MXPA05012070A - Composicion para mantenimiento de la viabilidad de organos y celulas. - Google Patents

Composicion para mantenimiento de la viabilidad de organos y celulas.

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MXPA05012070A
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Abstract

La presente invencion esta dirigida a composiciones de nanoparticulas para el mantenimiento de la viabilidad de organos, tejidos y celulas cuando estos estan separados de sus soportes fisiologicos normales. Tambien se describen composiciones que contienen las composiciones de nanoparticulas y metodos para conservar organos tales como rinones, tanto in vivo como ex vivo.

Description

COMPOSICIÓN PARA MANTENIMIENTO DE LA VIABILIDAD DE ÓRGANOS Y CÉLULAS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de patente estadounidense provisional número de serie 60/469,200, presentada el 9 de mayo de 2003, cuya descripción está incorporada a la presente solicitud mediante referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones para la conservación prolongada de órganos, tejidos y células, y particularmente para la conservación de órganos donados para transplantes, así como también a métodos para elaborarlas y usarlas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El progreso en las técnicas para el transplante de órganos, ha aumentado la demanda de órganos, tejidos y células viables de donantes. Dados los restringidos requerimientos para la coincidencia de tejidos y tipo de sangre, y las fuentes limitadas para donaciones, el suministro de corazones, hígados, pulmones, ríñones, etc. , dispon ibles , generalmente es sustancialmente menor q ue el n úmero de pacientes q ue esperan por u n transplante q ue les extienda la vida. As í, permanece una necesidad en aumento para optimizar el suministro limitado de órganos donados. Una forma en q ue la técnica ha busca do aumentar al máximo la disponibilidad de ó rganos donados, es mejorando la conservación de órganos después de la donación. Generalmente, los procedimientos para la conservación de órganos para los donantes actua les, no intentan recrear un estado fisiológico in-vivo para los órganos separados de un sumin istro sang u íneo norm al. En l ugar de ello, éstos utilizan hipotermia (por debajo de 20 °C, y típicamente a aproximadamente 4 °C) y almacenamiento en una solución cristaloide osmóticamente neutral . Las soluciones m ás com unes para la conservación del corazón son The University of Wisconsin Solution (UW), la St. Thomas Solution, y la Stanford University Solution (SU). Este y otros métodos actuales para conservar la viabilidad de un órgano que ha sido separado de sus fuentes de nutrientes usu ales , por ejemplo, la circulación sangu ínea de una persona o animal viviente, depende de poner en contacto y/o de perfusionar el órgano con una solución de soporte diseñada para proporcionar regulación de pH , equilibrio osmótico y/o algo de sostén n utricional m íni mo, por ejemplo, en la forma de glucosa y un conjunto limitado de otros nutrientes básicos. Este enfoq ue comúnmente se com bina con reducción de la temperatura de los órganos , hasta justo sobre el punto de congelación del agua. Esto está dirig ido a reducir la tasa metabólica de tejidos de órganos, haciendo as í más lento el consumo de nutrientes y la producción de prod uctos de desecho. Estas soluciones conservadoras conocidas en la materia, incluyendo , por ejemplo, soluciones salinas isotónicas, que pueden contener, en d iversas proporciones , sales, azúcares, agentes osmóticos, anestésicos locales , reg uladores y otros agentes como estos , tal como se describen , simplemente a manera de ejemplo, en Berdyaev y coinvestigadores, patente estadounidense n úmero 5,432,053; Belzer y coinvestigadores, y el producto ViaSpan®, descrito en las patentes estadounidenses números 4, 798,824; 4, 879,283 y 4, 873,230; Taylor, patente estadounidense n úmero 5,405 ,742, Dohi y coinvestigadores; patente estadounidense número 5, 565,31 7; Stern y coinvestigadores, patente estadounidense número 5, 370,989 y 5,552,267. La hoja de datos del prod ucto Viaspan® describe el producto como una solución estéril, no pirógena, para lavado hipotérmico y almacenamiento de órganos. La solución tiene una osmolaridad aproximada calculada de 320 mOsM, una concentración de sodio de 29 mEq/L, una concentración de potasio de 125 mEq/L, y un pH de 7.4. Las soluciones conservadoras que contienen piruvato, sales inorgánicas que sostienen el potencial de la membrana celular y albúmina o suero fetal bovino, están descritas en la patente estadounidense número 5,066, 578, mientras q ue las patentes estadounidenses números 6,495, 532 y 6, 004, 579, describen una composición para ia conservación de órganos que incluye u no o más ácidos o azúcares fosfáticos, y ácidos o azúcares lipofosfáticos , junto con mejoradores tales como albúmina, opcionalmente suministrados en composiciones liposómicas. El alm acenam iento y transporte de órganos ma ntenidos de esta forma, en a lmacenam iento hipotérmico permanece lim itado en el tiempo. Dada la actual reducción de órganos donados , perm anece todavía una necesidad largamente ma ntenida de extender el tiempo de almacenamiento o de transporte antes de la reimplantación. Se han esta blecido hipótesis de que una causa importante del corto tiempo de alm acenamiento para la reimplantación, es el daño incurrido durante el almacenamiento en frío, seguido por daños a! tejido que ocurren durante el calentamiento y reperfusión con la sangre del receptor del transplante. Se ha propuesto remediar este problema empleando una composición de liposoma que incluye varios fosfolípidos para prevenir la apoptosis (muerte celular programada) de las células o de los tejidos de órganos en almacenamiento, como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6 ,004,579 y 6 ,945,532. Sin embargo, esta propuesta no ha producido la búsqueda después de las mejoras, de la viabilidad y longevidad de los órganos en almacenam iento . Tam bién sufre de una cantidad de desventajas, incluyendo niveles indeseables de absorción de fosfolípidos en tejidos. Como se puede apreciar fácilmente, permanece una necesidad largo tiempo mantenida en la materia, de composiciones y métodos para la conservación mejorada de órganos, tejidos y aún de células viables durante periodos prolongados fuera del mantenimiento circulatorio normal, tanto in vivo como ¡n vitro, que estén combinados opcionalmente con portadores de oxígeno apropiados para mejorar el mantenimiento de la viabilidad de tejidos y células.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la invención, se proporciona una composición de dos fases para el mantenimiento de la viabilidad celular. La composición incluye una primera fase que contiene un medio nutritivo para la base, y una segunda fase que contiene nanopartículas que tienen un recubrimiento lipofílico exterior y un núcleo hidrofílico interior, en donde: a) la primera fase contiene concentraciones compatibles fisiológicamente/cantidades de nutrientes solubles o dispersables en agua, y sales fisiológicas; b) las nanopartículas de la segunda fase contienen uno o más de los siguientes: lípidos, ácidos grasos, esteróles, ácidos grasos libres, factores de crecimiento celular opcional, y c) la composición de dos fases tiene una osmolaridad de al menos aproximadamente 300 mOsM/kg. El pH de la composición de dos fases preferiblemente está entre aproximadamente 7.2 y aproximadamente 7.4. La porción del núcleo de ella tam bién puede incluir un ácido graso libre ta l como ácido oleico, ácido linoleico, palm ítico, ácido esteárico, ácido mi rístico, ácido láu rico , ácido eicosapentenoico , ácido decosahexenoico, y combinaciones de e llos. Alternativamente, el núcleo hidrofílico interior puede contener una solución o suspensión que tenga una porción capaz de enlazar y liberar oxígeno, tal como una proteína hemo. En todavía otros aspectos, el núcleo hidrofílico interior contiene una porción biológicamente activa, tal como un fármaco u otro ag ente terapéutico. Preferiblemente, las composiciones inventivas tienen una osmolaridad q ue es mayor que la de fluidos corporales normales, por ejemplo, preferiblemente al menos aproximadamente 300 y m ás preferiblemente abarca desde aproximadamente 385 hasta 425 mOsM/kg . En un aspecto alternativo de la invención, se proporciona una composición de tres fases que incluye la composición descrita anteriormente (es decir, la composición de dos fases) mezclada con una composición que contiene nanopartículas separadas que tiene un recubrimiento lipofílico exterior, y un núcleo hidrofílico interior, que contiene una solución o suspensión, que contiene una porción capas de enlazar y de liberar oxígeno, ta l como proteína hemo o una porción biológicamente activa . En aspectos adicionales de la invención, se proporcionan procesos para preparar las composiciones de dos fases y de tres fases descritas aquí, así como también métodos para conservar o mantener tejidos de mamíferos u órganos de mamíferos, ex vivo, en los cuales el tejido u órgano se mantiene en una cantidad efectiva de las composiciones descritas aquí.