CN111647551B - 同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取及保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法：(1)取胎盘，以小块的形式剪下绒毛小叶结构组织；(2)置于组织浸润液中，使得留存在小叶结构中的干细胞被浸润分离出来；(3)挑选包含白色主血管的组织块，剥离或剪除白色的绒毛小叶主血管成分，加入缓冲液中孵育消化，即得干细胞。本发明还公开了一种保存方法：提取的干细胞，采用右旋糖酐40重悬，加入冻存液，分装冻存。本发明的提取方法获得的干细胞中单个核样细胞比例高，CD34+或CD133+细胞比例高，纯度高。本发明的保存方法将同一胎盘来源的非膜组织制备的细胞、以满足精准医学个性化的应用需求进行特殊形式保存，以使得整个胎盘资源得到充分利用，适应未来细胞个性使用的需要。

Description

同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取及保存方法
技术领域
本发明涉及一种同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取及个性化保存方法，属于生物医学工程技术领域。
背景技术
胎盘作为连接胎儿和母体的重要器官，其结构较为复杂，至少可分为胎盘脐带连接、羊膜包被层、绒毛膜板、绒毛组织、底蜕膜等包含不同种类细胞的组织。现有研究表明，同一份胎盘至少可以获得包括造血(祖)干细胞、绒毛血管内皮干细胞以及绒毛膜、羊膜以及绒毛组织来源的间充质干细胞等不同种类的细胞。胎盘在胎儿发育早期也是重要的造血器官，研究表明，绒毛及其绒毛小叶结构中血管成分来源的内皮干细胞和造血祖细胞，在造血过程起着重要作用。在胎盘发育早期存在造血内皮组织，主要存在绒毛小叶结构之中，胎盘小叶结构中的血管内皮在一定条件下可以从血管内皮脱落、或造血内皮细胞失去表达钙黏素5发育成为血液中的悬浮细胞(Anderson H etal；Blood.2015Dec 24；126(26):2811-2820.)，成为具备造血分化功能的干细胞。胎儿分娩后胎盘中不仅留存着丰富的造血前体或造血(祖)干细胞，而且可分离得到大量的原始免疫细胞，再经体外扩增诱导为NK等过继性免疫治疗细胞用于临床辅助回输治疗(Kang L etal；Front Immunol.2013May 1；4:101.)。当前脐带血造血干细胞移植中造血(祖)干细胞(CD34+)细胞数量已成为临床移植植入的关键因素之一，然而单份脐带血CD34+细胞数量有限，造成植入周期较长，临床治疗费用较高，增加移植临床的风险。
解决当前脐带血造血干细胞数量，可以在移植后给予辅助淋巴细胞输注提高植入效率，也可以采用移植时辅助给予间充质干细胞输注以降低GvHD不良反应。但这些措施一般只采用异体来源的淋巴细胞或间充质干细胞辅助移植，会因引入异源细胞或抗原增加负反应强度和几率，进而增加临床移植失败的风险。
中国发明专利CN 101395266A公开了一种从胎盘分离干细胞群以及用于配制胎盘干细胞组合物注射溶液的方法，但该胎盘干细胞群的特征为CD200+和HLA-G+；CD73+、CD105+和CD200+；CD200+和OCT-4+；CD73+、CD105+和HLA-G+；CD73+和CD105+；CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+，显示不包括造血祖和干细胞，未涉及从胎盘中分离的造血祖和干细胞，造成了胎盘重要干细胞资源的浪费；而且该专利仅建立了胎盘干细胞群混合保存方法，但因干细胞所来源胎盘的组织部位不同细胞特点也不同，对应细胞保存所需的最佳条件也不同，于是干细胞混合保存会造成某些种类细胞丢失；同时，也未涉及细胞库中细胞根据不同个性化需要出库应用的方法；现有研究表明，胎盘作为一个器官，不同组织部位的细胞具有不同分化方向、修复不同同源器官的作用，因此该发明专利在应用时难以满足当前精准医学要求实现的个性化治疗需要。中国发明专利CN 1407088 A公开了一种从采集过脐带血后的胎盘组织分离制备造血干细胞的方法，该技术分离的造血干细胞含量少(CD34+占0.3％～0.7％)，由于分离方法缺陷，大量有用的活性成分未提取，造成了资源的浪费；该技术采用传统公知冻存方法，对细胞伤害较大，且未按照精准医疗要求满足个性化应用进行分袋/管、以供多次使用保存，不利于细胞库建立后造福社会的需要。
