DE1642578B2

DE1642578B2 - Verfahren zur Herstellung einer enzymatischen Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität

Info

Publication number: DE1642578B2
Application number: DE1642578A
Authority: DE
Inventors: Angelo J. Hempstead Chiulli; Edwin H. Freeport Wegman
Original assignee: Advance Biofactures Corp
Current assignee: Advance Biofactures Corp
Priority date: 1966-07-08
Filing date: 1967-06-29
Publication date: 1974-02-14
Also published as: JPS4924669B1; DE1642578A1; US3705083A; BR6791131D0; GB1192937A; DE1642578C3

Description

sammensetzung wirkt hemmend auf das Wachstum von Mikroben, Diese neue, die Wirksamkeit von Kollagenase und proteolytischem Enzym aufweisende Zusammensetzung verhindert in Konzentrationen von mehr als etwa 0,1 mg/ml das Wachstum verschiedener Mikroben, wie Staph. aureus und Organismen der Gattung Clostridium. Das Verdünnen der enzymatischen Zusammensetzung auf Konzentrationen von 0,1 mg/ml oder weniger erlaubt hingegen das Wachstum dieser Bakterien.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Clostridium histolyticum ATCC 21000 unterscheidet sich von dem gewöhnlichen Clostridium histolyticum, das in »Manual of Determinative Bacteriology« von B er ge y (7. Auflage 1957, S. 690 und 691) beschrieben worden ist, dadurch, daß der neue Stanui keine Flagellen enthält und deshalb nicht beweglich ist.

Die Fermentation gemäß der Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für das Wachstum von Clostiidium histolyticum üblich sind. Die Fermentation erfolgt bei etwa 32 bis 37° C (vorzugsweise 37° C) für 21 bis 26 Stunden in einem Nährmedium, das eiweißartige Stoffe, wie trypsinbehandeltes Soja und Proteasepepton sowie auch Vitamine und Mineralsalze, wie Magnesiumsulfat, einbasisches und zweibasisches Kaliumphosphat und Ferrosulfat enthält. Das eiweißartige Material dient als Quelle von sowohl Nährkohlenstoff als auch Nährstickstoff. Der bevorzugte pH-Wert des Fermentationsmediums liegt zwisc' en 6,5 und 7,5. Andere Fermentationsmedien für das Wachstum von Clostridium histolyticum sind bekam.t und können gegen das oben beschriebene Medium ausgetauscht werden. Das Fermentationsgefäß wird mit einer Kultur von Clostridium histolyticum ATCC 21 000 geimpft, wobei übliche Tmpftechniken angewandt werden. Vor dem Impfen werden das Fermentationsgefäß und sein Inhalt in einem Autoklav 30 Minuten bei erhöhter Temperatur und erhöhtem Druck gehalten, beispielsweise bei 121° C und 1,05 kg/cm^ä, und werden dann auf Zimmertemperatur gekühlt, am das Medium zu sterilisieren.

Die Fermentationsflüssigkeit wird zentrifugiert, um die Zellen des Mikroorganismus von der Flüssigkeit zu trennen. Die reine zentrifugierte Flüssigkeit wird dann in eine gesättigte v/äßrige Ammoniumsulfatlösung gegossen, um die enzymatische Zusammensetzung auszufällen. Die Ammoniumsulfatlösung wird auf einer niedrigen Temperatur, nicht über 6" C und gewöhnlich auf etwa 4° C, gehalten. Diese Lösung enthält etwa 500 g Salz je Liter, wobei die genaue Menge hauptsächlich in Abhängigkeit von der in der gesättigten Lösung bei der bestimmten gewählten Arbeitstemperatur enthaltenen Menge variiert. Das Material verbleibt über einen beträchtlichen Zeitraum in dieser Ammoniumsulfatlösung, etwa i8 Stunden, bei einer Temperatur, welche 6⁰C nicht übersteigen darf. Der Niederschlag wird in üblicher Weise filtriert ode:r zentrifugiert. Die enzymatische Zusammensetzung wird gekühlt, in Dialysierrohre gefüllt, die im allgemeinen aus Cellophan sind, und gegen rinnendes Wasser etwa 24 Stunden dialysiert, um Salz zu entfernen. Das Vorliegen von Ammoniak im abströmenden Wasser kann durch Nesslers Reagens bestimmt werden. Die Dialyse wird fortgesetzt, bis der Nessler-Reagens-Test negativ ist. Das dialysicrte Enzym wird gefroren und dann

gefriergetrocknet. Dies kann dadurch erfolgen, daß das Enzym aus dem Dialysierrohr in Schalen gebracht wird, in denen das Gefrieren und Gefriertrocknen stattfindet. Der Gefriertrockner wird auf einem Druck von 0,25 mm Hg oder weniger gehalten. Obwohl die Temperaturen beim Gefriertrocknen weitgehend variieren können, wird die Arbeitsweise beschleunigt, wenn eine verhältnismäßig hohe Temperatur, etwa 21° C, aufrechterhalten wird. Die Zeit in dem Gefriertrockner beträgt im allgemeinen etwa 18 Stunden. Das gefriergetrocknete Material wird aus den Trockenschalen entfernt und in Polyäthylenbeutel gebracht.

