JPS61501513A - 気体輸送に関する改良 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 気体輸送に関する改良 本発明は、気体の輸送に関し、さらに詳しくは、気体の配位子が１種または２種 以上のポリマーのリン脂質の安定な、透過性および生物適合性のバリヤーにより 保護されている、生体内および生対外の両者において使用するための、酸素およ び他の気体の安定な担体に関する。

赤血球の置換のための酸素の担体の開発への努力は数十年にわたってなされてき ている。血液の代替物の必要性は、相同血液輸注に関連する多数の問題から由来 する。多数の問題は、供与体の利用、交叉試験法の必要性、肝炎の伝搬１輸注の 反応、低い貯蔵安定性などを包含する。赤血球の代替物に要求される特性は、化 学的および物理的安定性、増大した生物学的半減期、低い免疫原性、生物学的不 活性（病原的潜在性の不存在）、血栓抵抗性および適切な酸素親和性を包含する 。

血液は、相互作用して止血を支持する多数の成分から構成された、複雑の組織で ある０輸注または血液置換のための最も頻繁な指示は、酸素運搬能力を回復また は維持することである０通常、過剰のヘモグロビンによる動脈の酸素含量におけ る有意な保存が存在する。ヘモグロビン濃度における非常に大きい［がアイソポ レミック（ｉ　５ｏｖｏ　ｌｅｍｉＣ）な］減少（５０％より大きい）は許容さ れうる；酸素含量の生ずる減少は心臓の搏出量の増加により補償される。それに もかかわらず、相同血液置換について大きい要求が存在する。１９７５年に米国 において、１１．５Ｘ１０”単位の血液および血液生成物が輸注された。

可能な赤血球代替物として研究された系は、ヘモグロビン溶液、酸素吸収性有機 液体および人工細胞を包含する。遊離ヘモグロビンの注入に関連する困難は、基 質液体による前記溶液の汚染から誘導される毒性を包含した。これらの問題はす ぐれた準備法により軽減された。しかしながら、永続する困難は輸注のためのヘ モグロビン溶液の使用を制限した。血漿において、ヘモグロビンのテトラマーは 解離してシマーになり、そして循環から急速に除去される（数時間の半減期）、 遊離ヘモグロビンは血管活性であり、そして高血圧および徐脈の危険をもたらす 。

さらに、血漿中のヘモグロビンは酸性の環境および赤血球のリン酸塩含量に欠け 、そして酸素に対する親和性をより高くしかつ組織への酸素の供給する容量を低 くする。赤血球の代替物として液状フルオロカーボンを使用することは、１９６ ０年代の中頃以来非常な注目を得てきた。ある患者はこれらの溶液の注入に成功 したが、広い使用についての可能性は疑わしい、フル十ロカーボンの使用におけ る主要な制限は、短い半減期（はぼ１１時間）、血液との劣った混和性および変 動する血液適合性である。

「人工細胞」の発展に導いた研究は、１９５０年代の初期に開始された。この時 まで、生物学的膜は蛋白質に関連する脂質の二層から成ることがよく知られてい た。少量の乾燥脂質を塩溶液中に分散することにより調製されたホスファチジル コリンの合成二層は、１９５８年に細胞膜のモデルとして最初に使用された［パ ンガム（Ｂａｎｇａ、ｍ）、ペシカ（Ｐｅｔｈｉｃａ）およびシー？７　（Ｓｅ ａｍａｎ）、１９５８］、リン脂質分散液が浸透圧計として挙動しうること、す なわち、シールされた容器を形成できることは、１９６５年において最初に立証 された［パンガム（Ｂａｎｇａｍ）、　スタンディー／シ（Ｓｔａｎｄｉｓｈ） およびワトキンス（Ｖａｔ　ｋｉ　ｎｓ）、１９６５］　、非生物学的性質の半 透膜、例えば、ナイロン、は１９６４年において細胞質の構成成分をマイクロカ プセル化するために最初に使用された［チャック（Ｃｈａｎｇ）、１９６４］が 、これらのカプセルは循環中に配置するためには大き過ぎかつ十分に「異質」で あった。

中性のリン脂質、ホスファチジルコリンの分散液は、細胞膜のモデルとして広範 に研究された［チャプマン（（１１ａｐｍａｎ）、１９８２］、「シール」され た容器を形成する能力は、薬理学的カプセルとじてリポソームの可能性に非常な 注意を集中させた。リポソームの利用は、リポソームの漏れる速度および凝集／ 融合／沈殿に向かう性質により妨害された。これらの悪影響を及ぼす性質は負に 帯電したリン脂質を含有させることによって部分的に排除することができる；し かしながら、この変更は負に帯電したのリン脂質が血栓に触媒作用を及ぼすため に、生体内の使用を排除する。

欧州特許出願ＥＰ−Ａ−００３２６２２号は、改良された血栓抵抗性を有する新 規なリン脂質ポリマーを記載している。これらのポリマーは、生物材料の設計、 すなわち、血液細胞膜の血栓抵抗性表面を真似るポリマーの設計における新しい 概念を反映する。

赤血球および静止血小板の血漿膜の細胞外表面は血栓抵抗性である：これと対照 的に、それらの細胞質表面は血栓発生性である。血液適合性細胞膜およびモデル の膜にける最も簡単な共通の特徴は、ホスファチジルコリンの頭部の基（ｈｅａ ｄ　ｇｒｏｕｐ）を含有する電気的に中性のリン脂質の含量が高いことである。

われわれは、重合可能なホスファチジルコリンを利用しかつ非反応性細胞表面を 真似る生物学的膜のモデル系開発した。ポリマーのリン脂質は、生物膜の特性（ 極端な薄さ、極性表面、非力栓発生性、低い抗原可能性および低い透過性）およ び合成ポリマーの特性（化学的および物理的安定性）の両者をもつ生物材料の新 しいクラスを表わす。

