CN1921870A - 人工生理盐溶液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种活性氢反应值为0.01－1、pH为4－7.9、渗透压为260mOsm/L－2560mOsm/L的人工生理盐溶液及其生产方法。因此提供了一种新颖的具有活性氧消除能力和抗炎活性的人工生理盐溶液，该溶液适用于各种用途，例如作为器官清洗液(如，眼和鼻清洗液)、人工输注液、人工羊水、保护液和细胞/组织培养液，还提供了其制备方法。

Description

人工生理盐溶液及其制备方法
技术领域
本发明涉及人工生理盐溶液及其制备方法。
背景技术
近年来，包括使用隐形眼镜的人在内的患有例如干眼、异物所致奇怪或不舒服感、眼疲劳、眼痒、眨眼增多、眼充血等症状的人数逐渐增加。眼干是一种因多种原因导致覆盖眼表面并起驱除环境病原体和营养隔膜功能的泪水量减少，从而妨碍泪水覆盖眼表面的功能的状况。结果导致上述症状出现：干眼、异物所致奇怪或不舒服感、眼疲劳、眼痒、眨眼增多、眼充血等。就眼干的原因而言，可能是因衰老、结膜炎、维生素A缺乏症、斯耶格伦综合征、史-约综合征、风湿病、糖尿病、药物副作用等导致泪腺分泌功能降低，从而导致分泌不足型干眼。此外，近年来，佩戴隐形眼镜、在VDT(可视显示终端)上工作时眨眼次数少等导致泪液过度蒸发造成了过度蒸发型干眼。
就干眼的常规补救方法而言，基于在泪液分泌和蒸发之间维持平衡的基础概念，使用了建议人们关注房间湿度和经常眨眼的生活方式的方法、经常使用人工泪液滴眼剂的方法、通过佩戴眼罩抑制泪液蒸发的方法和闭锁泪点的方法。近年来，已证实在患有干眼的患者的泪液层中发现有氧化反应或炎性反应发生(参见，例如Albert J.Augustin等，“干眼患者泪液中的氧化反应”(Oxidative Reaction in the TearFluid of Patients Suffering from Dry Eyes)，Graefe’s Archive for Clinical andExperimental Ophthalmology，Springer，第233卷，第11期，1995，第694-698页(非专利文献1))。因此，人们关注导致干眼或干眼所致的炎症的变化并试图通过应用滴眼剂和类固醇来缓解干眼的症状(参见，例如Avni M.Avunduk等，“局部皮质类固醇和非类固醇抗炎性滴剂对干眼患者效力的比较：临床和免疫细胞化学的研究”(The Comparison of Efficacies of Topical Corticosteriods and NonsteriodalAnti-inflammatory Drops on Dry Eye Patients：A Clinical and Immunocytochemicalstudy)，American Journal of Ophthalmology，Elsevier Science，第136卷，第4期，2003年10月，第593-602页(非专利文献2))。
然而在现代社会，人们不得不努力工作，基于在泪液分泌和蒸发之间维持平衡的基础概念的补救方法，即使是对生活方式的建议也难以充分贯彻，因此其作用基本上不可预期。此外，就使用类固醇的滴眼剂而言，虽然可保证其作用，但频繁使用后效果降低并且停用时也肯定会发生严重的副作用，例如症状恢复。因此，需要开发一种适用于清洗眼睛或用作滴眼剂并能抑制氧化反应和炎性反应而不发生副作用的新组合物。
此外，已知有为缓解过敏症状，例如花粉热而用于清洗鼻腔的常规清洗液。就鼻腔清洗液而言，所用的常规生理盐溶液等不能抑制还原反应或炎性反应。因此，与上述用于眼清洗液的场合相同，现在需要开发一种能充分抑制氧化反应和炎性反应的鼻腔清洗液。
近年来，例如在医疗现场频繁使用人工输注液，如总氨基酸输注液、高卡路里输注液用的糖/电解质/氨基酸液、电解质输注液、高卡路里输注液用的糖/电解质液、腹膜内透析液和人工肾脏使用的透析液。使用这种人工输注液的目的是术后恢复、脱水后的补水、维持生命等，在这些情况中，身体内部因可能的活性氧导致的氧化而遭破坏。此外，除了人工输注液之外，在分娩场合用于保护婴儿生命的人工羊水和保护液，以及在例如心脏手术中使用的心肌保护溶液也可能发生活性氧以相同方式通过氧化导致破坏作用的问题。因此，虽然需要能抑制体内氧化反应和炎性反应的人工输注液、人工羊水或保护液，现在还未开发出含有能抵御氧化所致破坏作用的物质的人工输注液、人工羊水或保护液。
此外，含有接近人体体液的组成从而不有害地影响所培养的细胞或组织和含有能充分防止氧化所致破坏作用的保护性物质的细胞/组织培养溶液现在还未制备出。与人体内的细胞/组织不同，使用细胞/组织培养溶液培养的细胞和组织更易于人工处理，因此与人体内的细胞/组织相比，更易遭受氧化作用，所以可以说开发一种能防止这种氧化所致的破坏作用的新细胞/组织培养溶液特别有用。
非专利文献1：Albert J.Augustin等，“干眼患者泪液中的氧化反应”(OxidativeReaction in the Tear Fluid of Patients Suffering from Dry Eyes)，Graefe’s Archive forClinical and Experimental Ophthalmology，Springer，第233卷，第11期，1995，第694-698页
非专利文献2：Avni M.Avunduk等，“局部皮质类固醇和非类固醇抗炎性滴剂对干眼患者效力的比较：临床和免疫细胞化学的研究”(The Comparison of Efficaciesof Topical Corticosteriods and Nonsteriodal Anti-inflammatory Drops on Dry EyePatients：A Clinical and Immunocytochemical study)，American Journal ofOphthalmology，Elsevier Science，第136卷，第4期，2003年10月，第593-602页
发明内容
本发明所解决的问题
本发明是为了解决上述问题，其目的之一是提供一种新的人工生理盐溶液及其制备方法，所述溶液具有活性氧消除活性和抗炎症作用并能用于多种应用领域，例如器官清洗液(眼清洗液、鼻腔清洗液等)、人工输注液、人工羊水、保护液和细胞/组织培养溶液。