Die durch Gefriertrocknen erhaltene enzymatische Zusammensetzung muß bei der ins Auge gefaßten Verwendung (s. oben) sterilisiert werden. Es wurde nun festgestellt, daß dies mit geringen Kollagenaseverlusten wirkungsvoll durch an sich bekanntes Bestrahlen geschehen kann. Kobalt 60 und andere radioaktive Isotope können als Strahlenquelle verwendet werden. Die Bestrahlung kann auch mit Röntgenstrahlen durchgeführt werden.

Bei der Bestrahlung wird die lyophilisierte enzymatische Zusammensetzung einer Gesamtstrahlungsmenge von mindestens 2,5 Megarad oder etwa 4,5 bis 5,5 Megarad ausgesetzt. Die Dosierung darf etwa 7 Megarad nicht übersteigen, da höhere Dosen die Enzyme zersetzen können. Die Bestrahlung wird mit herkömmlicher Apparatur ausgeführt. Die zu bestrahlenden Enzyme befinden sich in den PoIyäthylenbeuieln. welche in einem solchen Abstand angeordnet sind, daß die Strahlungsintensität durch den Beutel ziemlich gleichmäßig ist. Die Gesamtbestrahlungszeit beträgt etwa 120 bis 160 Stunden, wenn die Strahlungsintensität in der Giößenordnung von etwa 0,03 bis 0,04 Megarad pro Stunde n'egt.

Die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zusammensetzung kann, wenn gewünscht, auf andere Weise sterilisiert werden., beispielsweise durch Filtrieren.

Das sterilisierte Matenal wird sowohl auf KoI- !agenase-Aktivität als auch auf proteolytische Aktivität geprüft, wobei der Ninhydrin-Test bzw. der Azocoll-Test verwendet wird. Bekannte Standardversuchsverfahren werden zur Durchführung dieser Tests verwendet. Beispielsweise werden die Azocoll- und Ninhydrin-Testverfahren gemäß Mandl et al, J. Clin. Invest. 32, 1953, S. 1323 oben, durchgeführt. Das Material wird auch auf Sterilität geprüft.

Beim Sterilitätstest wird das Enzym auf 0.1 mg/ml verdünnt und aliquote Mengen des Enzyms in zwei Sätze von Röhren gebracht, von denen einer einen Nährboden und eine kleine Anzahl, beispielsweise etwa 5 bis 10, lebensfähiger mikrobieller Zellen enthält und der andere den Nährboden, aber keine Zellen enthält. Für diesen Zweck werden typische Versuchsmikroorganismen, wie Staph. aureus, verwendet. Wenn die enzymatische Zusammensetzung steril ist, entwickelt sich Wachstum in den Röhren, die Zellen enthalten, aber nicht in den Röhren, in die keine Zellen zugefügt wurden. Das Verdünnen des Enzyms auf etwa 0,1 mg/ml oder weniger ist wesentlich bei der Durchführung des Sterilitätstests, da das Enzym in größeren Konzentrationen das Wachstum von Mikroorganismen hemmen kann.

Die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zusammensetzung kann als lokal aufzutragende Salbe angewendet weiden. Zu diesem Zweck wird

5 Γ ό

die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zu- Wirkungen verursacht. Es entsteht höchstens gelegentsammensetzung in einen üblichen Salbenträ'ger, z, B, Hch leichte Entzündung von umgebendem Gewebe, Vaseline, in Konzentrationen von etwa 0,1 bis etwa Die erfindiingsgemäß hergestellte enzymatische 0,2 Gewichtsprozent eingebracht. Eine Salbe kann Zusammensetzung verhindert das Wachstum von auch 0,5 Prozent der enzymatischen Zusammen- 5 Mikroorganismen, wenn sie in Konzentrationen von setzung: bezogen auf das Gewicht der Vaseline, ent- etwa 1 mg/ml oder größer vorhanden ist. In vielen halten. Die Salben können, wenn gewünscht, auch Fällen, besonders wenn keine bakterielle Infektion Antibiotika enthalten, um Infektionen an der Ver- eingesetzt hat, ist die Verwendung von Antibiotika letzungsstelle zu bekämpfen. Die Salbe wird direkt in Verbindung mit der erfindungsgemäß hergestellten auf die Verletzung aufgetragen. Der Bereich wird ία enzymatisohen Zusammensetzung nicht nötig. Diese zuerst gereinigt, um alle Stoffe zu entfernen, welche kann jedoch, wenn gewünscht, mit einem Antidie Wirkung der enzymatischen Zusammensetzung biotikum verwendet werden. Es wurde auch festbeeinträchtigen können. Dies kann mit einem sterilen gestellt, daß ihre Wachstumshemmeigenschaften ihre Gazebausch geschehen, der mit sterilem Wasser oder Verdünnung auf etwa 0,1 mg/ml oder weniger erfor-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 getränkt 15 dem, indem Sterilitätsversuche, wie oben beschrieben, ist. Die Salbe wird auf einen Gazeüberzug gegeben., durchgeführt wurden.

