CN105875588A - 一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 - Google Patents
一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105875588A CN105875588A CN201410587471.7A CN201410587471A CN105875588A CN 105875588 A CN105875588 A CN 105875588A CN 201410587471 A CN201410587471 A CN 201410587471A CN 105875588 A CN105875588 A CN 105875588A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- preservation liquid
- liquid
- preservation
- hydrogen ion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 158
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 42
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 4
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 3
- 238000012683 free radical ring-opening polymerization Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- -1 hydride ion Chemical class 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 2
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 2
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100027280 Fanconi anemia group A protein Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000914673 Homo sapiens Fanconi anemia group A protein Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000832 liver cell necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- NHDHVHZZCFYRSB-UHFFFAOYSA-N pyriproxyfen Chemical compound C=1C=CC=NC=1OC(C)COC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 NHDHVHZZCFYRSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000009288 screen filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
本发明提供一种细胞保存液及其用途，另外提供一种细胞保存方法。本发明的细胞保存液以0.5g/ml至1.5g/ml的氯化钠水溶液为主要成分，其中还包含在细胞保存条件下存在的负氢离子类物质。本发明的效果在于能够使细胞例如干细胞在运输等过程中长期保持高活性率，减少细胞聚集。
Description
技术领域
本发明涉及一种保存细胞的技术，特别地涉及一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法，该技术能够使细胞在运输等过程中长期保持高活性率，减少细胞聚团。
背景技术
各种类型的细胞，特别是干细胞在生命科学研究、药物筛选测试、组织器官修复研究等各领域中具有极其重要的用途。例如，间充质干细胞(MSC，Mesenchymal Stem Cell)因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。
然而，目前这些细胞，特别是干细胞，例如间充质干细胞在科研、工业和临床上的应用还存在一些问题，如运输不便、临时储存不便，运输过程中细胞活性下降快，细胞容易积聚成团等。干细胞在运输过程中需要保持良好活性，并可直接回输给患者，因此干细胞保存液需要既能保护细胞活性，又能安全的用于人体静脉回输。现有的干细胞保存液以0.9％氯化钠注射液为主，另外改进的还有葡萄糖氯化钠注射液等，这些保护液对人体静脉回输是安全的，但细胞经长时间运输后细胞活率很低，干细胞大量死亡，直接影响临床效果。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法，以便解决现有技术中存在的细胞经长时间运输后细胞活率低、大量死亡等技术问题。防止在运输过程中因温度、pH、震荡等因素，细胞活性及活率将会下降。
用于解决问题的方案
为了达到上述目的，本发明的发明人意外发现：当在包含0.5g/ml至1.5g/ml的氯化钠水溶液中含有负氢离子类物质时，能够使细胞，特别是干细胞在运输过程中保持高存活率，减少细胞聚团。从而完成了本发明。
具体地，本发明的一方面，提供一种细胞保存液，其包含0.5g/ml至1.5g/ml的氯化钠水溶液，另外还含有负氢离子类物质。
优选地，细胞保存液进一步包含待保存的细胞。
在优选实施方案中，氯化钠水溶液的浓度为0.9g/ml。