解决问题的方法
本发明的人工生理盐溶液的特征在于活性氢反应值是0.01-1，pH是4.0-7.9(优选6.0-7.9)，等渗压是260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)。
本发明的人工生理盐溶液优选包含钠离子、钾离子和氯化物离子。
本发明的人工生理盐溶液优选包含不高于200mEq/L的钠离子。
本发明的人工生理盐溶液优选包含不高于100mEq/L的钾离子。
本发明的人工生理盐溶液优选包含不高于200mEq/L的氯化物离子。
此外，本发明的人工生理盐溶液优选含有用于调整离子平衡的电解还原水。
此外，本发明的人工生理盐溶液的氧化-还原势能优选为-800mV-+200mV。
本发明的人工生理盐溶液适用于以下应用领域(a)-(c)。
(a)器官清洗液
(b)人工输注液、人工羊水或保护液
(c)细胞/组织培养溶液
本发明也提供制备人工生理盐溶液的方法，其特征在于将电解还原水调整为活性氢反应值是0.01-1，pH是4.0-7.9(优选6.0-7.9)，等渗压是260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)。
本发明的人工生理盐溶液的制备方法优选还包括通过加入氯化钠和/或氯化钾来调整电解还原水中离子平衡的步
发明的效果
本发明的人工生理盐溶液表现出活性氧消除活性和抑制作为炎性细胞的多形核白细胞，特别是嗜中性白细胞的趋化活性和迁移活性的功能，并且对所施用的器官、组织和细胞不会产生负面影响，因此适合在多种应用领域中用作人工制备的生理盐溶液。
例如，除了使用类固醇的以外，与应用于眼睛的常规清洗液相比，本发明的人工生理盐溶液具有强的活性氧消除活性和抗炎症作用，因此与现有技术的相比，当其用于眼清洗液中时，清洗或应用较少次数的滴眼剂就可获得足够的效果。所以，即使人们处于不得不忙于工作的现代社会，也可预期实现对眼睛的基本保护作用。此外，与使用含有类固醇的常规溶液不同，本发明的人工生理盐溶液可防止眼睛发炎并防止眼组织受活性氧或产生活性氧的物质的破坏作用而无不利副作用，因此可获得缓解例如干眼、异物所致奇怪或不舒服感、眼疲劳、眼痒、眨眼增多、眼充血等症状的效果。
此外，当本发明的人工生理盐溶液用作鼻腔清洗液时，人工生理盐溶液由于具有抗氧化和抗炎症的作用，可获得以下效果：除去鼻腔内的灰尘、各种微生物、花粉等；适当清洗鼻腔内部；此外可抑制过敏症状，例如花粉热而不导致不良副作用。
此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，可获得以下效果：例如细胞、组织、器官和婴儿免氧化破坏，从而恢复更快。
此外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，细胞和组织不易受氧化破坏并可能在接近人体内的环境中进行使用所培养的细胞或组织等实验。此外，因为抑制了氧的破坏作用，特别是当本发明的人工生理盐溶液作为细胞/组织培养液用于初代培养细胞(应用于细胞系之前所培养的细胞)时，所获得的明显效果是延长了初代培养细胞的生命周期。
附图说明
图1显示了本发明的人工生理盐溶液抑制嗜中性白细胞的迁移/趋化活性的活性。
本发明的最佳实施方式
本发明的人工生理盐溶液的特征在于具有在各自特定范围内的活性氢反应值、pH和渗透压。本发明的人工生理盐溶液通过抑制下文所述活性氧消除活性、作为炎性细胞的多形核白细胞，特别是嗜中性白细胞的趋化活性和迁移活性来提供抗炎作用，而对施用人工生理盐溶液的器官、组织和细胞无有害影响。本文“人工生理盐溶液”指人工制备、具有类似于人体内的体液组成的生理盐溶液。此外，“类似于体液的组成”指其组成根据具体应用而分别接近于器官、组织或细胞中体液的组成，从而使得当该人工生理盐溶液施用于器官、组织或细胞时不损害器官、组织或细胞。具体地说，广泛的应用领域，例如器官清洗液(例如，眼清洗液(包括滴眼剂)和鼻腔清洗液)、人工输注液、人工羊水、保护液(例如，用于心肌的保护液)、细胞/组织培养液等均期待本发明的人工生理盐溶液。
本发明的人工生理盐溶液的活性氢反应值(氢基反应值)为0.01-1。当活性氢反应值小于0.01或大于1时，活性氧消除活性和抗炎症作用降低或丧失，因此不能实现本发明的目的。虽然只要本发明的人工生理盐溶液的活性氢反应值在上述范围内就不特别受限制，其优选在0.1-1，更优选在0.5-1之间。
在本文中，本发明的人工生理盐溶液的活性氢反应值根据本申请人在日本专利公布号2002-350420中提出的方法检测(本文称为“DBNBS方法”)。具体地说，根据以下方式检测活性氢反应值：
(1)在存在铂黑时将氢气以恒定速率通入在517nm附近有吸收的1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(hydrazyl)(DPPH)溶液，制作显示517nm附近吸收峰的减弱程度和通氢气时间长短之间的相关性图线(制成校验曲线A)。
(2)使不超过100μM的半胱氨酸和DPPH反应，制作显示517nm附近吸收峰的减弱程度和半胱氨酸浓度之间的相关性图线(制成校验曲线B)。
(3)在存在铂黑时将氢气以恒定速率通入在450nm附近有吸收的3，5-二溴-4-亚硝基苯磺酸钠(DBNBS)溶液，制作显示450nm附近吸收峰的减弱程度和活性氢浓度之间相关性的图线(制成校验曲线C)。
(4)向样品(人工生理盐溶液)中加入DBNBS，然后于60℃加热1小时，检测450nm附近的吸收峰，所获得的检测值用作活性氢反应值(氢基反应值)。
本发明的人工生理盐溶液的pH范围是4.0-7.9(优选6.0-7.9)。当pH低于4.0或高于7.9时，施用人工生理盐溶液的器官、组织或细胞中有可能发生不利的作用或功能衰退的风险，本发明的目的无法实现。虽然只要本发明的人工生理盐溶液的pH在上述范围内就不特别受限制，但当例如本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时，其pH优选在6.0-7.7(特别是，当人工生理盐溶液用于清洗眼睛时，pH优选7.3-7.6；当人工生理盐溶液用于清洗鼻腔时，pH优选6.0-7.4)。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，其pH优选为4.0-7.6，更优选为7.1-7.6，最优选为7.3-7.5。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，其pH优选6.9-7.5，更优选7.1-7.3。
