DE2414156A1

DE2414156A1 - Arzneimittel zur beseitigung uraemischer symptome und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2414156A1
Application number: DE2414156A
Authority: DE
Inventors: Kai Martin Edvard Pro Setaelae
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-03-23
Filing date: 1974-03-23
Publication date: 1975-09-25
Also published as: NL7503426A; US4022883A; FR2264557B1; FR2264557A1; SE7503260L; CA1062611A; BE826982A; LU72106A1; GB1488617A

Description

Arzneimittel zur Beseitigung urämischer Symp- . tome und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Beseitigung urämischer Symptome und Verfahren zu seiner Herstellung, das oral verabreicht wird. Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß die sich bei urämischen Patienten im Organismus ansammelnden nicht-proteinhaltigen Stickstoffverbindungen (!PS-Verbindungen: in der Literatur oftmals als "Urämietoxine" bezeichnet), biodegradieren und biosynthetisieren lassen zu nicht gefährlichen Metaboliten unter Verwendung von ausgewählten nichtpathogenen Bodenmikroorganismen, als Ergebnis dieser Mikroorganismen im Magen-Darm-Kanal des Patienten. Auf diese Weise kann wenigstens ein Teil der NPS-Verbindungen

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Konten: Deutsche Bank AG Hamburg, Kto.-Nr. 7/02455 ■ Postscheckkonto: Hamburg 1201 55-206

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sogar von dem Organismus genutzt werden. Es wird weiter festgestellt, daß NPS-Verbindungen als solche keine wertlosen "Abfallstoffe" darstellen, die notwendigerweise exkretiert werden müssen. Stattdessen wird nur ein nicht benötigter Überschuß an NPS, der nicht gebraucht worden ist, unter normalen Umständen ausgeschieden. NPS sind ferner keine "Endprodukte", sondern potentiell wertvolle Zwischenprodukte, die einen sogenannten Pendelverkehr im inneren Stoffwechsel gestatten, mit anderen V/orten

Synthese < Degradation < Resynthese. Zur Verhinderung der ÜberSchußanreicherung von ungünstigen NPS-V*erbindungen im Körper von Patienten, die an irreversiblem, fortschreitendem Nierenversagen leiden, müssen die für den inneren Stoffwechsel verantwortlichen Prozesse "zum Ablauf in umgekehrter Richtung" gebracht werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Arzneimittel zur Lin derung bzw. Beseitigung urämischer Symptome zu schaffen, das eine spezifische NPS-Verbindungen-ζersetzende Wirkung unter Verwendung von nicht pathogenen im Magen-Darm-Kanal von an Urämie erkrankten Personen einführbaren Bodenbakterien aufweist, wobei eine Biodegra dation von NPS-Verbindungen evtl. mit anschließender Biosynthese möglich ist. Darüber hinaus werden.die Aus bildung und Konzentration von stickstoffhaltigen

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"Schlackenstoffen" im Organismus Terringert.

Zur Bedeutung, d.h". Häufigkeit von Nierenkrankheiten sei folgendes ausgeführt: Im Vorwort von Manual of Artificial Organs (Handbuch der "künstlichen Organe), Bd. 1: The Artificial Kidney (Verf. X. Nose, Mosby Go., Saint Louis 1969) schreibt W.J. KoIff z.B. "je mehr wir besorgt und unglücklich über die Tatsache sind, daß nur 1,5% der bedürftigen 40 000 Menschen mit Nierentransplantation oder mit der künstlichen Niere geholfen wird, desto mehr suchen wir nach einer Lösung für die grausamen Probleme, welche durch chronisches Nierenversagen aufgeworfen werden." ¥.J. KoIff schreibt ferner in dem Geleitwort von Hämodialyse und Peritonealdialyse (Verf. P.Dittrich u. Mitarbeiter, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York 1969)» daß "zwei Komitees auf hoher Ebene, das Gotschalk-Komitee und das Burton-Komitee, haben bemerkenswert objektive Berichte in den Vereinigten Staaten vorgelegt. Wenn alle 40 000 Patienten, die Dialyse oder Nierentransplantation benötigen, behandelt werden wurden, wären die Unkosten in den Vereinigten Staaten 600 000 000 Dollar pro Jahr. Aber wie ich schon zuvor ausführte, nur ein und einhalb Prozent werden behandelt. Die übrigen werden einfach dem Ster·» ben überlassen, wie der frühere Kongreßabgeordnete Fogerty sagte, welcher zusammen mit Senator Lister Hill

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vermutlich mehr als irgendwer sonst für den Fortschritt der medizinischen Behandlung in den Vereinigten Staaten getan hat. Es sei daran erinnert, daß sich in den Vereinigten Staaten die Anzahl der tödlichen Automobilunfälle auf 57 000 im Jahre 1966 "belief. Diese Ziffer vergleicht sich mit den im Endzustand befindlichen urämischen Patienten pro Jahr, die für Nierentransplantation in Frage kommen sollten".

Zum urämischen Syndrom wird beispielsweise auf die Handbücher "Hämodialyse und Peritonealdialyse", P.Dittrich u. Mitarbeiter, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 1969; "The Kidney", A. Golden und J.F. Mäher, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1971; "Uremia: Progress in Pathophysiology and Treatment", J.P, Merill und CL. Hampers, Grüne and Stratton, New York, 1971» verwiesen.

Synonyme: Urämisches Syndrom = chronisch fortschreitendes irreversibles Nierenversagen = irreversible Funktionsstörung der Nieren.

Basische Pathogenese: Ist so weit unbekannt, nur die Symptome sind bekannt. Es ist ein Symptomkomplex, der oft in Zusammenhang mit vermehrten Metabolitenverhaltenswerten in Eörperflüssigkeiten steht. Oft besteht

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wenig Übereinstimmung zwischen chemischen Bestimmungen und klinischen Erscheinungen. Es ist nicht bekannt, welche der zahlreichen, im Blut und anderen Körperflüssigkeiten gemessenen NPS-Verbindungen toxisch und/oder für die urämisehen Symptome verantwortlich sind. -Guanidin ist eines der NPS, welches für "toxisch" gehalten wurde. Die Blut-Liquor-Schranke kann in Urämie geändert werden. Harnstoff beeinflußt ggf. den Transport anderer HPS-Verbindungen durch physiologische Membranen und spielt vielleicht eine wichtige Rolle bei der Diffusion mehr toxischer Substanzen in das Gehirn.

Schwere Urämie führt zur generellen Unfähigkeit. Die Patienten zeigen Schwäche in Verbindung mit anderen Symptomen, wie z.B. Übelkeit, Anorexie, Erbrechen, Gewichtsverlust, Unfähigkeit zur geistigen Konzentration, Hypertonie einschließlich ihrer verschiedenen Konsequenzen begleiten oft Nierenversagen und kommen zu den Symptomen hinzu. Bei manchen Patienten können verschiedene Grade und Typen von Anämie und/oder Protein- und/oder Salzerschöpfung die Zellenernährung beeinträchtigen. Alle Änderungen können nicht auf das .Verhalten von Harnstoff und anderen NPS-Verbindungen im Organismus zurückgeführt werden. Wasserintoxikation, Ungleichgewicht in der K- und Na-Verteilung können wichtig sein. Außerdem treten neuronale Änderungen auf. Depression des zentralen Nervensystems und neuromuskulare

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Reizbarkeit wurden als Auswirkungen von z.B. Guanidinen erklärt. Herz- und Perikardialstrukturen können "beeinflußt werden. Die Lunge kann urämische Pneumonitis zeigen. Krankhafte Veränderungen im Magen-Darm-Kanal sind häufig. Bestimmte Serumenzyme können sich in urämisehen Patienten verändern. Anämien entwickeln sich infolge von Knochenmarkunterdrückung. und/oder Hämolyse.