在另外的优选实施方案中，负氢离子类物质的浓度为200ppb H-至600ppb H-之间。
在进一步优选的实施方案中，细胞保存液中细胞的浓度为2.0×105/ml至2.0×106/ml之间。
在此外的优选实施方案中，细胞保存液中的细胞选自间充质干细胞、单个核细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、造血干细胞、肝干细胞和脂肪干细胞组成的组中的至少之一。特别优选选自间充质干细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组中的至少之一。
本发明的另一方面提供一种保存细胞的方法，其中使用本发明所述的细胞保存液。
本发明的其它方面提供细胞保存液在保存细胞中的用途。
发明的效果
本发明的细胞保存液能使细胞，例如人间充质干细胞在运输过程中保持高存活率，有效清除自由基，减少了细胞之间及细胞与容器之间的黏附，减少临床输注人间充质干细胞时血管内出现细胞团栓塞的可能性。本发明的细胞保存液可使细胞，例如人间充质干细胞在4℃～10℃时在24小时内保持高活性及减少细胞聚团，本细胞保存液将有效扩大干细胞配送区域范围，增加临床使用人间充质干细胞的范围，所用的成分为符合临床使用的成分，可满足临床使用人间充质干细胞及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的需求。
附图说明
图1为人为设定判断MSC聚集情况的标准，根据聚集程度的轻重分为四级：-、+、++、+++。
图2为间充质干细跑的免疫表型分析的流式结果。
图3为CIK细跑的免疫表型分析的流式结果。
图4间充质干细胞活性在不同保存液中细胞活性随时间的变化情况。
图5MSC细胞在不同保存液中其数量随时间的变化。
图6MSC细胞在不同保存液中其活性随时间的变化。
图7CIK细胞在不同保存液中细胞数量随时间的变化。
图8CIK细胞在不同保存液中细胞活性随时间的变化。
具体实施方式
本申请中所述的细胞保存液以氯化钠水溶液为主要成分，同时在氯化钠水溶液中含有负氢离子类物质。关于本发明的细胞保存液能够使细胞，特别是干细胞在运输过程中保持高存活率，减少细胞聚团的原因，发明人认为可能在于负氢离子类物质有超强抗氧化能力，能有效清除细胞内的自由基，从而能长时间保持细胞的高存活率，降低细胞功能衰竭，防止细胞聚团。
具体地，本发明的细胞保存液能够长时间保持细胞高存活率的原因可能在于，在细胞内有多种产生自由基的途径。线粒体是内源产生自由基的主要场所，是自由基浓度最高的细胞器，例如，在线粒体氧化磷酸化生成ATP的过程中，大约有1％～4％的氧转化为活性氧(reactive oxygen species ROS)。自由基，特别是那些游离存在的自由基，因含有1个或1个以上不配对电子的分子、离子、原子或原子团，在细胞内有很强的氧化反应能力，易对蛋白质、脂质和核酸等产生伤害，从而引起细胞及机体的损伤。
例如，生物膜易受自由基攻击而发生过氧化连锁反应，从而造成生物膜的脂质过氧化损伤。氧自由基是机体内的主要自由基，其可引起肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜和溶酶体膜发生脂质过氧化，产生LPO及其降解产物(醛类及烃类)可加重生物膜的损伤，破坏膜的稳定性和完整性，使其通透性增加，最终导致肝细胞的坏死。此外，红细胞膜发生脂质过氧化损伤后，通透性增加，细胞变脆，易发生溶血；当有Fe2+、Cu+等存在时，线粒体膜在其作用下，邻近的H2O2会分解为OH-，使膜肿胀甚至消失。
本发明的细胞保存液中除了包含能够使细胞保持最佳状态的氯化钠水溶液外，还含有负氢离子类物质，其激活细胞内的自由基清除系统，例如大分子酶促自由基清除系统，例如包含SOD、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷光甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxides，GSH-Px)等的自由基清除系统。另外，负氢离子类物质本身在细胞内还可能具有与小分子抗氧化剂等非酶类清除剂相似的功能，这些小分子抗氧化剂包括维生素A和E、抗坏血酸、β-胡萝卜素、尿酸、次氯酸、微量元素Fe、Se、Mn、Cu、Zn等。当脂质过氧化反应链遇到SOD，维生素A、E等抗氧化物后就会终止，从而能够实现长时间保持细胞活性，防止其功能下降的目的。
如本文中所使用的术语“氯化钠水溶液”，是指氯化钠在去离子水中溶解后得到的水溶液。本发明中可使用任何浓度的氯化钠水溶液，只要能够保持细胞的所需的活性或功能即可。优选地，所述浓度可为0.5g/ml至1.5g/ml，优选0.6g/ml至1.0g/ml，从保持细胞与周围环境等渗性的观点，在人细胞的情况下特别优选氯化钠水溶液的浓度为0.9g/ml。本文中，本领域内已知氯化钠的浓度单位g/ml也可表示为％，在本文中两种单位可互换使用，而没有任何区别。另外，需要说明的是0.9g/ml氯化钠水溶液在本领域内通常还称作生理盐水。
如本文中所使用的术语“负氢离子类物质”，是指负氢离子以及能够在细胞保存条件下，例如0至4℃温度下产生负氢离子的任何物质。负氢离子也可表示为H-，是指形成带一个单位负电荷的阴离子氢，也称为氢负离子或氢化物离子。本发明可使用任何形式的负氢离子类物质，例如商购可得的含有负氢离子类物质的水溶液或通过已知设备例如中国专利申请号为CN201320780513.X中所述的装置，依据其说明书制备的负氢离子类物质。
另外，本发明的细胞保存液中负氢离子的浓度没有任何限定，然而，从细胞保存效果方面考虑，优选100ppb H-至1000ppb H-，特别优选150ppb H-至800ppb H-，最优选200ppb H-至600ppb H-。本发明中的负氢离子的浓度可通过本领域内公知的测量手段测得。例如通过已知设备例如“便携式溶存水素计”(ポ一夕ブル溶存水素计)ENH-1000，根据其说明书记载的标准操作步骤测得。