welcher direkt auf die Verletzung gelegt wird. Das Die Erfindung wird nun an Hand nachfolgender

Aufbringen der Salbe geschieht täglich oder jeden Beispiele beschrieben,
zweiten Tag. Die Gaze, die die Salbe enthält, wird

mit einem sterilen Überzug bedeckt. 20 B e i^c ρ i e 1 1

Die Zersetzungswirksamkeit der erfindungsgemäß

hergestellten enzymatischen Zusammensetzung mit Der Stamm Clostridium his*olyticum ATCC 21 000

proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität wird zur Impfung eines Keimmediums verwendet,

kann durch kontrollierte Experimente an Versuchs- das 3 Gewichtsprozent trypsinbehandeltes Sojaöl, tieren, wie Meerschweinchen, demonstriert werden. 25 1 Gewichtsprozent Proteasepepton und als Rest Was-

Für Versuchszwecke werden Brandwunden von vor- ier enthält und einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7.5

herbestimmter Intensität auf den Versuchstieren her- aufweist, welches vorher in einem Autoklav bei

gestellt. Das Aufbringen einer Salbe, welche die 121,5' C und einem Druck von 1,05 kp/em"² mehr

erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zusam- als 15 Minuten sterilisiert worden war und anschliemensetzung enthält, auf die verbrannten Flächen er- 30 ßend auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Das

gibt eine ungewöhnlich wirksame Zersetzung von Volumen jedes Keimkolbens beträgt 250 ml. Die

verbranntem Gewebe. Keimkolben werden 48 Stunden auf 37° C gehalten.

Diese Salbe hat sich bei Raumtemperatur über Nach Ablauf dieses Zeitraums werden Proben des

einen Zeitraum von 48 Wochen als haltbar erwiesen. Fermemationsmodiums mikroskopisch auf Reinheit Das Enzym ist jedoch wärmeempfindlich, und Tem- 35 geprüft, und die proteolytische Aktivität wird durch

peraturen beträchtlich über der Raumtemperatur die Azocoll-Miethode gemessen, die unten beschrieben

sollten vermieden werden. Um eine lange Lagerfähig- wird.

keit sicherzustellen, sollte die Salbe bei einer Tempe- Es werden 10 1 Fermentationsmedium mit folgen-

ratur nicht über 24° C gelagert werden. der Zusammensetzung hergestellt:
Die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische 40

Zusammensetzung kann injiziert werden, um interne Trypsinbehandeltes Sojaöl 1,5 %

Verschorfung und Reabsorption von physiologisch Proteasepepton 5,0⁰O

antagonistischem Gewebe zu erleichtern. Beispiels- MgSO₄ · 7H₂O 800 mg

weise werden Injektionslösungen verwendet, um das KH₂PO₄ 19.2g

Verschorfen von operablen Vorsteherdrüsen zu be- 45 Wa₂HPO₄ 90 g

schleunigen, deren Lebensfähigkeit durch Injektion Vitaminkonzentrat *) 50 ml

von flüssigem Stickstoff zerstört worden ist, um das FeSO₄-Lösung

Stroma von Tumormassen zu zerstören und die (0.120 Gewichtsprozent) 60 ml

Kollagenmatrix von überflüssigen Calciumablagerun- pH-Wert 6.5 bis 7,5

gen aufzulösen. Geeignete Injektionslösungen ent- 50 *) 100 ml dieses Konzentrates enthalten:

halten etwa 0,2 bis 5 Gewichtsprozent der erfindungs- Calciump<mtothenat 20 mg

gemäß hergestellten enzymatischen ZusammensetzuiiE Nikotinsäure 20 mg

in physiologischer Salzlösung. " ^^Γία.?^χ'Π ?0 mg

Die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische ThiLmiT"^ '.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'..''.''.'.'..''.'.'.'. 20 mg

Zusammensetzung besitzt eine kombinierte Aktivität 55 Riboflavin ................. '. 2,0 mg

von proteolytischem Enzym u>id Kollagenase, wodurch sie bei der Zersetzung von Gewebe unerreicht 8 1 d-s obigen Mediums werden in ein 10-1-Fcrwirksam wird. Diese enzymatische Zusammensetzung mcntationsgeläß gebracht.

kann zur wirksamen Zersetzung von nekrotischcm Das Fermentationsgefäß wird 30 Minuten bei

und absterbendem Gewebe verwendet werden, wäh- 60 121,5° C und 1,05 kp/cm² im Autoklav behandelt

rend bekannte Kollagenase, wenn sie allein venven- und auf Raumtemperatur gekühlt. Es wird dann mit

det wurde, schlechtere Ergebnisse ergab. Die gemein- den Keimkulturen von Clostridium histolyticum

same Verwendung von bekannter Kollagenase und ATCC 21 000 beimpft und 21 bis 26 Stunden bei

einem proteolytüchen Enzym führt zu keiner verlaß- 37° C inkubiert. Die Zellen werden dann von der

liehen wirksamen Zersetzung, weil die zwei Enzyme Flüssigkeit abgetrennt, indem letztere bei 10000UpM

häufig unvereinbar sind. °⁵ zentrifugiert wird, bis man eine reine Flüssigkeit

Durch die ejf.ndungsgemäß erhältliche cnzy- erhält. Die Flüssigkeit wird dann in eine Ausfäll-

matische Zusammensetzung werden keine Neben- trommel gegossen, die eine gesättigte wäßrige