发明内容
针对上述现有技术，为解决现有技术中存在的胎盘组织有用资源浪费、未充分获取胎盘中残留的造血干细胞，现有胎盘干细胞保存方式单一、对细胞损伤大、不能满足精准医疗个性化临床应用多次使用、多方式使用的要求等问题，本发明建立了一种向自体移植患者提供同一个体胎盘来源的用于辅助脐带血造血干细胞移植的多种细胞的提取方法、保存方法和应用方法，包括提供具有辅助造血功能恢复的造血内皮细胞，以大幅提高脐带血造血干细胞移植效率，降低移植失败风险。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法，包括以下步骤：
(1)剪取绒毛小叶结构组织：取胎盘，清洗消毒，以小块的形式剪下绒毛小叶结构组织，每块绒毛小叶组织至少包括1个较粗的、容纳红色胶状组织的主血管，组织小块为红色或深红色；
进一步地，所述每块绒毛小叶结构组织的体积在1～27cm3，一般一个胎盘可剪取15～20个绒毛小叶结构组织小块；
进一步地，剪下绒毛小叶结构组织的具体方式为：从子面开始解剖胎盘，先剪除脐带，用手术镊子撕开绒毛膜板，露出绒毛小叶主干血管，以主干血管为中心剪取绒毛小叶结构组织；
所述胎盘通过以下方式收集得到：选择收集未采集脐带血的留有不少于10cm脐带的胎盘，并在胎盘娩出后立即结扎胎盘上的脐带，娩出后24小时内提取造血干细胞；
进一步地，为保证样本在娩出后24h内交付提取细胞，可采用装有包含抑菌剂的缓冲溶液的生物医学样本无菌袋(如中国发明专利CN 107320332 A中公开并保护的生物医学样本无菌采集运输保存组合袋)和恒温运输箱将胎盘样本在4～10℃的温度下运输到实验室；
所述清洗是将胎盘浸润到生理盐水中进行清洗；所述消毒是指将75％医用酒精淋洗到胎盘组织表面进行消毒；
(2)第一次提取：将上述剪取的绒毛小叶结构组织小块立即置于组织浸润液中，在组织浸润液中将绒毛小叶结构组织剪碎，浸泡15～30min，使得留存在小叶结构中的干细胞被浸润分离出来；过滤得细胞悬液，用100～150um的细胞筛过滤，2000rpm、10min离心，即得干细胞，此步提取可以获得1×109～3×109个有核细胞，CD34+或CD133+细胞比例在3％～5％；充分提取出留存细胞的胎盘组织可转移到新的洁净离心管中，进行第二次提取干细胞；
所述组织浸润液是由血细胞保护剂和0.9％生理盐水溶液组成的，血细胞保护剂占30％～90％(体积百分数)(可根据绒毛小叶组织的颜色由深到浅，选择90％、80％、50％、30％的体积比)；该组织浸润液的使用可以显著提高干细胞分离效果；所述血细胞保护剂可采用市售产品，比如：商品名血液保存液I，
Figure BDA0002536064440000031
(3)第二次提取：步骤(2)中提取出留存细胞的胎盘绒毛小叶组织块，挑选包含白色主血管的组织块，用镊子剥离或剪刀剪除白色的绒毛小叶主血管成分，留下的红色组织进一步剪碎(剪成1～3cm3的小块)，然后加入含有浓度50～100ug/mL胶原酶的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中，置于37℃、150rpm的恒温摇床中孵育30分钟～90分钟，进行孵育消化；孵育消化后，过滤得消化液，对剩余的组织再进行一次孵育消化；合并两次的消化液，用100～150um的细胞筛过滤，2000rpm、10min离心，即得干细胞，一般每份胎盘可获得消化液300～800mL，此步提取可获得3×109～9×109的有核细胞，CD34+或CD133+细胞比例在3％～5％；该步用于消化的胎盘组织是经过挑选、去除了白色的绒毛小叶主血管成分的绒毛小叶组织，获得的干细胞比以往方法更纯：单个核样细胞比例更高(达80％以上)，造血相关干细胞(包括CD34+造血干细胞和CD133的造血内皮干细胞)比例更高，达50％以上。