本発明は、リポソームのリン質ポリマーの水性分散液を提供し、前記リポソーム は分子状酸素とあるいは窒素または一融化炭素または二酸化炭素と可逆的に結合 する配位子を含有し、そして前記リポソームは、一般式： 式中、Ｂ１およびＢ２の少なくとも一方は式：（Ｃｏ）Ｐ　Ｘ＋　−ＣＴＣ−Ｃ ＝Ｃ−Ｙ＋の基であり、ここでｐは０または１であり、ｘｌは直接結合または二 価の脂肪族もしくは環式脂肪族の基であり、ＹｌはＨまたは一価の脂肪族もしく は環式脂肪族の基であり、各Ｂ１および／またはＢ２におけるｘｌおよびＹｌ中 の炭素原子の合計の数は８〜２６であり、そしてＢ１およびＢ２の他方は（ａ） 式： ％式％ の同一もしくは相異る基であるか、あるいは（ｂ）少なくとも８つの炭素原子を 含有する脂肪族もしくは環式脂肪族の基であり：ｎは０またはｌであり、ｍは２ ．３または４であり、そして各Ｒは独立に１〜４つの炭素原子を含有するアルキ ル基を表わす。

の共役ジーインの分子間および／または分子内で架橋したポリマーから形成され ている。

これらのポリマーを以後ジアセチレン系リン脂質ポリマーと呼ぶ、これらのポリ マーは、通常、構造 式中、２．．２２、Ｚ３およびＺ４の２つは上に定義したＹ、を表わし、Ｚｌ、 Ｚ２　、Ｚ３８よびＺ４（７）他の２つは各ｈ−Ｘ＋−（Ｃｏ）Ｐ−Ｇを表わし 、ここでｘｌおよびＰは上に定義した通りであり、そを表わし、ここでｎ、　ｍ およびＲは上に定義した通りであり、架橋した鎖は同一もしくは相異るＧ残基に 結合している、の反復単位を含有する。

式１の共役ジーインは、好ましくは、双性イオンの基が自然のリン脂質レシチン およびスフィンゴミエリンのリン酸塩結合基、即ち、コリンリン酸塩の基二 または関連するホスフィン結合基： ｅ であるものである。

好ましい双性イオンの基は天然に産出する生産物の類似体でり、ここでｍは２で あるが、ｍはまた３または４であることもできそして、各Ｒ基はメチルであるこ とが好ましいが、それが天然に産出する生産物であるので、Ｒはまたエチル、プ ロピルまたはブチルであることができ、モして双性イオンの基は第四窒素におい て非対称に置換されていることができる。

また、本発明のリボソームにおいて、Ｂ】およびＢ２の両者は各々式： ％式％ の基を表わすことが好ましい、実際的事柄として、対称化合物、すなわち、Ｂ＋ およびＢ２において、Ｐ、ＸＩおよびＹｌが同一である化合物、は合成が容易で ある。しかしながら、このような対称は本発明に従い必須ではなく、そしてＢ１ およびＢ２の一方において、ｐがゼロであり、そしてＢｌおよびＢ２の他方にお いて、Ｐが１であり、ここで各ｘ１およびＹ、が同一であるかあるいは異るる化 合物を利用することが可能である。しか１．なから、かかる物質を合成すること はより困難である。

本発明の理論的基準に関するかぎり、ＢｌおよびＢ２の残基における共役ジ−イ ン系の位置は臨界的ではない０例えば、ｘＩは直接結合であることができ、これ により共役ジーインはカルボン酸のエステルまたはエーテルに直接隣接し、そし てこのような場合において、Ｙｌは少なくとも８つの炭素原子を含有することが 必要であろう、また、共役ジ−イン系はカルボン酸エステルまたはエーテル官能 から離れた疎水性鎖の端に存在することが等しく可能であり、これによりＹｌは 水素でありモしてｘｌは少なくとも８つの炭素原子を含有する。しかしながら、 下の詳述する理由のため、共役ジ−イン系を疎水性鎖の中心に向かって配置させ て、ｘＩおよびＹｌ中にほぼ同一の数の炭素原子が存在するようにすることが最 も便利であることが通常発見される。

ｘｌおよびＹｌは各々好ましくは脂肪族もしくは環式脂肪族の基である。われわ れの最初の実験は脂肪族もしくは環式脂肪族の基が分枝鎖でない炭化水素基であ る化合物に集中されたが、原理的には、脂肪族もしくは環式脂肪族の基が分枝鎖 の炭化水素基であってはならない理由、あるいは脂肪族もしくは環式脂肪族の基 が炭化水素鎖上に置換基、例えばアルコキシ置換基またはハロゲンを含有べきで ある理由は存在しない。

下の説明から明らかとなるであろう理由のため、共役ジ−イン系は疎水性鎖中に 炭素対炭素の不飽和のみを表わすことが好ましいが、追加の架橋を望む場合、そ れ以上の炭素対炭素の不飽和が基ｘ１およびＹｌ中に存在することができるであ ろう。

各Ｂ１およびＢ２におけるｘｌおよびＹｌ中の炭素原子の合計の数は８〜２６で あり、これにより各疎水性鎖が合計１２〜３０の炭素原子を含有することが重要 である。基Ｂ１および／またはＢ２が１２より少ない炭素原子を含有すると、得 られる材料は非常に低温度以外重合が困難であることがわかった。実際的事柄と して、基Ｂ１および／またはＢ２中に１６〜２６の炭素原子が存在するとき、と くに鎖が２２または２４の炭素原子を含有するとき、最も満足すべき結果が得ら れることを発見する。