7 8

Ammoniumsulfatlösung (ungefähr 500 g/l) bei 4° C auf das Vorhandensein von Chloridionen geprüft, enthält, und 10 Minuten gründlich umgerührt. Die wobei der Silbernitrat-Test angewendet wird. Die Ausfälltrommel und ihr Inhalt werden 18 Stunden Wasserwaschung wird fortgesetzt, bis der Test negaauf 4° C gehalten. Der Niederschlag wird dann tiv ist. Die vorstehende Bearbeitung erfolgt bei einer filtriert, gesammelt und in ein Cellophan-Dialyse- 5 Temperatur von nicht höher als 6⁰C. Nach dem rohr gebracht und 24 Stunden gegen laufendes Was- Waschvorgang wird überschüssiges Wasser abgezogen, ser dialysiert. Während der letzten Stunde läßt man und die Sehnenstücke werden lyophilisiert
das Wasser mit dem Rohr in Berührung stehen. Das 25 mg geschnitzeltes, nicht denaturiertes Kollagen Wasser wird mit Kesslers Reagens auf Ammoniak werden in ein Versuchsrohr gebracht, und 0,1 ml geprüft. Wenn die Reaktion positiv ist, wird die io einer O,l°/oigen wäßrigen Lösung des lyophilisierten Dialyse drei Stunden fortgesetzt und das Wasser Enzyms und 5 ml eines Puffers, werden zugegeben, wieder mit Nesslers Reagens geprüft. Wenn die Der Puffer hat folgende Zusammensetzung:
Reaktion negativ ist, wird der dialysierte Niederschlag in Lyophilisierschalen aus rostfreiem Stahl Tris-(hydroxymethyl)-aminomcthan

geleert, gefroren und in einen Gefriertrockner ge- 15 (0,2 M) 50 ml

bracht. Der Gefriertrockner wird bei einem Druck HCl (O,2 M) 44,2 ml

von nicht über 0,25 mm Hg und einer Temperatur Calciumacetat (0.02 M) 100 ml

von 2PC gehalten. Die Gefriertrocknungszeit be- Destilliertes Wasser 200 ml

trägt etwa 18 Stunden. Das gefriergetrocknete . .
Material wird entfernt, leicht gemahlen und in Poly- 20 ^Ein Kontrollrohr A wird wie oben hergestellt, ausäthvlenbcutcl gebracht. Ein Beutel wird für jede genommen, daß das Enzym weggelassen wird. Ein Schale verwendet. Jeder Beutel enthält im Durch- ^7Weites Kontrollrohr B wird wie ooen hergestellt, schnitt 35 g eefriereetrocknete enzymatischc Zu- ausgenommen das Weglassen des Kollagens (Rohr B samn-wnsetzung " " enthalt Enzym). Ein drittes Kontrollrohr C wird wie "Das Enzym'wird durch Bestrahlung sterilisiert. 25 oben hergestellt, ausgenommen, daß 0,1 ml 0,l«/.iges wobei eine Kobalt-60-StrahlungsquelIe verwendet ^Τ0Φ*'η an Stelle des obigen Enzyms zugegeben wird. wird. Ein Paar Beutel und ecgebenenfalls znsätz- Jedes der vier Rohre wird 24 Stunden bei 37° C liehe kleine Probenteile mit einem Gesamtgewicht mkubiert. Nach der Intaibiening werden 0,5 ml der von etwa 75 g werden in einen Behälter von 108 mm ^klaren· ^oben schwimmenden Flüssigkeit von jedem Durchmesser und 127 mm Höhe gebracht. Der Be- 30 Rohr dekantiert und in einen 10-ml-Meßkolben gehälter wird in. einer Vorrichtune bestrahlt, die einen ^bracht- ^In J^eden Meßkolben werden 1 ml l°/oige abgeschirmter Bereich, eine Kobalt-60-Sirahlung-;- ^wäßn_?e Ninhydrinlösung und 2 ml 5%>iige wäßrige quelle und einen um eine durch die Strahlungsquelle f'yridinlösung zugefügt. Die Meßkolben werden verlaufende vertikale Achse rotierenden Drehtisch -° Minuten in ein siedendes Wasserbad gebracht, enthält. Bei einem typischen Versuch wird ein mit 35 Genügend destilliertes Wasser wird zugefügt, um ein Enzym gefüllter Behälter auf einen Drehtisch ge- Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben, und die Testbracht, wobei sich seine Basis 178 mm oberhalb lösungen werden in einem photoelektrischen Klettdcs Bodens der Abschirmung und seine Achse Colorimeter bei 570 Millimikron gegen diie Kontrolle 127 mm von der Quelle befinden. Die Durchschnitts- abgelesen. Die Kollagenaseaktivität wird in C-Emhöhe des Behälters oberhalb des Bodens ist dieselbe 40 ^{heiten aus}iedruckt. Eine C-Einheit stellt die Abwie die Höhe der Quelle. In einem typischen Ver- ^Iesun? ^der optischen Dichte dar, die erreicht wird, such wurde der Behälter inseesamt 142 Stunden ^wenn ^l ^m? Enzym auf 25 mg Kollagena;;e unter den bestrahlt, wobei er eine Durchschnittsdosis von ^oblS^en Bedingungen einwirkt. Die Kollagenase muß 5.0 Megarad erhielt, die von 4,77 Megarad am ^eine Mindestaktivität von 40 000 C-Einheiten je Boden des Behälters bis 5.25 Megarad in der Mitte 45 Gramm haben, sonst wird sie ausgeschieden,
variierte.