Zur gegenwärtigen Therapie der Urämie sei bemerkt, daß diese die Nierentransplantation und die Dialyse, wie Hämodialyse, Peritonealdialyse und verschiedene Enterodialysen "bzw. Magen-Darmschaftdrainagen mit oder ohne Diät aus energiereichen, qualitativ hochwertigen Nährstoffen umfaßt. Eine Nierentransplantation kann aus verschiedenen Gesichtspunkten nur an, einer beschränkten Anzahl von Nierenpatienten vorgenommen werden. So besteht beispielsweise ein Mangel an geeigneten Spendern. Grundlegende immunologische Prinzipien sind noch ungelöst. In einigen Fällen wird die verpflanzte Niere in ähnlicher Weise wie das ursprüngliche Organ angegriffen.

Die am meisten angewandte Maßnahme bei chronischer Niereninsuffiziens ist die Hämodialyse. Das Blut der Nierenpatienten wird z.B. einmal pro v/o ehe oder jeden zweiten oder dritten Tag jahraus, jahrein dialysiert.

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Große Mengen der angesammelten NPS-Verbindungen (urämische "Schlackenstoffe¹¹) werden durch die
Hämodialyse aus dem Blut entfernt. Dabei nimmt
beispielsweise im Verlauf von etx^ra 8 Stunden
dauernden Hämodialyse die Blut-Harnstoffkonzentration gegenüber dem Ausgangsxirert um etwa 50 % ab. Aber die NPS-Werte im Blut steigen wieder
schnell an: z.B. der Serum-Kreatinwert erreicht innerhalb etwa 24- Stunden den Ausgangswert. Die Peritonealdialyse ist im Prinzip nahezu genau so wirksam wie Hämodialyse. Sie muß ebenfalls wiederholt ausgeführt werden. Ihre Anwendbarkeit ist begrenzt: Sie kann nicht kontinuierlich angewandt werden.

Bestimmte Harnstoffmengen können auch vermittels Enterodialysen oder Magen-Darmschaftdrainagen entfernt werden. Diese Verfahren lassen sich nicht mehrfach wiederholen. Außerdem werden solche NPS-Verbindungen wie z.B. Kreatinin, nicht aus dem
Blut entfernt.

Es sei festgehalten, daß der menschliche Organismus sehr überschwenglich ic der Abscheidung von NPS-Verbindungen durch die Nieren zu sein scheint. In der Tat verlassen enorme Mengen den Organismus, wie z.B. Harnstoff 25 - 55 g pro Tag (=8-12 kg pro Jahr),

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Harnsäure 0,6 - 0,9 g pro Tag (= 0,2 bis 0,3 kg pro Jahr) und Kreatinin 1 - 2 g pro Tag (= 0,3 - 0,7 kg pro Jahr).

In Wiederkäuern werden Eiweißstoffe aus hydrolysiertem Harnstoff unmittelbar durch Wirkung von Mikroorganismen synthetisiert. Eine Diät, die niedrige Mengen von Stickstoff und hohe Mengen von Kohlehydraten enthält, begünstigt die Proteinsynthetisierung. Die Wiederverwendung von "Schlackenstickstoffen" verringert vermutlich die Abhängigkeit des Tieres von Umweltproteinquellen. Schafe mit Diät, arm an Proteinen können wenigstens 50 % des täglich produzierten endogenen Harnstoffs wiederverwenden, statt diesen zu exkretieren. Experimente mit Wiederkäuern zeigen außerdem, daß Kreatinin durch Pansenbakterien unter Erzeugung von Ammoniak metabolismert werden kann: Kreatin und Kreatinin werden durch Pansenmikroorganismen zu Harnstoff und Sarkosin abgebaut. Ein Teil des im Pansen erzeugten Ammoniaks (NH^) wird durch die Bakterien zur Synthese von Zellenbestandteilen verwendet. Ein Teil wird durch die Pansenwand in dem Pfortaderkreislauf absorbiert. Ein Teil verläßt den Pansen in die unteren Segmente des Magen-Darm-Kanals. Die Fähigkeit von Pansenbakterien zur Verwendung von Ammoniak hängt von der gleichzeitigen Verfügbarkeit anderer, zur Synthese ihrer Zellenbestandteile erforderlichen Nährstoffe

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ab. Besonders wichtig sind geeignete Kohlenstoff- und Energiequellen. Das Vorhandensein anorganischer Ionen zur Pansen-Ureasenaktivität ist entscheidend. Die Ergebnisse zeigen, daß Ureasenaktivität bei Vorhandensein von Mh, Mg, Ga, Sr und Ba stimuliert wird. Am wirksamsten ist Mn. Die Pansenbakterien erzeugen und benötigen B-Vitamine. Die verzweigtkettigen, flüchtigen Fettsäuren spielen offenbar hierbei eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des KohlenstoffSkeletts zur Biosynthese derjenigen Aminosäuren, die nicht durch bestimmte Pansenbakterien synthetisiert werden können. Neben der Harnstoffzersetzung sind verschiedene Mikroorganismen aufgrund der in ihnen enthaltenen Enzymsystemen in der Lage, Kreatin, Kreatinin, Harnsäure usw. zu zersetzen, also gerade diejenigen NPS-Verbindungen, die sich im Organismus von urämischen Patienten ansammeln. Die Ausbildung einiger Enzymsysteme im Organismus hängt vom Vorhandensein des Substrats im Medium ab. Die für die Oxidation von Kreatinin verantwortlichen Enzyme, Laktose oder Malonsäure sind "völlig anpassungsfähig", d.h. sie werden bei Abwesenheit des in Präge stehenden Substrats nicht gebildet. Die für die Zersetzung vieler anderer Substanzen, wie z.B. Harnsäure, Aminosäuren, Milchsäure, verantwortlichen Enzyme sind "teilweise anpassungsfähig", d.h. ihre Ausbildung erfolgt zu einem gewissen Ausmaß in Abwesenheit des Substrats aus dem

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Medi lim und wird bzw. durch dessen Zugabe zum Medium stark gesteigert. Andere Enzymsysteme wie z.B. die für die Oxidation von Glukose oder Glyzerol verantwortlichen sind konstitutiv.

Beim Menschen lassen sich die folgenden Merkmale über den NPS-Stoffwechsel beobachten. Harnstoffhydrolyse erfolgt im Magen-Darm-Kanal und beruht ausschließlich auf Bakterien. Die Verdauung in Wiederkäuern steht in einem bestimmten intimen Zusammenhang mit dem von monogastrischen Tieren. Beim Erwachsenen ist der Magen-Darm-Kanal / Darm von mehreren Spezies, Arten, Gattungen von Mikroorganismen bewohnt. Die Menge an Mikroorganismen im menschlichen (Dick·^ Darm ist enorm: so enthält ein Milligramm Kot etwa I5O 000 Mikroorganismen, und Bakterien stellen etwa 2/3 des trockenen Kots dar. Wenige Tage nach der Geburt beginnt sich die Darm-Flora zu entwickeln: die Blutgerinnungszeit normalisiert sich als Ergebnis der bakterienbedingten Synthese von "Vitamin K im Darm. In Erwachsenen synthetisieren Darmbakterien zahlreiche lebensnotwendige Verbindungen. Bei Patienten, die an chronisch fortschreitendem, irreversiblem Fierenversagen leiden, führt z.B. die Enterodialyse dazu, daß die Schleimhautmembranen passiv durchsetzt werden, wobei sie Unterschieden zwischen Gradienten, z.B.

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-MC-

Harnstoff folgen, und andere durch aktive Kräfte (ein Teil der Elektrolyten) durchgesetzt werden. Unter dem Gesichtspunkt der Erfindung ist es wichtig, daß die Bewegung von Harnstoff sehr schnell erfolgt.