ｘｌおよびＹｌ中の炭素原子の正確な構造的形状は本発明にとって臨界的ではな く、それらの主な機能は化合物に正しい程度の疎水性を付与すること、および便 利な温度において重合を可能とすることであり、一方炭素原子が直鎖状または分 枝鎖状であることは必須条件ではなく、基Ｘ！およびｙ＋は、また、１式脂肪族 の形状において３〜８あるいはさらにそれより多い炭素原子を含有する環式脂肪 族残基を含むことができる。

Ｂ１およびＢ２の両者は共役ジ−イン系を含み、これにより共役ジ−イン系が分 子間および分子内の両者の重合に参加できることが好ましい、しかしながら、十 分な程度の架橋は単に分子間重合により得ることができ、この場合において、基 Ｂ１およびＢ２の一方が共役ジ−イン系を含有することが必須要件であるだけで ある。Ｂ１およびＢ２の一方のみが共役ジ−イン系を含有するとき、Ｂ１および Ｂ２の他方はＣＢ−Ｃ３０の脂肪族もしくは環式脂肪族の残基、好ましくは炭化 水素残基であることができ、この残基は飽和であるか、あるいはオレフィン系ま たは多分単一のアセチレン系の不飽和を含有することができ、この不飽和は隔離 されているかあるいは共役ジ−イン系と共役であることができる。このような基 は、再び、グリ上ロール残基へエステルまたはエーテル基を介して結合しており 、そして再び好ましくは少な（とも１２の炭素原子を含有する。

本発明において使用する共役ジーインは、ＥＰ−Ａ−００３２６２２号に記載さ れている手順により調製することができる。こうして、双性イオンの基は適当な リン酸またはホスフィン酸またはそれらのエステル化可能な誘導体をグリセロー ルまたはそのエステル化可能な誘導体と反応させ、これによりグリセロールのα −ヒドロキシ基が反応して必要なリンのエステル基を形成するようにすることに よって導入することができる。基Ｂ１およびＢ２の分子中への導入は、エステル 化またはエーテル化により、カルボン酸ＢＩ　Ｃ０ＯＨまたはアルコールＢＩ　 ＯＨまたは対応するＢ２Ｃ０ＯＨまたはＢＯＨ物質、またはこれらのカルボン酸 またはアルコールの１種とグリセロールのエーテル形成またはエステル形成誘導 体とのエステルまたはエーテル形成誘導体を使用して導入することができる。こ れらの反応は一方においてグリセロールまたはその誘導体および他方においてカ ルボン酸またはアルコールおよびリンのエステルの間で、同時にあるいは引続い ていずれかの順序で実施することができる０本発明の好ましい化合物である対称 リン脂質の製造のために、実際には、選択したリン酸またはホスホン酸と必要な グリセロールのモノエステルをまず形成し、次いでこのリン含有モノエステルを 選択した共役ジ−インカルボン酸の無水物（この酸をジシクロヘキシル−カーポ ジイミドで処理することによって得られる）と反応させ、次いでグリセロールの モノエステルを前記無水物と有機溶媒中でかつ有機塩基の存在下に反応させるこ とは便利であることがわかる。

エステル基の形成のための他の既知の方法を同等によく使用することができる、 ｐがＯである化合物を製造しようとするとき、対応する慣用のエーテル形成法を 用いることができる。

共役ジーインは、化学線、通常＜３００ｎｍの範囲の波長の紫外線に露光するこ とによって重合することができる。このような照射は隣接する鎖中の共役ジ−イ ン系間の架橋を生成する。これは構造：式中、ｚ、、ｚ２、Ｚ３およびＺ４は上 に定義した通りである、の反復単位を含有するポリマーを生ずる。架橋に参加す る共役ジ−イン系は非対称的に置換されたジーインである。架橋は共役ジーイン の４炭素原子釦の０１およびＣ４を含むが、非対称置換のためＣ１およびＣ４は 互いに等しくないので、種々の架橋生成物は架橋が各鎖中の０１およびＣＩの間 あるいはＣＩおよびＣ４の間あるいはＣ４およびＣ４の間で起こるかに依存して 生成しうる０例えば、架橋が０１およびＣ４の間で起こるとき、反復単位は、 ポリマーについてのわれわれの研究は、架橋したポリマーが１種または２種以上 の架橋した生成物を含有するかどうかを確立していないが、架橋したポリマーは 共役系 を含有し、この共役系はすべての架橋構造について共通であることがわ力）っだ 。

Ｂ１およびＢ２の両者が共役ジ−イン系を含有するとき、本発明のポリマーのほ とんどの応用について望ましい分子間および分子内の両者の架橋が存在するであ ろう、この理由でＢ１およびＢ２の両者は共役ジ−イン系を含有することが好ま しく、そして分子内の架橋を最適にするためには、ＢＩおよびＢ２中の共役ジ− イン系の相対的位置はほぼ同一であること、換言すると、グリセロール残基へ共 役ジ−イン系を結合する炭素鎖は長さが２炭素原子より多く異ならないことが好 ましい。

本発明のポリマーの意図する生物医学的用途にかんがみて、重合は通常化学線、 通常可視光線の波長より短い波長を有する化学線に露出することにより誘導させ ることが最もよいが、原理的には、共役ジ−イン系の重合を誘導できる任意の既 知の方法を本発明のポリマーの製造に使用することができる。

重合に利用できる方法の例は１次の通りである：Ｘ線照射、ガンマ線照射、増感 および白色光を使用する照射および粒子（例えば、電子ビーム）の衝撃。

リポソームは共役ジーインを水性媒質中に分散させ、この分散液の温度をリポソ ームの形成が起こる温度である脂質またはチャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）転移温 度より上の温度に上昇させ、次いでこの分散液を周囲温度に冷却することによっ て調製される。