Jede Enzymprobe wird nach der Bestrahlung auf Proteaseprüfung
Kollagenaseaktivität, Proteaseaktivität und Sterilität

geprüft. »Azocolk wird nach dem Verfahren von D a k 1 e y

Kollaeenaseprüfune ⁵° ^{et aI}· ^Joumal of Pathology and Bacteriology,

Band LVIII, Nr. 2, S. 227 und 232 (1946), hergestellt.

Nicht denaturiertes Kollagen wird für die KoI- Die proteolytische Enzymaktivität bei Verwendung

lagenase wie folgt hergestellt: von Azocoll-Reagenz wird nach dem Verfahren von

Von einem frisch geschlachteten Tier genommene Ma η dl et al., journal of Clinical Investigation, 32 Rinder-Achillessehne wird von Fett und Unregel- 55 (1953), S. 1323, bestimmt. Die Proieaseaktivität dar! mäßigkeiten befreit und dann in Stücke von etwa nicht weniger als 4000 Q-Einheiten betragen, sonsi 6 mm im Quadrat geschnitten. Diese Stücke werden wird das Enzym ausgeschieden,
nacheinander bei 6⁰C in drei Lösungen von wäßrigem zweibasischem Natriumphosphat (m/15) drei Anwendungsbeispiel A
Tage in jede Lösung getaucht. Nach dem dritten 60

Eintauchen wird die Sehne 24 Stunden in Leitungs- Es wird eine Salbe durch Vermischen von 5 g gewässer gelegt. Die gewaschene Sehne wird dann nach- maß Beispiel 1 hergestellter enzymatischer Zusameinander in drei 25prozentige wäßrige Kaliumchlorid- mensetzung mit 995 g weißer Vaseline hergestellt, lösungen getaucht, wobei sie drei Tage in jeder

Lösung verbleibt. Nach dem dritten Tränken mit 65 Anwendun«sbeispielB

Kaliumchlorid wird die Sehne eine Woche lang in ° ... "

Leitungswasser gelegt, wobei das Wasser täglich ge- Es wird eine Salbe durch Vermischet der folgen

wechselt wird. Die oben schwimmende Lösung wird den Bestandfeile hergestellt: ; ·

ίο

Enzymatische Zusammensetzung

(erhalten gemäß Beispiel 1) 5 g

Antibiotikum*) 10 g

Weiße Vaseline 985 g

*) Das verwendete Antibiotikum ist ein parenteral« Antibiotikum in Einheitsdosierungsform und enthält 0,5 g Streptomycin, 300 000 Einheiten Procain-Penicillin G und 100'000 Einheiten gepuffertes Penicillin G. Es wird dei Salbe einverleibt, um nicht-spezifische Zersetzung zu vernic'den.

Anwendungsbeispiel C

20 Meerschweinchen mit einem Gewicht von 500 bis 800 g wurden mit Natriumpentobarbital anästhetisiert. Beide Seiten der Tiere wurden mit einer elektrischen Haai schneidemaschine geschoren und dann rasiert. Ein kreisförmiger Bereich von 5 cm Durchmesser wurde auf jeder Seite tangierend an eine Linie markiert, die parallel und in einem Abstand *o von 13 mm zum Rückgrat des Tieres verlief. Ein i25-ml-Becheirglas mit Wasser wurde auf 8O⁰C erhitzt, was mit einem gerade unter die Oberfläche des Wassers getauchten Quecksilber-Thermometer gemessen wurde:. Der markierte Bereich des Tieres as wurde 20 Sekunden mit der Oberfläche des Wassers in Berührung gebracht. Der Verbrennungsbereich wurde mit denaturiertem Äthylalkohol gereinigt, der dann verdampfen konnte.

Es wurde eine Testsalbe wie im Anwendungsbeispiel E und eine Kontrollsalbe, bestehend aus Vaseline und dem Antibiotikum in den Mengen, wie im AnwenduEgsbeispiel B, aber ohne die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zusammensetzung hergestellt und bewertet.