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona composiciones para conservar/mantener celular, tejidos y órganos in vivo, ex vivo y/o in vitro, así como también métodos para elaborar y usar esas composiciones. Ampliamente, las composiciones de la invención incluyen e incorporan liposomas y/o nanopartículas formuladas para incluir nutrientes de mantenimiento y/o de conservación y otras sustancias para mantener la salud y viabilidad de células, tejidos y/u órganos tanto in vivo como ex vivo, en rangos de temperatura no hipotérmica, por ejemplo, en temperaturas que abarquen desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 37 °C. Las composiciones de la presente invención pueden, por supuesto, emplearse en los rangos hipotérmicos usados comúnmente en la materia, los cuales pueden abarcar desde menos de 20 °C hasta aproximadamente 4 °C. Sin considerar la temperatura a la cual se mantiene el órgano o muestra conservado, las composiciones de la presente invención proporcionan resultados mejorados cuando se comparan con los de la técnica anterior. Si bien estos resultados deseables se observan cuando se emplean las soluciones de dos fases de la invención, se obtienen resultados ventajosos adicionales cuando se incluye el portador opcional oxígeno como parte de las composiciones o como parte de las composiciones de tres fases preferidas opcionalmente. En ciertas modalidades opcionales, las composiciones de la invención están formuladas con un portador oxígeno, por ejemplo, un portador oxígeno que contiene una porción hemo. Preferiblemente, esta es hemoglobina o un derivado de hemoglobina incorporado en un liposoma y/o nanopartícula. Unos pocos ejemplos representativos de portadores de oxígeno basados en hemoglobina conocidos en la materia, se describen en las patentes estadounidenses números 5,674,528, 5,843,024, 5,895,810, 5,952,470, 5,955,581, 6,506,725, 6,150,507, 6,271,351, cuya descripción está incorporada a la presente solicitud mediante referencia. La cantidad de la hemoglobina o del portador de oxígeno incluida se describe como una cantidad que es efectiva para lograr el resultado terapéutico deseado. Variará en algo dependiendo de la composición seleccionada y de las necesidades del técnico, pero en la mayoría de las instancias, está presente en cantidades que abarcan desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10% de la solución final. La invención también incluye métodos para tratar o mantener tejidos u órganos en un animal o persona después de que ha ocurrido la muerte clínica, pero antes de que el órgano o tejido de interés sea extraído para donación. Cualesquiera órganos que requieran mantenimiento osmótico y nutricional para su almacenamiento y transporte óptimos se benefician de las com posiciones de la invención, tanto in vivo como in vitro. Los órganos y tejidos que van a ser co nservados por perfusión y/o por contacto con l a com posición de la invención , incluyen: riñ on, hígado, pulmón , corazón, combinación de corazón-pulmón , páncreas , y otros órganos del tracto digestivo, vasos sanguíneos, órganos o tej idos endocrinos, piel , huesos y otros órganos y tejidos demasiado numerosos como para m encionarlos . La invención también incluye métodos para tratar animales o personas vivos q ue necesitan de tratamiento de manten im iento. Así, simplemente a manera de ejemplo, las composiciones de la invención son útiles para proporcionar mantenimiento localizado, o circulatorio sistém ico, o de perfusión, para órganos o tejidos privados agudamente de la circulación sang uínea normal ocasionada por trauma, por ejem plo, infusiones o circu lación temporal de las composiciones de la invención, para mantener una extremidad parcialmente rota, o en condiciones análogas, hasta que se logra la reparación quirúrgica de la vasculatura dañada . La invención incluye además métodos para conservar y p roteger intactos tejidos y/u órganos durante procedimientos quirúrg icos, por ejem plo, en situaciones en donde se interrumpe o se compromete la circulación sang u ínea. Estas situaciones incluyen, por ejemplo, perfusión de tejidos u órganos como parte de un procedimiento quirúrgico que requiere una interrupción circulatoria local o sistémica. Las composiciones de la invención ta mbién están contem pladas para ser em pleadas durante o antes de la reparación de áreas anatóm icas dañadas por enfermedad o accidente, por ejemplo, ayuda ndo en la conservación de un dedo o extremidad parcialmente cortada, antes de la restauración de l a integridad circulatoria . Se co ntempla además que las com posiciones de la invención sean útiles en la conservación de célu las, tejidos y órganos tanto para seres humanos com o para animales, en la búsq ueda de escenarios en donde se necesiten células , órganos y otras técnicas de cultivo, para investigación biomédica básica y aplicada y/o para procedimientos de diag nóstico que requieran conservación de la viabilidad de los tejidos in vitro. El término " órgano" como se usa en la presente solicitud , comprende tanto órganos sólidos, por ejemplo, riñon, corazón , h ígado, pulmón, como partes funcionales de órganos, por ejem plo , segmentos de piel, secciones de arteria, lóbulos transplantables de un hígado, riñon, pulmón y similares. El término "tejido" se refiere aquí a materiales celulares viables en una forma agregada, por ejemplo, pequeñas porciones de un órgano, así como también a célu las dispersas , por ejemplo, célu las dispersas, aisladas y/o en crecimiento de músculo cardiaco, h ígado o riñon , incluyendo células de médula espinal y célu las de progenie, células madre hemáticas y progenie, y los otros d iversos elementos de la sang re conocidos en la materia, a menos q ue se especifiq ue otra cosa .
El término "nanopartícula" como se emplea en la presente solicitud, se define como una partícula en emulsión de dos capas, preferiblemente con una capa exterior lipofílica, y un núcleo hidrofílico, en un tamaño (diámetro promedio) que abarca desde aproximadamente 100 n, hasta aproximadamente 300 nm, y más preferiblemente en un tamaño que abarca desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 200 nm. Además, el uso de términos singulares para la comodidad en la descripción de manera alguna tiene la intención de ser limitante. Así, simplemente para ilustración, la referencia a una composición que contenga "una nanopartícula" incluye la referencia a una o más de estas nanopartículas, por ejemplo, a una preparación con suficientes nanopartículas para el propósito deseado, a menos que se indique otra cosa.
LAS COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN Ampliamente, y en la mayoría de los aspectos preferidos de la invención, las composiciones de la invención incluye dos ¿fases: un medio nutritivo de base acuosa y emulsión de partículas, por ejemplo, liposomas o nanopartículas. El medio nutritivo base incluye combinaciones de diversos componentes, incluyendo los seleccionados de entre aminoácidos, sales, elementos residuales, vitaminas, carbohidratos simples, y similares. Este medio nutritivo base está complementado además con combinaciones de i ngred ientes que pueden incluir reg uladores, antioxidantes, expansores de volumen de plasma, sustratos energéticos, inhibidores de xantina oxidasa y similares, disueltos o dispersos en un medio acuoso. Así, el medio nutritivo base contiene m uchos nutrientes y factores minerales en concentraciones análogas a las encontradas en sangre , suero, plasma y/o tej idos corporales normales, a pesar de q ue algunos de ellos no son constituyentes naturales de la sang re. Por ejem plo, los reg uladores están presentes para sustituir sistemas reg u ladores sang uíneos, los dextran y mannosa proporcionan osmolaridad mejorada , sobre la normalmente provista por proteínas sanguíneas, etc. , el glutation es un agente protector, la heparina está presente para reducir al m ínimo la coagulación sangu ínea, y el Yeastolite proporciona vitaminas complementarias. En ciertas modalidades opcionales, las composiciones de la invención incluyen además uno o más agentes antimicrobianos conocidos en la materia, tales como antibióticos , antibacterianos, anticuerpos específicos, y/u otros agentes conocidos en la técn ica para controlar la contaminación microbiana en los órganos , tejidos y/o células. La mayoría de los antim icrobianos conocidos en la materia están referidos en detalle, por Goodma n & Gilman, en The Pharmacolog ical Bas is of Therapeutics, 1 0a. edición, McGraw Hill, incorporado mediante referencia a la presente solicitud en su totalidad, con atención particular a los- ca pítulos 43-51 . En ciertas modalidades adicionales opcionales , las composiciones de la invención se incluyen además en uno de los siguientes: anticoagulante, trombótico, y agentes farmacológicos a nti plaquetas, pa ra evitar la coagulación o formación de fibrina d urante la preparación , almacenamiento y transplante del órgano , por ejemplo, heparina y glicosaminoglicanos relacionados , dícumarol, fenprocumon , acenocumarol , biscumacetato de etilo, indand iona , y sus derivados, aspi rina y dipiridamol, y sim ilares. Los agentes antiinflamatorios no esferoides tam bién están incluidos opcionalmente en ciertas modal id ades, por ejemplo, en donde se cree que los procesos i nflamatorios son etiológicos para acortar la vida útil de un órgano, tejido o cél ulas , por ejemplo , mediante transplante. Todos los agentes precedentes son explicados en mayor detalle en la obra citada de Goodman & Gilman, incorporada como referencia . La cantidad de estos compuestos incluida se describe como una cantidad que es efectiva para lograr el resultado terapéutico deseado. Variará algo dependiendo de la com posición seleccionada y de las necesidades del técnico, pero en la mayoría de los casos, está presente en cantidades q ue abarcan desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10% de la solución final. U na segunda fase de la composición de la invención incluye una emulsión acuosa l ípida que incorpora, por ejem plo, lípidos, ácidos grasos, esteróles y opcionalmente, factores de crecimiento u otros materiales considerados esenciales para la viabilidad de las células vivientes, incluyendo células endoteliales vasculares, en una partícula que tenga una capa exterior lipofílica que cruce fácilmente las mem branas celu lares, y una capa interior hidrof ílica que sea suministrada intracelularmente. Muchos productos de medios para el cultivo de células o tej idos dis ponibles comercialmente que están l ibres de proteínas o suero animal no d efinido, se pueden adaptar para servir como el medio nutritivo de base, o punto de i nicio, para preparar la com posición de la invención, siempre que estos medios sean compatibles con los req uerimientos específicos de la composición de la invención. Por ejemplo, la composición de la i nvención preferiblemente tiene las s ig uientes características y elementos, además de los med ios n utrientes celu lares básicos mencionados anteriormente: los sustratos energéticos para restaurar el banco de energ ía intracelular de ATP , y para proporcionar metabolismo aeróbico durante el proceso de perfusión y de conservación ; antioxidantes y/o inhibidores de oxidasa xantina para m itigar el daño por reperfusión debido a los radicales de oxígeno l ibres. Una em ulsión lípida en "nanopartículas" o componente de liposomas con una capa exterior lipofílica y un núcleo interior hidrofílico. Esta incluye una membrana exterior l ípida y/o de esterol, y ácidos grasos esencia les, y un núcleo i nterior hidrofíl ico. El n úcleo interior h idrofílico incluye materiales esenciales tales como factores de crecimiento derivados de proteínas y opcionalmente, s ustancias adiciona les, tales como ATP, y similares.