リポソームの形成は既知の技術により実施して多層リポソームを生成することが できる。小さい直径の単一層のリポソームは、多層リポソームを超音波振動にさ らすことによって発生させることができる。大きい単一層のリポソームは、共役 ジーインをアルコール、ペンタン、ヘキサン、ジエチルエーテルまたは他の溶媒 の中に溶解し、次いでこの溶液を、例えば、注射器により、水性媒質中に注入す ることによって発生させることができる。これらの単一層の物質は時には微小小 胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）として知られている。配位子をリポソームの形 成前に水性媒質中に導入し、これによりリポソームは配位子を含有し、この配位 子はリポソーム中に保護されるであろうが、リポソーム壁を通して気体の交換を 行うことができる。あるいは、ジアセチレン系リン脂質工をまずリポソームの形 態で前述のいずれかの方法により調製することができ、次いで配位子をリポソー ム分散液中に導入し、次いでこの分散液を凍結および融解の２以上のサイクルに かけることができ、こうすると配位子はリポソーム中にマイクロカプセル化され るようになり、次いで重合を上のように誘導することができることがわかった。

リポソームは重合の前または後に大きさに従い分離することができる。モレキュ ラーシーブのクロマトグラフィーのカラムに分散液を通過させると、大きいリポ ソームは小さいリポソームから分離される。あるいは、リポソームの大きさは分 散液を限外濾過膜、例えば、ポリカーボネートおよびヌクレオボア（ｎｕｃｌｅ ｏｐｏｒｅ）の膜に強制的に通過させることによって変更することができる。

適当な配位子は、ヘモグロビンまたは架橋したヘモグロビンの溶液、他のポルフ ィリン誘導体、合成キレート［例えば、Ｆｅ（ＩＩ）またはｃｏ　（ｎ）に基づ くもの；パルドウイン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、１９７５］、フルオロカーボンまた はパーフルオロ化学物質［例えば、パーフルオロトリブチルアミンおよびパーフ ルオロデカリン：スロビター（Ｓ１ｏｖｉｔｅｒ）、１９７５］を包含する。

ジアセチレン系リン脂質七ノマーエの水性分散液は、多層１球形の小胞（「リポ ソーム」）を形成し、これらのリポソームは照射後それらの形状を維持する。可 溶性標識物質（ｍａｋｅｒ）の連行および浸透圧計としての分散液の挙動は、七 ツマ−の脂質がシールされた構造を形成することを確証した。ジアセチレン系リ ン脂質の小胞の重合は、沈殿に対するそれらの安定性を劇的に増大した。その上 、球形の形態は高濃度の塩溶液またはエタノールの溶液の中で変更しないように 思われる。生対外の予備実験において、重合したリポソームは人間の血漿中で３ ７℃において１週間にわたって安定であった。

リン脂質の濃度およびサブクラス（ｓｕｂ−ｃｌａｓｓ）の組成の変動に感受性 である生体外系における種々のリポソームの凝固速度を、われわれは検査した。

脳の脂質抽出物（大量の負に帯電したリン脂質を含有する）は、濃度に依存する 方法で凝固物の形成速度を著しく加速した。負に帯電したリポソームと対照的に 、シミリストイルホスファチジルコリンから調製した小胞はブランクの凝固時間 を減少しなかった。同様に、凝固物の形成は、七ツマ−またはポリマーの形態の いずれで存在するときも、ＥＰ−Ａ−００３２６２２号のジアセチレン系ホスフ ァチジルコリンにより影響を受けなかった。これらの結果は、本発明において使 用する重合したリン脂質リポソームが非血栓発生性であることを示唆する。

重合したリポソームの脂質組成は、ある比率の非重合性脂質および／または親油 性添加剤を含むように変更することができる０例えば、非重合性類が重合性類と 長さにおいて異るある混合銀ジアセチレン系リン脂質について起こりうる、ポリ マー鎖の充填の不完全性は、リポソームの内側から外側への配位子の漏れ速度に 影響を及ぼすことがある。ジアセチレン系脂質から形成される二層内にコレステ ロールを含めることにより、モノマーのジアセチレン系リン脂質から構成される リポソームの漏れ速度を減少するとかできる。同様に、充填に劣るポリマーのリ ン脂質からの潟れもコレステロールにより減少することができる０重合したジア セチレン系リン脂質の共役バックボーンは、長期の貯蔵又は高い酸素濃度の条件 下で１次第に酸化される。非常に少量の親油性酸化防止剤、例えば、アルファト コフェロールまたはブチル化ヒドロキシトルエンを含有させると、脂質の酸化は 制限される。少量の負に帯電したリン脂質１例えば、ホスファチジン酸、ホスフ ァチジルエタノールアミン、ジアセチルホスフェートまたはホスファチジルセリ ンを含めると、リポソームによる捕獲の効率（例えば、合計の脂質のモル当りに 捕獲されるヘモグロビンのモル数）が増加し、モしてモノマーのリポソームが凝 集する能力が制限される。モノマーの状態における負に帯電したリン脂質の血栓 発生性と対照的に、われわれの前の研究［ハイワード（Ｈａｙｗａｒｄ）および チャブーＦ７　（Ｃｈ　ａ　ｐｍａ　ｎ）、１９８４　、　ハイワードら、１９ ８５］は、血栓発生性リン脂質のプロコアギュラントの可能性がジアセチレン系 部分の重合により発生する結晶質格子中にそれらを含めることによって低下また は排除されることを明瞭に立証する。

本発明は、ポリマーのリポソームの特定かつ新規な用途−ポリマーの小胞中に捕 獲される化合物との結合による酸素または他の気体の輸送を取扱う０本発明は１ 人工細胞の早期および最近の見解［チヤツプ（ｃｈａｎｇ）、１９８０］からの 有意の進歩であリージアセチレン系リン脂質の非常に向上した安定性および血液 適合性のため−そしてジアセチレン系脂質の従来未知の応用である。

