CN107624753A - 一种细胞低氧稳压运输方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种细胞低氧稳压运输方法，包括如下步骤，(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体；(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。本发明的优点在于，将细胞在上述保存液中经过12‑24h的长时间运输，细胞无溶解、肿胀现象，仍能很好的维持细胞活性，细胞死亡率低。
Description
技术领域
本发明属于生物材料运输的技术领域，具体为一种细胞低氧稳压运输方法。
背景技术
细胞作为重要的生物材料，往往是科学研究、药物筛选、各种实验的研究对象，而使用者也往往要通过采购的方式获得，在采购后，就需要将细胞运输到各个目的地，但在运输过程中，万一运输细胞的环境达不到细胞本身的需求，就会造成细胞破坏、死亡或生物特征改变，导致无法继续后面的研究和实验，所以运输细胞为至关重要的一个环节，特别是干细胞在生命科学研究、药物筛选测试、组织器官修复研究等各领域中具有极其重要的用途。例如，间充质干细胞(MSC，Mesenchymal Stem Cell)因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。现有技术中对于这种细胞的运输方法为以0.9％氯化钠注射液为主制成保存液，细胞置入保存液中进行运输，这种方法虽然解决了对人体静脉回输是安全的，但其在运输过程中细胞活性下降快，细胞容易积聚成团，导致细胞经长时间运输后细胞活率很低，干细胞大量死亡，直接影响临床效果。
发明内容
为解决现有技术中细胞长时间运输后细胞活率降低、甚至大量死亡的技术问题，本发明提供了一种细胞低氧稳压运输方法，实现的目的为在运输过程中最大化保证细胞的活性，在经过长时间运输后，仍能保持细胞活性，从而为各种科学研究和实验奠定良好的基础条件。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供的一种细胞低氧稳压运输方法，包括如下步骤，(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体,所述两种成分在原材料中的质量百分比分别为，0.9％的氯化钠溶液20％-40％，kit配体1％-5％；
(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。
本领域技术人员一般在制备细胞保存液时，都会测量瓶体内的氧气，采用真空泵抽取瓶体空气，使空气内部氧含量降低，并且均需要在无菌条件下操作，此低氧步骤为本领域的常规技术，故不在此过多阐述，采用临床级别的干细胞因子kit配体与氯化钠溶液混合，由于干细胞因子能够帮助细胞维持弹性，使细胞在该保存液中，经过12-24h的长时间运输，仍能维持细胞活性，细胞无死亡。
进一步的，所述步骤(1)中保存液还包括VEGF、L-谷氨酰胺，各成分在原材料中的质量百分比分别为，VEGF为0.5％-3％，L-谷氨酰胺为1％-5％。
进一步的，所述步骤(1)中保存液还包括HGF、胱氨酸，各成分在原材料中的质量百分比分别为，HGF 0.1％-2％，胱氨酸1％-5％。
进一步的，所述步骤(1)中保存液还包括bFGF、精氨酸，成分在原材料中的质量百分比分别为，bFGF 0.1％-2％，精氨酸1％-5％。
进一步的，所述步骤(1)中保存液还包括SDF-1、天门冬氨酸，成分在原材料中的质量百分比分别为，SDF-1 0.1％-2％，天门冬氨酸1％-5％。
进一步的，所述步骤(1)中保存液还包括IGF-1、G-CSF，各成分在原材料中的质量百分比分别为，IGF-1 0.1％-2％，G-CSF 1％-5％。
上述采用的干细胞因子、蛋白质均是采用临床级别的试剂，将上述干细胞因子、蛋白质代替氯化钠溶液的用量，维持等渗的渗透压，增强细胞膜弹性和厚度，从而使细胞不易破碎。
进一步的，所述步骤(2)中采用压力传感器实时检测运输箱箱体的压力，采用控制器预设箱体中的压力阈值，控制器从压力传感器获取的压力值超出/低于阈值时，将该预警信息发送至工作人员移动终端。采用压力传感器实时采集运输箱体内的压力，一旦打破恒压条件，工作人员可及时获取到信息，对细胞转运或者其他方法补救。
