aufnahme durch eine flexible Trägerschicht vorgesehen ist, welche als Pflaster oder Binde eingesetzt werden kann.
11. Verwendung von mikrobieller Hyaluronatlyase oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym bzw. Enzymfragment als wäßrige Lösung hergestellt aus gefriergetrocknetem Enzym bzw. Enzymfragment vorliegt.
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