酸素または他の気体を輸送できるリポソームの調製に、いくつかの方法を利用す ることができる。特定の目的は、リポソームにより取囲まれた隔室内に配位子を 捕獲することである。適当な配位子は、上に示したヘモグロビン、合成午レート および誘導体およびフルオロカーボンオイルを包含する。配位子は自発的に形成 したリポソーム内に、水溶液／懸濁液をモノマーのリン脂質の乾燥したフィルム へ添加するとき捕獲されるようになる。モレキュラシーブのクロマトグラフィー および限外濾過により、ヘモグロビンがヘモソーム（ｈａｅｍｏｓｏｍｅ）内に 捕獲されることを、われわれは立証した。捕獲されたヘモグロビンは、これらの 方法の両者により余分のヘモソームのヘモグロビン（ｅｘｔｒａ−ｈａｅｍｏｓ ｏｍａｌ　ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）から容易に分離される。遊離ヘモグロビン からの捕獲されたものの溶解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、重合の前または後に 紫外線により達成することができる。大量の酸素の存在は重合過程を阻害するこ とがあるので、ヘモグロビンーヘモソームはデオキシ−ヘモグロビンを用いて最 もよく調製される０重合は懸濁液の色の変化により定性的に証明され、そして後 に脂質をクロロホルム溶液中に抽出することにより確証された。捕獲された配位 子の濃度は、乾燥脂質フィルムへ添加される溶液／＠濁液の水性濃度を単に変更 することにより調節される。

重合したヘモソームは、また、凍結乾燥した血液代用物の生産を約束する。生物 学的膜の脱水は構造的および機能的一体性の取返しのつかない損失を通常伴い［ クロウ（Ｃｒ　ｏ　ｗｅ）ら、１９８４］、その少なくとも一部は複雑な結晶層 のリン脂質の形成のためであり、そのあるものは二層でない構造である。再水和 すると２　リポソームおよび再構成された系は形態的損傷の証拠を示す、対照的 に、膜を炭水化物、とくにトレハロースの存在下に乾燥すると、転相の証拠は脱 水の間および再水和時に見られず、小胞は新しく調製されたものに形態学的かつ 機能的に類似する。こうして、炭水化物を使用して凍結−乾燥の間にリポソーム を安定化することができる０重合したリポソームは、隣接するリン脂質の間の共 有結合により支持される結晶格子のために、脱氷／再水和の間に増大した安定性 を示すことができる。

また、凍結−乾燥の間のヘモグロビンの安定性をわれわれは研究した。新たに分 離したヘモグロビンの約８５〜９７％が酸素の周囲分圧で酸素化される。炭水化 物の不存在下の脱水／再水和の後、新しいヘモグロビンの９０％までがメトヘモ グロビン（ｍｅｔｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）に酸化され、そして酸素をもはや輸 送することができなかった。対照的に、ヘモグロビンをトレハロース、ガラクト ースまたはグルコースの存在下に乾燥すると、蛋白質の８０％までは酸素と結合 しかつそれを輸送する能力を保持した。これらの結果が強く示唆するように、ポ リマーのヘモソーム内に炭水化物を含めることは凍結−乾燥した血液代用物を製 造する手段を提供することができる。

次の実施例により、本発明を説明する。

実施例 いく種類かのジアセチレン系ホスファチジルコリンを、こらの研究において使用 した６式１の脂質を使用した：式中、ｎ＝１．ｍ＝２かつＲ＝ＣＨ３ モしてＢ、＝８２＝ −Ｃｏ　−（ＣＨ２）　ｓ　、　Ｃ＝Ｃ、Ｃ＝Ｃ−（ＣＨ２）　ｎｃＨ３ここで ｎ＝９（脂質Ｉａ）またはｎ＝１３（脂質Ｉｂ）および式中、Ｂ＋ｔ’ＪよびＢ ２の一方はＣｏ　（ＣＨ２）ｓ　ＣａＣ、Ｃ＝Ｃ（ＣＨ２）ｇ　ＣＨ３であり、 　そしてＢ＋　１３よびＢ２の他方はＣ＋５Ｈ３３とＣ＋５Ｈ３３との残基の混 合物である（脂質Ｉｃ）。

脂質Ｉａ、ＩｂおよびＩｃの各々を、下の方法Ａ、ＢおよびＣの各々によりヘモ ソーム（ヘモグロビン誘導体を含有するリポソーム）に配合した。

方法Ａ、す′／酸塩緩衝液ｐＨ７中のデオキシ−・〜モグロビン（６ミリモルの ヘム）を乾燥したモノマーの脂質（５ｍ　ｇ　／　ｍ　］の最網製度）に酸素不 合条件下に添加することによって、多層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａ、ｒ）のへ モソームを調製した。この懸濁液を脂質の転相温度より上におだやかに加熱し、 渦形成し２次いで適度に音波処理した。ヘモソームを遊離ヘモグロビンからセフ ァロース（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ）　４ＢＦフアーマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）のモレキュラーシーブのクロマトグラフィーにより分離した。

方法旦、リポソームをまた上の方法Ａにおけるように調製したが、音波処理を高 度に実施して小さい単一層（ｕｎｉ　ｌａｍｅ　Ｉ　ｔａｒ）のへモソームを製 造した。

方法９、リポソームをまた上の方法Ａにおけるようであるが、ヘモグロビンの不 存在下に調製した６次いで、ヘモグロビンをリン酸塩緩衝液中のリポソームの懸 濁液へ添加し、そしてヘモグロビン（６ミリモルのヘム、最終）およびリポソー ム（５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）の混合物を使用して数サイクルの凍結および融解 によりマイクロカプセル力（ｅｎｃａｐｓｌａＬｉｏｎ）した、ヘモグロビンの 捕獲（ｅｎｔ　ｒａｐｍｅｎｔ）を、セファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ のモレキュラーシーブのクロマトグラフィーにより確かめた。