本发明采用上述技术方案，包括以下有益效果：将干细胞因子、蛋白质代替氯化钠溶液的使用，得到细胞保存液，细胞在该保存液中经过12-24h的长时间运输，细胞无溶解、肿胀现象，仍能很好的维持细胞活性，细胞死亡率低。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：本发明提供的一种细胞低氧稳压运输方法，包括如下步骤，(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体、VEGF、L-谷氨酰胺、HGF、胱氨酸、bFGF、精氨酸、SDF-1、天门冬氨酸、IGF-1、G-CSF,所述两种成分在原材料中的质量百分比分别为，0.9％的氯化钠溶液40％，kit配体5％、VEGF3％、L-谷氨酰胺5％、HGF2％、胱氨酸5％、bFGF2％、精氨酸5％、SDF-1 2％、天门冬氨酸5％、IGF-1 2％、G-CSF5％，余量可用无菌注射用水助溶；
(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。
本发明将现有技术中常用的细胞保存液主要用的成分氯化钠溶液，用临床级别的干细胞和蛋白质代替，发现本发明成分制备出的保存液在运输24h后细胞活性保持良好，如下述表格以MSC细胞的试验结果：
| 运输时间 | 细胞活性 | 运输时间 | 细胞活性 | 运输时间 | 细胞活性 |
| 0h | 95％ | 2h | 95％ | 4h | 95％ |
| 6h | 92％ | 8h | 90％ | 10h | 90％ |
| 12h | 90％ | 14h | 89％ | 16h | 86％ |
| 18h | 85％ | 20h | 84％ | 22h | 83％ |
| 24h | 83％ | 26h | 82％ | 28h | 80％ |
| 30h | 79％ | 32h | 78％ | 34h | 76％ |
采用现有技术对MSC细胞测试细胞活性，由于测试细胞活性的方法属于现有技术，故不在此具体阐述。
实施例二：本发明提供的一种细胞低氧稳压运输方法，包括如下步骤，(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体、VEGF、L-谷氨酰胺、HGF、胱氨酸、bFGF、精氨酸、SDF-1、天门冬氨酸、IGF-1、G-CSF,所述两种成分在原材料中的质量百分比分别为，0.9％的氯化钠溶液20％，kit配体1％、VEGF0.5％、L-谷氨酰胺1％、HGF0.1％、胱氨酸1％、bFGF0.1％、精氨酸1％、SDF-1 0.1％、天门冬氨酸1％、IGF-1 0.1％、G-CSF1％，余量可用无菌注射用水助溶；
(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。
所述步骤(2)中采用压力传感器实时检测运输箱箱体的压力，采用控制器预设箱体中的压力阈值，控制器从压力传感器获取的压力值超出/低于阈值时，将该预警信息发送至工作人员移动终端。压力传感器、控制器、工作人员移动终端之间的通讯协议均为现有技术，涉及到软件程序部分，本领域技术人员根据想要实现的目的，可采用任何一种计算机化的语言编程实现。
本发明制备的保存液，不会使细胞产生聚集现象，进一步保证细胞活性，例如MSC、UBMNC细胞为例，采用本发明细胞保存液测试MSC、UBMNC细胞的集聚试验，具体实验步骤如下：
1.含细胞的保存液的制备
1)收集MSC、UBMNC细胞，调整细胞密度至105/ml。
2)吸取细胞悬液放入15ml离心管，加入10ml PBS，重悬细胞，1000rpm 5min洗涤细胞。
3)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm 5min洗涤细胞。
4)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm 5min洗涤细胞。
5)弃PBS液，根据所需细胞浓度加入本实施例中制备的细胞保存液，PBS溶液或0.9％生理盐水，并轻轻混匀。
2.细胞聚集情况的观察
将上述1中制备的细胞置于4℃冷藏箱保存。分别在1h、2h、4h、6h、8h和12h后观测细胞聚集情况。