En ciertas m odalidades opcionales, este núcleo i nterior puede estar inclu ido o ser reemplazado con u n portador de oxígeno apropiado, por ejem plo, un a proteína hemo o una solución o suspensión de proteínas hemo, incluye ndo, por ejemplo, un hem o derivado naturalmente, un hemo recombinante mutado opcionalmente o m odificado qu ím icamente para que tenga una curva de saturación de oxígeno efectiva para transportar y su m inistrar oxígeno y extraer di óxido de carbono en un órga no o tejido transplantado, y/o hemo artificial soluble en agua, para nombrar unos pocos tipos de portadores de oxígeno. Ventajosamente, la composición de la invención no contiene suero animal o prote ínas no definidas en la modalidad más preferida. Sin q uerer estar atado por cualquier teoría o hipótesis acerca de cómo puede funcionar la composición de la invención, se cree que al contacto con las membranas celulares de las células tratadas, la capa exterior hidrofóbica se fusiona con la membrana celular, permitiendo que el núcleo hidrofílico de la nanopartícula de la invención sea absorbido por las células q ue están en el citoplasma , libera ndo así com puestos energéticos suplementarios y factores de crecimiento esencial que mejoran la viabilidad. Se cree también q ue la elevada osmolaridad, con relación a la osmolaridad de flu idos corporales normales , funciona para mitigar la inflamación celular, y para facilitar la conservación de la integridad celular vascular.
En una modalidad preferida, el medio nutritivo base incluye, en concentraciones fisiológicamente apropiadas, sales, vitaminas solubles en agua, aminoácidos y nucleótidos. Estos incluyen, simplemente a manera de ejemplo, y sin limitación, adenosina y sus fosfatos, uridina y su fosfato, otros nucleótidos y desoxinucleótidos; vitaminas B, por ejemplo, B1, B2, B6, B12, biotina, inositol, colina, folato, y similares, coenzimas y co-factores de vitaminas, por ejemplo, nicotinamida y dinucleótidos flavina-adenina, y sus fosfatos respectivos, coenzima A y similares, diversas sales fisiológicas y minerales residuales, por ejemplo, sales de sodio, potasio, magnesio, calcio, cobre, zinc y hierro; los aminoácidos esenciales, a pesar de que todos los veinte aminoácidos de origen natural y/o sus derivados, están incluidos opcionalmente. El medio base nutritivo también incluye, por ejemplo, reguladores de pH, tales como reguladores fosfatados y regulador ácido N-2-hidroxietilp¡perazin-N'-2-etanosulfónico ("HEPES"); azúcares simples, por ejemplo, glucosa, mejoradores osmóticos, tales como cualquier dextrán apropiado, mannosa y similares, así como también componentes misceláneos opcionales, tales como, alopurino, controtina, cocarboxilasa, ácidos orgánicos fisiológicos, por ejemplo, piruvato, y opcionalmente, un extracto nutritivo de fuentes naturales, por ejemplo un extracto de vitamina de levadura. En una modalidad alternativa, la vitamina C (ascorbato) está incluida opcionalmente en concentraciones fisiológicas o más altas que fisiológicas.
La segunda fase de la composición es una em ulsión acuosa lípida que contiene liposomas o partículas en nano-escala con una capa exterior lipofílica y un núcleo hidrofílico. Generalmente, la segu nda fase incluye com ponentes lipofílicos capaces de formar y esta bil izar la capa li pofílica exterior, incluyendo, por ejemplo, colesterol , fosfatidi lcolina, vitamina E, aceite de h ígado de bacalao, etc. Los componentes adicionales incluyen fuentes de energ ía basadas en lípidos, incluyendo cantidades compatibles fisiológicamente de ácidos grasos libres, tales como ácido linoleico, linolénico, oleico y equivalentes funcionales. En otra modal idad preferida, la segunda fase tam bién incluye factores endocrinos hid rofílicos de mantenimiento, tales como hidrocortisona, tiroxina o sus d erivados, y similares. Los componentes de mantenimiento adicionales pueden incluir, por ejemplo, factores de crecimiento celular, por ejemplo, factores de crecimiento epitelial y endotelial , incluyendo cantidades fisiológ icamente compatibles de factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento endotel ial derivado de plaquetas, factor de crecimiento epitelial , factor de creci miento de hepatocitos, factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas, y similares. Opcionalmente, otros factores contemplados para ser incluidos en la seg unda fase incluyen mensajeros intracelulares, tales como prostaglandinas, por ejemplo, prostaglandina E1 . Preferiblemente, tam bién están incluidos agentes tensioactivos y detergentes compati bles fisiológicamente , por ejem plo, no o más agentes tensioactivos solubles en agua , preferiblemente u n copolímero amfifílico en bloque, con un peso molecu lar de va rios miles de Dalton , tal como un agente tensioactivo copol ímero de óxido de polipropileno-óxido de polietileno en bloque (por ejem plo Pluron ic F-68, de BASF) y/o agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos no iónicos apropiados in cluyen, por ejemplo, derivados polioxietileno de ésteres de sorbitol, por ejemplo, agentes tensioactivos de monooleato de polioxietilen-sorbitán que están comercialmente disponibles como TWEEN® (Atlas Chemical Co.), TWEEN 80® es particularmente preferido. La porción del núcleo de las com posiciones de dos fases de la i nvención , preferiblemente no incluye u na cantidad farmacéuticamente significativa de un ácido o azúcar fosfatídico, o un ácido o azúcar lisofosf atídico.
PREPARACIÓN DE LAS COM POSICION ES DE LA INVENCIÓN Las com posiciones de la invención generalmente se producen mediante un proceso de dos pasos. El primer paso es preparar combinaciones específicas de los ingredientes necesarios q ue se usan como bloques para la construcción del producto final. U na parte clave en el primer paso es preparar una premezcia para la pri mera fase, la cual es el medio nutritivo base descrito anteriormente, denominado Premezcia I , en la presente solicitud . La parte conciuyente de este primer paso es preparar une premezcia para la segunda fase, denominada Premezcla I I en la presente solicitud , en la cual los componentes deseados son premezclados , disueltos y/o suspendidos en agua . La composi ción de la premezcla I I se procesa luego a través de un m icrofluidizador o apa rato sim ilar, bajo condiciones efectivas para proporcionar una emulsión finamente dividida , por ejemplo , una emulsión en escala de nanopartículas , con las nanopartículas con el diámetro medio antes mencionado, de desde aproximadamente 1 00 nm hasta aproximadamente 200 nm. La composición en emulsión resultante basada en la Premezcla I I se mezcla entonces con la Premezcla I , la cual proporciona diversos n utrientes residuales, y otros componentes, para completar la prod ucción de las composiciones de la i nvención.
PREPARAC IÓ N DE LAS COMPOSICIONES DE PREMEZCLA Fórmula 1 : Las tablas 1 a 4 resumen alg u nos de los componentes preferidos y rangos de peso para los componentes encontrados en una modalidad preferida que contiene una primera fase denominada como Premezcla I , y una segunda fase que contiene las nanopartículas elaboradas a partir de la Premezcla I I . Los componentes enumerados en las Tablas, son las cantidades que se encuentran preferiblemente en un litro de la composición final, después de que todo el procesamiento se termina. Los com ponentes están ordenados en estas tablas para comodidad de la descripción , con el fin de agrupar los componentes en la forma en la cual se prepara la composición conservadora mediante los ejemplos discutidos aquí en lo sucesivo. A menos que se indique otra cosa, todas las cantidades mostradas en las tablas más adelante están en gramos por litro de la composición final, es decir, la composición que incluye tanto la fase acuosa como la fase de emulsión.