脂質Ｉａ、ＩｂおよびＩｃを使用して方法Ａ、ＢまたはＣにより得ｒれたヘモソ ームの重合を、キセノンランプを使用する２５４ナノグーにおける照射により実 施した。ポリマーの形成を、懸濁液の色変化により、およびクロロホルム中への 脂質の抽出により定性的に確かめた。重合は、マイクロカプセル化されていない ヘモグロビンからヘモソームを分離する前または後のいずれにおいても実現する ことができた９重合は余分のヘモンームのヘム（ｈａｅｍｅ）の不存在下に最も 急速に進行した。

ヘムの多少の酸化（Ｆｅ＋“からＦｅ十“＋への）は、１０分以上の照射後に認 められた。これは１モル％のアルファトコフェロール（リン脂質のモル濃度に関 して）を含めることによって部分的に排除された。

酸化は次の２つのアプローチの組み合わせにより最も効果的に排除された：ａ） ｊＪｉ製されたヘモグロビンの代わりに溶血物を使用する、およびｂ）重合前に ヘモグロビンをカーボンモノキシ（ｃａｒｂｏｎ　ｍｏｎｏｘｙ）ヘモグロビン に転化する。溶血物は天然の酸化防止剤（例えば、グルタチオン）を多少含有す る。この天然の酸化防止剤は赤血球中に含有されているが、精製されたヘモグロ ビンの溶液中には存在しない、−酸化炭素のヘモグロビンへの結合は、紫外線に よる照射の間のヘムの酸化に起因する微量のヘモグロビンを効果的に除去する。

オキシヘモグロビンの再転化（重合後）は、純粋な酸素の流れの下に可視光線を 照射することによって達成された。可視光線の低いエネルギーはこれらの条件下 にヘムを酸化しなかった。

脂質Ｉａ、ＩｂおよびＩｃを使用してすべての方法により調製されたヘモソーム は、ヘモグロビンを室温または４℃において５日にわたって保持した。脂質Ｉｂ （これらの条件下に検定した唯一の脂質）から調製した試料はヘモグロビンを４ ℃において３月にわたって保持した（ヘモグロビンの２％より少ない量は外部の 媒質の中に漏れた）、ヘモグロビンの保持を遠心分離により確かめた：ヘモグロ ビンを上ずみ液中に検出することはできなかった。

捕獲されたヘモグロビンの濃度は、乾燥した脂質のフィルムへ添加する溶液／懸 濁液の水性濃度を単に変化させることによって調節することができる。他の配合 物において、イノシトールへキサホスフェート（２ミリモル）はポリマーのヘモ ソーム中に捕獲され、そして停止した流れの急速反応（ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏ ｗ　ｆａｓｔ−ｒｅａｃｔ　ｉ。

ｎ）顕微鏡検査法により測定して、酸素の供給（ｏｘｙｇｅｎ　Ｑｆｆ−１ｏａ ｄｉｎｇ）を加速した。

重合したヘモソームおよび七ツマ−のへモソームの無機アニオンに対する透過性 を、ヘモソームの分散液にフェリシアン化カリウムの小さい結晶を添加すること によって試験した。この高度に帯電したアニオンはヘモグロビンに接近したとき 、ヘム基は急速に酸化される；この過程はソウレット領域（Ｓｏｒｅｔ　ｒｅｇ ｉｏｎ）におけるスペクトルの監視によって観測できる。モノマーのへモソーム ヘフェリシアン化物を添加すると、ヘムは急速に酸化された。リン脂質の重合は 酸化速度を著しく減少させた。脂質Ｉｃおよびコレステロール（モル分率０．５ ）から構成された重合したヘモソームはフェリシアン化物に対して高度に不透過 性であった：洗浄剤溶液（１〜５％のトリトンＸ−１００）中においてさえヘム の酸化は起こらなかった。

顕微鏡検査法により、前述にようにして得られた重合した脂質１ａ、Ｉｂおよび Ｉｃに基づくヘモソームのヘモグロビンーヘモソームの気体透過性を検査した。

ヘモグロビンは生理学的条件（室温においてｐＨ７の水性緩衝液）下に分子状酸 素、窒素または二酸化炭素を可逆的に結合することができた。平衡は総時間目盛 （数秒）で急速であり、そして同一条件下の無傷の赤血球の挙動に密接に類似し た。添付図面の第１図は、リン酸塩緩衝液中のヘモグロビンーヘモソームについ てのソウレット領域（ヘモグロビンの結合状態に感受性である領域）における可 視スペクトルを示す０重合したリポソーム（ヘモグロビンを含まない）を参照ビ ーム中に配置した。

酸素化−脱酸素化に対応する可逆スペクトルのシフトは、懸濁液中に窒素または 酸素を泡立てて通入したのち得られた。遠心分離後の無色の上澄み液の形成によ り証明されるように、ヘモグロビンはヘモソームから開放されなかった。これら の結果が明白に示すように：ａ）ヘモグロビンはポリマーのヘモソームの閉じた 体積内に保持される、ｂ）捕獲されたヘモグロビンは溶解した気体を可逆的に結 合することができる、およびＣ）ポリマーの脂質の二層は気体透過性である。

ポリマーの酸素輸送性リポソームは、生体内および生体外の両者において重要な 潜在的用途を有する。気体の結合および解離はリポソームが生体内において酸素 の担体として作用するために十分に急速であるように思われ、その見解はそれら の明白な生物適合性および血液適合性により強化される。このようなリポソーム は外科の血液希釈（ｈａｅｍｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）の間に使用することができる であろう、この手順において、放血は外科の前に実施される。外科の血液の損失 は緩衝液、内因性血漿、または血漿増量剤中の酸素輸送性リポソームにより補償 されうる。最後に、患者自身の血液は、リポソームの除去後に再注入することが できる。これらのリポソームは、宗教的立場に基づき相同血液輸注を拒否する患 者のために、あるいは積な血液型または免疫疾患をもつ患者において使用するこ とができる。酸素を含んだリポソームは−酸化炭素の中毒を処置するために、鐘 状赤血球の発祥の作用を逆転するために、あるいは貧血におけるヘマトクリット を増加するために使用することができる。生体外の用途は６計の始動、遠隔（例 えば、水中）呼吸装置における酸素の輸送または他の気体の輸送媒体を包含する 。追加の用途は、塊状発酵および下水処理におけるようなバクテリアの培養物の 酸素化を包含する。