在本文中，将pH计(Φ260，Beckman，Inc.制造)的pH电极浸入人工生理盐溶液中，从其显示器读数来测定本发明的人工生理盐溶液的pH值。
本发明的人工生理盐溶液的渗透压为260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)。当渗透压低于260mOsm/L或高于2560mOsm/L时，施用人工生理盐溶液的器官、组织或细胞中有可能发生不利的作用或功能衰退的风险，本发明的目的无法实现。虽然只要本发明的人工生理盐溶液的渗透压在上述范围内就不特别受限制，但是其优选为270mOsm/L-315mOsm/L，更优选280mOsm/L-305mOsm/L，例如，当本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，其渗透压优选为270mOsm/L-2560mOsm/L，更优选270mOsm/L-310mOsm/L，最优选280mOsm/L-300mOsm/L。另外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，其渗透压优选为260mOsm/L-310mOsm/L，更优选265mOsm/L-280mOsm/L。
在本文中，根据凝固点降低法的原理使用渗压计(ROEBLING公司制造)测定本发明的人工生理盐溶液的渗透压。
当本发明的人工生理盐溶液的活性氢反应值、pH和渗透压分别处于上述具体范围内时，其提供活性氧消除活性和抑制作为炎性细胞的多形核白细胞，特别是嗜中性白细胞的趋化活性和迁移活性的作用，此外，本发明的人工生理盐溶液不会对所施用的器官、组织或细胞生产不利影响，因此可作为人工制备的生理盐溶液适用于多种应用领域。
在本文中，通过例如芬顿反应法证实了本发明的人工生理盐溶液的活性氧消除活性。芬顿反应法是从活性氧中检测·OH的方法，其中，使用铁作为催化剂从过氧化氢产生·OH，·OH激发发光试剂鲁米诺，利用那时发出的光观察活性氧的还原情况。具体的操作方法是用高度灵敏的化学发光检测仪(CLD-10，Tohoku ElectronicIndustrial Co.，Ltd.制造)。向细胞中加入Tris-盐酸缓冲溶液(pH 7.8)、鲁米诺、DTPA(二亚乙基三胺-N，N，N’，N”，N-五乙酸)、FeSO4和过氧化氢，使得它们的终浓度分别为0.1M、2.5μM、5μM、5μM和50μM，再加入样品(人工生理盐溶液)使总体积调整为2mL，然后检测并确认发光强度的变化。
此外，除上述芬顿反应法以外，可以根据过氧化氢方法或HX-XOD方法测定本发明的人工生理盐溶液的活性氧消除活性。过氧化氢方法从活性氧中检测H2O2，该方法通过除去上述芬顿反应法的反应溶液中混合有DTPA的FeSO4溶液而获得反应溶液，并检测从过氧化氢产生的鲁米诺光。此外，HX-XOD方法从活性氧中检测O2·，该方法使用HX(次黄嘌呤)作为底物，通过XOD(黄嘌呤氧化酶)产生O2·，O2·激发发光试剂CLA(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)并观察那时产生的活性氧的还原。具体地说，根据HX-XOD方法，向CLD-110的细胞中加入磷酸盐缓冲溶液(pH 7.8)、CLA、XOD和HX，使得它们的终浓度分别为0.2μM、1μM、5U/mL和10μM，再加入样品(人工生理盐溶液)使总体积调整为2mL，然后检测发光强度的变化从而确定活性氧消除活性。
此外，根据趋化室方法(chemotaxis chamber method)可确认本发明的人工生理盐溶液吸引炎性细胞(趋化活性和迁移活性)的作用。具体地说，首先使自人血液分离的嗜中性白细胞漂浮于本发明的生理盐溶液中处理一定时间。然后，将趋化因子，例如IL-8或RANTES的溶液放入小室的孔中，在孔上蒙上聚碳酸酯制成(通常提供的孔径略小于嗜中性白细胞)的膜(不含聚乙烯吡咯烷酮)，上述漂浮有嗜中性白细胞的溶液置于该膜之上(的孔中)，使其迁移并经历趋化作用一定时间，用染色溶液，例如Diff-Quick给迁移并经历趋化作用通过膜上的小孔而进入孔的嗜中性白细胞染色并计数，藉此评价该作用。
本发明的人工生理盐溶液优选含有钠离子(Na+)、钾离子(K+)和氯化物离子(Cl-)中的至少一种。这是因为当本发明的人工生理盐溶液不含有钠离子(Na+)、钾离子(K+)和氯化物离子(Cl-)中的至少一种时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的细胞生长停滞，从而有该器官、组织或细胞的功能可能受损或停滞的风险。本发明的优选实施方案的人工生理盐溶液含有钠离子、钾离子和氯化物离子中的至少一种，从而获得维持施用人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能的作用。
当本发明的人工生理盐溶液含有钠离子时，其含量优选不超过200mEq/L。这是因为当钠离子的含量超过200mEq/L时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能有可能发生不良作用或存在衰退的风险。此外，为防止施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能衰退，本发明的人工生理盐溶液中优选含有不低于30mEq/L的钠离子。