Bei üramischen Patienten ist die Verwendung von Harnstoff-Stickstoff für die Eiweißsynthese erörtert worden. Bekanntlich stehen die Folgen "bei irreversiblem Eierenversagen in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Maß/Grad des Eiweißkatabolismus. Wenn dieser maximal verringert werden könnte, würde nicht nur die Ansammlung bzw. .Retention von MPo-Yerbindungen verlangsamt und verringert werden, sondern ebenfalls die Belastung durch K, P usw. bzw. das Verschwinden derselben verhindert werden. Ein Ziel bei der Therapie von irreversiblem lierenversagen ist, das Stickstoffgleichgewicht auf der niedristmöglichen Aufnahme von minderwertigen Proteinen und/oder Aminosäuren zu halten. Einige Ergebnisse wurden bei Behandlung urämischer Patienten mit entsprechender Diät erhalten, vermutlich weil das Stickstoff-Gleichgewicht durch Verabreichung essentieller Aminosäuren und hochwertiger Proteine im Gleichgewicht gehalten wurde. Untersuchungen des Harnstoff-Stoffwechsels bei niedriger Eiweißaufnahme

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haben gezeigt, daß z.B. Stickstoff aus Harnstoff, offensichtlich über bakterielle Hydrolyse zu Ammoniak zur Proteinsynthese verwendet werden kann. Die Harnstoff produkti on wird bei einer wenig Protein enthaltenden Diät verringert, jedoch der Harnstoffabbau aufrechterhalten. Es ist weiterhin nachgewiesen worden, daß bei Angehen des Ernährungsproblemes vermittels einer geeigneten Diät im Falle von Nierenversagen die Wahrscheinlichkeit dafür besteht, daß wenigstens einige der klinischen Probleme, wie Acidose, Hyperkalämie, Phosphatverhalten, verschwinden würden, wie auch einige Symptome der Urämie, welche vermutlich durch Harnstoff selbst verursacht werden. Harnstoff ist bei der Untersuchung bestimmter Probleme Kindernverabreicht worden, um aufzuzeigen, daß Kinder Harnstoff und andere einfachere stickstoffhaltige Stoffe verwenden können. Auch ist vorgeschlagen worden, den Harnstoffwechsel im Organismus unter günstigen Umständen "rückwärts zu steuern". Es ist ferner vorgeschlagen worden, daß die Harnstoffproduktion in den Nierenversagen von Patienten bis zu einem Wert von 20 g/Tag von der Proteinaufnahme abhängig wäre. Eine aus sogenannten natürlichen Nahrungsmitteln bestehende, nur wenig Eiweißstoffe enthaltende und für urämische Patienten geeignete Diät enthält in der Regel zu wenig Kalorien, d.h. Energie. Andererseits verringert die Zugabe einer rein aus Kohlenwasserstoffen bestehenden

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Kalorienergänzung die Harnstoffproduktion in einem bedeutenden Umfang. Bei den meisten Nierenpatienten, welche auf diese V/eise behandelt v/erden, werden 20 bis 80 Prozent des erzeugten Harnstoffs außerhalb der Fieren metaboliziert. Eine Literaturstudie hinsichtlich der Produktion und des extrarenalen (außerhalb der Uiere) Metabolismus von Harnstoff in Ni erenpantienten, welche mit Diät und Dialyse behandelt werden zeigt, daß eine wesentliche extrarenale Harnstoff degradation in diesen Patienten auftreten kann, ferner eine Verringerung der Harnstoffmenge im Organismus vermittels Dialyse die Harnstoffdegradation verringert und darüber hinaus die gesteigerte Harnstoffdegradation bei "Vorhandensein einer hohen Körperflüssigkeits-Harnstoffkonzentration eine Auswirkung anpassungsfähiger Enzyme sein oder eine Umkehr des Harnstoffkreislaufs darstellen kann.

In der Umwelt des Menschen gibt es Mikroorganismen, Bodenbakterien, welche diejenigen NPS-Verbindungen biodegradieren bzw. zersetzen können, die sich auch im Organismus von Nierenpatienten ansammeln. Versuche mit einigen von den Bodenbakterien haben gezeigt, daß sich die bakteriellen Enzyme leicht anpassen lassen. Außerdem sind der optimale pH-Wert und die zur maximalen Biοdegradation von z.B. Kreatinin erforderlichen Wachstumstemperaturen ähnlich denen innerhalb des Pansens. Die Enzymsysteme der Bodenbakterien sind ziem-

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a* -

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lieh, spezifisch, angehend z.B. Kreatinin und Kreatin. So versagen "beispielsweise Kreatin-biodegradierende Bodenbakterien bei der Zersetzung oder greifen viele eng mit Kreatinin verwandte Verbindungen nur langsam an. Es sei noch festgehalten, daß im allgemeinen die meisten Bodenbakterien nicht pathogen für den Menschen sind, wenn sie per os, d.h. durch den Verdauungskanal in den Organismus gelangen.

Die Mikrobenflora in dem menschlichen Verdauungssystem läßt sich auch durch mehrere unterschiedliche Verfahren beeinflussen. Sogar Einpflanzung, Anreicherung oder teilweiser Ersatz einiger Mikroorganismen im Magen-Darm-Kanal sind möglich. Zweckbestimmte Verabreichung von "trainierten" bzw. "untrainierten" Mikroorganismen ist schon als therapeutisches Verfahren ausgeführt worden. Die eingeführten Mikroorganismen verschwinden jedoch bei therapeutischer Behandlung nach Unterbrechung der Maßnahmen verhältnismäßig schnell aus dem Magen-Darm-Kanal. Andererseits können Mikroorganismen länger im Magen-Darm-Kanal leben, vorausgesetzt, daß spezifische Substrate, in Verbindung mit anderen vitalen Baustoffen vorhanden sind.

überraschenderweise wurde nun aufgefunden, daß urä-r mische Symptome bei Patienten beseitigt werden konnten,

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- VSf -

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wenn ein Arzneimittel,per os verabreicht wird, das und hierin besteht die Erfindung - aus einem Grundbestandteil aus nicht-pathogenen Bodenbakterien hervorgehenden Systemen mit den Eigenschaften nichtproteinhaltige Stickstoffverbindungen (NPS) zu zersetzen und im Magen-Darm-Kanal aktiv zu sein, besteht. Der unter Verwendung von Bodenbakterien hergestellte Grundbestandteil enthält spezifische, konstitutive Enzymsysteme mit der Eigenschaft, HTS-Verbindungen zu zersetzen.

Die Bodenbakterien können auch in lyophilizierter ' Form verabreicht werden.

Das Arzneimittel enthält z.B. als Harnstoff zerstörende Bodenmikroorganismen Arten von Serratia und als Kreatinin zersetzende Bodenbakterien,

a) eine nicht-fluoreszierende Pseudomonas oder

b) Rhizobium oder

c) Agrobacterium oder

d) Gorynebacterium ureafaciens oder

e) Arthrobacter ureafaciens oder

f) ■ Escherichia coli oder

g) Pseudomonas aeruginosa

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und als Harnsäure biodegradierende Bodenmikroorganismen

a) nicht-fluoreszierende Arten von Pseudomonas oder

b) Bacillus subtilis oder

c) Bacillus fastidosus oder

d) Micrococcus dentrificans oder

e) Mycobacterium phlei oder

f) Aerobacter aerogenes oder

g) Pusarium moniliforme oder h) Histoplasma capsulata oder i) Penicillinum chrysogenum.

Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung urämischer Symptome, das darin besteht, daß die Art des Harnstoff
zersetzenden Mikroorganismus ausgewählt und hierauf
eine Seinkultur, um zu prüfen, daß nur ein Zellentyp
im Kulturmedium wächst, mit nachstehender Stoffzusammensetzung hergestellt wird:

Thiamin, Pyridoxin, Ca-Pantothensäure, Nikotinsäure, p-Aminobenzolsäure von jeweils 0,25 mg, 0,05 mg Folsäure, 1 Ug B-, ,-,-Vitamin, 0,5 yig Biotin, 1,0 g K₂HPO₄, 1,5 g NaH₂PO₄ . 4H₂O, 0,05 S MnGl . 4H₂O, 0,1 g MgSO₄ 7H₂O, 0,01 g Fe SO₄ . 7H₂O, 1,0 g Hefeextrakt und 10 g/1000 ml Harnstoff, bei einem pH-Wert von 7,0 7,5· Wenn der Harnstoff als Stickstoffquelle verwendet wird, wird 5»0 g/1000 ml Glukose oder Glyzerol zugesetzt, die Bakterienkultur bei +28° C aufgezogen,

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im Gärbehälter die mit Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7>2 mehrfach gewaschene und zentrifugierte Zellenmasse in 1 Mol Glukoselösung im Verhältnis 1 : 1 als Stabilisator zugesetzt, hierauf das Produkt in flüssigem Stickstoff eingefroren, danach 48 Ms 72 Stunden bei -50⁰G und 0,03 Torr lyophilisiert, unter Ausschluß von atmosphärischem Sauerstoff, einem inerten Gas, id.e Argon, ausgesetzt, getrocknet und das getrocknete Produkt in oral verabreichbare Präparate, wie Kapseln od. .dgl. übergeführt wird.

