JP3933403B2 - 電解還元水およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電解還元水およびその製造方法、ならびにその用途に関し、特に、生物学的活性に関与する有効量の水素ラジカルを含む電解還元水およびその製造方法、ならびに癌、細菌または酸化ストレスを抑制するためのその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水を電気分解することによって、陽極側および陰極側にそれぞれ電気分解水が得られる。このうち、陰極側において生成される電解還元水（アノード水あるいはアルカリイオン水）は、還元性を有し、生体内の酸化的状態から引き起こされ得る種々の異常や疾患に有利に作用し得ることが期待される。
【０００３】
たとえば、特開平１０−１１８６５３号公報は、ＤＮＡの損傷を防止または抑制することができる電解水素溶存水を得るため、純水中にＮａＣｌを加えてその電気伝導率を１００μＳ以上に調整し、当該水を電気分解して陰極水を取り出すことを開示する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このようにＮａＣｌを溶解させた水を電気分解する方法によると、ＮａＣｌ水溶液の電気分解時に次亜塩素酸や塩素ガスが発生し、これらが電解還元水に溶け込む可能性がある。また、塩素（Ｃｌ2）を含む水道水を電気分解する際にも、次亜塩素酸が生成され、電解還元水に溶け込む可能性がある。次亜塩素酸や塩素ガスは、細胞に有害な作用を及ぼし得るものである。したがって、従来では、還元性を有する電解水が得られたとしても、次亜塩素酸や塩素ガスによる作用により、十分に有用な生理学的効果が得られない可能性があった。
【０００５】
また、電解還元水のもつ活性酸素消去作用やＤＮＡ切断抑制作用は、その中に含まれる還元性物質、たとえば活性水素によるものであると考えられる。しかし、電解還元水中に含まれる還元性物質の量とその生理学的効果との関係は明らかでなかった。
【０００６】
本発明の目的は、次亜塩素酸や塩素の影響が十分に排除され、有用な生理学的活性を有し得る電解還元水およびその製造方法を提供するとともに、当該電解還元水の用途を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明により、電解質を含む一方、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である水の電気分解によって陰極に生成された電解還元水が提供される。当該電解還元水は、以下の特徴を備える。
（ａ）残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満である。
（ｂ）塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である。
（ｃ）１２℃〜１４℃において−５〜−１０００ｍＶの酸化還元電位を有する。
（ｄ）１２℃〜１４℃において７〜１２のｐＨを示する。
（ｅ）１２℃〜１４℃において水素ラジカルを０．０１μＭ〜１０μＭの濃度で含む。
【０００８】
本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａ（１ａｔｍ）において、典型的に０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ、好ましくは０．１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、より好ましくは０．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍの溶存水素を含有し得る。
【０００９】
一方、本発明による電解還元水において、１２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａにおける溶存酸素量は、１０ｐｐｍ以下であることが好ましく、たとえば１ｐｐｍ〜６ｐｐｍであることがより好ましい。
【００１０】
本発明による電解還元水は、７〜８のｐＨを有するよう、陰極で生成されたアルカリ性の水を中和したものであってもよい。より好ましい態様において、中和後のｐＨは１２℃〜１４℃において７．２〜７．８である。中和には、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、あるいは電気分解において陽極で得られる酸性水を使用することが好ましい。
【００１１】
典型的に、本発明による電解還元水は、電解質としてＮａＯＨを含む水の電気分解により得られたものであり、好ましい態様において、本発明による電解還元水は、純水に０．０００１Ｎ〜０．０２Ｎの濃度でＮａＯＨを含有させた水の電気分解によって生成されたものである。
【００１２】
さらに本発明による電解還元水の製造方法が提供され、当該製造方法は、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である純水にＮａＯＨを溶解させる工程と、得られたＮａＯＨを含む水を電気分解する工程とを備えることを特徴とする。
【００１３】
本発明による製造方法において、ＮａＯＨを含む水中のＮａＯＨの濃度は、典型的に４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌであり、好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌである。
【００１４】
本発明による製造方法において、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である純水は、水道水を逆浸透膜でろ過することにより、あるいは、水道水を蒸留することによって得ることができる。
【００１５】
本発明による電解還元水は、癌を治療または予防するために使用することができる。また、本発明による電解還元水は、細菌の増殖を阻害するために使用することができる。さらに、本発明による電解還元水は、細胞または生体を酸化ストレスから保護するために使用することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明による電解還元水は、典型的に純水を使用して製造することができる。純水には、市販のものを使用してもよいし、水道水から含有成分を除去して得られるものを使用してもよい。水道水から含有成分を除去する場合、一般的な逆浸透膜を使用するろ過を行ってもよいし、蒸留を行ってもよい。使用する純水中の残留塩素（Ｃｌ2）の濃度は、０．１ｍｇ／ｌ未満であり、典型的には０．０９ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。実質的に塩素（Ｃｌ2）を含まない純水を使用することはより好ましい。また、使用する純水中の塩素イオンの濃度は、５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。通常の検出法による検出限界以下である、実質的に塩素イオンを含有しない純水を使用することがより好ましい。また、純水中の金属の濃度は、水道水に通常含まれる金属の濃度より小さくなっている。たとえば、使用する純水中に含まれるナトリウムの濃度は、典型的に５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下である。使用する純水の典型的な抵抗率は１〜１０ＭΩ・ｃｍ程度である。
【００１７】
典型的に本発明では、このような純水に電解質としてＮａＣｌではなく水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加する。ＮａＯＨは、得られる水の電気伝導率が１００μＳ／ｃｍ以上、典型的には１００〜１０００μＳ／ｃｍになるよう、純水に添加することができる。純水へのＮａＯＨの添加量は、典型的に４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌであり、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌである。
【００１８】
このようにして得られたＮａＯＨの水溶液は電気分解に供される。たとえば、図１に示すような電解槽において電気分解が行われる。電解槽は、陰極１を含む陰極室２と、陽極３を含む陽極室４とを備える。陰極室２と陽極室４とは隔膜５により分離されている。陰極室２には、陰極水（電解還元水）を取出す管６が接続されており、陽極室４には、陽極水（酸性水）を外部に排出する管７が接続されている。陰極室２および陽極室４のそれぞれには、給水管８が接続されており、ＮａＯＨが所定量添加された純水が供給されるようになっている。
【００１９】