细胞聚集情况的分析基于以下标准，即当在放大×40倍的显微镜(奥林巴斯，货号CKX-41)下观察时，在10μm×10μm视野中计数出现5个以上的细胞连接到一起的聚集情况，其中：
-：表示没有观察到细胞聚集成团。
+：表示观察到1个以上至2个以下的细胞聚团。
++：表示观察到3个以上至5个以下的细胞聚集成团。
+++：表示观察到大于5个细胞聚集成团。
结果如下表所示。
由上表可以看出当使用不含负氢离子的生理盐水时，随着时间的推移，细胞出现聚集情况，MSC细胞甚至当两小时时开始出现较为严重的聚集。另一方面，在本发明的细胞保存液的情况中，无论是UBMNC细胞还是MSC细胞甚至在12小时后也未出现细胞聚集现象。上述结果表明，本发明的细胞保存液具有优异的抑制细胞聚集的效果。
实施例三：本发明提供的一种细胞低氧稳压运输方法，包括如下步骤，
(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体、VEGF、L-谷氨酰胺、HGF、胱氨酸、bFGF、精氨酸、SDF-1、天门冬氨酸、IGF-1、G-CSF,所述两种成分在原材料中的质量百分比分别为，0.9％的氯化钠溶液30％，kit配体3％、VEGF1.5％、L-谷氨酰胺3％、HGF1％、胱氨酸3％、bFGF1％、精氨酸2.5％、SDF-1 1.5％、天门冬氨酸3％、IGF-1 1.5％、G-CSF3％，余量可用无菌注射用水助溶；
(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。
所述步骤(2)中采用压力传感器实时检测运输箱箱体的压力，采用控制器预设箱体中的压力阈值，控制器从压力传感器获取的压力值超出/低于阈值时，将该预警信息发送至工作人员移动终端。压力传感器、控制器、工作人员移动终端之间的通讯协议均为现有技术，涉及到软件程序部分，本领域技术人员根据想要实现的目的，可采用任何一种计算机化的语言编程实现。
采用本发明方法，可以保证细胞维持正常渗透压、不易出现破损、溶解，保证了细胞存活率，例如下表所示的以UBMNC细胞为例运输24h存活率试验结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)配置细胞保存液，保存液原材料包括质量浓度为0.9％的氯化钠溶液、kit配体,所述两种成分在原材料中的质量百分比分别为，0.9％的氯化钠溶液20％-40％，kit配体1％-5％；
(2)将细胞置入步骤(1)制备出的保存液中，利用运输箱在低氧稳压条件下运输。
2.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(1)中保存液还包括VEGF、L-谷氨酰胺，各成分在原材料中的质量百分比分别为，VEGF为0.5％-3％，L-谷氨酰胺为1％-5％。
3.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(1)中保存液还包括HGF、胱氨酸，各成分在原材料中的质量百分比分别为，HGF 0.1％-2％，胱氨酸1％-5％。
4.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(1)中保存液还包括bFGF、精氨酸，成分在原材料中的质量百分比分别为，bFGF 0.1％-2％，精氨酸1％-5％。
5.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(1)中保存液还包括SDF-1、天门冬氨酸，成分在原材料中的质量百分比分别为，SDF-1 0.1％-2％，天门冬氨酸1％-5％。
6.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(1)中保存液还包括IGF-1、G-CSF，各成分在原材料中的质量百分比分别为，IGF-1 0.1％-2％，G-CSF1％-5％。
7.根据权利要求1所述的细胞低氧稳压运输方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用压力传感器实时检测运输箱箱体的压力，采用控制器预设箱体中的压力阈值，控制器从压力传感器获取的压力值超出/低于阈值时，将该预警信息发送至工作人员移动终端。
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