Zahlreiche Untersuchungen sowohl in vitro als auch in vivo, d.h. am lebenden Objekt, sind mit dem Arzneimittel durchgeführt worden. Die Untersuchungen in vivo umfaßten Tierexperimente (Hunde) und klinische Versuche (sowohl freiwillige Versuchspersonen als auch urämische Patienten). Anhand der nachstehenden Versuchsergebnisse und Beispiele wird die Wirkungsweise und Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels aufgezeigt:

Versuch 1

Zunächst sollte aufgezeigt werden, daß im Magen-Darm-Kanal des Menschen Bestandteile vorhanden sein können,

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die in der Lage sind, NPS-Verbindungen in vitro zu biodegradieren. Der Darminhalt von in drei Gruppen eingeteilten Versuchspersonen wurde gesammelt. Die Gruppe I bestand aus 5 urämischen Patienten, welche keine Nierenfunktion mehr aufwiesen und regelmäßig Hämodialyse erhielten. Die Gruppe II bestand aus 5 Patienten mit Nierenversagen niedrigeren Grades, welche z. Zt. noch keine Hämodialyse benötigten. Die Gruppe III bestand aus 5 Erwachsenen mit normalen Nierenfunktionen. Eine infinitesimale Menge (Nadelspitze) Kot wurde in entweder Kreatin, Kreatinin oder Harnsäure als Substrat enthaltende auto— klavisierten Teströhrchen okuliert. Das Grundprinzip bestand darin, daß die Kulturmedien so arm an Nährstoffen wie möglich waren. Die quantitative Biodegradationskapazität sämtlicher drei NPS-Verbindungen wurde getrennt vermittels herkömmlicher spektrophotometrischer Verfahren gemessen. Das Wachstum der Mikroorganismen wurde regelmäßig nach allgemein anerkannten, bekannten bakteriologischen Verfahren verfolgt. Der Unterschied: Quantität des anfänglichen NP8-Substrats minus übrigbleibendes (^restliches) NPS-Substrat wurde in jeder einzelnen experimentellen Reihe quantitativ bestimmt. Wenn ein Bakterienwachstum festgestellt wurde, wurde die Identifizierung der Mikroorganismen in üblicher Weise ausgeführt.

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Ergebnisse: Die Darmbakterien in der Gruppe I (Urämiker) waren in der Lage, hochsignifikante Mengen an Kreatin, Kreatinin und Harnsäure zu Modegradieren. In den Gruppen I und II (Nierenpatienten in beiden Gruppen) waren viele Fälle (Patienten), die bis zu 100 % der in Frage stehenden NPS-Verbindung benutzten. Die Darmbakterien in Gruppe III (gesunde Versuchspersonen) waren nahezu unfähig zur Benutzung der drei NPS-Verbindungen unter identischen/analogen experimentellen Umständen.

Zusammenfassung: Festgestellt wurde somit, daß die Darmbakterien in Nierenpatienten fähig waren, in vitro Kreatin, Kreatinin und Harnsäure zu zersetzen, wenn nur eine dieser NPS-Verbindungen, jeweils als das einzige Substrat diente, anscheinend vermittels angepaßter Enzymsysteme der Darmbakterien.

Versuch 2

Danach wurde nachgewiesen, daß gewisse Bakterien im Magen-Darm-Kanal des Menschen fähig sind, in vitro NPS-Verbindungen zu zersetzen.

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In Reihen von 15 Röhrchen für jede Gruppe diente eine einzige UPS-Yerbindung z.B. Kreatin, Kreatinin, Harnsäure, als einziges Substrat. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Bakterienkulturen und die Fähigkeit zur Zersetzung der NTS-Verbindung wurden wie vorangehend in Versuch 1 beschrieben "bestimmt, mit dem Ergebnis, daß einige Arten von Pseudomonas am aktivsten waren. Sie wuchsen schnell auf diesem armen Boden und biodegradierten große Mengen an ETPS-Yerbindungen: bei denen z.B. auch einige Arten von Escherichia coli, Enterococcus, Proteus, KLebsiella.

Zusammenfassung: Unter kontrollierten experimentellen Bedingungen waren somit Reinkulturen von Laboratoriums-Mikroorganismen in der Lage, z.B. Kieatin, Kreatinin und Harnsäure zu bi ο degradieren, wenn diese NPS-Verbindungen jeweils einzeln als das einzige Substrat dienten. Die Bakterien wurden unter denjenigen ausgewählt, welche bekanntermaßen unter physiologischen Bedingungen im Magen-Darm-Kanal des Menschen leben.

Versuch 3

Eine große Anzahl an Bodenproben wurde gesammelt, um die Fähigkeit zur HP3-Biodegradation der Bodenbakterien,

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die dann in Heinkulturen isoliert wurden, zu bestimmen. Die Proben stammten von gepflügtem Boden, Weideland, verschiedenen Feldertypen, Gebieten um Schlachthöfe, aus zoologischen Garten, die Yogelkot enthielten. Die Proben wurden in Süd-Finnland (Helsinki) während des Sommers gesammelt. Somit war bereits im voraus bekannt, daß die optimale Wachstumstemperatur der Bodenbakterien niedriger sein muß, als z.B. in den Mittelmeerrandbereichen. Die Proben iirarden vermittels herkömmlicher bakteriologischer Verfahren kultiviert, isoliert und identifiziert. Auch bei diesem Versuch 3 wurde die Biodegradationsfähigkeit der isolierten Reinkulturen von Bodenbakterien unter Verwendung von NPS-Verbindungen, jeweils nur einer, als einziges, armes Substrat geprüft, und zwar wie folgt: 12 ΪΓΡ3 Verbindungen: Harnstoff, Guanidin, Ornithin, Arginin, Kreatin, Kreatinin, Harnsäure, Glutaminsäure, Histidin, Xanthin, Allantoin und Agmatin. Diese NPS-Verbindungen wurden ausgewählt, weil sie Schlüsselstellungen im inneren Stoffwechsel einnehmen. Das Ernten, die Grundkultivierung und die Anreicherung der Bodenmikroorganismen erfolgen bei + 28° 0.

Ergebnisse: insgesamt 729 Bodenbakterienarten wurden in Reinkultur in etwa 100 000 Einzelkulturen isoliert. Jede der 12 NPS-Verbindungen diente Jeweils einzeln in einer Reihe als die einzige Stickstoffquelle; in der Parallelreihe gleichzeitig sowohl als Stickstoff-

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als auch als Kohlenstoffquelle. Gleichzeitig wurde die bakterielle Ammoniakfreisetzung (NEU) determiniert. Tabelle 1 zeigt die Verteilung der 729 isolierten Bodenbakterienarten in Gruppierung entsprechend ihrer spezifischen Fähigkeit zur Verwendung
der 12 NPS-Verbindungen als Substrat.