また、上述した一連の工程を図２に示す電解還元水製造装置において行うことができる。図２に示す装置では、原水（水道水）をポンプで加圧し、逆浸透膜によりろ過し、純水を得る。純水に定量ポンプを介してＮａＯＨ溶液を添加し、この溶液の電気伝導率を測定し、所定の濃度になるように定量ポンプを制御する。ＮａＯＨ水溶液は、流量センサ、電磁弁１を通して、図１に示すような構造の電解槽に供給される。電解槽がＮａＯＨ水溶液で満たされると、流水速度が０となり、流量センサから制御回路に停止の信号が送られる。停止信号が送られると、ポンプ、定量ポンプが停止し、電磁弁１が「閉」となる。そしてタイマが起動し、所定の時間、電気分解用の直流電流を電解槽に供給する。タイマがタイムアップすると、電磁弁２、電磁弁３が「開」となり、生成された還元水および酸性水が取出される。生成された水が取出された後、各電磁弁は初期状態となり、次の電気分解用のＮａＯＨ水溶液が供給される。
【００２０】
水の電気分解では、陽極側に酸素ガスが発生し、陰極側に水素ガスが発生する。水素ガスが発生するのは、電気分解により、水素イオンと陰極電極から供給された電子とが結合し、原子状水素となり、この原子状水素が２つ結合し、水素ガスが生成するためである。得られた電解還元水は、後述するように、所定の濃度範囲で水素ラジカルを含有する。そのような水素ラジカルを含む電解還元水は、たとえば、癌細胞の増殖抑制効果および転移抑制効果を有する。これは、水素ラジカルの強い抗酸化力によって起こる現象と考えられる。水素は、ガス状になる前のラジカルの状態で、水中に多量に溶存することが望ましい。高い電圧による高電流電気分解反応によって得られる陰極水は、水素の大半がガス化し、水素ラジカルの溶存量が減少する傾向が見られる。このような現象を解決するため、水素ガスの気泡が顕著に発生しないよう、電気分解を時間をかけて行なうのが好ましい。したがって、たとえば、低電圧、低電流で、長時間電気分解を行うことが好ましい。そのような電気分解は、たとえば、５Ｖ〜１００Ｖの電圧、５ｍＡ〜２Ａの電流、５分〜１２０分の電解時間という条件で行うことができる。
【００２１】
このようにして得られる電解還元水は、塩素（Ｃｌ2）および次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）を含まないか、含んだとしても極微量しか含まないものである。かくして本発明による電解還元水の残留塩素の濃度は、０．１ｍｇ／ｌ未満、典型的には典型的には０．０８ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。実質的に塩素（Ｃｌ2）を含まない電解還元水はより好ましい。また、本発明による電解還元水の塩素イオンの濃度は、５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。通常の検出法による検出限界以下である、実質的に塩素イオンを含有しない電解還元水はより好ましい。塩素イオンは、次亜塩素酸の含有指標となる。得られた電解還元水に次亜塩素酸が含まれていれば、その濃度に正に相関して、高い濃度の塩素イオンが検出されるからである。電解還元水中の塩素イオン濃度が低ければ、次亜塩素酸の濃度も低くなる。
【００２２】
一方、本発明による電解還元水は、典型的にナトリウムを比較的高い濃度で含有し得る。本発明による電解還元水中のナトリウム濃度は、たとえば２．３ｍｇ／ｌ〜４６０ｍｇ／ｌであり、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌであり、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌである。一方、典型的に、その他の無機物質、重金属および一般有機化学物質の含有量は、日本国における上水道水の基準を満たすものである。典型的に、本発明による電解還元水は以下の基準を満たす。カドミウム０．０１ｍｇ／ｌ以下、水銀０．０００５ｍｇ／ｌ以下、セレン０．０１ｍｇ／ｌ以下、鉛０．０５ｍｇ／ｌ以下、ヒ素０．０１ｍｇ／ｌ以下、六価クロム０．０５ｍｇ／ｌ以下、シアン０．０１ｍｇ／ｌ以下、硝酸性窒素および亜硝酸性窒素１０ｍｇ／ｌ以下、フッ素０．８ｍｇ／ｌ以下、四塩化炭素０．００２ｍｇ／ｌ以下、１，２−ジクロロエタン０．００４ｍｇ／ｌ以下、１，１−ジクロロエチレン０．０２ｍｇ／ｌ以下、ジクロロメタン０．０２ｍｇ／ｌ以下、シス−１，２−ジクロロエチレン０．０４ｍｇ／ｌ以下、テトラクロロエチレン０．０１ｍｇ／ｌ以下、１，１，２−トリクロロエタン０．００６ｍｇ／ｌ以下、トリクロロエチレン０．０３ｍｇ／ｌ以下、ベンゼン０．０１ｍｇ／ｌ以下、クロロホルム０．０６ｍｇ／ｌ以下、ジブロモクロロメタン０．１ｍｇ／ｌ以下、ブロモジクロロメタン０．０３ｍｇ／ｌ以下、ブロモホルム０．０９ｍｇ／ｌ以下、総トリハロメタン０．１ｍｇ／ｌ以下、１，３−ジクロロプロペン０．００２ｍｇ／ｌ以下、シマジン（ＣＡＴ）０．００３ｍｇ／ｌ以下、チウラム０．００６ｍｇ／ｌ以下、チオベンカルブ０．０２ｍｇ／ｌ以下。さらに、本発明による電解還元水の蒸発残留物は、典型的に８００ｍｇ以下、たとえば１０ｍｇ〜８００ｍｇであり、好ましくは５００ｍｇ以下、たとえば１０ｍｇ〜５００ｍｇである。
【００２３】
本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において−５〜−１０００ｍＶ、好ましくは−２０〜−１０００ｍＶ、より好ましくは−５０ｍＶ〜−１０００ｍＶの酸化還元電位を有する。酸化還元電位は、市販の酸化還元電位計を用いて測定することができる。
【００２４】
また本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において７〜１１のｐＨ、典型的には８〜１１のｐＨを有する。陰極において生成されたアルカリ性の電解還元水を中和することにより得られる電解還元水は、典型的に７〜８のｐＨを有し、好ましくは７．２〜７．８のｐＨを有する。中和には、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、あるいは電気分解において陽極で得られる酸性水を使用することが好ましい。
【００２５】
さらに本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において水素ラジカルを０．０１μＭ〜１０μＭ（μＭはμｍｏｌ／ｌ）、好ましくは０．１μＭ〜１０μＭ、より好ましくは１μＭ〜１０μＭの濃度で含む。以下に示すように、本発明者らは、電解還元水中に存在する水素ラジカルを定量する方法を見出すとともに、このような範囲における濃度で水素ラジカルを含有する電解還元水が抗癌（制癌）作用、抗菌作用、あるいは酸化ストレス抑制作用をもたらすことを見出した。
【００２６】
[電解還元水に含まれる水素ラジカルの定量法]
本発明者は大量の水試料を中和し、ラジカルトラップ剤である３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）反応させた後、ロータリーエバポレーターで濃縮することを試みた。その結果活性酸素消去活性の認められた電解還元水試料においては橙色の着色が認められた。しかし超純水（Milli Q水）や他のミネラルウォーターや水道水では着色が認められなかった。このことはＤＢＮＢＳが電解還元水中の活性水素と反応し新たに着色物質を作るからではないかと考えられた。この現象を利用し、水溶液中の水素ラジカルを高精度で検出できる考え、水素ラジカルの検出法および定量分析の開発を行なった。
【００２７】
この水素ラジカル検出法では、試料に３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）を添加し、水素ラジカルとの反応によりＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成し、その吸収特性に基く着色によって水素ラジカルを検出する。上記着色は３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）が水素ラジカルと反応し、ＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成する着色反応を利用する。そして、着色は波長が４５０ｎｍの吸収ピークに起因する。より具体的には、水素ラジカルの定量法は、次の（１）〜（３）の工程よりなる。
（１）５１７ｎｍ近傍に吸収を有する１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）の溶液に、白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込み、５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰と水素ガスの吹込み時間との相関のグラフを求める（検量線Ａの作成）。
（２）０〜１００μＭのシステインとＤＰＰＨを反応させ、ＤＰＰＨの５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰とシステイン濃度との相関のグラフを求める（検量線Ｂの作成）。システイン１モルが１モルの活性水素を与えると仮定して、活性水素濃度を計算する。
（３）４５０ｎｍ近傍に吸収を有する３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）の溶液に白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込み、４５０ｎｍ近傍の吸光度と活性水素濃度との相関のグラフを求める（検量線Ｃの作成）。