如上所述，当本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时，其中钠离子的含量优选不超过200mEq/L，例如优选含量为125mEq/L-165mEq/L，更优选135mEq/L-155mEq/L。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，其中钠离子的含量优选135mEq/L-170mEq/L，更优选145mEq/L-160mEq/L。另外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，其中钠离子的含量优选115mEq/L-155mEq/L，更优选125mEq/L-145mEq/L。
当本发明的人工生理盐溶液含有钾离子时，其含量优选不超过100mEq/L。这是因为当钾离子的含量超过100mEq/L时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能有可能发生不良作用或存在衰退的风险。此外，为防止施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能衰退，本发明的人工生理盐溶液中优选含有不低于1mEq/L的钾离子。
如上所述，当本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时，其中钾离子的含量优选不超过100mEq/L，例如优选含量为10mEq/L-40mEq/L，更优选20mEq/L-30mEq/L。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，其中钾离子的含量优选2mEq/L-10mEq/L，更优选3mEq/L-7mEq/L。另外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，其中钾离子的含量优选1mEq/L-8mEq/L，更优选2mEq/L-6mEq/L。
当本发明的人工生理盐溶液含有氯化物离子时，其含量优选不超过200mEq/L。这是因为当氯化物离子的含量超过200mEa/L时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能有可能发生不良作用或存在衰退的风险。此外，为防止施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能衰退，本发明的人工生理盐溶液中优选含有不低于1mEq/L的钾离子。
如上所述当本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时，其中氯化物离子的含量优选不超过200mEq/L，例如优选含量为110mEq/L-150mEq/L，更优选120mEq/L-140mEq/L。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，其中氯化物离子的含量优选90mEq/L-130mEq/L，更优选100mEq/L-120mEq/L。另外，当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，其中氯化物离子的含量优选80mEq/L-120mEq/L，更优选90mEq/L-110mEq/L。在本文中，本发明的人工生理盐溶液的钠离子、钾离子和氯化物离子的含量用ICP-MS(诱导偶联等离子-质谱仪)(Agilent 7500，Agilent Technologies Corporation制造)检测。
此外，除上述钠离子、钾离子和氯化物离子以外，在不丧失本发明作用的范围内，本发明的人工生理盐溶液可含有的其它组分。这些组分的例子有氨基、葡萄糖、柠檬、钙离子、碳  氢根离子、氢根离子、二氢根离子、葡萄糖、果糖、木糖醇、乙、乳和镁离子。除了这些以外，例如当本发明的人工生理盐溶液用作器官清洗液时，可含有硫  软骨素钠、透明质  等；当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液时，可含有锌、硫、蛋白质、糖、脂质、、铁、、锰、铜、钒、尿胰蛋白  抑制剂(UTI)等；当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，可含有锌、硫、蛋白质、糖、脂质、、铁、、锰、铜、钒、亚硒盐(亚硒钠)、乙醇胺、尿胰蛋白抑制剂(UTI)、血清、血浆、活化素等。
离子平衡优选用本发明的人工生理盐溶液的电解还原水来调节。本文的“电解还原水”是通过电解从负极室产生并富含大量具有高度反应性、原子形式的活性氢的水，其中溶解有电解质的水(矿物质水)被引入由隔膜与正极室隔开的负极室。由于“电解还原水”富含大量具有还原(抗氧化)性能的活性氢而具有抗氧化作用，因此它可用于预防或治疗多种疾病，抑制衰老，此外，除了医学领域外，预期它可用于许多领域，例如食物防腐和清洗半导体。如上所述，可用电解还原水制备上述本发明的人工生理盐溶液，由于即使当活性氧被消除时电解还原水中活性物质的活性组分因其本质而简单地转化为水，所以其优点是无副作用。就生产电解还原水的方法而言，例如已知一种使用电解还原水生产设备(TI-8000，Nihon Trim Co.，Ltd.制造)的方法，下文有关本发明的人工生理盐溶液的生产方法的说明中描述了一种合适的方法。
此外，“调节离子平衡”指调节钠离子和钾离子的含量使得钾离子∶钠离子＝1∶4-1∶8(摩尔比)。这是因为当离子达到平衡，钾离子∶钠离子小于1∶4或超过1∶8时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能易于受损。优选将离子平衡调节至上述范围内的钾离子∶钠离子＝1∶5-1∶7，最优选调节为钾离子∶钠离子＝1∶6。
在本文中，人工生理盐溶液中的离子是否平衡可通过使用ICP-MS(Agilent7500，Agilent Technologies Corporation制造)计算该人工生理盐溶液中所含的钠离子与钾离子的摩尔比来确认。
此外，本发明的人工生理盐溶液的氧化-还原电位(ORP)优选为-800mV至+200mV，更优选为-500mV至+100mV，最优选-400mV至+50mV。这是因为当氧化-还原电位低于-800mV或超过+200mV时，施用该人工生理盐溶液的器官、组织或细胞的功能易于受损。
在本文中，本发明的人工生理盐溶液的氧化-还原电位用氧化-还原电位计(RM-20P，Toa Denpa Kogyo Co.，Ltd.制造)检测。