进一步地，所述胎盘组织与杜氏磷酸盐缓冲液的体积比为1:2～3。
上述两步分离的细胞，所含细胞成分不同，其中第一步分离的细胞为留存在胎盘绒毛小叶中的脐带血成分，较适于联合脐带血直接移植，应单独成袋保存，以用于辅助造血干细胞移植直接回输。具体应用时，上述两个提取步骤(步骤2、3)，可以根据客户需要只进行其中一个步骤，只采用第一个步骤提取的细胞，一般可获取0.5×107～1×107细胞/g胎盘绒毛小叶组织，可以用于辅助同源脐带血造血干细胞移植直接回输使用，应单独成袋保存；具体的，对于胎盘破损较严重的样本，也可以只采用第二步的方法提取胎盘细胞，一般可以获取3×107～5×107细胞/g胎盘绒毛小叶组织。
进一步地，还包括以下步骤(一种同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的个性化保存方法)：
(4)上述步骤(2)、(3)提取的干细胞，分别采用少量的右旋糖酐40重悬，然后加入冻存液，分装到冻存容器中，冻存，配合造血干细胞移植疗法直接回输或扩增后回输进行联合移植；；分装时，步骤(2)、(3)提取的干细胞不能混合；本发明提供方法分离的其他细胞(指除了步骤2分离提取的干细胞之外的细胞)根据需要，可以分别用于过继性免疫治疗、或联合淋巴细胞输注辅助移植、或部分造血干细胞扩增联合移植等。
进一步地，所述冻存液分两步加入：向右旋糖酐40重悬的细胞悬液中加入A冻存液重悬细胞，再加入B冻存液；所述A冻存液，为20％人血白蛋白溶液(重量体积百分数，g/ml)，与15％右旋糖酐溶液(重量体积百分数，g/ml)或5％葡萄糖注射液(重量体积百分数，g/ml)二者的混合液，二者的体积比为3:1；所述B冻存液为杜氏磷酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或0.45％氯化钠注射液、二甲基亚砜(DMSO)三者的混合液，三者的体积比为25:25:6；A冻存液、B冻存液的体积比为：1～3:7～9(即：A冻存液占总冻存液体积的10％～30％，B冻存液占总冻存液体积的70％～90％)。
进一步地，所述冻存液，在使用前进行预冷，使得与细胞混合时的温度保持在2～4℃，冻存液加入时应在4℃控温台中进行。
进一步地，所述冻存液采用GMP或药品级溶液，可以满足临床直接复苏后输注要求。
进一步地，所述容器，可以是冰冻袋，也可以是冻存管。所用冰冻袋，可以选择中国发明专利CN 106577636 A中公开并保护的细胞冻存袋，其中三联袋可满足同时进行同源免疫细胞诱导扩增后辅助回输和同源造血干细胞扩增后辅助回输临床个性需求，可满足移植完成后至少2次的免疫细胞过继性免疫细胞辅助回输治疗。也可以采用4～5联冰冻袋，每袋冻存体积可根据需要在(5～25)mL之间调整，以满足临床移植时多次、不定期的适用同源的胎盘细胞。
进一步地，分装的细胞数量规格一般为2×107～5×107/mL，体积规格一般为0.5mL、1mL、5mL、10mL、25mL、45mL；一般用于辅助造血干细胞移植，一份胎盘来源的细胞应采用1mL、5mL、25mL和45mL保存，其中1mL和5mL装用于同源免疫细胞诱导扩增后辅助回输，25mL装用于同源造血干细胞扩增后辅助回输。具体应用时，应在为胎盘供者提供保持服务时，根据实际需要设定细胞的保存规格，一般可用于过继性免疫治疗、联合淋巴细胞输注辅助移植、部分造血干细胞扩增联合移植，以及单独或联合使用等临床个性化应用方案，用于过继性免疫治疗可以冻存规格包括：0.5mL、1mL、5mL、10mL各多份或单份，用于联合淋巴细胞输注辅助移植可以冻存规格包括：10mL、15mL、20mL、25mL、35mL各多份或单份，用于部分细胞扩增联合移植可以冻存规格包括：10mL、15mL、20mL、25mL、35mL相互组合1大1小2份或1大2小3份。