TABLA 1 Descripción química g / unidad / litro -- ango— Clorohidrato de Adenina 0.00019-0.00021 B-12 0.00065-0.0007 Biotina 0.00000038-0.00000042 Sulfato cúprico 0.00000124-0.00000137 Nitrato ferroso 0.000048-0.000053 Sulfato ferroso 0.00048-0.00053 Clorohidrato de putrescina 0.000077-0.000085 Clorohidrato de piridoxina 0.000029-0.000033 Riboflavina 0.00021-0.000231 Timidina 0.00035-0.00039 Sulfato de Zinc 0.00041-0.000454 TABLA 2A q / unidad / litro Descripción química --Rango-- Adenosina 0.950-1.050 5' Monofosfato de adenosina 0.0019-0.0021 Trifosfato de adenosina 0.0019-0.0021 Alopurinoi 0.133-0.0147 Fosfato de dinucleótido B' 0.038-0.042 nicotinamida-adenina Dinucleótido B' nicotinamida-adenina 0.0019-0.0021 Cloruro de calcio 0.152-0.168 Cloruro de colina 0.0085-0.0094 Sulfato de condrotina 0.0038-0.0042 Cocarboxilasa 0.038-0.042 Coenzima A 0.0095-0.00105 Ciclodextrina 0.475-0.525 Desoxiadenosina 0.038-0.042 Desoxicitidina 0.038-0.042 Desoxiguanosina 0.038-0.042 Dextran 70 33.25-36.75 Dinucleótido flavina-adenina 0.038-0.042 Ácido fólico 0.0026-0.0028 Glucosa 3.800-4.200 Glutationa 0.950-1.050 Glicina 0.0179-0.0197 TABLA 2B Descripción química g / unidad / litros --Rango— Heparina 0.171-0.189 HEPES 3.396-3.753 Hipoxantina 0.002-0.0022 Inositol 0.0124-0.0137 Insulina 0.0095-0.0105 L-alanina 0.00428-0.00473 L-arginina 0.141-0.155 L-asparagina 0.0076-0.0084 Acido L-aspártico 0.064-0.070 L-cisíeina 0.0297-0.0329 L-cistina 0.0167-0.0185 Acido L-glutámico 0.007-0.0078 L-glutamina 4.750-5.250 L-histidina 0.030-0.033 L-isoleucina 0.052-0.0572 L-leucina 0.057-0.063 L-lisina 0.0095-0.0105 L-meíionina 0.0019-0.021 L-fenilalanina 0.0337-0.0373 L-prolina 0.0164-0.0182 L-serina 0.025-0.0276 L-treonina 0.051-0.056 TABLA 2 C Descripción química g / unidad / litro — Rango— L-triptófano 0.009-0.0095 L-tirosina 0.053-0.059 L-valína 0.050-0.055 Cloruro de magnesio 0.058-0.0643 Sulfato de Magnesio 0.0475-0.0525 Mannosa 3.135-3.465 Niacinamida 0.0019-0.0021 Acido pantoténico 0.0021-0.0024 Cloruro de potasio 0.296-0.328 Clorohidrato de piridoxal 0.0019-0.0021 Acido pirúvico 0.209-0.231 Bicarbonato de sodio 1.140-1.260 Cloruro de sodio 6.650-7.350 Fosfato de sodio dibásico 0.0676-0.0748 Fosfato de sodio monobásico 0.0516-0.0570 Tiamina 0.0021-0.0023 Transferrina 0.00475-0.00525 Uridina 0.038-0.042 Trifosfato de uridina 0.038-0.042 Yeastolate ultra filtrado (Sigma Chemical 38-42 ML Company, No. de Cat. Y2000) TABLA 3 Descripción química g / unidad / litro —Rango-- TABLA 4 Descripción química g / unidad / litro — Rango-- Colesterol 0.00475-0.00525 Aceite de hígado de bacalao 0.00095-0.00105 Factor de crecimiento epitelial 0.00000285-0.00000315 Factor de crecimiento de 0.0000048-0.0000053 hepatocitos Hidrocortisona 0.00095-0.00105 Ácido linoléico 0.00095-0.00105 Acido linolénico 0.00095-0.00105 Ácido oléico 0.00095-0.00105 Fosfatidílcolina 0.6% Factor de crecimiento endotelial 0.00000095-0.00000105 derivado de plaquetas Pluronic F-68 0.950-1.050 Prostaglandina E1 0.000042-0.0000263 TABLA 4 (CONTINUACIÓN) Las cantidades de componentes que se exponen en las tablas 1 a 4, están basadas en un volumen de lote total de 1 litro. Tal como se ejemplifica aquí, el volumen de lote de 1 litro es el volumen final después de que se combinan la Premezcla I y la Premezcla II, después de que la Premezcla II ha sido procesada en una emulsión en microescala o nanoescala. El técnico se dará cuenta de que los procesos descritos pueden ser aumentados o disminuidos a escala para tamaños de lote más pequeños o más grandes, dependiendo de la necesidad. todas las sustancias químicas usadas para la preparación de la composición de la invención son de pureza sustancial y están disponibles en numerosos proveedores comerciales de bioquímicos. Preferiblemente, estos son de grado USP o equivalente. El técnico se dará cuenta de que las sustancias químicas empleadas están sustituidas opcionalmente por sustancias químicas equivalentes sustancialmente, que demuestran la misma pureza y actividad.
TABLA 5 Balanza analítica; Balanza macro con carga superior; Placa de agitación magnética; Diversos recipientes para mezcla; Agua grado WFI*; Pipetas y otros utensilios de laboratorio estándar; y Procesador microflouidizador modelo HC-500 - icrofluidics Corporation.
*Agua para inyección, preferiblemente grado USP.
Los reactivos misceláneos adicionales incluyen: NaOH 5N, HCI 5N, que se emplean para la titulación de pH, y etanol puro al 95% ("EtOH").
PROCESO PARA ELABORAR LA PREMEZCLA l La premezcla I se prepara disolviendo o dispersando componentes en un orden que es efectivo para lograr una composición acuosa uniforme y clara, al tiempo que se evitan reacciones indeseables o la formación de complejos insolubles. Por esta razón, los componentes de la Premezcla I preferiblemente no están mezclados antes de la disolución total o de la dispersión en agua. Preferiblemente, como se ejemplifica aquí, los componentes enumerados en las tablas 1, 2A, 2C y 3, se procesan en tres soluciones iniciales diferentes, respectivamente, sin embargo, el técnico se dará cuenta de que esta composición base se prepara opcionalmente por variaciones del esquema ejemplificado. El inicial basado en las soluciones componentes individuales de la tabla 1, 2A, 2B, 2C y 3, se combina para preparar la Premezcla I, la cual constituye el medio nutritivo base no emulsionado.
PROCESO PARA ELABORAR LA PREMEZCLA il La premezcla II incluye los componentes formadores de emulsión de la composición de la invención. Ampliamente, estos incluyen la capa hidrofílica de la partícula en emulsión resultante, por ejemplo, componentes que se desea que sean suministrados intracelularmente en un tejido o célula de órgano que va a ser tratado de acuerdo con la invención. La premezcla II también incluye los componentes que forman la capa hidrofobica de la partícula en emulsión resultante, por ejemplo, una capa exterior lipofílica que permite la fusión con membranas celulares vivientes para suministro del contenido del núcleo hidrofílico, incluyendo factores endocrinos de mantenimiento, agentes apropiados para ayudar a la emulsificación, por ejemplo, agente o agentes humectantes y/o un detergente copolímero en bloque, así como también componentes de fase hidrofobica, tales como colesterol y/o lípidos derivados de fósforo. Preferiblemente, estos son los que se indican en la tabla 4, supra y se combinan como se describe en los ejemplos más adelante.
II. MICROFLUIDIZACIÓN La técnica de homogenización de alta presión, e presiones en o por encima de 351.5 kg/cm2 se conoce en la técnica como "microfluidización". Este proceso se usó para crear liposomas o nanopartículas con una distribución de tamaño uniforme de un diámetro medio preferiblemente desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 300 nm, y más preferiblemente desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 200 nm. En aspectos alternativos de la invención, las partículas tienen un diámetro medio de menos de 200 nm. Además de la microfluidización, se emplea opcionalmente otros métodos estándar de emulsificación, por ejemplo, tratamiento con ultrasonido, homogenización de válvula [Thornberg, E. y Lundh, G. (1978) J. Food Sci. 43:1553] y agitación con aspas, etc. Deseablemente, se añade a la solución acuosa un agente tensioactivo soluble en agua, preferiblemente un copolímero amfifílico en bloque con un peso molecular de varios miles de Dalton, tal como un agente tensioactivo copolímero de óxido de polipropileno-óxido de polietileno en bloque (por ejemplo, Pluronic F-68, que está disponible comercialmente en ASF) y/o TWEEN 80, con el fin de estabilizar las partículas recubiertas contra la agregación como ellas la forman. El agente tensioactivo también sirve para potenciar el efecto del tratamiento con ultrasonido, sí se emplea este método. Un aparato preferido para la microfluidización como se ejemplifica aquí, es el Microfluidizer No. HC5000V (Microfluidics Corp., Newton, Massachusetts) usando aire comprimido suministrado por un compresor de aire encapsulado, por ejemplo, No. ES-6 de Sullari Solutions (Michigan City, Indiana). El aparato descrito anteriormente emplea homogenización por alta presión y alto esfuerzo cortante, para tratar y emulsificar la composición de la Premezcla II y proporcionar las nanopartículas dentro del rango de tamaño deseado. En resumen, la composición de la Premezcla II se procesó por homogenización a alta presión usando el microfluidizador. La Premezcla II se añadió al depósito del microfluidizador en una forma continua, y se empujó a través de la cámara de cavitación o interacción especialmente diseñada, en donde las fuerzas de alto esfuerzo cortante y de cavitación formaron una emulsión altamente dividida. A través de ciclos múltiples, el tamaño medio de las gotitas o del liposoma, la distribución y la combinación de ingredientes produjeron el producto final deseado, por ejemplo, las nanopartículas preferidas. Los detalles adicionales de la operación del microfluidizador Modelo No. HC5000V se proporcionan en el Manual de Operación del fabricante, disponible en Microfluidics Corporation, con el número de catálogo 85.0112, incorporado mediante referencia aquí en su totalidad. Una segunda formulación (Fórmula II) de acuerdo con la presente invención, está basada en los materiales que se encuentran en las Tablas 6 a 10 más adelante. Las instrucciones para prepararla se proporcionan más adelante en los ejemplos.