ヘモソームのノ」・脳内の含量は配位子の濃度または組成の簡単な操作を越えて 変更することもできる。２．３−ジホスホグリセレートまたはアデノシントリホ スフェートを含有させると、酸素に対するヘモグロビンの親和性が低下し、そし てそれらは組織への酸素の供給を増加するために使用することができる。リダク ターゼ系を捕獲させてヘモグロビンの酸化を防止することができる。他の研究所 は二暦自体内ば酸素付加物を「埋める」ことによって酸化の問題を排除する試み をした［ツチダ（Ｔｓｕｃｈｔｄａ）ら、１９８］。

Ｊ１用文献− １、パルドウイン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、Ｊ、、Ｅ−Ｌ９７５．可艶な人２、バン グハム（Ｂａｎｇｈａｍ）、Ａ、Ｄ、、ペシカ（Ｐｅｔｈｆｃａ）、Ｂ、Ａ、お よびシー−Ｆ７　（Ｓｅａｍａｎ）、Ｇ、Ｖ、Ｆ、、１３、バングハム（Ｅａｎ ｇｈａｍ）、Ａ、Ｄ、、スタンプ！−／シ（Ｓｔａｎｄｉｓｈ）、Ｍ、Ｍ、およ びワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）。

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およびゴｙトシャルク（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ）、Ｗ、１９８３．ラッ（Ａｎａ 、ｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ）、旦５．（ｓｕｐｐｌ、）。

９、ジョンストア（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）、Ｄ、Ｓ、、サングヘラ（Ｓａｎｇｈｅ ｒａ）、Ｓ、、ポンス（Ｐｏｎｓ）、Ｍ、およびチャブマン（Ｃｈａｐｍａｎ） 、Ｄ、、１９８０．リン脂質ポリマー−合成およびスペクトル特性、バイオロジ ー・バイオロジカ１乙７ｆｆ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、 ６０２．５７−６９゜１０、スロビタ−（Ｓｌｏｖｊｔｅｒ）、Ｈ，Ａ、、１９ ７５．人工赤血球としてのパーフルオロ化合物、フェダレーションズ・プロシー ディンゲス（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、）、３４．１４８４−１４８７゜１１、　ツチ ダ、Ｅ０、ニシデ、Ｈいセキネ２Ｍ、およびヤマギシ。

Ａ、、１９８３．半生理学的条件下の酸素担体としてのリポソームのヘム、バイ オヒミカーバイオフィジカ１乙９９　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ ｔａ）、ヱ３４．２７４−２７８゜１２、ハイワード（Ｈａｙｗａｒｄ）、Ｊ、 Ａ、およびチャブマン（Ｃｈａｐｍａｎ）、Ｄ、、１９８４．ポリマー設計のた めノモデルとして生物膜表面：血液適合生のための可能生、バイヲマティーリア ルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、５，１３５−１４３゜１３、ハイワード（ Ｈａｙｗａｒｄ）、Ｊ、Ａ、、カステリ　（Ｃａｓｔｅｌｌｉ）、Ｆ、、ライラ タム（Ｗｈｉｔｔａｍ）、Ｍ、Ａ、、ジョンストア（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）、ｎ、 ｓ、５よびチャブーｒン（Ｃｈａｐ：ｍａｎ）、Ｄ、、１９８５　：リポソーム および再構成された系における光重合されたジアセチレン系リン脂質の特性、− 物有機化学および分子’ｈ’ｔＡｃｔ３Ｌｆ６ａｌＪ　ＣＰ　ｒ　ｏ　ｇ　ｒ　 ｅ　ｓ　ｓ　土ｎ　ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ）、（Ｙｕ、Ａ、オブヂニコ−ｊｔｌＡ）　、エルセビーア、アムステ ルダム、３３５−３４２゜τ公１黒蕃赳失