（４）試料に３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）を添加し、（１）と同一条件で白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込んだ後、６０℃で１時間加熱後の４５０ｎｍ近傍の吸光度を測定し、その吸光度の値から前記検量線Ｃを用いて水素ラジカルの濃度を読み取る。
【００２８】
ここで電解還元水は１０〜５００倍に濃縮されていることが好ましい。
この水素ラジカルの検出方法は次の反応に基く、光吸収特性を利用するものである。即ち、３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）が水素ラジカルと反応し、ＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成する。そしてＤＢＮＢＳアゾ化合物は波長が４５０ｎｍの吸収ピークを有するため、その着色によって水素ラジカルを検出できる。
【００２９】
【化１】
【００３０】
反応式で示すと、ＤＢＮＢＳ（式Ａ）は水又は水溶液中の水素ラジカルと反応して、ＤＢＮＢＳ−Ｈ・（式Ｂ）となり、その２分子が反応して二量体（式Ｃ）を生成する。その後加熱下で脱水してＤＢＮＢＳアゾキシ化合物（式Ｄ）が生成する。更に２個の水素と２個の酸素がとれて安定なＤＢＮＢＳアゾ化合物（式Ｅ）が生成する。このＤＢＮＢＳアゾ化合物の４５０ｎｍの吸収を検出することにより、水素ラジカルの定性分析が可能となる。
【００３１】
ＤＰＰＨは周波数が５１７ｎｍに特異吸収を有する安定なフリーラジカルである。ＤＰＰＨは水素ラジカルと定量的に反応し、５１７ｎｍの吸収が消失する。一方、白金黒（粒状白金）は大きな表面積を有し、ガス状の水素分子を水素ラジカル（原子状水素）に変換してそれを保持する。そのため溶液中で白金黒の存在下で水素ガスを吹込むことにより、容易に水素ラジカルを発生させることができる。そこで白金黒存在下で所定濃度のＤＰＰＨ水溶液に水素ガスを吹込み、その吹込み時間とＤＰＰＨの５１７ｎｍでの吸光度の減衰の関係を求めることにより、水素ラジカル濃度と水素ガスの吹込み時間との関係の検量線Ａが作成できる。
【００３２】
一方、前述の如くＤＢＮＢＳ（式Ａ）は水素ラジカルと反応して、式Ｂの活性水素付加中間体（ＤＢＮＢＳ−Ｈ・）およびその二量体（式Ｃ）を経てＤＢＮＢＳアゾキシ化合物（式Ｄ）を生成する。その後加熱により生じるＤＢＮＢＳアゾ化合物の４５０ｎｍ近傍の特異吸収を定量分析に使用する。白金黒存在下で水素ガスを吹き込むと水素ラジカルが発生することは前述のとおりであり、したがって、４５０ｎｍ近傍の吸光度と水素ガスの吹込み時間の関係を求めることにより、検量線Ａおよび検量線Ｂを用いて４５０ｎｍ近傍の吸光度と水素ラジカルの濃度の関係を示す検量線Ｃを求めることができる。
【００３３】
そこで試料中の水素ラジカル濃度を求めるには、試料溶液に所定濃度のＤＢＮＢＳを添加し、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルを反応させＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成させた後、その４５０ｎｍ近傍の吸光度を測定し、前記検量線Ｃから水素ラジカル濃度を測定する。
【００３４】
水素ラジカルの測定において、電解還元水は１０〜５００倍に濃縮して使用することが好ましい。例えば電解還元水１２５ｍｌにＤＢＮＢＳ保存液を２００μｌ添加し、攪拌した後、ロータリエバポレーターで６０℃の恒温槽にて濃縮乾固する。これを１ｍｌの超純水（Milli Q水）で濃縮乾固物を溶解して回収する。次に６０℃恒温槽にて約１時間保温し、氷上に５分間静置し例えば１２，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得る。
【００３５】
測定例１： ＤＢＮＢＳを用いた白金黒−水素による水素ラジカル発生の検出
１−１ 試薬
ＤＢＮＢＳはラボテック（株）製を、白金黒は石福金属鉱業（株）製を、水素ガスは大洋サンソ（株）製を使用した。ＤＢＮＢＳは超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）に１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し４℃に保存し、２週間以内に使い切るようにした。
【００３６】
１−２ 白金黒−水素による水素ラジカル発生
水素ガスは白金表面上で原子状の水素になる。そこで０．０１ｍｇ／ｍｌの白金黒を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを吹きこんだ。５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分後にそれぞれ２００μｌずつ回収し１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を６０℃の恒温槽にて１時間保温した。コントロールとしては水素ガスを吹き込ませなかったものを６０℃時間保温処理した。
【００３７】
１−３ 水素ラジカルの検出
反応後のコントロールのＤＢＮＢＳ水溶液をキャリブレーションし、ＤＢＮＢＳ自身の吸光度を０とし、各ＤＢＮＢＳ試料の３５０〜６００ｎｍの波長をスキャンし差スペクトルを得た。この差スペクトルの測定は白金黒−水素処理によってＤＢＮＢＳが新たな物質に変化したことを検出するためである。また白金黒−水素処理によって生成する活性水素にＤＢＮＢＳが特異的に反応するかを調べるために白金黒のみ、水素ガスのみ、窒素ガスのみ、白金黒−窒素ガス処理した試料も行なった。
【００３８】
白金黒−水素反応によって得られたＤＢＮＢＳアゾ化合物の試料の吸収スペクトルは図１（Ｐｔ−Ｈ2）に示す如く、４２５ｎｍから４５０ｎｍにピークを持つなだらかな可視吸収スペクトルを示した。それらの試料はオレンジ色に着色していた。このことは白金黒−水素処理によってＤＢＮＢＳが新たなオレンジ色の着色物質であるＤＢＮＢＳアゾ化合物に変化したことを示す。そしてそのピークの高さは図３に示される如く、吹き込んだ水素ガス量に依存して増加していき、４５分間吹き込みにおいて最大となり、その後は減少した。
【００３９】
また白金黒−水素反応特異性を調べるために行なった白金黒のみ、水素ガスのみ、窒素ガスのみ、白金黒−窒素ガス処理した試料では全く着色が認められず、紫外部吸収においても波形に変化が認められなかった。吸収スペクトルの４５０ｎｍにおける吸光値を水素ラジカルと反応して得られたものは水素ラジカル反応値（ＡＨ値）とした。
【００４０】
測定例２： ＤＢＮＢＳを用いた電解還元水中の水素ラジカルの検出
２−１ 試薬
測定例１と同じものを用いた。
【００４１】
２−２ 電解還元水
０．０１％ＮａＣｌ水を日本トリム社製の電解還元水装置ＴＩ−８０００でレベル４（５Ａ）で電解還元し、陰極側の電解還元水を得た。
【００４２】
２−３ 水素ラジカルの検出
電解還元水１２５ｍｌにＤＢＮＢＳ保存液を２００μｌ添加し、攪拌した後、ロータリエバポレーターで６０℃の恒温槽にて濃縮乾固した。１ｍｌの超純水（Milli Q水）で濃縮乾固物を溶解し、回収した。次に６０℃恒温槽にて１時間保温し、氷上に５分間静置し、１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を得た。コントロールとして上記超純水で同様に行なったＤＢＮＢＳ試料をキャリブレーションし、ＤＢＮＢＳ試料の３５０〜６００ｎｍの波長をスキャンし差スペクトルを得た。
【００４３】
測定例１で求めた吸収スペクトルと同様のスペクトルが電解還元水において認められ（図４：電解還元水）、電解還元水中に水素ラジカルが存在することが確認された。
【００４４】
測定例３： 電解還元水の濃度と水素ラジカル反応値の関係、および電解強度と水素ラジカル反応値の関係
電解還元水の濃度と水素ラジカル量の相関関係があるかどうかを試験した。電解還元水を超純水（Milli Q水）で希釈して、それぞれ試料の水素ラジカル反応値を測定した。また電解強度と水素ラジカル反応値との関係を調べるためにＮａＣｌ濃度が０．０００１％から０．０１％までの水を用意し、それぞれを電解還元した水の活性水素反応を測定した。電解還元水は日本トリム社製の電解還元水装置ＴＩ−８０００でレベル４（５Ａ）で電解還元し、陰極側の還元水を得た。
【００４５】
電解還元水の％体積が２５、５０、７５、１００％の水を希釈により作成し、水素ラジカル反応値を測定したところ、図５に示す如く電解還元水の濃度とともに水素ラジカル反応値が上昇していたので、この測定系は電解還元水の試料においても定量性があることが明らかとなった。また電気分解で電解還元水を得る際の電解強度を変化させた水溶液を作成するために、水溶液の塩濃度（ＮａＣｌ濃度）を変えて得られた電解還元水においては図６に示す如く、電解強度（ＮａＣＬ濃度）とともに水素ラジカル反応値も上昇した。このことは電解強度を強くすることによって水素ラジカルも多く発生することを意味する。
【００４６】