如本文所使用的术语“细胞”，具有本领域内公知的含义，包含任何类型或来源的细胞。本文中优选动物细胞，例如，鸟类细胞、哺乳动物细胞，特别优选人细胞，特别优选人干细胞，例如，人间充质干细胞、人单个核细胞、人树突状细胞、人细胞因子诱导的杀伤细胞、人造血干细胞、人肝干细胞和人脂肪干细胞，最优选人间充质干细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞。另外，本发明的细胞可以是直接来源于组织、器官等的天然细胞，也可以是培养细胞，例如，在培养基条件下培养的细胞。此外，还可以是人工处理的细胞，例如杂交瘤细胞等。
如本文所使用的术语“细胞活性”是指细胞发挥其正常功能所需的性质、性能等，并且可通过测量或观察而确定。本发明的细胞保存液中可使用上述细胞中的任一种或多种的组合。
另外，本发明的细胞保存液中的细胞浓度不特别限定，然而如果细胞浓度过低，则会不利地影响保存效率，浪费保存液。另一方面，如果细胞浓度过高，则会可能会影响到细胞的实际使用，在细胞使用时引起额外的操作步骤。从保存液中保存的细胞直接使用，例如，直接输回体内，例如活体内的观点，所述细胞浓度可为1.0×103/ml至1.0×1010/ml，优选1.0×104/ml至1.0×108/ml，在直接输回人体的情况下，特别优选1.0×105/ml至1.0×106/ml，最优选2.0×105/ml至2.0×106/ml。关于细胞浓度单位，除非另有说明，则否指个/ml。例如1.0×103时，指每ml液体中细胞的个数为1.0×103个。
关于细胞浓度的测定方法，可使用例如Countess自动细胞计数仪通过台盼蓝对死细胞进行染色，结合图像分析技术，测量细胞存活率和细胞计数。具体操作可参见其使用说明书，包括将细胞样本与台盼蓝混合，滴加于Countess细胞计数板内。相机将采集细胞计数板上的细胞图像，图像分析软件则自动对其进行分析，通过台盼蓝染料检测细胞数量和存活率。另外，本计数仪还可提供下列数据：活细胞浓度/mL，死细胞浓度/mL，总的细胞浓度/mL，存活率(活细胞数与全部细胞数的百分比)，平均直径，细胞图像图示数据。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。另外，需要说明的是，除非另作说明，否则本文中使用的实验材料、试剂、仪器、计数方法等一般方法均在本领域内通常使用的手段。
实验例1本发明的细胞保存液的配制
试验步骤
1.0.9％含负H离子生理盐水配制：无菌环境下取100ml 3％NaCl，用适宜量负H离子水(本实验室根据说明书中所述装置自制)稀释至0.9％，定容。
2.将定容好的含负H离子水进行革兰氏检测，内毒素检测，无菌、支原体检测，确认没有内毒素、无菌和支原体污染。
实验例2细胞保存液中负氢离子浓度的选择(600ppb H-，400ppb H-，200ppb H-)
1.根据上述实验例1中所述的方法，分别配制负氢离子浓度分别为600ppb H-，400ppb H-，200ppb H-的细胞保存液。
2.MSC、CIK细胞的制备
本实验中使用的MSC、CIK(本实验室由脐带组织制备的间充质干细胞、脐血来源的细胞因子诱导的杀伤性T细胞)。另外，本文中PBS具有本领域内的通常的含义，本实验例中PBS的组成优选为KCl0.2g/L；KH2PO40.2g/L；NaCl8g/L；Na2HPO41.15g/L；Ph7.2-7.4；渗透压275+15。
1)收集培养的MSC、CIK细胞，调整细胞密度至1×105/ml。吸出培养液，往培养瓶内加入5ml PBS液，轻轻晃动，弃PBS。
2)加入胰酶(迈晨科技，货号：CC012)2ml，37℃3min，或者室温，显微镜观察细胞全部悬浮，加入F002(国产血清来自Solarbio，货号：f8260，)0.5ml，终止消化。
3)吸取细胞悬液放入15ml离心管，加入7.5ml PBS洗涤培养瓶，收集洗涤液至15ml离心管中，离心1000rpm5min。
4)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm5min洗涤细胞。
5)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm5min洗涤细胞。
6)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞吸取一滴细胞计数，离心1000rpm 5min洗涤细胞。
7)弃PBS液，加入上述配制的负氢离子浓度为-600，-400，-200的细胞保存液，以使MSC、CIK的细胞浓度和活性率相同。
8)将上述制备的细胞置于4℃冷藏箱保存。分别在1h、2h、4h、6h、8h后计数活细胞的数量(Countes细胞计数仪，型号：C10281，测出细胞数量值)，并检测细胞活性(Countes细胞计数仪，型号：C10281，测出细胞活性)。
不同保存液中活细胞的变化情况如下表1所示。
表1.负氢离子浓度的选择
表1(续)
表1(续)
注：每次样本的活性检测都是取少量样本在计数板上再上机检测，检测时只计算该次样本的活细胞浓度与总细胞浓度，再然后获得细胞活性等数据，所以每次测量时都只和该次样本本身比较，得出相应数据。
如表1所示，在负氢离子浓度为200ppb H-、400ppb H-和600ppb H-的情况下，活细胞的存活率以及细胞活性均表现良好。
实验例3本发明的细胞水溶液对不同浓度的脐带间充质干细胞及CIK细胞活性的影响。
选用负氢离子浓度为600ppb H-的生理盐水作为本实验中使用的细胞保存液，并选用不含负氢离子的生理盐水作为对照，分析本发明的细胞保存液对不同细胞浓度的影响。具体结果如下表2所示。
表2.细胞保存液对不同细胞浓度的影响。
表2(续)
表2(续)
如表2所示，细胞保存液无论是对不同浓度的CIK还是对不同浓度的MSC细胞均显示出优异的存活率。而当与相同条件下但不含负氢离子的生理盐水相比较时，本发明的细胞保存液显示出明显更加优异的存活率。