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Tabelle

OO OJ IO

NPN-Verbindung	NPN als einzige Stickstoffquelle	- 521	_%	NPN als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle	der	41,5	Gleichzeitige Freisetzung von NH₃ wenn NPN die einzige Stickstoffquelle ist	19,0	NH₃ frei gesetzt	81,0	Gesamt	1 ro V Vl
-	Anzahl der Arten	377		Anzahl Arten		67,0	NH₃ nicht frei gesetzt	47,8	Anzahl d.Arten	52,2	geprüften Arten	VN I
	>'·	637	71,1		geprüft	23,4	Anzahl d Arten	54,0	273	46,0	337
Harnstoff	570	51,8	nicht	geprüft	23,5	64	29,8	.87	70,2	167
Guanidin	432	87,3	nicht	61,1	80	58,1	110	41,9	239
Ornithin	322	78,3	302	59,1	129	72,1	207	27,9	235
Arginin	595	59,3	489	71,0	88	33,4	69	66,6	165	rsi
Kreatinin	590	41,4	170	38,3	96	28,0	40	72,0	143
Kreatin	631	81 ,6	171	57,1	103	40,1	177	59,8	266	4156
Harnsäure	478	81,0	446	69,2	89	40,5	206	59,6	287
Glutaminsäure	657	87,9	431		81	30,4	217	69,5	362
Histidin	620	65,6	517	145	25,2	138	74,9	232
Xanthin		90,0	279	94		1.92		276
Allantoin	86,0	417	84	223	298
Agmatin		504	75

IH

Spezielle Bestimmungen wurden auf diagnostischen Medien ausgeführt zur visuellen Prüfung der extrazellularen und intrazellularen Fermentierung. Alle 12 KTS-Verbindungen wurden mikrobiologisch zersetzt. Unter den 729 untersuchten Bodenbakterien waren etwa 30 Arten (Stämme), welche die Fähigkeit aufwiesen, sämtliche 12 NPS-Verbindungen zu biodegradieren, entweder gleichzeitig oder nach Anpassungszeitraum. Tabelle 1 zeigt weiterhin, daß 521 (71,1 %) von den 729 Bodenbakterien - Arten Harnstoff als einzige Stickstoffquelle verwenden können. 7 Arten (577-579, 588, 677 und 722) zeigten eine außerordentlich hohe Degradationsfähigkeit. Es zeigte sich ferner, daß, wenn die Harnstoff-Degradationsfähigkeit eines vorgegebenen Bodenbakteriums besonders hoch xtfar, die Fähigkeit zur gleichzeitigen Biodegradation anderer NPS-Verbindungen in den meisten Fällen beträchtlich niedriger war. Tabelle 2 zeigt die Biodegradation von Harnstoff, verursacht durch einige willkürlich ausgewählte Bodenbakterienarten nach 30 Minuten langer Inkubation bei + 37 C. Das Material umfaßt auch Bakterienarten, die sogai 85 mg (d.h. 85 °/o) Harnstoff von 100 mg unter den gleichen experimentellen Bedingungen zersetzen können.

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T a b e 1 1-e

Nr.' der Art

cc co to

47 50 577 578 579 677

Trockengewicht der Zellen (mg/ml)

3,6 3,2 3,6 3,6 3,5 3,7 1,9

Grad der Harnstoffzersetzung

' Gleichzeit

Zersetzte ZersetzungsgeschwiSdigk. Zersetzgs. Freisetzg, Gesamtmenge (yMol Harnstoff/mg Zellen- wirkungs- von NH₃ # trockengewicht · min) grad (%)

33 34 46 57 61 60 75

5,48 ·

5,94 *

4,44 ·

9,56 ·

12,53

-2

10

-2

9,96 · 30,57 ·

-2

33 34 46 57 61 60 75

M Ergebnisse von Vorversuchen. NH_ vorübergehend vorhanden, da dieses schnell durch andere Mikroorganismen aufgebraucht wird

* * +_ Vorhandensein von NH₃ unbestimmt (< 1 ug/ml)
+ NH₃-Konzentration niedrig (=1 pg/ml)

- Pfi —

Zahlreiche Bodenbakterienstämme biodegradierten Kreatinin schnell. 4-32 (59,3 %) von 729 Bodenbakterienarten benutzten Kreatinin als einzige Stickstoff quelle und 170 (23,^ %) waren in der Lage, Kreatinin sowohl als Stickstoff- und Kohlenstoffauelle zu benutzen. Tabelle 3 zeigt die bakterielle Degradation von Kreatinin durch drei ausgewählte Bodenbakterienstämme. Inkubation der Zellmasse 30 Minuten bei + 37°C.

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Tabelle

Nr. der Art

Trockengewicht der Zellen (mg/ml)

Grad der Kreatininzersetzung Gleichzeit.

Zersetzte Zersetzungsgeschwindigk. Zersetzgs. Freisetzg.

Gesamtmenge (μΜοΙ Kreatinin/mg Zellen-wirkungs- von NH₃ ^ (mg/ml) trockengewicht · min) grad (%)

UD CO CO IO

O CO £T»

20

591/a 591/b 656

1,2 1,2

4,3 3,8

5,89 · 10

9,60 * ΙΟ"'

9,25 · 10

4,47 · 10

-4

.-4

21 36 89 43

Ergebnisse von Vorversuchen. NH₃ vorübergehend vorhanden, da dieses,schnell durch andere Mikroorganismen aufgebraucht wird

+ NH₃~Konzentration niedrig (=yg/ml)
- NH₃ nicht vorhanden

24 U156

Die Biodegradationsfahigkeiten für FPS-Verbindungen erscheinen in Tabelle 1. Die folgende Beobachtung war wichtig in Anbetracht des Ziels der Erfindung. Bei Biοdegradation und Biosynthese von Eiweißstoffen muß die Bildung des Ammoniaks besonders berücksichtigt werden. Tabelle 1 zeigt, daß Ammoniakfreisetzung als Ergebnis bakterieller Zersetzung der Eiweißstoffe keineswegs Unveränderliche darstellt. Es gab zahlreiche Bodenbakterienstämme, die Ammoniak nicht in meßbaren Mengen erzeugten. Dementsprechend biodegradierten 103 (72,1 °/o) Stämme aus 153 geprüften Stämmen Kreatin, und 96 (58,1 %) aus 165 geprüften Stämmen Kreatinin, ohne Freisetzung von Ammoniak. Obwohl z.B. Stämme 59l/b und 656 (Tabelle 3) binnen 30 Minuten 89 % bzw. 43 % Kreatinin zersetzen, wurde keine Ammoniakbildung beobachtet. Entweder erzeugten diese Bodenbakterien überhaupt kein Ammoniak, oder es erfolgte eine vorübergehende Ammoniakfreisetzung, die durch die gleichen Bakterien benutzt wurde. Wichtig war die Observation, daß es außerdem Stämme gab, die Ammoniak als einzige Stickstoffquelle benutzten.

Zusammenfassung: Die Folgerung ist, daß es zahlreiche Bodenmikroorganismenstämme gibt, die in vitro Versuchen schnell hochsignificante Mengen gerade derjenigen NPS-Verbindungen biodegradieren, die sich bekanntlich im Körper von urämischen Patienten ansammeln. Mehrere Stämme

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haben sogar eine sehr hohe biodegradative Fähigkeit und sind in der Lage, bis zu 90 % der als Substrat verwendeten NPS-Verbindungen zu zersetzen. Unter den untersuchten 729 Bodenmikroorganismen gab es etwa 30 unterschiedliche Bakterienstämme, die sämtliche 12 untersuchten NPS-Verbindungen zersetzen konnten. Die Bakterien benutzten diese NPS-Verbindungen entweder als die einzige Stickstoff- oder sowohl gleichzeitig als Stickstoff und Kohlenstoff(Energie)Quelle.

Versuch 4-

Dieser Versuch behandelt normale und urämische Hunde, die mit Bodenbakterien behandelt wurden. Wenn normalen Hunden oral lyophilisierte Bodenbakterien, ausgewählt nach Versuch 3 verabreicht wurden, entwickelten sich keine Blutabnomitalen. Insbesondere trat keine Steigerung des Blut-Ammoniakgehaltes auf. Auch gab es keine Veränderungen in den Blut-Harnstoff- und Kreatininkonzentrationen.

Zusammenfassung: Wenn die selben Bakterien urämisehen Hunden verabreicht wurden, verbesserte sich der Allgemeinzustand der Tiere, Anorexie und Schlaflosigkeit verschitfanden und das Körpergewicht nahm zu. Quantitative Bestimmungen zeigten, daß der Ammoniakwert im Blut nicht gesteigert wurde. Demgegenüber nehmen Blut - Harnstoff

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als Kreatinin-Eonzentration in einer signifikanten V/ei se ab.