測定例４： 水素ラジカルとＤＢＮＢＳとの反応過程の解析
４−１ 試料
ＤＢＮＢＳはラボテック（株）製、白金黒粉末Ｍタイプは石福金属鉱業（株）、水素ガスは大洋サンソ（株）製のものをそれぞれ用いた。
【００４７】
４−２ ＤＢＮＢＳの反応
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金黒を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを１時間吹き込み、加熱処理しないものと、６０℃で１時間加熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを分析試料に用いた。
【００４８】
４−３ 分析試料の調整
（１） 高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）分析試料
分析試料をそれぞれ０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌを用いた。
【００４９】
（２） ＮＭＲ、ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析における分析試料
ＨＰＬＣより、分離した非加熱処理である反応中間体は、無水酢酸（和光純薬株式会社製）を用いアセチル化し安定化させたものを用い、加熱処理により分離されたアゾ化合物は、再度ＨＰＬＣ分取することにより分離度を完全なものにして用いた。
【００５０】
（３） 微量元素分析における分析試料
非加熱処理の反応中間体はＨＰＬＣより分離したもの用い、加熱処理により分離されたアゾ化合物はＮＭＲ、ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析と同様のものを用いた。
【００５１】
４−４ 機器測定条件
（１） ＨＰＬＣはWaters社のWaters600E、移動相はMilli-QWater、流速は５ｍｌ／ｍｉｎ、注入量は、Waters717のオートサンプラーで採取した２０００μｌ、カラムはWaters社製Nova-Pak C18 １９×３００ｍｍを用いた。また検出器にはWaters社のWaters996フォトダイオードアレイ検出器を用い２００−６００ｎｍの波長領域において１．２ｎｍ間隔でデータを取込んだ。スペクトルクロマトグラムによる解析は、コンパックＶ７００パーソナルコンピュータを用いミレニアム３２（Waters社）で作成したプログラムで行なった。
【００５２】
（２） ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析計は、Voyager（パーセプティブ、バイオシステム社）を使用した。Voyagerは、窒素レーザ（３３７ｎｍ）を搭載した、加速電圧２０ｋＶのレーザイオン化飛行時間型質量分析装置である。加速電圧は、２０ｋＶを使用し、飛行モードはリニアモードで分析を行なった。マトリックスは、２−（４−ヒドロキシ−フェニルアゾ）−安息香酸（ＨＡＢＡ）（アルドリッチケミカル社製）１．３ｍｇを、５０：５０水・アセトニトリル１ｍｌに溶解し使用した。試料スライドに０．５μｌの試料を塗布して自然乾燥した後、同量のマトリックス溶液を添加し、再度自然乾燥してイオン源に導入した。
【００５３】
（３） ＮＭＲは、４００ＭＨｚ ＮＭＲ（ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＧＳＸ４００ＮＭＲシステムスペクトロメータ）を使用し、1Ｈ−ＮＭＲ測定を行なった。溶媒として、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）（和光純薬株式会社製）およびデュートリウムオキシド（Ｄ2Ｏ）（アルドリッチケミカル社製）を使用した。
【００５４】
４−５ 解析結果
（Ａ） 高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）測定結果
（ｉ） 分析試料（１）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを１時間吹き込み、０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌをフォトダイオードアレイ検出器付きＨＰＬＣ用いて、非加熱処理の試料を測定した。その測定結果を図７に示す。図７において非加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物の保持時間約９．０分に認められるピークは２８０ｎｍに吸収ピークが認められた。これは式Ｃに示される二量体に相当する。
【００５５】
（ii） 分析試料（２）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの通気速度で水素ガスを１時間吹き込み、６０℃で１時間加熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌをフォトダイオードアレイ検出器付きＨＰＬＣ用いて、加熱処理の試料を測定した。測定結果を図８に示す。図８において加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物の保持時間８．５分に認められるピークは４５０ｎｍに吸収ピークが認められた。これは式Ｅで示されるＤＢＮＢＳアゾ化合物に相当する。
【００５６】
（Ｂ） マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）の測定結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて測定した。
【００５７】
アセチル化した２８０ｎｍに吸収を持つ非加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のマススペクトルは図９に示す如くｍ／ｚ６７５．４４９にイオンピークが示され、これは中間体（式Ｃ）よりＢｒが１つ脱離し、式Ｃの中間体のヒドロキシル基が１つアセチル化したものと一致した。
【００５８】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物をマススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて測定した。
【００５９】
４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のマススペクトルが図１０に示す如くｍ／ｚ６５６．３２９にイオンピークが示され、Ｎａが２つ脱離したＤＢＮＢＳアゾ化合物（式Ｅ）と一致した。
【００６０】
（Ｃ） ＮＭＲ測定結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、1Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した結果を図１１に示す。図１１からアセチル化した２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物のスペクトルが示されている。コントロールとしてアセチル化に用いた無水酢酸を同様にＨＰＬＣ分取により採取したものを示した。コントロールと比較し、ケミカルシフト２．０ｐｐｍにメチル基の存在が示されたことにより、非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物のヒドロキシル基と無水酢酸が直接反応が生じたことを示している。
【００６１】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、1Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した結果を図１２に示す。
【００６２】
４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のプロトン、ケミカルシフトは６．６〜６．７ｐｐｍであり、６．７５７５ｐｐｍ，６．６３４ｐｐｍに左右に１本づつの対照なシグナルに分裂している。これはアゾ基の形成にともなって、メタ位のプロトン間にカップリングが生じたことを示している。
【００６３】
（Ｄ）微量元素分析結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、微量元素分析した。炭素含量１９．９３％（計算値１９．３５％）、水素含量１．６１％（計算値１．６１％）、窒素含量３．７６％（計算値３．７６％）となった。これは中間体より、Ｎａが２つ脱離し、３水和物のものと一致する。
【００６４】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、微量元素分析した。
炭素含量２１．５３％（計算値２１．４３％）、水素含量１．７３％（計算値１．７９％）、窒素含量３．８４％（計算値４．１７％）となった。これはＤＢＮＢＳアゾ化合物より、Ｂｒ、Ｎａが１つづつ脱離し４水和物としたものと一致する。
測定例５：水素ラジカルの定量分析