实验例4负氢离子生理盐水对脐带间充质干细胞及CIK细胞聚集的影响。
具体实验步骤如下：
1.含细胞的保存液的制备
1)收集MSC、CIK细胞，调整细胞密度至105/ml。吸出培养液，往培养瓶内加入5ml PBS液，轻轻晃动，弃PBS。
2)加入胰酶(迈晨科技，货号：CC012)2ml，37℃3min，或者室温，显微镜观察细胞全部悬浮，加入F002(Solarbio，货号：f8260)0.5ml，终止消化。
3)吸取细胞悬液放入15ml离心管，加入7.5ml PBS洗涤培养瓶，收集洗涤液至15ml离心管中，离心1000rpm 5min。
4)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm 5min洗涤细胞。
5)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞，1000rpm 5min洗涤细胞。
6)离心后，弃上清，加入PBS液10ml，重悬细胞吸取一滴细胞计数，离心1000rpm 5min洗涤细胞。
7)弃PBS液，根据所需细胞浓度加入适量实验例1中制备的细胞保存液，PBS溶液或0.9％生理盐水，并轻轻混匀。
2.细胞聚集情况的观察
将上述1中制备的细胞置于4℃冷藏箱保存。分别在1h、2h、4h、6h、8h和12h后观测细胞聚集情况。
细胞聚集情况的分析基于以下标准，即当在放大×40倍的显微镜(奥林巴斯，货号CKX-41)下观察时，在10μm×10μm视野中计数出现5个以上的细胞连接到一起的聚集情况，其中：
-：表示没有观察到细胞聚集成团。
+：表示观察到1个以上至2个以下的细胞聚团。
++：表示观察到3个以上至5个以下的细胞聚集成团。
+++：表示观察到大于5个细胞聚集成团。
结果如下表3所示。
表3.细胞聚集情况
由表3可以看出当使用不含负氢离子的生理盐水时，随着时间的推移，细胞出现聚集情况，MSC细胞甚至当两小时时开始出现较为严重的聚集。另一方面，在本发明的细胞保存液的情况中，无论是CIK细胞还是MSC细胞甚至在12小时后也未出现细胞聚集现象。上述结果表明，本发明的细胞保存液具有优异的抑制细胞聚集的效果。
实验例5细胞表型流式分析
为了分析本发明的细胞保存液对细胞功能的影响，本实验采用表型流式分析来验证细胞特异性的标记，进而说明细胞是否具有良好的成熟度，是否可以发挥相关的功能。
具体步骤如下：
1.人脐带间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定。
(1)在体外，将人脐带用磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至约1mm3的小块，加入原料重量0.1％的胶原酶(sigma，USA)，37℃消化45分钟；
(2)加入原料重量0.125％的胰酶(Sigma，USA)37℃消化45分钟，在消化过程中用转子搅拌，加入适量的血清终止胰酶的作用；
(3)消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；
(4)将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释，消化液与磷酸缓冲液比例为1∶10；
(5)离心，获得细胞，离心机的转速为1500rpm/min离心20min，获得细胞；
(6)细胞按1～2×103cm2接种于培养瓶中，用含DMEM-LG/F12培养基(Sigma，USA)，5％胎牛血清(FCS)(Gibco BRL，USA)的培养基，置37℃，5％CO2培养箱培养，4-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。待细胞80％融合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代。
(7)贴壁细胞常规消化后以FITC标记的CD14、CD34、CD44、CD45和HLA-DR，PE标记的CD19、CD90、CD73、CD105，抗体及其相应同型对照标记细胞，流式细胞仪(FACA Calibur型，USA)检测。以上荧光标记抗体均购自BD公司(USA)。
2.间充质干细胞及CIK细胞在保存液中保存24小时后免疫表型分析。具体步骤如下：
1)每管加入一定量抗体(如抗体带有荧光标记，则需避光操作)，对照管内加同型对照抗体。4℃，孵育30min，此步开始避光操作。
2)每管加1mL磷酸缓冲液(PBS)洗涤2遍，每次离心：1000rpm，5min。
5)加流式固定液重悬细胞，200ul/管。4℃避光可以保存1周。
6)测试前转移到流式检测管内(避光保存)。
5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样)。
6)报告结果。
3.实验结果：
结果如图3所示。脐带间充质干细胞的流式免疫表型检测结果显示：脐带间充质干细胞高表达CD90、CD44、CD73和CD105，不表达CD14、D34、CD34、CD19和HLA-DR。而CD90、CD44、CD73和CD105表明细胞具有高的成熟度。
另外，根据图4也可明显看出CIK细胞也具有高成熟度。
实验例6细胞保存液对细胞活性和活细胞保持率的影响
为了分析本发明的细胞保存液对细胞活性和活细胞保持率的影响，而进行了本实验。
实验步骤：具体操作和实验设计参见上述实验例1-至3。实验条件如图4-8中的表格所示。
实验结果：
如图4-8的所示。由图4-8可以看出，本发明的细胞保存液与PBS或不含负氢离子的生理盐水相比均表现出显著优异的细胞活性和细胞存活率。
实验例7本发明的细胞保存液与其它保存液(PBS/生理盐水等)的保存细胞的效果比较
具体操作步骤如实验例1-3所示。
具体实验条件及实验结果如下表4和5所示。
表4.间充质干细胞的活细胞数量随时间的变化情况