Von den 20 bei dieser Untersuchung verwendeten Tieren wurden 16 Tiere auf einer Seite mit der erfindungsgemäß hergestellten, enzymatische Zusammensetzung enthaltenden Salbe und auf der anderen Seite mit Kontrolkalbe behandelt. Davon erhielten acht die Salbe auf die rechte Seite. Zwei Tiere wurden auf beiden Seiten mit der Salbe behandelt, und zwei Tiere schließlich erhielten die Kontrollsalbe auf beide Seiten.

Die Salben wurden täglich auf jedes Versuchstier « aufgetragen. Die Salben wurden auf Gazekissen verteilt, die mit der Wunde in Berührung gebracht wurden. Diese wurden mit einem Klebestreifen am Umfang des Tieres befestigt, und eine zusätzliche Streifenlänge wurde um den Nacken des Tieres ge- 50 führt, um ein Losreißen zu verhindern. Die Salben wurden mit einem Code versehen, so daß die Person, die sie auflegte, nicht wußte, ob sie eine Salbe mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder eine Kontrollsalbe auflegte. Die Reihenfolge, in welcher 55 die Tiere beobachtet wurden, wurde täglich verändert. Vor jeder Beobachtung wurde die Wunde mit einem in Wasser getauchten Baumwollbausch leicht abgerieben. Die Behandlung wurde insgesamt 96 Stunden lang durchgeführt Am Ende dieser Zeit 60 wurden die Tiere beobachtet, und der Prozentsatz der Zersetzung wurde durch Messen des zersetzten Bereiches bestimmt Die Prozentsätze der Zersetzung bei Verwendung sowohl der Salbe mit der erfindungsgemäß hergestellten enzymatischen Zusammeaset- 65

zung als auch der Kontrollsalbe und die Differenzen

zwischen diesen Prozentsätzen der 2&Set»ffig für ATCC 21 OfK)

die 16 Tiere, welche die Salbe auf dnnrSäK und ATCC 8034 .

Kontrollsalbe auf der anderen Seite erhielten, sind in der folgenden Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

	Seite der Tiere,	°/o der Zersetzung	rechte Seite	Differenz
	die mit der die		0
	erfindungsgemäß		100
	hergestellte		25
Tier-Nr.	enzymatische	linke Seite	95	90
	Zusammen	90	70	100
	setzung enthal	0	0	70
	tenden Salbe behandelt wurde	95	100	95
8-1	links	0	0	70
8-2	rechts	0	20	80
8-3	links	80	90	90
9-1	rechts	10	30	15
9-2	rechts	15	95	75
9-3	links	95	15	60
9-4	rechts	30	95	65
9-5	links	95	15	95
10-1	links	0	70	60
10-2	rechts	75	70	90
10-3	links	5	70	75
10-4	rechts	90	5	70
10-5	links	0	0
10-6	rechts	85		—
10-7	links	90
10-8	rechts	0		—
10-9	beide	20
10-10	beide
Ii -11	keine
10-12	keine

Vergleichsversuche

Die erfindungsgemäß unter Einsatz des unbeweglichen flagellenlosen Stammes Clostridium histolyticum ATCC 21 000 hergestellte enzymatische Zusammensetzung und eine unter der aus der USA.-Patentschrift 3 201325 bekannten Verwendung eines Clostridium-histolyticum-Stammes, wozu hier der bewegliche, mit Fiagellen versehene Stamm Clostridium histolyticum ATCC 8034 eingesetzt wurde, erhaltene Präparation mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität wurden hinsichtlich der Wirksamkeit und Tcxizität bewertet.

Jeder dieser Clostridium-histolyticum-Stämme wurde zur Herstellung des kollagenasehaltiger Enzympräparates unter sonst identischen Verfahrensmaßnahmen eingesetzt, die denen des im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens ähnlich waren.

a) Jede dieser Enzymproben wurde hinsichtlicl der Kollagenase-Aktivität sowohl vor als auch nacl Bestrahlung untersucht, wobei folgende Ergebnis» erhalten wurden:

Tabelle Π
Untersuchungen zur Kollagenase-Aktivität

Stamm

vorder
Bestrahlung

Wirksamkeit

nach der
Bestrahlung

16
10

6,5
4,5

Das vom ATCC 21 000 abgeleitete Enzympräparat besaß somit eine größere Kollagenasewirksamkeit als das von ATCC 8034 abgeleitete Enzympräparat.

b) Jede der wie oben erhaltenen Enzymproben wurde auf ihre nroteolytische Wirksamkeit sowohl vor als räch der Bestrahlung geprüft, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Tabelle III
Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität

Sitamm

ATCC 21 000
ATCC 8034 ..

vor der
Bestrahlung

Wirksamkeit

nach der
Bestrahlung

190
140

100
70

Wiederum besaß die aus dem Stamm ATCC 21 000 hergestellte, enzymatische Zusammensetzung überlegene Wirksamkeit im Vergleich mit der Wirksamkeit des von dem bekannten Stamm abgeleiteten Enzympräparates.