进一步地，冻存时采用的降温方法，一般选择以下程控降温方法：4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃。也可参照中国发明专利申请CN 109122665 A、CN 108812642 A中的方法。冻存完毕后，快速取出，将其转移至冻存盒中，放置于液氮中储存。
利用上述方法提取得到的胎盘干细胞，在制备干细胞产品中的用途；所述干细胞产品为用于同源造血干细胞扩增后辅助回输的干细胞、用于过继性免疫治疗的干细胞、用于联合淋巴细胞输注辅助移植的干细胞、用于部分细胞扩增联合移植的干细胞中的任意一种或两种以上。
本发明针对胎儿娩出后未采集脐带血的胎盘样本，对胎盘进行充分消毒后，依照胎盘生理结构，分两步制备胎盘祖细胞和干细胞，根据客户个性化和精准医疗需要，对收集的细胞进行多袋、多管灌装保存，该方法制备的胎盘干细胞造血干细胞含量高，分袋多管保存便于客户应用时，可选择进行过继性免疫治疗、联合淋巴细胞输注辅助移植、部分细胞扩增联合移植等临床个性化应用方案。本发明提供的胎盘干细胞分离方法，可以获得比以往方法更纯(现有技术提取干细胞所用组织因含有非造血相关类型的组织成分，比如白色的主血管组织，造成其分离的细胞混杂，不利冻存，应用时不利个性化选择)的干细胞：第一次分离提取的单个核样细胞比例更高(达80％以上)、第二次分离提取的造血相关细胞(包括CD34+造血干细胞和CD133的造血内皮干细胞)比例更高，造血内皮干细胞达50％以上，本发明提供的保存方法，可以将同一胎盘来源的非膜组织制备的细胞、以满足精准医学个性化的应用需求进行特殊形式保存，通过从胎盘非膜组织分离不同类型的细胞并采用不同细胞联合、分袋保存，以使得整个胎盘资源得到充分利用，适应未来细胞个性使用的需要。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：第二步提取分离的干细胞分类分析示意图，图中显示，两次分离法第二次提取的干细胞分布集中于单个核细胞位置，比例约占90％，均一性好。
图2：第一步提取分离的干细胞在保存前的流式检测结果示意图，造血干细胞与造血内皮干细胞分别占2.72％和2.63％。
图3：第二步提取分离的干细胞在保存前的流式检测结果示意图，造血干细胞占18.71％，造血内皮干细胞占54.19％。
图4：细胞冻存后凋亡检测结果示意图，其中，C2和C3表达Annexin-FITC表示凋亡细胞比例，左下象限表示正常细胞，正常细胞比例分别为96.6％和99.3％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1
在取得医院和产妇的同意后，选择收集未采集脐带血的留有不少于10cm脐带的胎盘，胎盘娩出后由专业人员立即结扎胎盘上端的脐带，再将样本转入装有包含抑菌剂的缓冲溶液的无菌生物样本袋，封好样本袋后装入恒温运输箱，采取保温措施以保障样本在4～10℃的温度下运输并24h内交付实验室提取细胞。到实验室后进行样本和运输符合性检查，确认运输最高温度低于10℃，运输时间在20h以内，如表1所示。
表1
样本号 运输时间(h) 最高样本温度 样本重量(g) 小叶组织重量(g)
201901S 15 10℃ 480.0 137.0
201902S 10 5℃ 265.4 100.5
201903S 12 10℃ 367.0 158.8
201904S 8 6℃ 281.7 129.3
201905S 18 8℃ 450.0 158.8
平均 12.6 7.8 368.82 136.88
将接收合格的胎盘样本放入GMP实验室洁净工作台上，分别对胎盘母、子两面以及附带组织进行3次、4次、5次的清洗和2次、3次、4次的消毒，每次清洗按照先用75％医用酒精再用0.9％生理盐水再用75％医用酒精最后再用0.9％生理盐水，按照体积(mL)比100:300:200:200进行清洗消毒。子面胎盘表面羊膜有破损或有明显污渍时，也可以对目标部位在洁净工作台外用50～200mL 75％医用酒精和100～300mL 0.9％生理盐水冲洗，确保样本解剖时不引入污染。