表5.CIK细胞活细胞数量随时间的变化情况
尽管参考其具体实施方案已详细描述本发明，但是对于本领域熟练技术人员来说，其中在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变和改进将是显而易见的。
Claims (9)
1.一种细胞保存液，其包含0.5g/ml至1.5g/ml的氯化钠水溶液，其特征在于还包含在细胞保存条件下存在的负氢离子类物质。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液进一步包含要保存的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞保存液，其中所述氯化钠水溶液的浓度为0.9g/ml。
4.根据权利要求1或2所述的细胞保存液，其中所述负氢离子类物质的浓度为200ppb H-至600ppb H-之间。
5.根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中细胞的浓度为2.0×105/ml至2.0×106/ml之间。
6.根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中的细胞选自间充质干细胞、单个核细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、造血干细胞、肝干细胞和脂肪干细胞组成的组中的至少之一。
7.根据权利要求2或3所述的细胞保存液，其中所述细胞保存液中的细胞选自间充质干细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞组成的组中的至少之一。
8.一种保存细胞的方法，其中使用权利要求1至7中任一项所述的细胞保存液。
9.根据权利要求1至7任一项所述的细胞保存液在保存细胞中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410587471.7A CN105875588A (zh) | 2014-10-29 | 2014-10-29 | 一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410587471.7A CN105875588A (zh) | 2014-10-29 | 2014-10-29 | 一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105875588A true CN105875588A (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=57001567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410587471.7A Pending CN105875588A (zh) | 2014-10-29 | 2014-10-29 | 一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105875588A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107624753A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-26 | 北京瑞格瑞特生物科技有限公司 | 一种细胞低氧稳压运输方法 |
| CN108088781A (zh) * | 2016-11-23 | 2018-05-29 | 上海迈泰君奥生物技术有限公司 | 一种用于细胞计数仪的试剂组合 |
| JP2019193627A (ja) * | 2018-04-25 | 2019-11-07 | セルトラスト・アニマル・セラピューティクス株式会社 | 細胞の保存方法および細胞懸濁液 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1921870A (zh) * | 2004-02-27 | 2007-02-28 | 日本多宁股份有限公司 | 人工生理盐溶液及其制备方法 |
-
2014
- 2014-10-29 CN CN201410587471.7A patent/CN105875588A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1921870A (zh) * | 2004-02-27 | 2007-02-28 | 日本多宁股份有限公司 | 人工生理盐溶液及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张智敏: "《无机合成化学及技术》", 31 January 2002, 中国建材工业出版社 * |
| 李朝略 等: "《化学析疑》", 30 April 1987, 湖南科学技术出版社 * |
| 樊行雪 等: "《大学化学原理及应用 下》", 31 July 2007, 化学工业出版社 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108088781A (zh) * | 2016-11-23 | 2018-05-29 | 上海迈泰君奥生物技术有限公司 | 一种用于细胞计数仪的试剂组合 |
| CN107624753A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-26 | 北京瑞格瑞特生物科技有限公司 | 一种细胞低氧稳压运输方法 |