虽然本发明的人工生理盐溶液可应用于各种领域，但它特别优选用作(a)器官清洗液；(b)人工输注液、人工羊水或保护液和(c)细胞/组织培养液。本文只说明了本发明的人工生理盐溶液特别适用的领域，本发明的人工生理盐溶液适用范围很广，并不局限于这些领域。
(a)用作器官清洗液
用作器官清洗液的例子有眼清洗液(包括滴眼剂)、鼻腔清洗液，此外可用于清洗例如皮肤、耳朵、心脏、肺、肾、肝、肌肉、胰腺、大脑、口腔、腹腔、脾、胆囊、阑尾和消化器官。
(a1)用作眼清洗液(包括滴眼剂)
在眼睛炎症中，局部发炎的部位产生活性氧，此外炎性细胞被吸引到这些部位并产生活性氧，这两种现象导致眼痒或例如眼疲劳等症状以及眼组织破坏。为防止上述活性氧导致的破坏，需要消除活性氧并使炎性细胞难以被吸引至发炎部位。本发明的人工生理盐溶液表现出活性氧消除活性和抑制作为炎性细胞的多形核白细胞，特别是嗜中性白细胞的趋化活性和迁移活性，因此，当本发明的人工生理盐溶液用作清洗眼睛和预防眼病(游泳后，当灰尘或汗水进入眼睛时，当使用隐形眼镜时，在VDT上工作时等)的眼清洗液，以及用作眼睛愈合和手术过程中的清洗液时，由于电解还原水的抗炎症作用使得活性氧或产生活性氧的物质难以破坏眼组织，从而抑制了炎症。结果缓解了干眼、由于异物而导致的奇怪或不舒服的感觉和眼充血等症状。因此，本发明的人工生理盐溶液特别适用于在干眼、使用隐形眼镜、VDT工作导致的干眼、异物导致的奇怪或不舒服感觉、眼疲劳、眼痒、眨眼增加和眼充血时清洗眼睛，以预防活性氧破坏眼组织，用于预防眼病(游泳后，当灰尘或汗水进入眼睛时)或在眼睛愈合及手术过程中使用。在近来对干眼的临床研究中，31.2％的VDT工作者患有干眼，44％的易于患干眼。近年来，VDT工作者的数量逐步增加，实际上许多人患有干眼或相似症状。本发明的人工生理盐溶液可以采用流水线生产以及进行高水平的再现性大规模生产，从而可能为患有干眼或相似症状的人们广泛提供本发明的人工生理盐溶液。
当本发明的人工生理盐溶液用作眼清洗液时，该人工生理盐溶液盛放于，例如5mL-20mL的杯子中，该杯边缘的形状与眼睛吻合，对着眼睛的周围区域挤压边缘并且使用者眨眼以使人工生理盐溶液与眼睛接触从而清洗眼睛。此外，本发明的人工生理盐溶液可以滴眼剂使用，在这种情况中，人工生理盐溶液盛放于常规的滴眼剂容器中，从而使数滴滴眼剂滴入眼睛。当该人工生理盐溶液用于滴眼剂中时，滴眼剂优选一次性包装，而不混合在常规滴眼剂的抗菌剂中。
(a-2)用作鼻腔清洗液
另外，当本发明的人工生理盐溶液用作鼻腔清洗液时，可除去鼻腔内的灰尘、各种微生物、花粉等；可适当清洗鼻腔内部；此外由于该人工生理盐溶液的抗氧化作用和抗炎症作用可抑制过敏症状，例如花粉热而不会导致不良副作用。例如，当本发明的人工生理盐溶液用作鼻腔清洗液时，可盛放于具有喷雾装置的容器内，以提供适合于喷入鼻腔的喷雾形式来适当地清洗鼻腔。
(b)用作人工输注液、人工羊水或保护液
当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液、人工羊水或保护液(例如保护心肌的溶液)时，细胞或组织、器官或婴儿不易受氧化破坏从而恢复更快。当本发明的人工生理盐溶液用作人工输注液时，该人工生理盐溶液可以任何熟知的形式提供，例如盛放于输液袋中。此外，为通过降低输液给药量以预防水肿，人工输注液可采取具有本发明上述范围内的高渗透压的浓溶液(例如其浓度比常规人工生理溶液的高8倍)。当本发明的人工生理盐溶液用作人工羊水时，它可以盛放于合适容器中的形式提供，从而可用，例如导管经阴道注射入早产时患有羊膜破裂或分娩时患有羊水过少症的怀孕妇女的子宫。此外，当本发明的人工生理盐溶液用作保护液时(例如保护心肌的溶液)，该人工生理盐溶液，例如可以盛放于任何熟知的输液袋中的形式提供。
(c)用作细胞/组织培养液
当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，可具有细胞或组织不易受氧化破坏的作用。结果，使采用在接近体内的环境中培养的细胞和组织进行实验成为可能。就可在本发明的人工生理盐溶液中培养的细胞而言，可举出许多熟知的培养细胞，例如初代培养细胞(应用于细胞系之前所培养的细胞)、传代培养细胞和ES细胞。当本发明的人工生理盐溶液用于培养初代培养细胞时，由于抑制了氧化破坏作用，在这些细胞中获得的明显效果是延长了初代培养细胞的生命周期。当本发明的人工生理盐溶液用作细胞/组织培养液时，它可以预先浓缩并盛放于容器中的状态提供，然后在使用时根据应用领域与合适的培养基以合适的所需比例混合来培养细胞/组织。
在不丧失本发明作用的范围内，本发明的人工生理盐溶液可含有许多蛋白质。这些蛋白质的例子有胰岛素、运铁蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、白蛋白和活化素。本发明的人工生理盐溶液中的上述蛋白质的含量优选不超过6.0质量％。这是因为当蛋白质含量超过6.0质量％时，施用人工生理盐溶液的器官或细胞中有可能发生不利的作用或存在功能衰退的风险。
本发明也提供生产上述本发明的人工生理盐溶液的方法。本发明的人工生理盐溶液的生产方法通过调节电解还原水使得活性氢反应值为0.01-1，pH为4.0-7.9(优选6.0-7.9)，渗透压为260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)。
根据本发明的生产方法，首先使用，例如电解还原水生产设备(TI-8000，NihonTrim.，Ltd.制造)获得电解还原水。可通过，例如向原料水(电解前的水)中加入适量电解质，然后电解该水以获得电解还原水。用于制备电解还原水的原料水的例子有超纯水(MilliQ水)、纯水、蒸馏水和自来水，鉴于要应用于人体或活细胞，优选使用超纯水、纯水或蒸馏水作为原料水。
电解质的例子有氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钠、氯化钾和六氯铂酸(hexachloroplatinic acid)，为防止正极产生的次氯酸混入以及次氯酸的产生，这些物质中优选氢氧化钠和/或氢氧化钾。加入原料水中的电解质应使原料水的电导优选不低于100μS/cm，更优选100μS/cm-1000μS/cm。当使用氢氧化钠作为电解质时，为在原料水中得到这种电导，所需电解质的加入量可以是，例如4mg/L-800mg/L、优选10mg/L-300mg/L、更优选50mg/L-200mg/L。
可使用熟知的电解还原水生产设备(优选TI-8000(Nihon Trim.，Ltd.制造))，该设备具有至少一个电解池，电解池中有隔膜隔开的一个负极室和一个正极室，负极室中有一负极，正极室中有一正极。对电解条件没有具体限制，可在通常已知的电解条件下进行。例如，条件可以是电流1A-5A，电压0V-80V，温度4℃-60℃，时间长度1秒-1小时，流动速率0mL/分钟-1500mL/分钟。电解结束后，负极室中产生的水可用作电解还原水。此外，优选提供经RO(反渗透膜)处理后的电解还原水。
根据本发明的人工生理盐溶液的生产方法，调节以此种方式获得的电解还原水使其活性氢反应值、pH和渗透压分别处于上述范围内。例如，可通过稀释或浓缩电解还原水以获得所需的活性氢反应值来调节活性氢反应值。此外，可通过加入缓冲剂(例如，碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠或HEPES)，或通过加入盐酸或氢氧化钠来调节pH。另外，可通过，例如稀释或浓缩电解还原水以获得所需的渗透压来调节渗透压。考虑到它们相互之间的作用，可适当地联用这些技术使得活性氢反应值最终为0.01-1，pH为4.0-7.9(优选6.0-7.9)，渗透压为260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)。
根据本发明的人工生理盐溶液的生产方法，优选还包括通过加入氯化钠和/或氯化钾来调节电解还原水的离子平衡的步骤。具体地说，可通过加入氯化钠和/或氯化钾来调节钠离子和钾离子的含量从而使电解还原水中钾离子∶钠离子＝1∶4-1∶8(摩尔比)。本文使用氯化钠和氯化钾，因为它们不影响pH。
可在调节上述活性氢反应值、pH和渗透压之前或之后进行离子平衡的调节步骤，但优选在调节活性氢反应值、pH和渗透压之前进行，因为这些离子在调节渗透压时也使用。
本发明的人工生理盐溶液的生产方法的所有步骤优选在无菌状态下进行，或在该人工生理盐溶液制备后过滤除菌或用高压釜灭菌。
如上所述，只要活性氢反应值为0.01-1，pH为4.0-7.9(优选6.0-7.9)，渗透压为260mOsm/L-2560mOsm/L(优选260mOsm/L-320mOsm/L)，在本文中，本发明的人工生理盐溶液不限于本发明的上述生产方法。本发明的人工生理盐溶液也可根据，例如以下方法来生产：向水中加入选自铂胶体、钯胶体、钒胶体、铁胶体和硅胶体的氢吸附性/吸附性金属胶体；然后通过利用微波、光辐射等的氢气鼓泡、矿物质溶解、超声波处理、磁化处理、物理生成(physical inheritance)、原子振动来产生溶解氢；再适当地调节活性氢反应值、pH和渗透压，或先将锂、钠或镁加入酸性水中再适当地调节活性氢反应值、pH和渗透压。然而，本发明的人工生理盐溶液优选根据本发明的上述生产方法生产。
下文通过引用实施例来进一步详细描述了本发明，但本发明不限于这些实施例。
<实施例1>
在电解还原水生产设备(TI-8000，Nihon Trim.，Ltd.制造)中电解(电流：5A；温度：20℃；流动速率：1100mL/分钟)0.857mM的NaOH水溶液和0.143mM的KOH水溶液的混合溶液(0.428mL的2N NaOH水溶液和KOH水溶液(0.428mL的2N NaOH水溶液和0.072mL的2N KOH溶解于1升MilliQ水中))。向所产生的电解还原水中加入1.437M NaCl-238mM KCl水溶液以调节渗透压(混合比是NaCl-KCl水溶液∶电解还原水＝1∶9)。然后用1N HCl和0.1N HCl调节pH至7.5。
结果，最终获得的人工生理盐溶液的活性氢反应值为0.06(根据DBNBS方法检测)，pH为7.5(使用pH计(Φ260，Beckmen，Inc.制造)检测)，渗透压为303mOsm/L(使用渗透压力计(ROEBLING公司制造)检测)。该人工生理盐溶液含有145mEq/L的钠离子、24mEq/L的钾离子和170mEq/L的氯化物离子(分别使用ICP-MS(Agilent 7500，Agilent Technologies Corporation制造)检测)，氧化-还原电位是-100mV(用氧化-还原电位计(RM-20P，Toa Denpa Kogyo Co.，Ltd.制造)检测)。
<比较实施例1>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是用蒸馏水代替电解还原水。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为0，pH为7.5，渗透压为303mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为145mEq/L、钾离子含量为24mEq/L、氯化物离子含量为170mEq/L、氧化-还原电位是+350mV。
<比较实施例2>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是将实施例1所制备的电解还原水浓缩至其原始浓度的5倍来代替原始的电解还原水使用。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为1.8，pH为7.6，渗透压为303mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为145mEq/L、钾离子含量为24mEq/L、氯化物离子含量为180mEq/L、氧化-还原电位是-150mV。
<比较实施例3>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是通过加入1N的HCl将实施例1所制备的电解还原水的pH调节为5.5。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为0.06，pH为5.5，渗透压为303mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为145mEq/L、钾离子含量为24mEq/L、氯化物离子含量为200mEq/L、氧化-还原电位是-50mV。