TABLA 6 Descripción química g / unidad / litro --Rango-- Instrucciones de preparación para la Tabla 6: 1. Pesar 1 y disolver con mezclado en agua para inyección (agua para inyección) 2. Pesar 2 y disolver en ETOH al 95%. 3. Preparar concentrados a 100X de los componentes 3 en agua para inyección. 4. Mezclar el grupo 1 y el grupo 2 juntos y añadir 1 mL por litro de volumen final del lote del grupo 3 a esta solución.
TABLA 7 A Descripción química g / unidad / litro --Rango-- Gluconato de sodio 18.500-25.000 Fosfato de potasio 3.000-4.500 Sulfato de magnesio 1.000-1.500 Cloruro de calcio 0.100-0.150 Fosfato de sodio monobásico 0.250-0.350 TABLA 7 B Descripción química g / unidad / litro --Rango— Clorhidrato de L-arginina 0.065-0.080 Ácido L-aspártico 0.050-0.065 Ácido L-glutámico 0.100-0.160 TABLA 7 B (CONTINUACIÓN) Instrucciones de preparación para la Tabla 7: 1. Pesar todas las sustancias químicas y disolver mezclado en agua para inyección. 2. Añadir a la solución de la Tabla 6.
TABLA 7C I nstrucciones de preparación para la Tabla 8: 1 . Pesar todas las sustancias químicas y disolver mezclado en ag ua para inyección . 2. Añadir a la sol ución de la Tabla 6.
TABLA 8 Descripción q uím ica g / unidad / litro --Rango-- Biotina1 0.000015-0.00003 Bitrato de colina 0.40-0.50 Ácido fólico1" 0.00035-0.0005 Inositol 0.0008-0.002 Niacinamida 0.0008-0.002 Ácido pantoténico 0.0008-0.002 Piridoxina 0.0008-0.002 Riboflavina1 0.0008-0.002 Tiamina 0.008-0.015 Vitamina B-12 0.000015-0.00003 Adenosina 0.85-1.50 I nstru cciones de preparación para la Tabla 8: 1 . Pesar el grupo 1 y disolver en pequeña cantidad de 5 NaO H y agua para inyección 2. Pesar los componentes restantes y disolver con mezclado en agua para inyección 3. Añadir el grupo 1 a la solución en el paso 2 y mezclar. 4. Añadir esta solución a la solución en la Tabla 6.
TABLA 9 Descripc ión química g / unidad / litro --Rango-- ETOH 95% 8.00-16.00 mi Hidrolisato de soya 3-8 mi Fosfatidil colina 0.00095-0.010 Ácido aracadónico 0.0000015-0.00002 Ácido linoléico 0.000095-0.00015 Acido linolénico 0.000095-0.00015 Acido mirístico 0.000095-0.00015 Ácido oleico 0.000095-0.00015 Acido palmítico 0.000095-0.00015 Acido esteárico 0.000095-0.00015 Colesterol 0.002-0.004 Vitamina E tocoferol 0.0006-0.0008 TWEEN 80 0.020-0.030 Pluronic F-68 .010-1.000 Instrucciones de preparación para la Tabla 9: 1. El contenido de la Tabla 9 fue sometido al mismo paso de microfluidización mencionado anteriormente para la Formulación I, Premezcla II. 2. Añadir con mezclado a la solución de la Tabla 6 cuando se mezcle.
TABLA 10 Instrucciones de preparación para la Tabla 10: 1. Pesar todas las sustancias químicas y disolver en agua para inyección hasta que la disolución esté completa. 2. Añadir a la solución en la Tabla 6. 3. cantidad suficiente con agua para inyección hasta un volumen final de lote y mezclar. Ajustar el pH con NaOH 5N o con HCI 5N hasta un pH de 7.0 a 7.2.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar apreciación adicional de la invención, Estos ejemplos no significan de ninguna forma restricción del alcance efectivo de la invención. En cada cado en donde se preparan las soluciones, la cantidad de cada componente incluido fue el punto medio del rango expresado en la respectiva Tabla a la que se refiere.
EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE LA PREMEZCLA I PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN 1 Usando un equilibrio apropiado, se preparó un concentrado a 10.000X de cada componente enumerado en la Tabla 1, supra (usando el punto medio de la escala indicada) . La cantidad de cada componente incluido fue el punto medio de la escala expresado en la tabla. Por conveniencia, se prepararon soluciones madre para varios de estos componentes con anticipación, como sigue, y se mezcló una cantidad apropiada de solución madre en la solución 1.
SOLUCIÓN MADRE DE SULFATO CÚPRICO EN CONCENTRACIÓN DE 100.000X Se pesó y se mezcló 0.130 gramos de sulfato cúprico y se mezcló en 100 mL de agua para inyección. Cuando fue necesario, se añadió por goteo HCI 5N, con mezcla, hasta que la disolución estuvo completa. Esta se mezcló hasta disolverse, y se almacenó a -20 °C.
SOLUCIÓN MADRE DE SULFATO FÉRRICO. NITRATO FÉRRICO Y SULFATO DE ZINC EN CONCENTRACIÓN DE 10.000X Se preparó la solución madre pesando 5.0 gramos de sulfato férrico, 0.5 gramos de nitrato férrico, y 4.3 gramos de sulfato de zinc en 1000 mL de agua para inyección. Cuando fue necesario, se redujo el pH para ayudar a la disolución, añadiendo HCI 5N por goteo hasta terminar la disolución Esta solución se almacenó a -20 °C. Se usó 0.1 mL por litro de lote (volumen final del producto terminado).
SOLUCIÓN MADRE DE BIOTINA EN CONCENTRACIÓN DE lOO.OOOX Se preparó la solución madre de biotina pesando 0.040 gramos de biotina en 5 mL de agua para inyección. Se añadió HCI 5N por goteo, según fue necesario, durante la mezcla, hasta terminar la disolución. Se añadió la cantidad suficiente para 1000 mL, y se almacenó a -20 °C. Se usó 0.01 mL por litro en la solución final.
SOLUCIÓN MADRE DE VITAMINA B-12 Y TIMIDINA A 1000X Se preparó esta solución madre pesando 0.670 gramos de vitamina B-12 y 0.370 gramos de timidina en 1000 mL de agua para inyección, y se mezcló hasta terminar la disolución, y se almacenó a -20 °C. Se usó 1 mL por litro en ia solución final. Una vez que se elaboraron todos los concentrados madre, se añadieron a la solución 2 en un volumen consistente con su concentración, por ejemplo 1000x = 1 mL por litro, etc. Luego se añadieron los componentes adicionales hasta 1000 mL de agua para inyección y se mezclaron en una placa de agitación magnética hasta terminar la disolución. La solución resultante se añadió a la solución 2, descrita más abajo, en una proporción de 0.1 mL por litro de volumen del lote final (producto terminado).
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN 2 Usando la balanza apropiada, se pesó cada componente enumerado en las tablas 2A, 2B y 2C (medido en el punto medio de la escala indicada), y se añadió hasta aproximadamente 50% del volumen final de agua para inyección en el volumen del lote final, es decir, para 1 litro de lote final, se preparó solución 2 hasta aproximadamente 500 mL de agua para inyección. Esta se mezcló hasta terminar la disolución.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN 3 Usando la balanza apropiada, se pesó cada componente enumerado en la Tabla 3 (usando el punto medio de la escala indicada) y se añadió a un recipiente para mezcla de tamaño apropiado que contenía 5% del volumen del lote total de agua para inyección. Mientras se mezclaba, se añadió por goteo NaOH 5N, hasta que la mezcla se volvió clara, indicando la disolución completa. Luego se preparó la Premezcla I tomando solución 1 y combinándola con la solución 2, con mezclado, en una proporción de 0.1 mL por litro de volumen de lote final (producto terminado) para formar una solución combinada (1+2). Luego, se mezcló el lote completo de solución 3 con la solución (1+2) para producir la Premezcla I, que podía usarse inmediatamente o almacenarse.
EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE LA PREMEZCLA II Se usaron cantidades de componentes para la premezcla II usando el punto medio de la escala indicada como se muestra en la Tabla 4, supra. Por conveniencia, una cantidad de componentes de la Premezcla II se preparó primero como soluciones madre, y luego se emplearon en volúmenes apropiados para la preparación de la Premezcla II. Las soluciones madre fueron las siguientes. SOLUCIÓN MADRE DE FACTOERS ENDOCRINOS A 10.000X Se preparó esta solución madre, pesando 0.052 gramos de HGF, 0.050 gramos de triyodo-L-tiroxina, 0.050 gramos de VEGF, y 0.030 gramos de EGF en 1000 mL de agua para inyección, con mezclado hasta terminar la disolución. Se calculó el tamaño del lote a X0.1 mL y se añadió a la solución en el paso 4 / tratamiento 4. Se almacenó a -20 °C. Se usó 0.1 mL por litro en la solución final.
SOLUCIÓN MADRE DE HIDROCORTISONA A 1000X Esta solución madre se preparó pesando 0.95 gramos de hidrocortisona en 10 mL de EtOH al 95% y mezclando hasta terminar la disolución. Se calculó el tamaño del lote a X1 mL y se añadió la solución madre a la solución en el paso 2, más adelante. Se almacenó entre 2 y 8 °C, Se usó 1 mL por litro en la solución final.