| JP2019193627A (ja) * | 2018-04-25 | 2019-11-07 | セルトラスト・アニマル・セラピューティクス株式会社 | 細胞の保存方法および細胞懸濁液 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104719282B (zh) | 一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
| ES2588438T3 (es) | Materiales y métodos para la recogida hipotérmica de sangre entera | |
| Tarin et al. | Metastatic colonization potential of primary tumour cells in mice | |
| CN102539736B (zh) | 一种cd106阳性细胞、其鉴定、制备方法及应用 | |
| JP7401865B2 (ja) | 機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物 | |
| CN104450616A (zh) | 一种dc细胞与cik细胞的共培养方法 | |
| CN101919380A (zh) | 一种改进的间充质干细胞保护液及其用途 | |
| CN102365933B (zh) | 一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用 | |
| CN104026118A (zh) | 一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用 | |
| CA2990348C (fr) | Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique | |
| TW202020144A (zh) | 源自齒髓的細胞之製造方法 | |
| CN101919378B (zh) | 一种直接静脉应用的间充质干细胞冻存液 | |
| WO2013042095A1 (en) | Platelet lysate, uses and method for the preparation thereof | |
| CN107912421A (zh) | 一种用于骨髓间充质干细胞移植的干细胞保存液 | |
| CN105875588A (zh) | 一种细胞保存液及其用途和保存细胞的方法 | |
| CN103146648A (zh) | 一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基 | |
| CN105211052B (zh) | 一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法 | |
| CN107410288B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的储存液 | |
| CN106614524B (zh) | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 | |
| CN113973805B (zh) | 细胞冻存试剂盒及其使用方法 | |
| Thakur et al. | Characterization of viability and proliferation of alginate‐poly‐L‐lysine–alginate encapsulated myoblasts using flow cytometry | |
| EP2859092A1 (en) | Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 | |
| CN105963699B (zh) | Fats作为黑色素瘤免疫治疗的靶点及应用 | |
| CN115281184B (zh) | 一种间充质干细胞复合冻存液及其制备方法和应用 | |
| CN106520805A (zh) | 急性淋巴细胞白血病小鼠模型及建模方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: YIDA INTERNATIONAL BIOTECHNOLOGY (BEIJING) CO., LTD. Document name: Notification of Publication of the Application for Invention |
|
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: YIDA INTERNATIONAL BIOTECHNOLOGY (BEIJING) CO., LTD. Document name: Notification of Patent Invention Entering into Substantive Examination Stage |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: YIDA INTERNATIONAL BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Document name: the First Notification of an Office Action |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Wu Yuyu Document name: Deemed as a notice of withdrawal |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160824 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |