CN114698630B - 一种胎盘组织保存液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胎盘组织保存液及其制备方法与应用，属于组织保存技术领域。所述胎盘组织保存液包括氨基酸、硫酸葡聚糖、丙酮酸钠、柠檬酸铁、硫酸锌、抑菌剂和细胞凋亡抑制剂。保存方法包括：将胎盘组织用无菌生理盐水冲洗后，置入含有胎盘组织保存液的密闭容器中，胎盘组织完全浸泡在胎盘组织保存液中，置于2‑8°C保存。该保存液可以长时间的保持胎盘组织的活性，有效保存期长达120小时。可以提高胎盘间充质干细胞的细胞得率和细胞活率，保证细胞的生物学功能。

Description

一种胎盘组织保存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及组织保存技术领域，尤其是一种胎盘组织保存液及其制备方法与应用。

背景技术

胎盘组织是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是胎盘间充质干细胞的重要来源。间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，可分化为多种间质组织,如骨骼、软骨、脂肪等。胎盘组织取材方便，胎盘组织的应用无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，极其适合用于临床研究和应用，是间充质干细胞的理想来源。

由于组织离体后，受到多种因素影响导致细胞活性降低甚至死亡，使得原代培养的预处理过程中无法获得足量具有活性的细胞，进而导致培养失败。胎盘组织中含有丰富的胎盘血，血液容易凝集导致无法进行细胞的分离提取。保持胎盘组织的活性直接影响到胎盘间充质干细胞的分离培养和后续的细胞治疗应用。因此胎盘组织的保存显得尤为重要。

胎盘组织是在产妇分娩后采集的，离体后的胎盘组织要转运到洁净实验室中，在完成传染病及微生物检测后，再进行后续的分离培养实验。从胎盘组织离体到完成原代细胞分离培养需要相对较长的时间，如果洁净实验室在异地，则需要更长的时间。如何长时间保存胎盘组织而不使其失去活性是一项亟需解决的难题。

目前的细胞保存液主要分为含血清和无血清保存液两种，其中含血清保存液由于血清成分的差异，其保存效果具有不稳定性，有异种蛋白污染和致病微生物感染风险，且血清中的某些细胞因子会导致细胞的非预期分化，从而无法获得高活性的原代细胞。无血清保存液则以基础培养基为主，虽然解决了生物安全性问题，但由于营养成分不足，无法避免失巢凋亡，保存时间短等问题。综上，目前的组织保存液无法较长期地保留组织活性和维持来源组织的特性，成为原代细胞分离培养成功的重要障碍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种成分稳定、安全、无任何毒副作用或生物安全问题，能长时间有效保存胎盘组织，且能很好的维持胎盘间充质干细胞活力，不引起细胞的功能性变异的胎盘组织保存液。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种胎盘组织保存液，包括氨基酸、硫酸葡聚糖、抑菌剂和细胞凋亡抑制剂，保存液以终浓度计包括以下组分和配比：

L-亮氨酸20~150 mg/L

L-赖氨酸盐酸盐50~300 mg/L

L-苏氨酸10~100 mg/L

L-谷氨酰胺200~500 mg/L

L-精氨酸盐酸盐50~300 mg/L

硫酸葡聚糖0.1~5g/L

抑菌剂Primocin6~20 mg/L

细胞凋亡抑制剂Survivin10~200 μg/L

细胞凋亡抑制剂Pifithrin-α 5~50μg/L

其余为水。

还包括以下终浓度的组分：丙酮酸钠20~300 mg/L、柠檬酸铁10~50 mg/L、硫酸锌0.1~5 mg/L。

上述胎盘组织保存液的制备方法，其特征在于，根据各组分的溶解特性分类溶解，然后混合，加入水，调节pH值至7.2~7.4混合均匀即可。

上述胎盘组织保存液在对胎盘组织进行胎盘间充质干细胞分离培养前保存中的应用。

将胎盘组织离体后完全浸入胎盘组织保存液中，于2~8℃的密闭容器中保存。

所述保存液对胎盘组织的有效保存时间为120小时，并能保证胎盘间充质干细胞分离培养的细胞数量、活力和生物学功能。

本发明的有益效果是：

（1）本发明的胎盘组织保存液可以使离体组织较长期地在2-8℃环境下保存并保留其活性与分化特征。

（2）本发明的胎盘组织保存液摒弃了胎牛血清(FBS)这一常用的保存液组分，从而降低了由于血清的批间不稳定性导致的效果差异和非预期分化，克服了异种蛋白污染和致病微生物感染风险。