Die Versuche an Hunden zeigten somit, daß erstens die Verabreichung lyophilisierter Bodenbakterien an normale und urämische Tiere keine erkennbaren Schaden verursachte, zweitens, bei urämisehen Hunden nahmen die Blut-Harnstoff- und Kreatininwerte ab, drittens, die Ammoniakkonzentration stieg nicht an.

Versuch 5

Dieser Versuch wurde an Menschen durchgeführt. Das Material umfaßte 6 erwachsene, freiwillige Versuchspersonen und 4 urämische Patienten, bei denen Veränderungen in den Blut-Ammoniak-, Harnstoff- und KJreatininwerten untersucht wurden. Zur Behandlung wurden unter den in Reinkultur isolierten 729 Bodenbakterienarten nach Versuch 3 fünf Stämme ausgewählt. Drei von diesen Stämmen xiraren Harnstoff zersetzende, identifiziert als Serratia spp., zwei Bakterienstämme zersetzten Kreatinin, einer davon war ein nicht-fluoreszierendes Pseudomona spp., und die anderen wurden identifiziert als zugehörig zu entweder Rhizobium oder Agrobacterium. Die Identifizierung erfolgte nach Breed und Mitarbeiter ("Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7· Auflage, Williams and j/ilkins, Baltimore 1957) und nach Skermann, V.B.D. A Guide to Identification of the G-enera of Bacteria, 2. Auf-

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lage, Williams and Wilkins, Baltimore, 1967)· Die fünf Stämme waren nicht-hämolytisch und sulphonamidempfindlich, mit einer optimalen Wachsturnstemperatur von + 28°C. Die reinen Zellenmassen wurden in 1 Mol Glukoselösung als Stabilisator (Verhältnis 1:1) eingemengt und in flüssigem Stickstoff eingefroren, 72 Stunden lang in ein Lyophilisierungsgerat "bei -50°C und einem Kammerdruck von 0,03 Torr. Die Präparationen wurden Argongas ausgesetzt vor Berührrung mit atmosphärischem Sauerstoff, und in Snap-J?it -Kapseln verpackt, die mit Eudragit L 12.5 P darmlöslich gemacht worden waren. Eine Prüfung auf evtl. bakterielle Konta mination erfolgte in jeder Phase der Verfahrensgänge. Jede Gelantinekapsel enthielt Zellen von nur einer der ausgewählten reinen Bodenbakterienstämmen, im Mittel 175 mg der jeweils getrockneten Präparation. Alle Versuchspersonen wurden der gleichen Behandlung unterworfen, täglich die gleiche Anzahl an Kapseln mit einem Stamm von Harnstoff-zersetzenden Bodenbakterien einerseits und Kapseln mit einem Stamm von Kreatinin-zersetzenden Bodenbakterien andererseits. Pro Tag und pro Person wurden bis zu 15 + 15 Kapseln verabreicht. Insgesamt wurden etwa 4500 Kapseln ausgegeben, 175 pro Versuchsperson. Einige Testpersonen nahmen bis 1000 Kapseln ein. Die Harnstoff- und Kreatininkonzentrationen im Blut wurden täglich vermittels bekannter Verfahren bestimmt. Aus Sicherheitsgründen wurden nur kurze Behandlungsperioden (10 - 14 Tage) bei den Ver-

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- ⁵² - 74H

suchen mit den urämischen Patienten angesetzt. Die Gesamtbehandlungsdauer betrug I50 Tage.

Ergebnisse: Bei den 6 freiwilligen Versuchspersonen wurden keine nachteiligen Reaktionen, wie etwa Übelkeit, Diarrhöe, Gewichtsverlust, Ammoniakansammlung im Blut oder Harnstoff- und Kreatininänderungen als Ergebnis der Bodenbakterieneinnahme beobachtet. Die 4 urämischen Patienten im Krankenhaus, mit einer 40 g Protein enthaltenden, jedoch ansonsten ziemlich freien Diät, litten unter schwerer Anämie. Übelkeit und Anorexie verschwanden. Diarrhöe trat nicht auf. Es trat keine NH;,-Sammlung im Blut auf. Die Bodenbakterienbehandlung beeinflußte sowohl den Kreatinin- als auch den Harnstoffgehalt des Blutes: Maximale Abnahme von Kreatinin 30 %_t von Harnstoff 49 %, binnen etwa 14 Tagen. Schwankungen der beiden NPS-Werte erfolgten ziemlich parallel miteinander. Bei Patient Nr. 1 wurde der Versuch zeitweilig unterbrochen, nachdem Harnstoff- und Kreatinin-Werte in signifikanter Weise erniedrigt waren. Beide Werte stiegen - wie zu erwarten - wieder an, bis die Bodenbakterienbehandlung wiederaufgenommen wurde. Anschließend erfolgte eine neue Senkung der Werte als Folge der Bakterienbehandlung. Bei allen 4 ffrämiketn stiegen die Blutwerte nach Unterbrechung der Behandlung an. So zeigte beispielsweise Patient Nr. 1 einen Blut - Kreatinin - Wert von 12,5 mg% (d.h. eine 100 %ige Steigerung) nach weiteren acht Wochen ohne

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24 U156

Behandlung. Bei einem weiteren fünften Patienten mit häuslicher Diät (11 Jahre essentielle Hypertonie, retinale Abnormitäten und Papillanekrose der Niere) nahm der Blut-Kreatininwert von dem Ausgangswert 3,4 auf 2,0 mg % ,d.h. eine Senkung von 40 %, und der Harnstoffgehalt von 90 auf 63 mg % binnen 14 Tagen nach Einnahme von 280 Kapseln ab*

Zusammenfassung: Die Blut-Kreatinin- und Harnstoffvrerte lassen sich mittels konservativen Maßnahmen in signifikanter Weise beeinflussen. Die maximale Verringerung des Blut-Kreatinin-Wertes betrug 30 bis 40 %, die des Harnstoff-Wertes nahezu 50 % binnen 10 - 14 Tagen.

Somit dürfte ersichtlich sein, daß vielseitig aktive zweckmäßig ausgewählte Bodenbakterien, welche kontinuierlich im Magen-Darm-Kanal des Menschen eingeführt werden, in der Lage sind, signifikante bis hochsignifikante Mengen x^enigstens bestimmter NPS-Verbindungen zu biodegradieren, die bekanntlich sich im Organismus von Nierenpatienten ansammeln. Es dürfte weiterhin ersichtlich sein, daß die "Urämitoxine" keine sogenannten Endprodukte darstellen, die notwendigerweise exkretiert werden müssen. Klinische Versuche zeigen weiterhin, daß wenigstens einige der urämischen Symptome als Ergebnis dieser Behandlung verschwanden. Versuche 1 und 3 zeigten, daß einige Stämme von Bodenbakterien sehr große Mengen verschiedener NPS-Verbindungen benutzen können. Einige Arten waren in der

Lage, hauptsächlich eine einzige, spezifische NPS-Verbin-

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dung zu biodegradieren und andere, mehrere NPS-Verbindungen. Folglich und in Anbetracht der Möglichkeit der modernen mikrobiologischen Techniken und deren Anwendbarkeit in der allgemeinen Technologie kann davon ausgegangen x^erden, daß nicht-pathogene Bodenbakterien isoliert und/oder spezifisch zu NPS-Zersetzungszxtfecken angepaßt werden können. Weil die ETPS-Verbindungen im Organismus von Fierenpatienten von verschiedenen metabοIiseheη Wegen ausgehen und durch diese hindurchgehen, wäre es geeignet, eine ganze Reihe ITPS-verwert ender Bodenbakterien zu isolieren und/oder vermittels spezifischer Induktionsverfahren anzupassen. Auf diese Weise könnten mehrere metabolische Kreisläufe gleichzeitig angegriffen werden. Andererseits ist offensichtlich, daß eine über die ganze Lebensdauer des Nierenpatienten erfolgende Verabreichung vielseitiger BodenmikrοOrganismen (an Patienten) vielleicht nicht ausreicht. Die an irreversiblem Nierenversageη leidenden Patienten müssen auf einer geeigneten Diät gehalten werden: Hochwertige Proteine xvie essentielle Aminosäuren, energieerzeugende Grundstoffe wie Kohlenwasserstoffe, einige Zukkerarten, bestimmte Fettsäuren, Katalysatoren, Vitamine. Es muß eine entsprechende Einschränkung der Wasseraufnahme erfolgen. Es gibt bereits handelsübliche Diäten, für welche verhältnismäßig wenig Wasser erforderlich ist. In Abhängigkeit von den Symptomen, die ggf. an dem jeweiligen Nierenpatienten auftreten, wie z.B.