实施例2
取清洁后的胎盘样本，放在无菌盘上，从子面开始解剖胎盘，先从胎盘根部剪下脐带，并从留下的切口处用手术镊子撕开绒毛膜板，露出绒毛小叶主干血管，以主干大血管为中心剪下包含绒毛小叶结构组织，立即放入装有15mL细胞保护剂(商品名血液保存液I,
Figure BDA0002536064440000072
)的缓冲液溶液的50mL离心管中。同一个胎盘一般可剪取15～20个含有主干大血管绒毛小叶结构组织块，每个组织块体积一般在1～27cm3。每管绒毛小叶组织重量一般为20g～30g，再用手术剪将组织在缓冲液中剪碎，剪碎的组织进行充分搅拌和挤压使得留存在小叶结构中的细胞被分离出来，将分提细胞后的胎盘组织转移到新的洁净离心管中待第二次提取干细胞。
将上述提取的细胞悬液用150μm的细胞筛过滤，细胞滤液进行2000rpm、10min离心，每个胎盘可以获得1×109～3×109的有核细胞，CD34+或CD133+细胞比例在3％～5％。提取的细胞离心后用1mL右旋糖酐40重悬，再加入适量的冻存保护剂，使细胞最终浓度为2～5×107/mL，根据客户实际需要分装成0.5mL和1mL各两支冻存管，或5mL+5mL+(20～25)mL或(10～15)mL+(35～45)mL装入相应规格的组合式细胞冰冻袋中，其中0.5mL和1mL冻存管和5mL组合式细胞冰冻袋保存的细胞可用于过继性免疫治疗，(20～25)mL和(35～45)mL组合式细胞冰冻袋可用于联合淋巴细胞输注辅助移植，5mL和10mL冰冻袋可用于扩增造血干细胞后辅助移植。不同批次的样品的分装规格如表2所示。
表2
Figure BDA0002536064440000071
实施例3
取经剪碎、细胞缓冲液浸润初步分离细胞后的绒毛小叶组织，在超净工作台中转入到4～6支新的离心管并进一步剪碎、称重，使得组织剪成1～3cm3的乳糜状小块，向组织中按照组织与DPBS体积比1:3加入DPBS和胶原酶,酶的浓度为80μg/mL,将消化溶液置37℃、转速为150rpm的恒温摇床中孵育60min、90min。过滤出消化溶液中的剩余组织按照上述方法，再次进行同条件孵育消化20min～30min。最后每份胎盘可获得消化液300～800mL，可获得3×109～9×109的有核细胞，CD34+或CD133+细胞比例在3％～5％。上述提取的细胞悬液用150μm的细胞筛过滤，细胞滤液进行2000rpm、10min离心，细胞沉淀用1mL右旋糖酐40重悬，再加入适量的冻存保护剂，使细胞最终浓度为2～5×107/mL，根据客户实际需要分装成0.5mL和1mL各两支冻存管，或5mL+5mL+(20～25)mL或(10～15)mL+(35～45)mL装入相应规格的组合式细胞冰冻袋中，其中0.5mL和1mL冻存管和5mL组合式细胞冰冻袋保存的细胞可用于过继性免疫治疗，(20～25)mL和(35～45)mL组合式细胞冰冻袋可用于联合淋巴细胞输注辅助移植，5mL和10mL冰冻袋可用于扩增造血干细胞后辅助移植。如图1、表3所示。
表3
Figure BDA0002536064440000081
实施例4
取剪碎或消化分离提取的细胞，每份样本取两份细胞分别加入PE、PE-Cy7-IgG/FITC-CD45和FITC-CD45/PE-CD34/PE-Cy7-CD133各10uL进行流式细胞检测，结果如图2、图3所示。
实施例5
上述实施例2、3中提取的细胞进行保存时，首先向细胞沉淀重加入1mL右旋糖酐40重悬，进行细胞计数，根据保存体积规格调整细胞浓度为2～5×107/mL，计算细胞最终保存总体积。再向细胞悬液中加入A液(占冻存液总体积的20％)，置4℃冰箱15min后，再加入B液(占冻存液总体积的80％)，其中，A液为20％人血白蛋白：15％右旋糖酐/5％葡萄糖注射液体积比＝3:1的混合液，B液为DPBS：5％葡萄糖：DMSO体积比＝25:25:6的混合液。冻存时采用降温方法可参照中国发明专利申请CN 109122665 A中方法。上述方法中所述冻存液成分均采用GMP级溶液。