５−１ １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）と水素ガス吹込み時間との関係（検量線Ａの作成）
０．１Ｍの酢酸干渉液（ｐＨ５．５）１．９６ｍｌにエタノールおよび０．５ｍＭのＤＰＰＨ・エタノール溶液１ｍｌと１．０ｍｇ／ｍｌの白金黒・酢酸緩衝液０．０５ｍｌを加えて全量を５ｍｌとし、４５ｍｌ／ｍｉｎの速度で水素ガスを吹込み、一定の時間ごとに２００μの試料を採取し、ＤＰＰＨの特異吸収である５１７ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の減衰と吹込み時間の関係を示すグラフ（検量線Ａ）として図１３を得た。
【００６５】
５−２ 検量線Ｂの作成
０〜１００μＭのシステインとＤＰＰＨを反応させ、ＤＰＰＨの５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰とシステイン濃度との相関のグラフを求めた。グラフ（検量線Ｂ）として図１４を得た。
【００６６】
５−３ ３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩アゾ化合物（ＤＢＮＢＳアゾ化合物）の吸光度と水素ラジカル濃度の関係（検量線Ｃの作成）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液に４５ｍｌ／ｍｉｎの速度で水素ガスを吹込み、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルを反応させながら、一定の時間ごとに２００μｌの試料を採取し、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルの反応生成物であるＤＢＮＢＳアゾ化合物の特異吸収である４５０ｎｍの吸光度を測定し図１５に示す検量線Ｃを作成した。
【００６７】
５−４ 試料中の水素ラジカル濃度の測定
（１）試料調製
電解還元水をｐＨ７．０に調製し、その製造条件によりレベル１〜レベル４の試料を調製した。ここで電解還元水は隔膜で隔てられた陰極室と陽極室のそれぞれにＮａＯＨを含む水溶液を導入し、陰極と陽極の間に通電し、前記ＮａＯＨ水溶液を電気分解し、前記陰極室で得られたものである。これらの酸化還元電位（ＯＲＰ）およびｐＨを表１に示す。対照例として超純粋（ＭｉｌｌｉＱ水）を用いた。
【００６８】
１２５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水、レベル１〜４の電解還元水のそれぞれにＤＢＮＢＳストック溶液（１２．、５ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて、１２５倍に減圧濃縮した。ＭｉｌｌｉＱ水１ｍｌで濃縮後のナス型フラスコの内壁を洗い、しばらく静置し溶液を回収した。回収後の溶液を６０℃湯浴中（遮光）で加熱し、その後氷中で冷却し反応を停止した。回転速度１２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して上澄を採取した。
【００６９】
（２）吸光度の測定
上記試料の周波数４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定は同じ試料について、それぞれ三個の試料を用いて測定し、その平均値を求めた。吸光度の測定結果を表１に示す。
【００７０】
（３）水素ラジカル濃度の測定
コントロールとして用いたＭｉｌｌｉＱ水の４５０ｎｍでの平均吸光度０．０３５８を各レベルの試料の吸光度を差し引く、その差の吸光度の値から、検量線Ｃを用いて、水素ラジカル濃度を求めた。なお１２５倍に濃縮した電解還元水は水素ラジカル濃度がレベル１〜４で０．０３ｍＭ〜０．１２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）の範囲である。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【実施例】
実施例１
図１および図２に示す装置を使用して電解還元水を製造した。電解還元水の製造プロセスは上述したとおりである。水道水を逆浸透膜でろ過して得られた純水にＮａＯＨを０．０１質量％の濃度で添加し、得られたＮａＯＨ水溶液を、電圧５Ｖ〜１００Ｖ、電流５ｍＡ〜２Ａ、電解時間５分〜１２０分の条件下、電流密度３．２ｍＡ／ｃｍ2（電解度１）、６．４ｍＡ／ｃｍ2（電解度２）、１２．９ｍＡ／ｃｍ2（電解度３）、１６．２ｍＡ／ｃｍ2（電解度４）、２５．８ｍＡ／ｃｍ2（電解度５）でそれぞれ電気分解して、５種類の電解還元水を製造した。得られた電解還元水について、温度、ｐＨ、酸化還元電位、溶存酸素量、溶存水素量、および水素ラジカル濃度を測定した。酸化還元電位は、東亜電波工業製「酸化還元電位計」を用い、１２℃〜１４℃で検体水に測定用電極を漬けることによって測定した。溶存酸素量は東亜電波製溶存酸素計ＤＯ−１４Ｐ型にて測定した。また、溶存水素量は東和電波製溶存水素計ＤＨＤ１−１型にて測定した。水素ラジカル濃度は上述した方法に従って測定した。
【００７３】
得られた電解還元水についての測定結果を、水道水の測定結果とともに表２および表３に示す。表２および表３は同じような結果を示しているが、採取した水を変えて、異なる日に測定したものである。両表を比較参照して、再現性のよいデータが得られることがわかった。また表４に、電気分解の条件（電流密度の値）を示す。水道水は、電気分解を行なっていないので、その電流密度は０．０ｍＡ／ｃｍ2と表わしている。電気分解の条件で重要なのは、電流密度であり、これを、マイクロコンピュータで制御する。電流密度を決めると、必要な電圧とＮａＯＨの濃度が必然的に決まってくる。
【００７４】
【表２】
【００７５】
【表３】
【００７６】
【表４】
【００７７】
実施例２
得られた電解還元水（表２中の電解度５のもの）の、癌転移抑制効果を評価した結果を以下に示す。
【００７８】
図１６は、高転移性ヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の、in vitroでの、転移モデル系における電解還元水の抑制効果を示したものである。ＨＴ１０８０は、細胞銀行（例えば、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ ＢａｎｋまたはＡＴＣＣ（米国））より入手したものを用いた。
【００７９】
ＨＴ１０８０細胞は、１０％牛胎児血清添加ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ2／９５％ａｉｒ環境下で培養した。ケモタキセルのフィルタ（ポアサイズ８μｍ）に、マトリゲルを２５μｇ／フィルタとなるようにコートした。サブコンフルエントのＨＴ１０８０細胞を、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＭＥＭ培地（最少必須培地Minimum Essential Medium（栄養成分を最小限に留めた培地））に懸濁し、細胞数を４×１０5／ｍｌに調整した。得られたものの２００μｌをチャンバ上室に添加した。細胞添加後、直ちに下室（２４穴プレート側）に、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むＭＥＭ培地７００μを加え、ＣＯ2インキュベータ内で培養した。６時間後、チャンバを取出し、フィルタ上面の細胞を綿棒で除いた後、ＷＳＴ−１（生細胞の特異的な代謝能（細胞数）に応じて変色する試薬）の入った２４穴プレートに移し、１６時間培養後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図中、ｃｔｒｌは、純水を培地に用いて行なった結果であり、ＮａＯＨｍｉｘは、表２中の電解度５で得られた電解還元水を培地用いて行なった結果である。ＮａＯＸｍｉｘの場合は、ｃｔｒｌの場合に比べて、著しくＨＴ１０８０細胞の浸潤転移が減少している。これは、電解還元水が、ヒト繊維肉腫細胞の浸潤転移を抑制することを表わしている。
【００８０】
図１７は、１週間細胞障害性試験を示す図である。ＨＴ１０８０細胞を、純水または電解還元水（電解度５のもの）を用いて調製した１０％牛胎児血清添加ＭＥＭ培地で、１週間培養後、ＷＳＴ−１を添加し、生細胞数を４５０ｎｍの吸光度で測定した。純水を用いた場合のｃｔｒｌの場合と電解還元水（ＮａＯＨｍｉｘ）を用いた場合との間には、目立った差はなかった。すなわち、電解還元水は、健康な細胞の増殖に対して、影響を与えないということが見出された。図１６と図１７の結果より、ＮａＯＨ電解還元水は、細胞毒性を持つことなく、転移浸潤活性を抑制するということが明らかとなった。
【００８１】