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■- 35 -

24U156

arterielle Hypertonie und/oder verschiedene Typen nierenabhängiger Anämien, können antihypertonische und/oder die Hämatopoese stimulierende Arzneimittel zusammen mit den vorliegenden Grundbestandteilen verabreicht werden.

So weit sind die Wirkungen der Bodenbakterien auf 12 verschiedene NPS-Verbindungen entweder in vitro oder in vivo am lebenden Subjekt untersucht worden. Da sämtliche Versuche positive Ergebnisse erbrachten, kann hieraus entnommen werden, daß sich auch andere NPS-Verbindungen in ähnlicher Weise biodegradieren lassen.

Die erfindungsgemäßen Grundbestandteile sind in erster Linie zur Linderung der urämischen Symptome bestimmt. Es ist jedoch klar, daß auch andere NPS-Verbindungen, welche unter verschiedenen pathologischen Bedingungen im Überschuß erzeugt werden, sich ebenfalls entsprechend der Erfindung biodegradieren lassen. Z.B. eine Verwendung von ornithinzersetzender Bodenbakterien könnte wertvoll sein zur Therapie bestimmter Arten von hypertonischen Zuständen. Sogar einige Krankheiten, die sich durch gesteigerte Exkretion einiger Aminosäuren kennzeichnen, könnten auf verwandte Weise behandelt werden.

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⁵⁶ " 24H156

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht, wobei darauf hingewiesen sei, daß die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt ist. Ss sei bemerkt, daß es einerseits nahezu zahllose NP8-"Verbindungen und deren Derivate, und andererseits nahezu zahllose Bodenbakterienarten gibt. Folglich besteht eine unbegrenzte Anzahl an Möglichkeiten und/oder Alternativen. Die nachstehenden Beispiele sind nur auf einige präparat!ve Einzelheiten gerichtet, die bei Anwendung im Laboratorium und für klinische Versuche zu vielseitigen Erzeugnissen geführt haben.

Beispiel 1

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von Harnstoffzersetzenden Grundbestandteilen. Harnstoff gehört zu denjenigen NPS-Verbindungen, die sich am leichtesten durch Bakterien zersetzen lassen. Es ist unwichtig, ob die Bodenbakterien oder die Bakterien an sich aus einer registrierten Bakteriensammlung stammen oder in Verbindung mit den speziell gezüchteten Bakterienreinkulturen geerntet werden. Die wichtigsten Eigenschaften sind erstens die Aktivität und Anpassungsfähigkeit des Enzymsystems und zweitens die nicht-pathogenität der Bakterien. Verschiedene nrten von Serratia sind zur Degradation von Harnstoff besonders gut geeignet, insbesondere die Arten Nr. 577 - 579 der Sammlung. Sobald die Art der Harnstoff-zersetzenden Bakterien ausgewählt worden ist, können

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Reinkulturen hergestellt werden, um zu prüfen, daß nur ein Zellentjnp im Kulturmedium wächst. Otwohl es Bodenbakterien mit konstitution Enzymsystemen gibt (vide supra), X'/elche Harnstoff biodegradieren, ist mehr vorteilhaft und sicherer, Bakterien mit spezifisch angepaßten (induzierten) Enzymsystemen zu verwenden. Die folgende Zusammensetzung für Kultur wurde praktisch erprobt und wird empfohlen: Thiamin, Pyridoxin, Ga-Pantothensäure, Nikotinsäure, p-Aminobenzoesäure jeweils 0,25 mg, 0,5 mg Folsäure, 1 ug B-, .-,-Vitamin und 0,5 /Ug Biotin, 1,0 g K₂HPO₄, 1,5 S NaH₂PO₄ . 4- H_pC, 0,05 g MnGl . 4 H₂O, 0,1 g MgSO . 7 H₃O, 0,01 g FeSO₄ 7 H₉O und 1,0 g Hefeextrakt und 10 ^/1000 ml Harnstoff pH 7,0 - 7,5- Wenn Harnstoff als Stickstoffquelle dient, werden 5,0 g pro 1000 ml Glukose zugesetzt. G-lyzerol ist vorteilhafter als Glukose, weil es die Evolution stimuliert und/oder die Aktivität von Ureasen steigert. Auch andere Kohlenstoffzellen lassen sich verwenden. Die Massenherstellung der Bakterien erfolgt bei einer Temperatur von + 28° G, mit einer Inkubationszeit von 1 bis- 5 Tagen. Zur Produktion der Baltterienmaase werden Fermentatoren benutzt. Eine geeignete Belüftungskapazität ist etwa 40 l/min. Aus praktischen Gründen sind Fermentatoren mit einem wirksamen Mischungsvarmögen von 1000 1 vorzuziehen..Sobald die Wachstumsgeschwindigkeit der gewünschten entspricht, wird die Bakteri^nmasse wenigstens viermal in herkömmlicher Weise gewaschen. Das Waschen muß in der Weise erfolgen, daß

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" 24H156

die ganze NPS-Verbindung (hier Harnstoff als Substrat) entfernt wird. Die NPS-Verbindungen (= Substrate) können bei Einnahme die Entstehung toxischer Symptome hervorrufen. Der gewaschenen Masse wird ein Stabilisator, vorzugsweise 1 Mol Glukoselösung im Verhältnis 1:1, zugesetzt. Die reine Bakterienmasse wird vorzugsweise in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei dieser niedrigen Temperatur so lange aufbewahrt, bis es in ein Lyophilisierungsgerät eingebracht wird für 48 bis 72 Stunden lang. Die Kammertemperatur beträgt - 50 C, und der Kammerdruck 0,03 Torr bzw. so niedrig wie technisch möglich.

Die gefriergetrocknete Bakterienmasse wird vor Berührung mit dem ungünstigen Einfluß von atmosphärischem Sauerstoff einem inerten Gas, vorzugsweise Argon ausgesetzt. Die gefriergetrocknete Bakterienmasse wird unter aseptischen Bedingungen z.B. in geeignete Kapseln (von Hand oder vermittels automatischer Maschinen) abgepackt. Chemische, mikroskopische und bakteriologische Prüfungen um evtl. Verunreinigungen zu eliminieren erfolgen in jeder Phase sämtlicher Arbeitsgänge. Die Kapseln und/oder andere, geeignete Umhüllungen werden mit bekannten Substanzen und/oder Verfahren beschichtet. So lassen sich beispielsweise handelsübliche Lacke verwenden, wobei der

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³⁹ 24U156

Typ und/oder die Zusammensetzung der Beschichtungsverbindungen so ausgewählt ist, daß die endgültige Präparation (= der die gewünschte NPS-Verbindungzersetzende Grundbestandteil) in dem vorbestimmten Segment des Magen-Darm-Kanals freigesetzt wird. Die Harnstoff-zersetzende Aktivität der gefriergetrockneten Bodenbakterien muß jeweils bestimmt werden. Die Ausbeute bei Verwendung eines Gärbehälters von 1000 1 Rauminhalt oder Volumen beträgt von 5 bis 10 kg trockener Präparation. Auch nasse, d.h. ursprüngliche Bakterienmasse kann verwendet werden, obgleich die biodegradierende Fähigkeit der Bodenbakterien in diesem Zustand schnell abnimmt. Die Arten Nr. 4-7, 577 - 579 und 677 der Sammlung sind am aktivsten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Herstellung Kreatininzersetzender Grundstoffe. Die allgemeinen technischen Merkmale sind die gleichen wie in Beispiel 1. In einigen Fällen sind die Kreatin-ζersetζenden Bodenmikroorganismen auch fähig, Kreatinin zu zersetzen. Das Grundwachstumsmedium kann eine kleinere Hefeextraktmenge enthalten als bei Anpassung Harnstoff-zersetzenden Mikroorganismen, weil Kreatininmolekule mehr Kohlenstoff als Harnstoffmoleküle enthalten. Eigene Versuche zeigten,

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2AH156

daß unter Kreatinin-zersetzenden Bodenbakterien insbesondere drei Arten eine hohe Aktivität besitzen: zwei sind nicht-fluoreszierende Pseudomonas, eine ist endweder fihizobium oder Agrobacterium (Arten Nr. 591, 601 und 565) der Sammlung. Die folgenden Mikroorganismen sind ebenfalls in der Lage, Kreatin/Kreatinin zu zersetzen: Corynecaterium ureafaciens, d.h. Arthrobacter ureafaciens, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.

Beispiel 3

Dieses Beispiel bezieht sich auf die Herstellung Harnsäure-ζersetζender Grundbestandteile. Die allgemeinen technischen Merkmale sind die gleichen wie in Beispiel 1. Harnsäure wird als Substrat verwendet, durch welches die betreffenden Mikroorganismen angepaßt werden. Die Arten Kr. 93, 222, 260, 265, 281, 366, 373, 376, 415, 525, 557 der Sammlung sind aktiv und fähig Harnsäure zu zersetzen: Bacillus subtilis, Bacillus fastidosus, Micrococcus dentrificans, Mycobacterium phlei, Aerobacter aerogenes, IPusarium moniliforme, Histoplasma capsulata, Pencillinum chrysogenum.

- Patentansprüche -

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Claims

74U156 Patentansprüche

1. Arzneimittel zur Beseitigung urämischer Symptome, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Grundbestandteil aus nicht-pathogenen Bodenbakterien hervorgehenden Systemen mit den Eigenschaften nicht-proteinhaltige Stickstoffverbindungen (!TS) zu zersetzen und im Magen-Darm-Kanal aktiv zu sein, besteht.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unter "Verwendung von Bodenbakterien hergestellte Grundbestandteil spezifische, konstitutive Enzymsysteme mit der Eigenschaft KPS-Verbindungen zu zersetzen, enthält.

5- Arzneimittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Grundbestandteil Enzymsysteme enthält, die bestimmte KPS-Verbindungen zersetzen.

4. Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 3₅ dadurch gekennzeichnet, daß es eine Bodenbakterienart enthält, deren reinkulturierte Zellenmasse lyophilisiert ist.

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24 H 156

5· Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Grundbestandteil mit der Eigenschaft enthält, eine vorgegebene, einzelne NP3-Verbindung zu zersetzen.

6. Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Grundbestandteil mit der Eigenschaft enthält, gleichzeitig zwei oder mehrere KPS-Verbindungen zu zersetzen.

7· Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere Grundbestandteile
mit den Eigenschaften, vorgegebene einzelne
NP3-Verbindungen zu zersetzen, enthält.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß es als Harnstoff zersetzende
Bodenbakterien Arten von Serratia enthält.

9· Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß es als Kreatinin zerstörende
Bodenmikroorgani smen

a) eine nicht-fluoreszierende Pseudomonas oder

b) Hhizobium oder

c) Agrobacterium oder

d) Gorynebacterium ureafaciens oder

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- ·'<■? - 24H156

e) Arthrobacter ureafaciens oder

f) Escherichia coli oder

g) Pseudomonas aeruginosa enthält.

10. Arzneimittel nach Anspruch 1 bis 7> dadurch gekennzeichnet, daß es als Harnsäure biodegradierende Bodenbakterien

a) nicht-fluoreszierende Arten von Pseudomonas oder

b) Bacillus subtilis oder

c) Bacillus fastidosus oder

d) Micrococcus dentrificans oder

e) Mycobacterium phlei oder

f) Aerobacter aerogenes oder

g) Ifusarium moniliforme oder h) Histoplasma capsulata oder i) Penicillinum chrysogenum enthält.

11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Erleichterung urämischer Symptome mit Harnstoff zersetzenden Bestandteilen, dadurch gekennzeichnet, daß die Art des Harnstoff zersetzenden Mikroorganismus ausgewählt und hierauf eine Eeinkultur, um zu überprüfen, ob nur ein Zellentyp im Kulturmedium wächst, mit
nachstehender Stoffzusammensetzung hergestellt wird: Thiamin, Pyridoxin, Ca-Pantothensäure, Nikotinsäure, p-Aminobenzolsäure von jeweils 0,25 mg, 0,05 mg FoI-

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~ 24H156

säure, 1 ug B,„-Vitamin, 0,5 g Vg Biotin, 1,0 g K₂HPO₄, 1,5 g NaH₂PO₄ . 4H₂O, 0,05 g 4 H₂O, 0,1 g MgSO₄ . 7H₂O, 0,01 g FeSO₄, 1,0g Hefeextrakt und 10 g/1000 ml Harnstoff bei einem pH-Wert von 7,0 - 7i5i diese Stoffzusammensetzung, die Bakterienkultur bei +28⁰C inkubiert, und in Gärbehälter gegeben und in Abhängigkeit von. der Wachstumsgeschwindigkeit mehrfach bis zur Beseitigung des Harnstoffs gewaschen, der gewaschenen reinen Zellenmasse 1 Mol Glukoselösung im Verhältnis 1 : 1 als Stabilisator zugesetzt, hierauf das Produkt in flüssigem Stickstoff eingefroren, danach 48 bis 72 Stunden bei - 50° C und 0,03 Torr lyophilisiert, die gefriergetrocknete Zellenmasse unter Ausschluß von atmosphärischem Sauerstoff einem inerten Gas, wie Argon, ausgesetzt, und das Produkt in oral verabreichbare Formen wie Kapseln od. dgl. übergeführt wird.

12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Art der Harnstoff zersetzenden Bakterien ausgewählt und hierauf Heinkulturen von Bodenbakterien, um zu überprüfen, daß nur ein Zellentyp im Kulturmedium wächst, mit nachstehender Stoffzusammensetzung hergestellt wird:

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" ^ " 24U156

Thiamin, Pyridoxin, Ca-Pantothensäure, Nikotinsäure, p-Aminobenzolsäure von jeweils 0,25 mg 0,05 mg Folsäure, 1 ug B-, p-Vitamin, 0,5 yg BiO-tin, 1,0 g K₂HPO₄, 1,5 g NaH₂PO₄ . 4H₂O, 0,05 g MnGl . 4H₂O, 0,1 g MgSO₄ . 7H₃O, 0,01 g PeSO₄ . 7H₂O, 1,0 g/1000 ml Hefeextrakt und 10 g/1000 ml Harnstoff, diese Stoffzusammensetzung auf 1000 ml mit Wasser aufgefüllt bei einem pH-Wert von 7,0 - 7,5, wenn der Harnstoff als Stickstoffquelle dient, 5>0 g / 1000 ml Glukose oder GIyzerol zugesetzt, die Bakterienkultur bei +28 G inkubiert und in Gärbehälter gegeben und in Abhängigkeit von der Wachsturnsgeschwindigkeit mehrfach bis zur Beseitigung des Harnstoffs gewaschen, der gewaschenen Zellenmasse 1 Mol Glukoselösung im Verhältnis 1: 1 als Stabilisator zugesetzt, hierauf das Produkt in flüssigem Stickstoff eingefroren, danach 48 bis 72 Stunden bei - 50⁰G und 0,03 Torr od. niedriger lyophilisiert, unter Ausschluß von atmosphärischem Sauerstoff einem inerten Gas, wie Argon, ausgesetzt, das gefriergetrocknete Produkt in oral verabreichbare Präparate,' wie Kapseln od.dgl. übergeführt wird.

13. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Urämie mit Kreatinin - zersetzenden Bestand-

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teilen, unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Harnstoff Kreatin oder Kreatinin verwendet wird.

14-. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Urämie mit Harnsäure - zersetzenden Bestandteilen unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Harnstoff Harnsäure verwendet wird.

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