SOLUCIÓN MADRE DE PROSTAGLANDINA E1 ("PGE1") a 1000X Se preparó pesando 0.034 gramos de PGE1 en 1000 mL de agua para inyección y se mezcló hasta terminar la disolución. Se calculó el tamaño del lote X1 mL y se añadió a la solución en el paso 4, más adelante. Se almacenó a -20 °C. Se usó 1 mL por litro en la solución final.
SOLUCIÓN MADRE DE PDGF A 100.000X Esta solución madre se preparó pesando 0.095 gramos de PDG F en 1000 m L de agua para inyección y se mezcló hasta terminar la disolución . Se calculó el tamaño del lote a X0.01 mL y se añadió a la solución en el paso 4, más adelante. Se almacenó a -20 °C. Se usó 1 m L por litro en la solución final. Luego se preparó la Premezcla I I mediante los siguientes pasos, con los componentes ind icados en la Tabla 4, supra (med idos en el punto medio de la escala ind icada). ( 1 ) Se preparó la solución de Pluronic F-68 pesando 1 gramo en menos de 50% del volumen de lote total (basado en 1 litro de lote de prod ucto final, esto fue menos d e 500 mL) de ag ua para inyección . Ésta se mezcló durante aproximadamente 1 hora con calor bajo (menos de 1 00 °C). Se continúo mezclando hasta terminar la disolución . La composición acuosa resultante se enfrió hasta aproximadamente 35-40 °C antes de su uso. (2) Se mid ió 1 0 mL de EtOH al 95% en un recipiente de vidrio para mezclar y se colocó en una placa de agitación magnética . Se pesó fosfatidilcolina , de acuerdo con la Tabla 4 (punto medio de la escala) y se añadió a esta solución, segu ido por mezclado d urante 1 hora. (3) Se pesó colesterol , ácido linoleico, ácido linolénico, vitamina E , TWEEN 80, aceite de h ígado de bacalao, h idrocortisona , ácid o oleico hasta el punto medio de la escala indicada en la Tabla 4. Preferiblemente, estos se prepararon primero como un concentrado a 10,000X o solución madre para lograr la concentración de trabajo deseada. SE añadieron a la solución del paso 2 y se mezclaron durante 1 hora. (4) Se añadieron las soluciones del paso 2 y del peso 3 a las soluciones del paso 1, y se mezclaron durante 1 hora. La composición resultante tenía apariencia opaca y turbia. (5) Se pesó factor de crecimiento de hepatocitos ("HGF"), triyodo -L-tiroxina, prostaglandina E1, factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF"), factor de crecimiento epitelial ("EGF"), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas ("PDGF") hasta el punto medio de la escala expresada como se indicó. Preferiblemente, se prepararon como una solución madre de trabajo de estas sustancias químicas. (6) Se añadieron los ingredientes del paso 5 a la solución del paso 4, y se mezcló durante 1 hora para producir una composición líquida de Premezcla II.
EJEMPLO 3 FÓRMULA k A O PARTÍCULAS BASADAS EN COLESTEROL POR MICROFLUIDIZACIÓN Se preparó ia Fórmula I a partir de las composiciones Premezcla I y Premezcla II de los ejemplos 1 y 2, supra, como sigue. (1) Se encendió el compresor de aire y se ajustó la presión de la linea a 120 PSI, a 47,200 cm3/seg. Esto cargó a utomáticamente la cámara de presión del m icrofluidizad or con aire compri mido. (2) La presión del m icrofl uidizador se ajustó a 351 .5 kg/cm2. (3) La premezcla I I preparada en el Ejemplo 2, se añadió a l depósito de la m áquina y los controles del m icrofl uidizador se giraron hasta la posición llenar. (4) La Premezcla I I pasó a través de la cámara de cavitación activa y salió en un recipiente de recolección . (5) cuando toda la Premezcla I I se había procesado y recolectado, se completó un ciclo. (6) Se repitieron los pasos (1 ) hasta (5), y/o hasta que la composición líq uida procesada emergió en el recipiente de recolección con una apariencia clara. (7) La composición líq uida se filtró luego asépticamente a través de un filtro con membrana de 2 mieras y se almacenó desde 4 hasta 8 grados centígrados hasta su uso. (8) El producto del paso (7) anterior, se mezcló lentamente con la Premezcla I, preparada en el Ejemplo 1 , supra, con la finalidad de evitar la formación de espuma y la disociación de los constituyentes quím icos. La proporción final de las premezclas fue de aproximadamente 1 : 1 . (9) Se añadió cantidad suficiente de la solución fi nal para el volumen de lote deseado, con ag ua para inyección, basándose en las Tablas 1 a 4, el volumen del lote final fue de 1 litro, y se ajustó el pH a 7.2 + 0.2. La composición final de la invención se filtró luego asépticamente a través de una membrana de 0.2 mieras en un recipiente estéril para su almacenamiento, Ésta tenía apariencia de una solución lechosa opaca, libre de cualquier material particulado. El tamaño de vesícula tiene una gran influencia en la apariencia óptica de la dispersión de nanopartículas. Mientras más pequeña es la partícula, más transparente se ve la solución.
EJEMPLO 4 CONSERVACIÓN DE ÓRGANOS. COMPARACIÓN CON VIASPAN® La eficacia de la Fórmula I, preparada en el Ejemplo 3, para la conservación de ríñones, se evaluó con relación a las propiedades de conservación del "patrón dorado" anterior VIASPAN® (Barr Laboratories, Inc.).
MATERIALES Y MÉTODOS Un podenco macho solo no consanguíneo entre las edades de 1 a 2 años, se nefrectomizó y luego se eutanizó inmediatamente bajo anestesia general. El riñon izquierdo se lavó con VIASPAN® y el riñon derecho se lavó con la Fórmula I. Cada riñon se lavó hasta que el fluido corrió claro, con solución de lavado al 100%, sin restos de sangre o de otro material de desecho . Cada riñon se lavó con 50 mide solución /kg de peso . Se tomó inmediatamente una biopsia de cada riñon, después de que se lavó con la solución. Todas las biopsias fueron de pedazos de la corteza exterior y de la curvatura principal del riñon . Luego se colocó cada riño n en un recipiente que conten ía solución idéntica a la em pleada para el lavado (VIASPAN® o Fórmula I) . El recipie nte individual se colocó en una caja enfriadora abierta solamente para las biopsias. Se tomaron biopsias subsiguientes a 1 , 4, 8 y 24 horas después de la inmersión en VIAS PAN® o en la solución en estudio de la invención . Se enviaron biopsias de ríñones conservadas en formalina al 1 0% a Pathology Associates, una División de Charles River Laboratories, I nc. , para su evaluación histopatológica.
RESU LTADOS Los resultados de las evaluaciones microscópicas de las biopsias en diferentes puntos de tiempo, se presentan en la Tabla 6 siguiente: TAB LA 6 EVALUAC IÓN HISTOPATOLÓGI CA DE BIO PSIAS DE RI ÑON Biopsia de las muestras FORMULA -I Solución de VIASPAN® (Riñon Derecho) (Riñon Izquierdo) Hallazgos Der Der Der Der Der Izq Izq Izq Izq Izq microscópicos base 1 H 4 H 8 H 24H base 1H 4H 8H 24H N N N Inflamación 1) 1> 1) 1> mononuclear Degeneración tubular 1) Inflamación aguda 1) 1> 1> Fibrosis periglomerural 1) Degeneración vascular Códigos: N = Normal; P = Presente; 1+ Mínimo; ) = Focal; >= Multifocal; Horas = H; Derecho= Der.
Todas las muestras de biopsia consistieron en tejido cortical derivado. Además, estuvieron presentes deformaciones de imagen por perfusión tales como dilatación del espacio de Bowman y dilatación tubular, en un grado moderado en las muestras para biopsia del riñon derecho de 8 y 24 horas. La deformación de imagen por perfusión también estuvo presente en la muestra para biopsia del riñon derecho de 4 horas, pero fue menos pronunciada que en las muestras mencionadas anteriormente del mismo riñon. Los cambios menores degenerativos e inflamatorios percibidos en algunas de las muestras de biopsia son inconsecuentes.
Estuvo presente u na inflamación aguda m ín ima en la cápsula renal del riñon izquierdo de las muestras de 4 y 8 horas.
RES UMEN La conservación fue similar para las muestras de ambos ríñones de la línea de base y las m uestras de 1 hora. La conservación fue superior en las muestras para biopsia tomadas del riñon derecho (conservadas con la composición de la invención) pa ra los puntos de tiempo de 4, 8 y 24 horas.