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．リボソームのリン脂質ポリマーの水性分散液であって、前記リボソームは分 子状酸素とあるいは窒素または一酸化炭素または二酸化炭素と可逆的に結合する 配位子を含有し、そして前記リボソームは、一般式： ＣＨ２−Ｏ−Ｂｌ ＣＨ−Ｏ−Ｂ２ ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、 Ｂ１およびＢ２の少なくとも一方は式：−（ＣＯ）Ｐ−Ｘ１−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ− Ｙ１の基であり、ここでｐは０または１であり、Ｘ１は直接結合または二価の脂 肪族もしくは環式脂肪族の基であり、Ｙ１ほＨまたは−価の脂肪族もしくは環式 脂肪族の基であり、各Ｂ１および／またはＢ２におけるＸ１およびＹ１中の炭素 原子の合計の数は８〜２６であり、そしてＢｌおよびＢ２の他方は（ａ）式： −（ＣＯ）Ｐ−Ｘ１−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−Ｙ１の同一もしくは相異る基であるか． あるいは（ｂ）少なくとも８つの炭素原子を含有する脂肪族もしくは環式脂肪族 の基であり；ｎは０または１であり、ｍは２、３または４であり、そして各Ｒは 独立に１〜４つの炭素原子を含有するアルキル基を表わす、の共役ジーインの分 子間および／または分子内で架橋したポリマーから形成されていることを特徴と するリボソームのリン脂質ポリマーの水性分散液。 ２、ｎ＝１、ｍ＝２かつ各ＲはＣＨ３である請求の範囲１に記載の水性分散液。 ３、Ｂ１およびＢ２の各々は同一の−（ＣＯ）Ｐ−Ｘ１−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−Ｙ１ 基である請求の範囲１または２に記載の水性分散液。 ４、Ｂ１およびＢ２において各ｐは１であり、Ｂ１中に１６〜２６の炭素原子が 存在し、そしてＢ２中に１６〜２６の炭素原子が存在する請求の範囲３に記載の 水性分散液。 ５、Ｂ１およびＢ２の両者は直鎖状の脂肪族基である請求の範囲１〜４のいずれ かに記載の水性分散液。 ６、Ｂ１およびＢ２の各々は式： −ＣＯ−（ＣＨ２）８−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎＣＨ３式中ｎは９又は１ ３である の基である請求の範囲１〜５のいずれかに記載の水性分散液。 ７、Ｂ１およびＢ２の一方は式： −ＣＯ−（ＣＨ２）８−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）９ＣＨ３の基であり、そし てＢ１およびＢ２の他方は−（ＣＨ２）１５ＣＨ３基と−（ＣＨ２）１７ＣＨ３ 基との混合物である請求の範囲１または２に記載の水性分散液。 ８、配位子はデオキシヘモグロビンまたはヘモグロビンであり、そして分散した リボソームは分子状酸素と可逆的に結合することができる請求の範囲１〜７のい ずれかに記載の水性分散液。 ９、リボソームはコレステロールまたは負に帯電したリン脂質と一緒の共役ジー インＩの混合物から形成されている請求の範囲１〜８のいずれかに記載の水性分 散液。 １０．リボソームはアルファートコフェロールおよび／またはブチルヒドロキシ トルエンと一緒の共役ジーインＩの混合物から形成されている請求の範囲１〜９ のいずれかに記載の水性分散液。 １１．リボソームはリン酸塩および／または炭水化物と一緒の共役ジーインＩの 混合物から形成されている請求の範囲１〜１０のいずれかに記載の水性分散液。 １２、炭水化物をさらに含有する請求の範囲１〜１１のいずれかに記載の水性分 散液。 １３、請求の範囲１２に記載の水性分散液から水を除去することによって得られ 、再水和すると、分子状酸素または窒素または一酸化炭素または二酸化炭素と可 逆的に結合できる水性分散液を形成することを特徴とする固体ポリマー。 １４、炭水化物はトレハロース、ガラクトースまたはグルコースである請求の範 囲１３に記載の固体ポリマー。 １５、共役ジーインＩ ＣＨ２−Ｏ−Ｂ１Ｉ ＣＨ−Ｏ−Ｂ２ＯＲ ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂ１およびＢ２の少なくとも一方は式：−（ＣＯ）Ｐ−Ｘ１−Ｃ≡Ｃ−Ｃ ≡Ｃ−Ｙ１の基であり、ここでｐは０または１であり、Ｘ１は直接結合または＝ 価の脂肪族もしくは環式脂肪族の基であり、Ｙ１はＨまたは−価の脂肪族もしく は環式脂肪族の基であり、各Ｂ１および／またはＢ２におけるＸ１およびＹ１中 の炭素原子の合計の数は８〜２６であり、そしてＢ１およびＢ２の他方は（ａ） 式： −（ＣＯ）Ｐ−Ｘ１−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−Ｙ１の同一もしくは相異る基であるか、 あるいは（ｂ）少なくとも８つの炭素原子を含有する脂肪族もしくは環式脂肪族 の基であり；ｎは０または１であり、ｍは２、３または４であり、そして各Ｒは 独立に１〜４つの炭素原子を含有するアルキル基を表わす、のリボソームからな る分散液を形成し；分子状酸素とあるいは窒素とあるいは一酸化炭素または二酸 化炭素と可逆的に結合する配位子を導入し、前記配位子は共役ジーインがリボソ ームに形成される前、間または後に、導入され、そして最後に前記共役ジーイン を重合することを特徴とするリボソームのリン脂質ポリマーの水性分散液を製造 する方法。 １６、共役ジーインは音波処理によりリボソームに形成される請求の範囲１５に 記載の方法。 １７、多層または小さい直径の単一層のリボソームを形成する請求の範囲１６に 記載の方法。 １８、配位子をリボソームの形成後に分散液中に導入し、そして配位子およびリ ボソームを含有する分散液を凍結および融解の少なくとも２つのサイクルにかけ て配位子をリボソームの中に組入れる請求の範囲１５〜１７のいずれかに記載の 方法。 １９、共役ジーインを化学線への露出により重合させる請求の範囲１５〜１８の いずれかに記載の方法。 ２０、配位子およびリボソームは請求の範囲２〜１２のいずれかにおいて定義さ れたとおりである請求の範囲１５〜１９のいずれかに記載の方法。 ２１．分散液は炭水化物をさらに含有し、そして水を分散液から除去して固体の ポリマーを残し、前記ポリマーは、再水和すると、分子状酸素または窒素または 一酸化炭素または二酸化炭素と可逆的に結合できる水性分散液を形成する請求の 範囲１５〜２０のいずれかに記載の方法。 ２２、炭水化物はトレハロース、ガラクトースまたはグルコースである請求の範 囲２１に記載の固体ポリマー。 ２３、分子状酸素、窒素、一酸化炭素または二酸化炭素である気体を請求の範囲 １〜１２のいずれかに記載の水性分散液と第１ステーションにおいて接触させて 気体に富んだ水性分散液を形成し、前記気体に富んだ水性分散液を第２ステーシ ョンへ輸送し、そして前記気体に富んだ水性分散液から前記気体を第２ステーシ ョンにおいて解放することを特徴とする分子状酸素、窒素、一酸化炭素または二 酸化炭素である気体を輸送する方法。