c) Jede der wie oben erhaltenen kollagenasehaltigen Proben wurde nach ihrer Bestrahlung auf akute Säugetiertoxizität untersucht, indem Schweizer Albinomäusen Lösungen (durch Auflösung von 30 mg des jeweiligen Enzympräparats in 1 ml wäßrigem 0,85°/oigem NaCl) injiziert wurden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Tabelle IV

Akute Toxizität der bestrahlten Enzymprobe
von ATCC 21 000

Maus-Nr.	Maus- Gewicht, g	Dosis, mg	Ergebnis
1	26,3	2	überlebte
2	25,0	4	überlebte
3	27,0	6	überlebte
4	27,5	6	verendete
5	28,5	8	verendete
6	27,5	10	verendete
7	26,2	5	verendete
8	25,0	5	überlebte

Tabelle V

Akute Toxizität der bestrahlten Enzymprobe
von ATCC 21 000

Maus-Nr.	Maus- Gewicht, g	Dosig, mg	Er3ebnis
1	27,5	3	überlebte
2	26,0	6	verendete
3	26,5	9	verendete
4	25,0	4	überlebte
5	25,0	5	verendete
6	24,5	3	überlebte
7	25,0	5	verendete
8	29,0	6	verendete
9	27,0	4	überlebte

Aul Grund der obigen Daten beträgt die minimale letale Dosis des aus ATCC 21000 hergestellten kollagenasehaltigen Enzyms etwa 5,5 mg, während die minimale letale Dosis der aus ATCC 8034 hergestellten Enzymprobe etwa 4,5 mg beträgt. Somit ist die aus ATCC 21 000 hergestellte enzymatische Zusammensetzung weniger toxisch als die unter Verwendung des bekannten Stammes hergestellte Enzymprobe.

ίο Ferner wurden unter Anwendung ähnlicher Verfahrensmaßnahmen wie im Anwendungsbeispiel C Wundausscheidungsversuche durchgeführt. Bei diesen Versuchen wurde eine vorher hergestellte Salbe (Kollagenasewirksamkeit 5 · 10* Einheiten/g) mit der erfindungsgemäß hergestellten enzymatischen Zusammensetzung, die aus 0,5% der erfiiidungsgemäß hergestellten enzymatischen Zusammensetzung und 99,5 Vo Vaseline bestand, mit einer Salbe verglichen, die jedoch Kollagenase enthielt, welche unter Verwendung von ATCC 8034 hergestellt worden war, durch Milliporenfiltration an Stelle von Bestrahlung sterilisiert worden war und eine Kollagenasewirksamkeit von etwa 12,5 · 10⁴ Einheiten/g besaß und in einer Konzentration in der Salbe von etwa 0,2% verwendet wurde, wobei eine Salbe mit einer Kollagenasewirksamkeit von etwa 5 · 10⁴ Einheiten/g erhalten wurde. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind nachfolgend zusammengefaßt:

Tabelle VI

Tier-	ATCC-	Behandelte	•/0 Wund	Diffe
Nr.	Stamm	Seite des Tieres	ausscheidung	renz
1	21000	R	98	23
	8 034	L	75
2	21000	L	65	15
	8 034	R	50
3	21000	R	65	63
	8 034	L	2
4	21000	L	95	10
	8 034	R	85
5	21000	R	90	20
	8 034	L	70
6	21000	L	70	20
	8 034	R	50
7	21000	R	95	65
	8 034	L	30
8	21000	L	45	-50
	8 034	R	95
9	21000	R	70	-10
	8 034	L	80
10	Vergleich*)	R, L	0,0
11	Vergleich*)	R, L	0,0
12	Vergleich*)	R, L	0,0

*) Salbe ohne Kollagenase.

Diese Daten zeigen, daß bei der Application d gleichen Mengen von Kollagenaseaktivität die a

dem Stamm ATCC 21 000 hergestellte kollagenas haltige enzymatische Zusammensetzung bei d

Unterstützung der Wundancscheidung wirksam

war als die aus dem Stamm 8034 hergestel Kollagenase.

Claims

Patentanspruch;

Verfahren zur Herstellung einer enzyraatischen Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität durch aerobes Züchten eines Clostridium histolyticum in hierfür üblichen Nährmedien und bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, dadurch ge-io kennzeichnet, daß man das flagellenlose Clostridium histolyticum ATCC 21 000 einsetzt, die Zellen entfernt und die enzymatische Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität aus der Fermentationsflüssigkeit gewinnt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatischen Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität. Diese besitzt ausgezeichnete Eigenschaften zum Entfernen von nekrotischem Gewebe. Der Heilungsprozeß bei infeküerten Wunden, Hautgeschsvüren, Verbrennungen zweiten und dritten Grades und anderen Zuständen, welche Hautverletzungen beim Menschen und anderen Säugetieren erzeugen, ist gewöhnlich recht langsam. Eine der Eigenschaften solcher Verletzungen ist das Vorhandensein von totem Gewebe an der Verletzungsstelle. Es ist nötig, dieses tote Gewebe zu entfernen, um eine gesunde Grundlage für das Wachstum neuen Gewebes zu schaffen. Das Entfernen dieses toten Gewebes kann entweder durch chirurgisches oder enzymatisches Zerlegen beschleunigt werden. Chirurgisches Zerlegen hat den Nachteil, daß es recht schmerzhaft ist, wenn das gesamte tote Gewebe weggeschnitten wird und das lebende Gewebe freiliegt. Es ist jedoch wesentlich, daß das gesamte tote Gewebe entfernt wird, um die Heilung der Verletzung und das Wachsen von neuem Gewebe zu erleichtern. Enzymatisches Zerlegen bietet ein weniger schmerzvolles und zufriedenstellendes Verfahren zum Entfernen von totem Gewebe. Wirksames enzymatisches Zerlegen erfordert nicht nur das Entfernen des offensichtlich nekrotischen Gewebes, sondern auch jenes Materials, gewöhnlich an der Peripherie der Wunde, welches, obgleich offensichtlich lebensfähig, nachklinische Nekrose enthält.