所述冻存液A和B在使用前应进行预冷，使得与细胞混合是温度保持在2～4℃，冻存液加入应在4℃控温台中进行。
程控降温方法：按照2～8℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃的程序进行冻存，冻存完毕后，快速取出，将其转移至冻存盒中，放置于液氮中保存。
实施例6
取冻存不少于7天细胞，在35～38℃的水浴中解冻，每份样本取两份细胞，分别进行细胞活率和凋亡率检测，进行凋亡检测管加入PI/FITC-annexin7各10uL进行流式细胞术分析，结果见图4所示。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (4)

1.一种同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）剪取绒毛小叶结构组织：取胎盘，清洗消毒，以小块的形式剪下绒毛小叶结构组织，每块绒毛小叶组织至少包括1个较粗的、容纳红色胶状组织的主血管，组织小块为红色或深红色；
剪下绒毛小叶结构组织的具体方式为：从子面开始解剖胎盘，先剪除脐带，用手术镊子撕开绒毛膜板，露出绒毛小叶主干血管，以主干血管为中心剪取绒毛小叶结构组织；
（2）第一次提取：将上述剪取的绒毛小叶结构组织小块立即置于组织浸润液中，在组织浸润液中将绒毛小叶结构组织剪碎，浸泡15～30min，使得留存在小叶结构中的干细胞被浸润分离出来；过滤得细胞悬液，细胞筛过滤，离心，即得干细胞；
（3）第二次提取：步骤（2）中提取出留存细胞的胎盘绒毛小叶组织块，挑选包含白色主血管的组织块，剥离或剪除白色的绒毛小叶主血管成分，留下的红色组织进一步剪碎，然后加入缓冲液中，所述缓冲液为含胶原酶的杜氏磷酸盐缓冲液，孵育消化；孵育消化后，过滤得消化液，对剩余的组织再进行一次孵育消化；合并两次的消化液，细胞筛过滤，离心，即得干细胞；
（4）步骤（2）、（3）提取的干细胞，分别采用右旋糖酐40重悬，然后加入冻存液，分装到冻存容器中，冻存。
2.根据权利要求1所述的同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法，其特征在于：所述每块绒毛小叶结构组织的体积在1～27cm3，一个胎盘剪取15～20个绒毛小叶结构组织小块；
所述胎盘通过以下方式收集得到：选择收集未采集脐带血的留有不少于10cm脐带的胎盘，并在胎盘娩出后立即结扎胎盘上的脐带，娩出后24小时内提取造血干细胞；
所述清洗是将胎盘浸润到生理盐水中进行清洗；所述消毒是指将75%医用酒精淋洗到胎盘组织表面进行消毒；
所述组织浸润液是由血细胞保护剂和生理盐水溶液组成的，血细胞保护剂占30%～90%。
3.根据权利要求1所述的同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法，其特征在于，所述冻存液分两步加入：向右旋糖酐40重悬的细胞悬液中加入A冻存液重悬细胞，再加入B冻存液；
所述A冻存液，为20%人血白蛋白溶液，与15%右旋糖酐溶液或5%葡萄糖注射液二者的混合液，二者的体积比为3:1；
所述B冻存液为杜氏磷酸盐缓冲液、5%葡萄糖溶液或0.45%氯化钠注射液、二甲基亚砜三者的混合液，三者的体积比为25:25:6；
A冻存液、B冻存液的体积比为：1～3:7～9。
4.根据权利要求1所述的同一胎盘绒毛小叶组织来源细胞的提取方法，其特征在于：所述冻存容器，选自3联细胞冻存袋或4联细胞冻存袋或5联细胞冻存袋，分装的细胞数量规格为2×107～5×107/mL，体积规格选自0.5mL、1mL、5mL、10mL、25mL、45mL。
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