癌細胞の転移に重要な役割を果たすマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に焦点を合わせて、その中でも、特に癌転移と関係が深いことで知られるＭＭＰ２およびＭＭＰ９について解析した。ＨＴ１０８０細胞を、ケモタキセルチャンバ上で４８時間培養した後、その培養上澄みを、遠心装置で浄化後、回収した。上澄み１２μｌを、１ｍｇ／ｍｌゼラチンを含む１０％ポリアクリルアミドゲルに添加した。ゲル電気泳動を行なった後、ゲルを２％トリトンＸ−１００で１時間洗浄後、３７℃で６０時間保温した。その後、ゲルを０．１％Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓで染色した。この操作により、ゲラチナーゼ活性は、白抜きバンドとして検出された。図１８は、ザイモグラフィによるゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ活性の分析結果を示す図である。図１８において、白いバンドの幅が広いほど、癌転移を促進するＭＭＰの活性が強いことを示している。分析の結果、ＮａＯＨ電解還元水は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現には影響を与えなかったが、ＭＭＰ２の活性化を顕著に抑制することが見出された。以上の結果から、ＮａＯＨ電解還元水がＭＭＰ２の活性化を抑えることによる癌転移抑制効果を持つことが明らかとなった。
【００８２】
癌細胞の転移機構を阻害することは、転移抑制のみならず、癌細胞の浸潤活性による血管新生の抑制と、癌細胞の悪性化を抑える上でも重要である。また、癌転移を抑制する薬剤は、長期間効果を持続し、なお副作用が極力少ないものでなければならない。本発明において、ＮａＯＨ電解水が細胞に障害を与えることなく、癌細胞の転移を抑制することが証明できた。これは、日常の飲料水として使用することで、癌の進行を予防できる可能性を示唆しており、これからの癌治療法に与える意義は大変大きいと考えられる。
【００８３】
実施例３
大腸菌を電解還元水中に放置し、そのコロニー形成への影響を調べた。大腸菌（Esherichia coli JM109）を、Milli-Q（純水）を使用して調製したLB Broth Base（LIFE TECHNOLOGIES）にて、３７℃、３〜４時間振とう培養し、ほぼ一定の吸光度（約０．５７６）まで培養した（約１５×１０7個／ｍｌ）。得られた培養液を、電解還元水（上記表２の電解度５のもの）およびMilli-Q（純水）でそれぞれ調製した生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）によって１／１０００００に希釈した。この希釈液を、室温で放置し、次いで、Milli-Q（純水）で調製したLB Broth Baseに１．５％寒天を加えた平板培地に０．１ｍｌ滴下し、コンラージ棒（日水製薬製）によって、均一に塗布し、培養した。希釈液の室温での放置時間をそれぞれ０、３０、６０、１２０および１８０分とし、それぞれの処理時間のものについて、上述した平板培養を行った。所定の時間培養した後、２つの平板培地上のコロニー数をそれぞれ肉眼で測定し、その平均値を求めた。各放置時間に対して得られたコロニー数の平均値は、表５に示すとおりである。電解還元水で培養液を処理することによって、その後の大腸菌の増殖が阻害されることがわかった。その阻害効果は、電解還元水により処理する時間が長くなるにしたがって、大きくなる傾向が見られた。
【００８４】
【表５】
【００８５】
実施例４
酸化ストレスを与えた神経細胞の細胞死を電解還元水によって抑制できるかどうか検討した。Neuroblastoma N1E115細胞を２％Dimethyl Sulphoxideを添加した培地で７日間培養し、さらに無血清培地で１日培養し、ニューロンに分化させた。その後、過酸化水素を培地に０、１００、２００、３００μＭそれぞれ添加し、２４時間培養して酸化ストレスを与えた。酸化ストレスを与えた細胞を、純水を使用して調製した０．０１％ＮａＣｌ水、および上記表２の電解度４の電解還元水を使用して調製した０．０１％ＮａＣｌ水にそれぞれ懸濁し、処理した後、ＷＳＴ−８アッセイを使用して４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。純水を使用したものと、電解還元水を使用したものの結果を比較したところ、過酸化水素０、１００および３００μＭ添加の場合には差が認められなかったが、２００μＭ添加の場合、電解還元水による処理を行った方が、吸光度が高く、電解還元水は、細胞の酸化ストレスに対する保護効果あるいは抑制効果を奏し得ることが示唆された。過酸化水素３００μＭ添加の場合に差がでなかったのは、酸化ストレスが強すぎたためであると考えられる。
【００８６】
【発明の効果】
上述したように本発明によれば、次亜塩素酸や塩素が十分に排除され、有用な生理学的活性を有し得る電解還元水を提供することができる。
【００８７】
本発明による電解還元水は、癌を治療または予防するための水として使用することができる。この場合、癌に対する治療が必要な患者に、本発明による電解還元水をそのまま投与（たとえば、飲用水として経口投与、あるいは静脈経路による非経口投与）することができる。したがって、本発明による電解還元水は制癌剤として機能することができる。さらに、本発明による電解還元水は、癌に対する治療が必要な患者に、他の有効成分（たとえば制癌剤）を投与するための担体として使用してもよい。この場合、他の有効成分と本発明による電解還元水との相乗作用または相加作用を期待することができる。また、本発明による電解還元水を癌の予防のため使用してもよい。この場合、予防を必要とするものは、適当量を必要に応じて、たとえば飲用水として摂取すればよい。
【００８８】
また、本発明による電解還元水は、細菌の増殖を阻害するための水として使用することができる。この場合、たとえば、次のような処理を行うことができる。（ａ）細菌を直接電解還元水にさらす。（ｂ）細菌の増殖を阻害することが必要な製品、たとえば、食品、飲料、化粧品、医薬品などの原料や成分として電解還元水を使用する。（ｃ）細菌の増殖を阻害することが必要な製品、たとえば、野菜、果実、魚、肉類等の生鮮食品、あるいは花卉類などを電解還元水によって洗浄する。（ｄ）細菌による汚染を防ぐため、食器類、容器類、食品製造設備などを電解還元水によって洗浄する。（ｅ）医療や必要な場合に、細菌の増殖した部位や、細菌の増殖を防ぐべき部位を、電解還元水によって洗浄する。これらの処理において、本発明による電解還元水は、抗菌剤として機能し得る。さらに、本発明による電解還元水は、他の有効成分（殺菌剤または抗菌剤）の担体として使用することができ、この場合、他の有効成分と本発明による電解還元水との相乗作用または相加作用を期待することができる。
【００８９】
さらに本発明による電解還元水は、細胞を酸化ストレスから保護するための水として使用することができる。この場合、たとえば、酸化ストレスを受けた細胞あるいは生体に電解還元水を供給することにより、酸化ストレスの影響を低減することができる。また、本発明による電解還元水を日常的に摂取することにより、酸化ストレスに起因する顕著な疾患の誘発を阻止することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 水の電気分解に使用される電解槽を示す模式図である。
【図２】 本発明に使用される電解還元水製造装置の一例を示す模式図である。
【図３】 ４５０ｎｍにおける水素ガス吹き込み時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【図４】 ＤＢＮＢＳアゾ化合物の吸収特性を示すグラフである。
【図５】 電解還元水と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。
【図６】 塩化ナトリウム濃度と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。
【図７】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のＨＰＬＣ測定結果を示すチャートである。
【図８】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のＨＰＬＣ測定結果を示すチャートである。
【図９】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のマススペクトル測定チャートである。
【図１０】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のマススペクトル測定チャートである。
【図１１】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のＮＭＲスペクトル測定チャートである。
【図１２】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のＮＭＲスペクトル測定チャートである。
【図１３】 検量線Ａを示すグラフである。
【図１４】 検量線Ｂを示すグラフである。
【図１５】 検量線Ｃを示すグラフである。
【図１６】 ＮａＯＨ電解還元水が癌細胞転移抑制効果を示す図である。
【図１７】 ＮａＯＨ電解還元水の細胞障害性試験の結果を示す図である。
【図１８】 ザイモグラフィによるゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ活性の分析の結果を示す図である。
【符号の説明】
１ 陰極、２ 陰極室、３ 陽極、４ 陽極室、５ 隔膜。