EJ EMPLO 5 PREPARACI ÓN DE LA PREM EZC LA l USANDO LA FÓRM U LA II PREPARACIÓN DE LA SOLU CIÓN » Se pesó y se disolvió con mezclado en agua para inyección , ácido ascórbico, catalasa, SOD, L-cisteína, taurina y metionina. Luego, se disolvió la vitam ina E y el mercaptoetanol en ETOH al 95% . Se elaboraron concentrados a 1 00X de componentes de sulfato de zinc, selen io y sulfato cúprico. Los primeros dos grupos de materiales se mezcla ron, y se añadió a esta solución, 1 mL por litro de volumen de lote final de los concentrados. Se añadió 25 gramos/litro de dextran 70 y HSA a la solución. Cada ingrediente usado se midió hasta el punto medio de la escala indicada en la tabla 6.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN 2 Usando la balanza apropiada, se pesó cada componente enumerado en las tablas 7A, 7B y 7C (medidos en el punto medio de la escala indicada), y se combinó de acuerdo con las instrucciones que se encuentran debajo de las respectivas tablas.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN 3 Usando la balanza apropiada, se pesó cada componente enumerado en la tabla 8 (usando el punto medio de la escala indicada) y se combinó de acuerdo con las instrucciones que se encuentran debajo de la tabla. Luego se preparó la Premezcla I combinando la Solución 1 con la Solución 2, con mezclado, en una proporción de 0.1 mL por litro de volumen de lote final (producto terminado) para formar una solución combinada (1+2). Luego, se mezcló el lote entero de la solución 3 con la solución (1+2) para producir la Premezcla I.
EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE LA PREMEZCLA II Se repitió el proceso del Ejemplo 2, excepto porque los ingredientes de la Tabla 9 se usaron en lugar de los de la Tabla 4.
EJEMPLO 7 FÓRMULA II: NANOPARTÍCULAS BASADAS EN COLESTEROL POR MICROFLUIDIZACIÓN Se preparó la fórmula II a partir de las composiciones Premezcla I y Premezcla II de los ejemplos 4 a 6, supra, siguiendo el proceso del Ejemplo 3.
EJEMPLO 8 EVALUACIÓN PE LA CONSERVACIÓN DE RIÑON CON LA FÓRMULA II En este estudio, la solución (composición) del ejemplo 7, denominada aquí como Fórmula II, se comparó con VIASPAN a entre 2 y 8 °C en un entorno de conservación estático usando riñones de oveja frescos con +/- horas posteriores en frío al daño isquémico por la cosecha. Los riñones se extrajeron de una oveja recientemente sacrificada y se colocaron inmediatamente en hielo. Una vez regresados al laboratorio, se disecaron asépticamente para eliminar todo tejido graso, y aislar la arteria renal. Ambos riñones se pesaron en el tiempo = 0. Los riñones tenían apariencia normal en cuanto al color, textura y densidad. Cada riñon se lavó hasta que el fluido corrió claro, con solución de lavado al 100%, sin restos de sangre u otro material de desecho. Se tomó una biopsia de cada riñon respectivo inmediatamente después de que fue lavado con solución (T = =). Todas las biopsias fueron pedazos de la corteza exterior y de la curvatura mayor del riñon. Cada riñon (A y B) se colocó entonces en un recipiente que contenía solución idéntica a la empleada para el lavado (VIASPAN® (RIÑON a) O Fórmula II {riñon B). El recipiente individual se colocó en una caja enfriadora abierta sólo para las biopsias. Se tomaron biopsias subsiguientes a 12, 24, 36, 48, 60, 72 y 96 horas después de la conservación en VIASPAN® o en la solución de la fórmula II de la invención. Se conservaron las biopsias de riñon en formalina al 10% antes de la evaluación histopatológica. Las biopsias del riñon se conservaron en formalina al 10% antes de la evaluación histopatológica.
RESULTADOS Hubo diferencias histológicas significativas entre los dos ríñones. Aparecieron cambios autolíticos (que se refieren a la destrucción de células ocasionada por la lisina) gradualmente de 12 a 96 horas después de la conservación en el riñon tratado con VIASPAN. No hubo cambios histológicos en el riñon tratado con la fórmula II de la invención hasta 36 horas después de la conservación. Se puede ver a partir de los anterior, que la solución de la invención ofrece ventajas significativas sobre la técnica anterior cuando se usa en técnicas de conservación hipotérmica.
EJEMPLO 9 FÓRMULA III: NANOPARTÍCULAS QUE CONTIENEN HEMO Se obtiene hemoglobina libre de estromas de fuentes comerciales o se aisla a partir de eritrocitos empaquetados por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la patente estadounidense número 5,674,528, incorporada a la presente solicitud mediante referencia, y estandarizada en una concentración de 50% (peso/volumen). A 200 mL de hemoglobina libre de estroma se le añade ß-NAD (1 mM, 133 mg), D-glucosa (100 mM, 3.6 g), ATP-Na (1 mM, 110 mg), hexahidrato de cloruro de magnesio (1 mM, 40 mg), fosfato dipotásico de hidrógeno (9 mM, 247 mg), fosfato disódico de hidrógeno (11 mM, 310 mg), y ácido pítico (3 mM, 396 mg), y se agita la mezcla hasta que los reactivos estén totalmente mezclados para formar una solución de hemoglobina suplementada. A 45 gramos de un polvo mezclado uniformemente de fosfatidilcolina con una tasa de hidrogenación de 90%, colesterol, ácido mirístico y vitamina E, en una proporción molar de 7:720.28, respectivamente, se le añade 45 mL de WFI, y se calienta la mezcla hasta una temperatura que abarca desde 60 hasta 80 °C, para permitir el aumento de volumen. La solución de hemoglobina suplementada anterior, se añade al material lípido resultante, y se agita la mezcla durante 15 segundos. La solución de lípido-SFH mezclada se procesa a través de un Microfluid izer 5000 (Microflu idics Co.) y se procesa en un baño de hielo a una presión de 843.7 kg/cm2. La hemoglobina resultante encapsulada se mezcla con u na solución de sal in a y dextran (3% (peso/vol u men)) y la suspensió n resu ltante se centrifuga a 10,000 rpm (1 3, 000 g) x 30 minutos, a 4 °C. Los liposomas o nanopartícu las con hemog lobina encapsu lada se recuperan luego. El supernadante q ue contiene la hemog lobina residual libre no encapsulada y/o los componentes l ípid os iniciales remanentes se eliminan por decantación o succión. El proceso de lavado descrito anteriormente se repite hasta q ue no queda hemoglobina libre visible. El producto res ultante se filtra a través de un fi ltro de membrana con un tamaño de poros desde 0.2 hasta 0.45 mieras, dependiendo de la escala de tamaño de partícula deseada para el producto. SE concentra el filtrado, por ejemplo, mediante ultra filtración a través de un dializador del tipo de fibra hueca, hasta una concentración para producir 600 m L de suspensión purificada de liposomas encapsulados con hemoglobina o de nanopartículas, con una concentración de hemoglobina de aproximadamente 5% (peso/volumen). Los liposomas o nanopartículas resultantes se mezclan con la Premezcla I en una proporción que abarca desde aproximadamente 10 partes hasta aproximadamente 500 partes de emulsión, en un vol umen total de 1000 partes, con la Premezcla I , para proporcionar la Fórm ula I I .
Luego, la Fórmula III se mezcla en una proporción deseada con la Fórmula I, para proporcionar una composición conservadora de órganos con propiedades transportadoras de oxígeno.
EJEMPLO 10 MEDIO DE CULTIVO CELULAR En este ejemplo, la composición del ejemplo 3 identificada como Fórmula I, se sometió a prueba para identificar su habilidad para funcionar como un medio de cultivo celular. Se colocaron células de riñon humano en recipientes que contenían una cantidad suficiente de Fórmula I, y se demostró el crecimiento y viabilidad celular usando este material como un medio de cultivo celular a 4 y 37 grados C. Después de 72 horas, se demostró que las células viables pudieron crecer hasta una población de células saludables, que mostraron morfología normal y viabilidad. El contenido de todas las patentes estadounidenses y documentos publicados precedentes está incorporado aquí mediante referencia.

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de dos fases para el mantenimiento de la viabilidad celular, que comprende: una primera fase que contiene un medio nutritivo base; y una segunda fase que contiene nanopartículas que incluyen un recubrimiento lipofílico exterior y un núcleo hidrofílico interior, caracterizada porque: a) la primera fase contiene concentraciones fisiológicamente compatibles de nutrientes solubles o dispersables en agua, y sales fisiológicas; b) las nanopartículas de la segunda fase contienen lípidos, ácidos grasos, esteróles y ácidos grasos libres; y c) la composición de dos fases tiene una osmolaridad de al menos aproximadamente 300 mOsM/kg.
2. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque la composición de dos fases tiene una osmolaridad que abarca desde aproximadamente 385 hasta 425 mOs /g.
3. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque el pH de la misma es desde aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 7.4.
4. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque las nanopartículas tienen un diámetro medio que abarca desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 300 nm.
5. La composición de dos fases de la reivindicación 4, caracterizada además porque las nanopartículas tienen un diámetro medio que abarca desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 200 nm.
6. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene adicionalmente factores de crecimiento celular.
7. La composición de dos fases de la reivindicación 6, caracterizada además porque dichos factores de crecimiento celular se seleccionan del grupo que consiste en factores de crecimiento epitelial y endotelial, factores de crecimiento endotelial vascular, factores de crecimiento endotelial derivado de plaquetas, factores de crecimiento epitelial, factores de crecimiento de hepatocitos, y mezclas de los mismos. La composición de dos fases de la reivindicación 1 tiene la Fórmula I.
8. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque contiene aproximadamente cantidades iguales de la primera fase y de la segunda fase.
9. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque contiene un ácido graso libre seleccionado del grupo que consiste en ácido oleico, ácido linoleico, palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido eicosapentenoico, ácido docosahexenoico, y combinaciones de ellos.
10. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque la nanopartícula tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 200 nm.
11. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene g / unidad / litro Rango--
12. La composición de dos fases de la reivindicación 1 que contiene q / unidad / litro --Rango— Adenosina 0.950-1.050 5' Monofosfato de adenosina 0.0019-0.0021 Trifosfato de adenosina 0.0019-0.0021 Alopurinol 0.133-0.0147 Fosfato de dinucleotido B' 0.038-0.042 nicotina mida -a de nina Dinucleotido B' nicotinamida-adenina 0.0019-0.0021 Cloruro de calcio 0.152-0.168 Cloruro de colina 0.0085-0.0094 Sulfato de condrotina 0.0038-0.0042 Cocarboxilasa 0.038-0.042 Coenzima A 0.0095-0.00105 Ciclodextrina 0.475-0.525 Desoxiadenosina 0.038-0.042 Desoxicitidina 0.038-0.042 Desoxiguanosina 0.038-0.042 Dextran 70 33.25-36.75 Dinucleotido flavina-adenina 0.038-0.042 Ácido fólico 0.0026-0.0028 Glucosa 3.800-4.200 Glutationa 0.950-1.050 Glicina 0.0179-0.0197
13. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene g / unidad / litros --Rango-- Heparina 0.171-0.189 HEPES 3.396-3.753 Hipoxantina 0.002-0.0022 Inositol 0.0124-0.0137 Insulina 0.0095-0.0105 L-alanina 0.00428-0.00473 L-arginina 0.141-0.155 L-asparagina 0.0076-0.0084 Ácido L-aspártico 0.064-0.070 L-císteina 0.0297-0.0329 L-cistina 0.0167-0.0185 Acido L-glutámico 0.007-0.0078 L-glutamina 4.750-5.250 L-histidina 0.030-0.033 L-isoleucina 0.052-0.0572 L-leucina 0.057-0.063 L-lisina 0.0095-0.0105 L-metionina 0.0019-0.021 L-fenilalanina 0.0337-0.0373 L-prolina 0.0164-0.0182 L-serina 0.025-0.0276 L-treonina 0.051-0.056
14. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene g / unidad / litro —Rango-- L-triptófano 0.009-0.0095 L-tirosina 0.053-0.059 L-valina 0.050-0.055 Cloruro de magnesio 0.058-0.0643 Sulfato de Magnesio 0.0475-0.0525 Mannosa 3.135-3.465 Niacinamida 0.0019-0.0021 Acido pantoténico 0.0021-0.0024 Cloruro de potasio 0.296-0.328 Clorohidrato de piridoxal 0.0019-0.0021 Ácido pirúvico 0.209-0.231 Bicarbonato de sodio 1.140-1.260 Cloruro de sodio 6.650-7.350 Fosfato de sodio dibásico 0.0676-0.0748 Fosfato de sodio monobásico 0.0516-0.0570 Tiamina 0.0021-0.0023 Transferrina 0.00475-0.00525 Uridina 0.038-0.042 Trifosfato de uridina 0.038-0.042 Yeastolate ultra filtrado (Sigma Chemical 38-42 ML Company, No. de Cat. Y2000)
15. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene g / unidad / litro --Rango-- L-cistina 0.0167-0.0185 L-tirosina 0.053-0.059
16. La composición de dos fases de la reivindicación 1 que contiene g / unidad / litro —Rango— Colesterol 0.00475-0.00525 Aceite de hígado de bacalao 0.00095-0.00105 Factor de crecimiento epitelial 0.00000285-0.00000315 Factor de crecimiento de 0.0000048-0.0000053 hepatocitos Hidrocortisona 0.00095-0.00105 Ácido linoléico 0.00095-0.00105 Ácido linolénico 0.00095-0.00105 Ácido oléico 0.00095-0.00105 Fosfatidilcolina 0.6% Factor de crecimiento endotelial 0.00000095-0.00000105 derivado de plaquetas Pluronic F-68 0.950-1.050 Prostaglandina E1 0.000042-0.0000263 Tri-yodo L-tiroxina 0.00000475-0.0000053 TWEEN 80® 0.002375-0.002625 Factor de crecimiento endotelial 0.0000046-0.00000525 vascular Vitamina E 0.0019-0.0021
17. La composición de dos fases de la reivindicación 1 que contiene g / unidad / litro --Rango-- Hidrolisato de soya 6.0-10.0 Glutationa reducida 0.008-0.020 Acetato de vitamina A 0.0002-0.0003 Vitamina C (Ácido ascórbico) 0.040-0.060 Vitamina E (tocoferol) 0.00002-0.00003 Catalasa 0.040-0.060 SOD 0.040-0.060 Clorohidrato de L-cisteína 0.040-0.060 Taurina 0.025-0.040 Metionina 0.015-0.030 Sulfato de Zinc 0.0008-0.0009 Selenio 0.000025-0.000035 Sulfato cúprico 0.0000045-0.000006 Etanolamina 0.0025-0.005 ercaptoetahol 0.003-0.006
1 8. La composición de dos fases de la reivindicación 1 , que contiene g / un idad / litro "Rango-- Gluconato de sodio 18.500-25.000 Fosfato de potasio 3.000-4.500 Sulfato de magnesio 1.000-1.500 Cloruro de calcio 0.100-0.150 Fosfato de sodio monobásico 0.250-0.350
1 9. La com posición de dos fases de la reivindicación 1 que contiene g / u n idad / l itro --Ran go— Clorhidrato de L-arginina 0.065-0.080 Ácido L-aspártico 0.050-0.065 Ácido L-glutámico 0.100-0.160 L-glutamina 0.300-0.400 Glicina 0.045-0.060 Clorhidrato de L-histidina-H20 0.155-0.170 L-isoleucina 0.025-0.030 L-leucina 0.045-0.055 Clorhidrato de L-lisina 0.240-0.300 L-fenilalanina 0.045-0.055 L-prolina 0.045-0.055 L-treonina 0.065-0.075 L-tr¡ptófano 0.035-0.0450 L-valina 0.055-0.070 L-cistina 0.018-0.024 L-tirosina 0.050-0.060
20. La composición de dos fases de la reivindicación 1, que contiene
21. La composición de dos fases de la reivindicación que contiene g / unidad / litro --Rango-- Biotina 0.000015-0.00003 Bitrato de colina 0.40-0.50 Ácido fólico 0.00035-0.0005 Inositol 0.0008-0.002 Niacinamida 0.0008-0.002 Acido pantoténico 0.0008-0.002 Piridoxina 0.0008-0.002 Riboflavina 0.0008-0.002 Tiamina 0.008-0.015 Vitamina B-12 0.000015-0.00003 Adenosina 0.85-1.50
22. La composición dé dos fases de la reivindicación 1 que contiene I Descripción química g / unidad / litro — ango-- ETOH 95% 8.00- 6.00 mi Hidrolisato de soya 3-8 mi Fosfatidil colina 0.00095-0.010 Ácido aracadónico 0.0000015-0.00002 Ácido linoléico 0.000095-0.00015 Acido linolénico 0.000095-0.00015 Ácido mirístico 0.000095-0.00015 Ácido oleico 0.000095-0.00015 Ácido paimítico 0.000095-0.00015 Acido esteárico 0.000095-0.00015 Colesterol 0.002-0.004 Vitamina E tocoferol 0.0006-0.0008 TWEEN 80 0.020-0.030 Pluronic F-68 .010-1.000
23. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque dicho núcleo hidrofílico interior contiene una solución o suspensión que comprende una porción capaz de enlazar y de liberar oxígeno.
24. La composición de dos fases de la reivindicación 10, caracterizada además porque la porción capaz de enlazar y de liberar oxígeno es una proteína hemo.
25. La composición de dos fases de la reivindicación 1, caracterizada además porque dicho núcleo hidrofílico interior contiene una porción biológicamente activa.
26. La composición de dos fases de la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, proteínas, péptidos, polipéptidos, enzimas y mezclas de los mismos.
27. La composición de dos fases de la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha porción biológicamente activa es ranprinasa.
28. Una composición de tres fases que comprende la composición de la reivindicación 1 mezclada con una composición que contiene una nanopartícula que tiene un recubrimiento lipofílico exterior y un núcleo hidrofílico interior que contiene una solución o suspensión que incluye una porción capaz de enlazar y de liberar oxígeno.
29. La composición de tres fases de la reivindicación 28, caracterizada además porque la porción capaz de enlazar y liberar oxígeno es una proteína hemo.
30. Una composición de tres fases que comprende la composición de la reivindicación 1 mezclada con una composición que contiene una nanopartícula que tiene un recubrimiento lipofílico exterior y un núcleo tdrof ílico interior que contiene una porción biológicamente activa.
31. Un proceso para preparar la composición de dos fases de la reivindicación 1, que comprende combinar una primera fase líquida que contiene un medio nutritivo base que incluye concentraciones fisiológicamente compatibles de nutrientes solubles o dispersables en agua, y sales fisiológicas con una segunda fase líquida que contiene nanopartículas que incluyen un recubrimiento lipofílico exterior y un núcleo hidrofílico interior bajo condiciones suficientes para preparar una composición final de dos fases que tiene una osmolaridad de al menos aproximadamente 300 mOsM/kg.
32. Un método para conservar órganos de mamíferos, ex vivo, que comprende colocar un órgano en una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 1.
33. El método de la reivindicación 32, caracterizado además porque dicho órgano se selecciona del grupo que consiste en riñon, corazón, hígado, pulmón, piel, arteria, y partes funcionales e ellos.
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