<比较实施例4>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是通过加入1N的HCl将实施例1所制备的电解还原水的pH调节为8.5。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为0.06，pH为8.5，渗透压为304mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为145mEq/L、钾离子含量为24mEq/L、氯化物离子含量为180mEq/L、氧化-还原电位是-100mV。
<比较实施例5>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是在调节渗透压时将1.437M NaCl-238mM KCl水溶液混合入电解还原水(混合比是NaCl-KCl水溶液∶电解还原水＝0.8∶9.2)。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为0.06，pH为7.5，渗透压为240mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为115mEq/L、钾离子含量为19mEq/L、氯化物离子含量为135mEq/L、氧化-还原电位是-50mV。
<比较实施例6>
用与实施例1所述相同的方式制备人工生理盐溶液，不同之处是在调节渗透压时将1.437M NaCl-238mM KCl水溶液混合入电解还原水(混合比是NaCl-KCl水溶液∶电解还原水＝1.2∶8.8)。所得的人工生理盐溶液以相同于实施例1的方式检测，发现活性氢反应值为0.06，pH为7.5，渗透压为360mOsm/L。此外，以相同于实施例1的方式检测的钠离子含量为175mEq/L、钾离子含量为30mEq/L、氯化物离子含量为205mEq/L、氧化-还原电位是-50mV。
<评价测试1>
活性氧消除活性的评价测试
根据过氧化氢法，利用过氧化氢产生的鲁米诺发光计算实施例1和比较实施例1-6的人工生理盐溶液的活性氧的检测值(cpm)。结果示于表1。
表1
 实施例1   比较实施例1   比较实施例2   比较实施例3   比较实施例4   比较实施例5   比较实施例6
 活性氢反应值  0.06   0   1.8   0.06   0.06   0.06   0.06
 pH  7.5   7.5   7.6   5.5   8.5   7.5   7.5
 渗透压(mOsm/L)  303   303   303   303   304   240   360
 Na+(mEq/L)  145   145   145   145   145   115   175
 K+(mEq/L)  24   24   24   24   24   19   20
 Cl-(mEq/L)  170   170   180   200   180   135   205
 氧化-还原电位(Mv)  -100   +350   -150   -50   -100   -50   -50
 评价测试1(活性氧的检测值(cpm))  597979±34903   1917063±59565   683433±22323   614453±32239   625025±89892   619432±23898   634282±45292
 评价测试2(迁移细胞数(当IL-8是100ng/ml时))  95±21   180±23   135±15   -   -   -   -
 评价测试2(存活率(％))  98   98   97   60   49   47   39
 评价测试3(使用眼清洗液后的感觉)  良好   良好/尚可   良好/尚可   差   差   差   差
  评价测试4(TBRAS(nmol/ml))   2.7±0.5   4.6±0.5   2.3±0.4   3.1±0.4   -   -   -
  评价测试5(培养24小时后的存活率)   78   41   80   10   2   0   0
<评价测试2>
抑制嗜中性白细胞的迁移活性/趋化活性的作用的评价测试
图1显示了为阐明本发明的人工生理盐溶液是否抑制趋化因子所致的人嗜中性白细胞的迁移活性/趋化活性的实验结果。所用的实验方法是检测炎性细胞的迁移活性/趋化活性的趋化室方法。首先使自人血液分离的嗜中性白细胞漂浮于实施例1的人工生理盐溶液中并处理一定时间。然后，将趋化因子(IL-8、RANTES等)的溶液放入小室的孔中，在孔上放上膜。该膜中的小孔通常略小于嗜中性白细胞。装配好小室后，将漂浮有嗜中性白细胞的溶液置于在膜之上的孔中，并使其迁移并经历趋化作用一定时间。用特定的染色溶液(Diff-Quick)给迁移/经历趋化作用通过膜上的小孔的细胞染色并计数。获得的迁移细胞数(当IL-8是100ng/ml)见表1。
如图1和表1所示，用本发明实施例1的人工生理盐溶液处理的嗜中性白细胞中迁移并经历趋化作用的细胞约为对照(从蒸馏水制备的清洗水)的一半，因此可以看出，本发明的人工生理盐溶液抑制了嗜中性白细胞的迁移/趋化活性。此外，对比较实施例1-6进行了与上述相同的测试，结果，比较实施例1与对照一样未观察到抑制活性。虽然在比较实施例2中观察到了抑制活性，其程度约是实施例中一半。比较实施例3-6的存活率不超过一半，不可能检测。
此外，与上述测试一样，活细胞检测方法同时证实了人工生理盐溶液对嗜中性白细胞的作用。具体地说，活细胞检测方法使用台盼蓝测试。活细胞将台盼蓝(蓝色素)驱除至胞外从而未被染色，而死细胞无此作用从而被染色。台盼蓝测试是通过相差显微镜计数染色细胞和非染色细胞数并计算存活率((非染色细胞数/(染色细胞数+非染色细胞数))×100(％))的方法。结果见表1。如表1所示，嗜中性白细胞完全未受本发明实施例1的人工生理盐溶液破坏。同时，比较实施例3-6中的存活率不超过一半。因此，发现这种状态下的细胞不适于作迁移测试。
<评价测试3>
评价用作眼清洗液时的感觉
使用实施例1的人工生理盐溶液，在发明人的眼睛上进行眼睛清洗，无不舒服的刺激，洗净后溶液俘获灰尘。此外，根据以下3个水平对10位志愿者以相同方式进行了眼睛清洗并得到相同的评价。
良好：可清洗眼睛并且眼睛中无任何不舒服的刺激感
尚可：可以清洗眼睛，但眼睛中有一些不舒服的刺激感，或者虽然眼睛中没有不舒服的刺激感，但不能清洗眼睛
差：眼睛中有不舒服的刺激感并且不能清洗眼睛
结果见表1。如表1所示，所有的志愿者得出以下结论：可清洗眼睛并且眼睛中无不舒服的刺激感。结果可以看出本发明的人工生理盐溶液具有清洗眼睛的作用。同时，比较实施例1和2的一半评价良好，一半评价尚可，故而评价不一致。比较实施例3-6的所有评价是差，眼睛中有不舒服的刺激感。
<评价测试4>
作为人工输注液的评价
自电解还原水制备的人工生理盐溶液作为输注液连续给予用FNA(次氮基三乙酸铁)施加氧化应力的大鼠的静脉并评价抵御氧化应力的改善效果。TBARS(硫代巴比妥酸-反应活性物质)用作氧化应力的指示剂。该物质用于检测丙二醛(malnodialdehyde)或烷基醛与硫代巴比妥酸反应产生的红色物质，而所述丙二醛或烷基醛通过不饱和脂肪酸的过氧化反应产生的过氧化脂质的分解反应、糖的分解反应或核酸碱基的分解反应产生。
首先，为进行该测试，将6周龄的SD雄性大鼠分为4组((1)用FNA处理0小时，(2)用FNA处理6小时/给予实施例1的人工生理盐溶液，(3)用FNA处理6小时/给予比较实施例1的人工生理盐溶液，(4)用FNA处理6小时/给予比较实施例2的人工生理盐溶液)。采血前3天，在每只大鼠的颈外静脉处连接用于连续给予人工生理盐溶液的导管。连接后，为防止凝结，每天用含500u/ml肝素的生理盐溶液清洗导管。
将FNA施用入腹腔使得每只大鼠具有10mg Fe/kg。然后马上使用11型注射泵(Harvard Apparatus Corporation制造)经导管以流速0.05ml/分钟连续给予各组大鼠实施例1、比较实施例1和比较实施例2的人工生理盐溶液。腹腔内给予FNA 6小时后，通过乙醚麻醉打开腹部区域从动脉采集所有血液。血浆于-80℃冷冻保存直至检测TBARS。使用TBARS试验试剂盒OXLtec(ZeptoMetrix Corporation)根据其使用方法检测大鼠血浆中TBARS的量。结果见表1。
结果为，用FNA处理0小时的TBARS值是1.5+/-0.3nmol/ml；用FNA处理6小时/给予比较实施例1的人工生理盐溶液的值高3.1倍，增至4.6±0.5nmol/ml；而给予实施例1的人工生理盐溶液的值高1.8倍，仅增至2.7±0.5nmol/ml。这表明因FNA所致的氧化应力降低了42％。给予比较实施例2的人工生理盐溶液时，该作用未随电解还原水的浓缩比例增加而增加，TBARS的值高1.5倍，仅增至2.3±0.4nmol/ml。这表明因FNA所致的氧化应力降低了52％。在本文中，上述评价测试2中观察到细胞毒性，因此对比较实施例4-6未作评价测试。
<评价测试5>
作为细胞/组织培养液的作用
自人血液分离的嗜中性白细胞初代培养在本发明的人工生理盐溶液中进行并评价存活率是否增加。在该评价中，自人血液分离的嗜中性白细胞悬浮于实施例1和比较实施例1-6的人工生理盐溶液中，接种入5ml的实验室培养皿，在孵育箱内初代培养24小时(5％CO2，37℃)，根据台盼蓝测试计算存活率。结果见表1。
如表1所示，在培养开始时的存活率为98％，培养24小时后，比较实施例1的存活率降至41％。同时，虽然实施例1的存活率也有所降低，但依然是高的，为78％。这提示实施例1的人工生理盐溶液有助于增加存活率低的初代细胞培养的存活率。此外，虽然比较实施例2未随电解还原水的浓缩比例增加而增加存活率，但其依然维持了高达80％的高存活率。另外，比较实施例3的存活率是10％，比较实施例4的存活率是2％，比较实施例5的存活率是0％，比较实施例6的存活率是0％。

Claims (15)

1.一种人工生理盐溶液，其中活性氢反应值是0.01-1、pH是4-7.9、渗透压是260mOsm/L-2560mOsm/L。
2.如权利要求1所述的人工生理盐溶液，其特征在于，所述pH是6.0-7.9，所述渗透压是260mOsm/L-320mOsm/L。
3.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，含有钠离子、钾离子和氯化物离子。
4.如权利要求3所述的人工生理盐溶液，其特征在于，含有不超过200mEq/L的钠离子。
5.如权利要求3所述的人工生理盐溶液，其特征在于，含有不超过100mEq/L的钾离子。
6.如权利要求3所述的人工生理盐溶液，其特征在于，含有不超过200mEq/L的氯化物离子。
7.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，在电解还原水中调节离子平衡。
8.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，氧化-还原电位是-800mV至+200mV。
9.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，可用作器官清洗液。
10.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，可用作人工输注液、人工羊水或保护液。
11.如权利要求2所述的人工生理盐溶液，其特征在于，可用作细胞/组织培养液。
12.如权利要求1所述的人工生理盐溶液，其特征在于，可用作人工输注液、人工羊水或保护液。
13.一种人工生理盐溶液的生产方法，其特征在于，调节电解还原水，使得活性氢反应值是0.01-1、pH是4-7.9、渗透压是260mOsm/L-2560mOsm/L。
14.一种如权利要求13所述的人工生理盐溶液的生产方法，其特征在于，进行调节以使pH变为6.0-7.9、渗透压变为260mOsm/L-320mOsm/L。
15.一种如权利要求14所述的人工生理盐溶液的生产方法，其特征在于，还包括通过加入氯化钠和/氯化钾来调节电解还原水中的离子平衡。
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