（3）本发明的胎盘组织保存液能够有效降低原代培养中的微生物污染风险。

（4）本发明的胎盘组织保存液能够大幅度提高原代培养的成功率和存活率。

附图说明

图1是本发明实施例4的胎盘保存液中保存120小时提取的原代细胞的细胞形态以及成脂成骨分化后的染色结果图（A为提取的原代细胞的细胞形态；B为原代细胞的成脂分化后的染色结果；C为原代细胞的成骨分化后的染色结果）；

图2是本发明实施例5的组织保存液保存72小时和96小时提取的原代细胞的细胞形态图；

图3是本发明实施例6的胎盘保存液保存120小时的原代细胞的细胞形态图；

图4是本发明实施例4、5、6的各保存时间点的提取的原代细胞数量的比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。

本发明的胎盘组织保存液，包括氨基酸、硫酸葡聚糖、抑菌剂和细胞凋亡抑制剂，保存液以终浓度计包括以下组分和配比：

L-亮氨酸20~150 mg/L

L-赖氨酸盐酸盐50~300 mg/L

L-苏氨酸10~100 mg/L

L-谷氨酰胺200~500 mg/L

L-精氨酸盐酸盐50~300 mg/L

硫酸葡聚糖0.1~5g/L

抑菌剂Primocin6~20 mg/L

细胞凋亡抑制剂Survivin10~200 μg/L

细胞凋亡抑制剂Pifithrin-α 5~50μg/L

其余为水。

还包括以下终浓度的组分：丙酮酸钠20~300 mg/L、柠檬酸铁10~50 mg/L、硫酸锌0.1~5 mg/L。

上述胎盘组织保存液的制备方法，其特征在于，根据各组分的溶解特性分类溶解，然后混合，加入水，调节pH值至7.2~7.4混合均匀即可。

上述胎盘组织保存液在对胎盘组织进行胎盘间充质干细胞分离培养前保存中的应用。

将胎盘组织离体后完全浸入胎盘组织保存液中，于2~8℃的密闭容器中保存。

所述保存液对胎盘组织的有效保存时间为120小时，并能保证胎盘间充质干细胞分离培养的细胞数量、活力和生物学功能。

优选地，所述胎盘组织保存液，其组分的终浓度：L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360 mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α 20µg/L, Primocin 10mg/L。进一步优选地，增补添加组分的终浓度：丙酮酸钠 55 mg/L,柠檬酸铁 18 mg/L, 硫酸锌 1.2 mg/L。出人意料的发现，增补丙酮酸钠、柠檬酸铁和硫酸锌后，胎盘间充质干细胞的收率得到了大大的提高。

所述硫酸葡聚糖是一种多糖，能够抑制水溶性的纤维蛋白原被氧化成难溶的纤维蛋白，防止血细胞凝集。丙酮酸钠是一类参与组织和器官的代谢的内源性小分子物质，发挥显著地抗氧化作用，清除过氧化氢和其他活性化合物的损伤。所述Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一。能够促进细胞Rb磷酸化增加,S期细胞数显著增加，进而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。所述Pifithrin-α是一种细胞凋亡抑制剂，能可逆性地抑制p53依赖的基因转录激活,例如cyclin G, p21/waf1和mdm2，进而抑制p53介导的细胞凋亡。所述Primocin是一种专门设计用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用，Primocin对原代细胞没有毒性，因为其作用的靶标只存在于微生物上。

本发明的材料来源：

本发明实施例采用L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸盐酸盐购自Gibco公司。

本发明实施例采用的Primocin购自Invivogen公司。

本发明实施例采用survivin、Pifithrin-α购自Abcam公司。

本发明实施例采用的硫酸葡聚糖、丙酮酸钠、柠檬酸铁、硫酸锌购自Sigma公司。

此外，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种胎盘组织保存液，所述胎盘组织保存液为L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360 mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α 20µg/L, Primocin 10mg/L，丙酮酸钠 55mg/L, 柠檬酸铁 18 mg/L, 硫酸锌 1.2 mg/L。

实施例2

一种胎盘组织保存液，所述胎盘组织保存液为L-亮氨酸20 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐50 mg/L，L-苏氨酸10 mg/L，L-谷氨酰胺200 mg/L，L-精氨酸盐酸盐 50 mg/L，硫酸葡聚糖0.1g/L，Survivin 10µg/L，Pifithrin-α 5µg/L, Primocin6mg/L，丙酮酸钠20 mg/L, 柠檬酸铁 10 mg/L, 硫酸锌0.1 mg/L。

实施例3

一种胎盘组织保存液，所述胎盘组织保存液为L-亮氨酸150 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐300 mg/L，L-苏氨酸100 mg/L，L-谷氨酰胺500 mg/L，L-精氨酸盐酸盐300 mg/L，硫酸葡聚糖5g/L，Survivin 200µg/L，Pifithrin-α 50µg/L, Primocin20mg/L，丙酮酸钠300 mg/L, 柠檬酸铁50 mg/L, 硫酸锌5 mg/L。

实施例4

胎盘组织取自足月健康产妇，同时采集产妇外周血用于病毒检测。胎盘自手术台取下后，用无菌生理盐水冲洗后，置入含有实施例1的胎盘组织保存液的密闭塑料容器（3L塑料罐）中，胎盘组织完全浸泡在胎盘组织保存液中，置于2-8°C保存并运输至洁净实验室。病毒（HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等）检测项目均为阴性后，进行胎盘组织的分离提取。自组织放入密闭容器起开始计时，分别于24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时，在超净台内打开塑料容器，切下5g组织进行胎盘间充质干细胞分离提取，分离提取方法参考中国专利（CN103451150A），细胞贴壁6天后，观察细胞形态、贴壁率，比较细胞完全融合时间，细胞得率，传代后的细胞倍增时间。由表1可以看出组织在本发明的保存液保存小于120小时的各时间点，均可以成功提取到形态、数量、活率和倍增时间较好的原代间充质干细胞。组织在本发明的保存液保存超过120小时后，随着时间推移，细胞的形态变大，逐渐老化，数量和活率锐减，倍增时间变得很长。由此可见本发明的保存液可以至少保证120小时的组织保存。图1A为在实施例1的胎盘保存液中保存120小时提取的原代细胞的细胞形态。将保存120小时后提取的细胞进行表型鉴定和成脂成骨分化鉴定，结果表明所获得的间充质干细胞的表型为CD73 99.1%, CD90 99.5%, CD10598.9%, CD44 99.9%, CD34 0.8%, CD45 0.7%, CD19 0.9%, MHC-II 0.8%，结果表明此间充质干细胞具有特有的间充质干细胞表面标志。在成脂诱导分化14天后油红O染色阳性，表明间充质干细胞具有成脂分化能力。在成骨诱导分化21天后茜素红S染色阳性，表明间充质干细胞具有成骨分化能力。图1B、1C为在实施例1的胎盘保存液中保存120小时提取的原代细胞的成脂成骨分化后的染色结果。

表1 保存不同时间后提取原代间充质干细胞的各参数比较

	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	144小时
							细胞形态	个头小、典型纺锤形	个头小、典型纺锤形	个头小、典型纺锤形	个头小、典型纺锤形	个头变大，典型纺锤形	个头变大，变薄，老化
培养4天贴壁率（%）	60	60	50	40	30	5
							融合时间（天）	6	6	6	7	9	N/A
P0细胞数量(X10<sup>8</sup>)	7.8	6.9	6.3	5.7	4.2	0.2
							P0细胞活率（%）	98.7	98.5	99.4	99.2	79.8	54.3
P0-P1倍增时间(小时)	21.3	22.9	21.8	22.4	31.3	98.3

实施例5

胎盘组织取自足月健康产妇，同时采集产妇外周血用于病毒检测。胎盘自手术台取下后，用无菌生理盐水冲洗后，置入含有市售的组织保存液A（货号：BC-CFM-03,厂家:南京森贝伽生物科技有限公司）的密闭塑料容器（3L塑料罐）中，胎盘组织完全浸泡在胎盘组织保存液中，置于2-8°C保存并运输至洁净实验室。病毒（HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等）检测项目均为阴性后，进行胎盘组织的分离提取。自组织放入密闭容器起开始计时，分别于24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时，在超净台内打开塑料容器，切下5g组织进行胎盘间充质干细胞分离提取，分离提取方法参考中国专利（CN103451150A），细胞贴壁6天后，观察细胞形态、贴壁率，比较细胞完全融合时间，细胞得率，传代后的细胞倍增时间。实验结果表明市售组织保存液A保存72时内可以成功分离得到形态典型、状态好的间充质干细胞，超过72小时后，提取到细胞的状态变老，变差，数量锐减，细胞增殖缓慢，无法进一步传代（表2），图2为保存72小时和96小时提取的原代细胞的细胞形态。因此市售组织保存液A可以保证72小时的组织保存。保存时间远低于实施例4的120个小时。

表2 保存不同时间后提取原代间充质干细胞的各参数比较

	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	144小时
							细胞形态	个头小、典型纺锤形	个头小、典型纺锤形	个头变大，典型纺锤形	个头变大，老化变薄	个体变大，老化变薄	未见细胞
培养4天贴壁率（%）	60	60	40	30	10	N/A
							融合时间（天）	8	9	11	14	N/A	N/A
P0细胞数量(X10<sup>8</sup>)	6.4	7.1	4.8	1.3	0.04	N/A
							P0细胞活率（%）	95.0	87.4	80.2	57.3	56.1	N/A
P0-P1倍增时间(小时)	22.3	22.6	23.5	43.7	114.3	N/A

实施例6

胎盘组织取自足月健康产妇，同时采集产妇外周血用于病毒检测。胎盘自手术台取下后，用无菌生理盐水冲洗后，置入含有胎盘组织保存液（L-亮氨酸 50 mg/L， L-赖氨酸盐酸盐 90 mg/L，L-苏氨酸 50 mg/L，L-谷氨酰胺 360 mg/L，L-精氨酸盐酸盐 150 mg/L，硫酸葡聚糖0.5g/L，Survivin 50µg/L，Pifithrin-α20µg/L, Primocin 10mg/L）的密闭塑料容器（3L塑料罐）中，胎盘组织完全浸泡在胎盘组织保存液中，置于2-8°C保存并运输至洁净实验室。病毒（HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等）检测项目均为阴性后，进行胎盘组织的分离提取。自组织放入密闭容器起开始计时，分别于24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时，在超净台内打开塑料容器，切下5g组织进行胎盘间充质干细胞分离提取，分离提取方法参考中国专利（CN103451150A），细胞贴壁6天后，观察细胞形态、贴壁率，比较细胞完全融合时间，细胞得率，传代后的细胞倍增时间。由表3可以看出组织在此保存液保存小于72小时的各时间点，均可以成功提取到形态、数量、活率和倍增时间较好的原代间充质干细胞，随着时间推移，细胞的形态变大，逐渐老化，数量和活率锐减，和实施5的保存时效相似，但明显短于实施例4的保存时间。图3为该组织保存液保存120小时的原代细胞的细胞形态。该胎盘组织保存液的成分比实施1的成分减少了丙酮酸钠、柠檬酸铁和硫酸锌。由此可见，此三种成分在维持组织更长时间的保存起到了至关重要的作用（图4为实施例4、5、6的保存液保存不同时间点提取的原代细胞数量比较）。

表3 保存不同时间后提取原代间充质干细胞的各参数比较

	24小时	48小时	72小时	96小时	120小时	144小时
							细胞形态	个头小、典型纺锤形	个头小、典型纺锤形	个头变大，典型纺锤形	个头变大，老化变薄	个体变大，老化变薄	未见细胞
培养4天贴壁率（%）	60	50	50	20	5	N/A
							融合时间（天）	8	9	10	15	N/A	N/A
P0细胞数量(X10<sup>8</sup>)	7.7	6.8	4.8	1.8	0.1	N/A
							P0细胞活率（%）	93.0	82.4	78.8	52.4	53.5	N/A
P0-P1倍增时间(小时)	24.3	24.7	29.9	57.2	104.0	N/A

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.一种胎盘组织保存液，其特征在于，包括氨基酸、硫酸葡聚糖、抑菌剂和细胞凋亡抑制剂，保存液以终浓度计包括以下组分和配比：

2.如权利要求1所述胎盘组织保存液的制备方法，其特征在于，根据各组分的溶解特性分类溶解，然后混合，加入水，调节pH值至7.2～7.4混合均匀即可。

3.如权利要求1所述胎盘组织保存液在对胎盘组织进行胎盘间充质干细胞分离培养前保存中的应用。

4.根据权利要求3所述胎盘组织保存液在对胎盘组织进行胎盘间充质干细胞分离培养前保存中的应用，其特征在于，将胎盘组织离体后完全浸入胎盘组织保存液中，于2～8℃的密闭容器中保存。

5.根据权利要求4所述胎盘组织保存液在对胎盘组织进行胎盘间充质干细胞分离培养前保存中的应用，其特征在于，所述保存液对胎盘组织的有效保存时间为120小时，并能保证胎盘间充质干细胞分离培养的细胞数量、活力和生物学功能。

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