Das Säugetiergewebe, welches das Verschorfen aller Nekrose verhindert und Nekrose entwickelt, ist Bindegewebe oder Kollagen. Dies ist ein Protein, welches gegen alle Säugetierenzyme widerstandsfähig ist, so daß das Verschorfen von langsamen Denaturierungsvorgängen abhängig ist. welche das Kollagen in eine neue Form bringen, die dann durch lokale oder systemisclie Enzyme zersetzt werden kann. Um dann das nicht denaturierte Kollagen schneller zu entfernen, muß der Patient mit einer Kollagenase versehen werden, d. h. einem Emzym, welches nicht denaturiertes Kollagen zersetzt. Die Dringlichkeit, Nekrose zu entfernen, geht auf zwei wichtige Faktoren zurück. Erstens neigt Nekrose zur Beschleunigung mjkrobieller Infektionen, Ferner verbindert dieses tote und absterbende Gewebe die Einleitung des Heüungsprozesses, bei dem Menschen Granulation und Epithelisation.

Die Verwendung von Kollagenase als ein Material zum Zerlegen derartiger Gewebe wurde bereits vorgeschlagen. Jedoch sind die bisher bekannten Kollagenasen keine so wirkungsvollen Zersetzstoffe wie die erfindungsgemäß hergestellte enzymatische Zusammensetzung. In einigen Fällen besaßen die bisher bekannten Kollagenasen nur Kollagenasenwirksamkeit, ohne wesentliche Wirksamkeit gegen die anderen vorhandenen Proteine.

Auch ist. aus der USA.-Patentschrift 3 201325 bereits bekannt, daß zentrifugierte Fermentationsmedien, welche durch aerobes Züchten, eines Stammes von Clostridium histolyticum in bermentationsmedien erhalten wurden, proteolytisches Enzym und Kollagenase enthalten. Dort wird jedoch nicht der bestimmte erfindungsgemäß einzusetzende Stamm verwendet. Die nach diesem bekannten Verfahren hergestellte Kollagenase ist der erfindungsgemäß hergestellten enzymatischen Zusammensetzung sowohl hinsichtlich der Wirksamkeit als auch der Toxizitätswerte unterlegen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer enzymatischen Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität, die ein wirksameres Zersetzungsmittel als die gegenwärtig bekannte Kollagenase darstellt. Darüber hinaus soll diese enzymatische Zusammensetzung nicht toxisch sein und praktisch keine Nebenwirkungen zeigen. Ferner soll diese enzymatische Zusammensetzung als lokal anzuwendende Salbe zur Auftragung auf Hautverletzungen oder als injizierbares Mittel, das bei der Zersetzung von Bindegewebe in den inneren Teilen des Körpers wirksam ist, verwendbar sein und das Wachstum von Bakterien verhindern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatischen Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität durch aerobes Züchten eines Clostridium histolyticum in hierfür üblichen Nährmedien und bei hierfür üblichen Temperatur und pH-Wert-Verhältnissen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das flagellenlose Clostridium histolyticum ATCC 21 000 e^;nsetzt, die Zellen entfernt und die enzymatische Zusammensetzung mit proteolytischem Enzym und Kollagenase-Aktivität aus der Fermentationsflüssigkeit gewinnt.

Das erfindungsgemäß eingesetzte flagellenlose und somit unbewegliche Clostridium histolyticum ATCC 21 000 ist erstmals als Mutante in einer Kultur von üblichem mit Flagellen versehenem Clostridium histolyticum isoliert worden. Überraschenderweise hat die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte enzymatische Zusammensetzung unerwartete hervorragende Eigenschaften als Zersetzungswirkstoff. Diese neue enzymatische Zusammensetzung beseitigt nämlich wirksam das gesamte nekrotische Gewebe und einen kleinen umgebenden Bereich von gemischtem, d. h. lebendem und totem Gewebe, wobei sowohl Kollagen als auch andere Proteine angegriffen werden. Dadurch verbleibt eine reine Oberfläche, auf welcher das Wachstum von neuem, gesundem Gewebe einsetzen kann.

Die erfindungsgemäß erhaltene enzymatische Zu-