【発明の属する技術分野】
本発明は、電解還元水およびその製造方法、ならびにその用途に関し、特に、生物学的活性に関与する有効量の水素ラジカルを含む電解還元水およびその製造方法、ならびに癌、細菌または酸化ストレスを抑制するためのその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水を電気分解することによって、陽極側および陰極側にそれぞれ電気分解水が得られる。このうち、陰極側において生成される電解還元水（アノード水あるいはアルカリイオン水）は、還元性を有し、生体内の酸化的状態から引き起こされ得る種々の異常や疾患に有利に作用し得ることが期待される。
【０００３】
たとえば、特開平１０−１１８６５３号公報は、ＤＮＡの損傷を防止または抑制することができる電解水素溶存水を得るため、純水中にＮａＣｌを加えてその電気伝導率を１００μＳ以上に調整し、当該水を電気分解して陰極水を取り出すことを開示する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このようにＮａＣｌを溶解させた水を電気分解する方法によると、ＮａＣｌ水溶液の電気分解時に次亜塩素酸や塩素ガスが発生し、これらが電解還元水に溶け込む可能性がある。また、塩素（Ｃｌ2）を含む水道水を電気分解する際にも、次亜塩素酸が生成され、電解還元水に溶け込む可能性がある。次亜塩素酸や塩素ガスは、細胞に有害な作用を及ぼし得るものである。したがって、従来では、還元性を有する電解水が得られたとしても、次亜塩素酸や塩素ガスによる作用により、十分に有用な生理学的効果が得られない可能性があった。
【０００５】
また、電解還元水のもつ活性酸素消去作用やＤＮＡ切断抑制作用は、その中に含まれる還元性物質、たとえば活性水素によるものであると考えられる。しかし、電解還元水中に含まれる還元性物質の量とその生理学的効果との関係は明らかでなかった。
【０００６】
本発明の目的は、次亜塩素酸や塩素の影響が十分に排除され、有用な生理学的活性を有し得る電解還元水およびその製造方法を提供するとともに、当該電解還元水の用途を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明により、電解質を含む一方、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である水の電気分解によって陰極に生成された電解還元水が提供される。当該電解還元水は、以下の特徴を備える。
（ａ）残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満である。
（ｂ）塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である。
（ｃ）１２℃〜１４℃において−５〜−１０００ｍＶの酸化還元電位を有する。
（ｄ）１２℃〜１４℃において７〜１２のｐＨを示する。
（ｅ）１２℃〜１４℃において水素ラジカルを０．０１μＭ〜１０μＭの濃度で含む。
【０００８】
本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａ（１ａｔｍ）において、典型的に０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ、好ましくは０．１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、より好ましくは０．５ｐｐｍ〜２ｐｐｍの溶存水素を含有し得る。
【０００９】
一方、本発明による電解還元水において、１２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａにおける溶存酸素量は、１０ｐｐｍ以下であることが好ましく、たとえば１ｐｐｍ〜６ｐｐｍであることがより好ましい。
【００１０】
本発明による電解還元水は、７〜８のｐＨを有するよう、陰極で生成されたアルカリ性の水を中和したものであってもよい。より好ましい態様において、中和後のｐＨは１２℃〜１４℃において７．２〜７．８である。中和には、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、あるいは電気分解において陽極で得られる酸性水を使用することが好ましい。
【００１１】
典型的に、本発明による電解還元水は、電解質としてＮａＯＨを含む水の電気分解により得られたものであり、好ましい態様において、本発明による電解還元水は、純水に０．０００１Ｎ〜０．０２Ｎの濃度でＮａＯＨを含有させた水の電気分解によって生成されたものである。
【００１２】
さらに本発明による電解還元水の製造方法が提供され、当該製造方法は、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である純水にＮａＯＨを溶解させる工程と、得られたＮａＯＨを含む水を電気分解する工程とを備えることを特徴とする。
【００１３】
本発明による製造方法において、ＮａＯＨを含む水中のＮａＯＨの濃度は、典型的に４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌであり、好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌである。
【００１４】
本発明による製造方法において、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である純水は、水道水を逆浸透膜でろ過することにより、あるいは、水道水を蒸留することによって得ることができる。
【００１５】
本発明による電解還元水は、癌を治療または予防するために使用することができる。また、本発明による電解還元水は、細菌の増殖を阻害するために使用することができる。さらに、本発明による電解還元水は、細胞または生体を酸化ストレスから保護するために使用することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明による電解還元水は、典型的に純水を使用して製造することができる。純水には、市販のものを使用してもよいし、水道水から含有成分を除去して得られるものを使用してもよい。水道水から含有成分を除去する場合、一般的な逆浸透膜を使用するろ過を行ってもよいし、蒸留を行ってもよい。使用する純水中の残留塩素（Ｃｌ2）の濃度は、０．１ｍｇ／ｌ未満であり、典型的には０．０９ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。実質的に塩素（Ｃｌ2）を含まない純水を使用することはより好ましい。また、使用する純水中の塩素イオンの濃度は、５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。通常の検出法による検出限界以下である、実質的に塩素イオンを含有しない純水を使用することがより好ましい。また、純水中の金属の濃度は、水道水に通常含まれる金属の濃度より小さくなっている。たとえば、使用する純水中に含まれるナトリウムの濃度は、典型的に５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下である。使用する純水の典型的な抵抗率は１〜１０ＭΩ・ｃｍ程度である。
【００１７】
典型的に本発明では、このような純水に電解質としてＮａＣｌではなく水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加する。ＮａＯＨは、得られる水の電気伝導率が１００μＳ／ｃｍ以上、典型的には１００〜１０００μＳ／ｃｍになるよう、純水に添加することができる。純水へのＮａＯＨの添加量は、典型的に４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌであり、好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌである。
【００１８】
このようにして得られたＮａＯＨの水溶液は電気分解に供される。たとえば、図１に示すような電解槽において電気分解が行われる。電解槽は、陰極１を含む陰極室２と、陽極３を含む陽極室４とを備える。陰極室２と陽極室４とは隔膜５により分離されている。陰極室２には、陰極水（電解還元水）を取出す管６が接続されており、陽極室４には、陽極水（酸性水）を外部に排出する管７が接続されている。陰極室２および陽極室４のそれぞれには、給水管８が接続されており、ＮａＯＨが所定量添加された純水が供給されるようになっている。
【００１９】
また、上述した一連の工程を図２に示す電解還元水製造装置において行うことができる。図２に示す装置では、原水（水道水）をポンプで加圧し、逆浸透膜によりろ過し、純水を得る。純水に定量ポンプを介してＮａＯＨ溶液を添加し、この溶液の電気伝導率を測定し、所定の濃度になるように定量ポンプを制御する。ＮａＯＨ水溶液は、流量センサ、電磁弁１を通して、図１に示すような構造の電解槽に供給される。電解槽がＮａＯＨ水溶液で満たされると、流水速度が０となり、流量センサから制御回路に停止の信号が送られる。停止信号が送られると、ポンプ、定量ポンプが停止し、電磁弁１が「閉」となる。そしてタイマが起動し、所定の時間、電気分解用の直流電流を電解槽に供給する。タイマがタイムアップすると、電磁弁２、電磁弁３が「開」となり、生成された還元水および酸性水が取出される。生成された水が取出された後、各電磁弁は初期状態となり、次の電気分解用のＮａＯＨ水溶液が供給される。
【００２０】
水の電気分解では、陽極側に酸素ガスが発生し、陰極側に水素ガスが発生する。水素ガスが発生するのは、電気分解により、水素イオンと陰極電極から供給された電子とが結合し、原子状水素となり、この原子状水素が２つ結合し、水素ガスが生成するためである。得られた電解還元水は、後述するように、所定の濃度範囲で水素ラジカルを含有する。そのような水素ラジカルを含む電解還元水は、たとえば、癌細胞の増殖抑制効果および転移抑制効果を有する。これは、水素ラジカルの強い抗酸化力によって起こる現象と考えられる。水素は、ガス状になる前のラジカルの状態で、水中に多量に溶存することが望ましい。高い電圧による高電流電気分解反応によって得られる陰極水は、水素の大半がガス化し、水素ラジカルの溶存量が減少する傾向が見られる。このような現象を解決するため、水素ガスの気泡が顕著に発生しないよう、電気分解を時間をかけて行なうのが好ましい。したがって、たとえば、低電圧、低電流で、長時間電気分解を行うことが好ましい。そのような電気分解は、たとえば、５Ｖ〜１００Ｖの電圧、５ｍＡ〜２Ａの電流、５分〜１２０分の電解時間という条件で行うことができる。
【００２１】
このようにして得られる電解還元水は、塩素（Ｃｌ2）および次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）を含まないか、含んだとしても極微量しか含まないものである。かくして本発明による電解還元水の残留塩素の濃度は、０．１ｍｇ／ｌ未満、典型的には典型的には０．０８ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。実質的に塩素（Ｃｌ2）を含まない電解還元水はより好ましい。また、本発明による電解還元水の塩素イオンの濃度は、５ｍｇ／ｌ以下であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ以下であり、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。通常の検出法による検出限界以下である、実質的に塩素イオンを含有しない電解還元水はより好ましい。塩素イオンは、次亜塩素酸の含有指標となる。得られた電解還元水に次亜塩素酸が含まれていれば、その濃度に正に相関して、高い濃度の塩素イオンが検出されるからである。電解還元水中の塩素イオン濃度が低ければ、次亜塩素酸の濃度も低くなる。
【００２２】
一方、本発明による電解還元水は、典型的にナトリウムを比較的高い濃度で含有し得る。本発明による電解還元水中のナトリウム濃度は、たとえば２．３ｍｇ／ｌ〜４６０ｍｇ／ｌであり、好ましくは５ｍｇ／ｌ〜２００ｍｇ／ｌであり、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌである。一方、典型的に、その他の無機物質、重金属および一般有機化学物質の含有量は、日本国における上水道水の基準を満たすものである。典型的に、本発明による電解還元水は以下の基準を満たす。カドミウム０．０１ｍｇ／ｌ以下、水銀０．０００５ｍｇ／ｌ以下、セレン０．０１ｍｇ／ｌ以下、鉛０．０５ｍｇ／ｌ以下、ヒ素０．０１ｍｇ／ｌ以下、六価クロム０．０５ｍｇ／ｌ以下、シアン０．０１ｍｇ／ｌ以下、硝酸性窒素および亜硝酸性窒素１０ｍｇ／ｌ以下、フッ素０．８ｍｇ／ｌ以下、四塩化炭素０．００２ｍｇ／ｌ以下、１，２−ジクロロエタン０．００４ｍｇ／ｌ以下、１，１−ジクロロエチレン０．０２ｍｇ／ｌ以下、ジクロロメタン０．０２ｍｇ／ｌ以下、シス−１，２−ジクロロエチレン０．０４ｍｇ／ｌ以下、テトラクロロエチレン０．０１ｍｇ／ｌ以下、１，１，２−トリクロロエタン０．００６ｍｇ／ｌ以下、トリクロロエチレン０．０３ｍｇ／ｌ以下、ベンゼン０．０１ｍｇ／ｌ以下、クロロホルム０．０６ｍｇ／ｌ以下、ジブロモクロロメタン０．１ｍｇ／ｌ以下、ブロモジクロロメタン０．０３ｍｇ／ｌ以下、ブロモホルム０．０９ｍｇ／ｌ以下、総トリハロメタン０．１ｍｇ／ｌ以下、１，３−ジクロロプロペン０．００２ｍｇ／ｌ以下、シマジン（ＣＡＴ）０．００３ｍｇ／ｌ以下、チウラム０．００６ｍｇ／ｌ以下、チオベンカルブ０．０２ｍｇ／ｌ以下。さらに、本発明による電解還元水の蒸発残留物は、典型的に８００ｍｇ以下、たとえば１０ｍｇ〜８００ｍｇであり、好ましくは５００ｍｇ以下、たとえば１０ｍｇ〜５００ｍｇである。
【００２３】
本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において−５〜−１０００ｍＶ、好ましくは−２０〜−１０００ｍＶ、より好ましくは−５０ｍＶ〜−１０００ｍＶの酸化還元電位を有する。酸化還元電位は、市販の酸化還元電位計を用いて測定することができる。
【００２４】
また本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において７〜１１のｐＨ、典型的には８〜１１のｐＨを有する。陰極において生成されたアルカリ性の電解還元水を中和することにより得られる電解還元水は、典型的に７〜８のｐＨを有し、好ましくは７．２〜７．８のｐＨを有する。中和には、リン酸ナトリウム等の緩衝剤、あるいは電気分解において陽極で得られる酸性水を使用することが好ましい。
【００２５】
さらに本発明による電解還元水は、１２℃〜１４℃において水素ラジカルを０．０１μＭ〜１０μＭ（μＭはμｍｏｌ／ｌ）、好ましくは０．１μＭ〜１０μＭ、より好ましくは１μＭ〜１０μＭの濃度で含む。以下に示すように、本発明者らは、電解還元水中に存在する水素ラジカルを定量する方法を見出すとともに、このような範囲における濃度で水素ラジカルを含有する電解還元水が抗癌（制癌）作用、抗菌作用、あるいは酸化ストレス抑制作用をもたらすことを見出した。
【００２６】
[電解還元水に含まれる水素ラジカルの定量法]
本発明者は大量の水試料を中和し、ラジカルトラップ剤である３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）反応させた後、ロータリーエバポレーターで濃縮することを試みた。その結果活性酸素消去活性の認められた電解還元水試料においては橙色の着色が認められた。しかし超純水（Milli Q水）や他のミネラルウォーターや水道水では着色が認められなかった。このことはＤＢＮＢＳが電解還元水中の活性水素と反応し新たに着色物質を作るからではないかと考えられた。この現象を利用し、水溶液中の水素ラジカルを高精度で検出できる考え、水素ラジカルの検出法および定量分析の開発を行なった。
【００２７】
この水素ラジカル検出法では、試料に３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）を添加し、水素ラジカルとの反応によりＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成し、その吸収特性に基く着色によって水素ラジカルを検出する。上記着色は３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）が水素ラジカルと反応し、ＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成する着色反応を利用する。そして、着色は波長が４５０ｎｍの吸収ピークに起因する。より具体的には、水素ラジカルの定量法は、次の（１）〜（３）の工程よりなる。
（１）５１７ｎｍ近傍に吸収を有する１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）の溶液に、白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込み、５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰と水素ガスの吹込み時間との相関のグラフを求める（検量線Ａの作成）。
（２）０〜１００μＭのシステインとＤＰＰＨを反応させ、ＤＰＰＨの５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰とシステイン濃度との相関のグラフを求める（検量線Ｂの作成）。システイン１モルが１モルの活性水素を与えると仮定して、活性水素濃度を計算する。
（３）４５０ｎｍ近傍に吸収を有する３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）の溶液に白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込み、４５０ｎｍ近傍の吸光度と活性水素濃度との相関のグラフを求める（検量線Ｃの作成）。
（４）試料に３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）を添加し、（１）と同一条件で白金黒存在下で一定の速度で水素ガスを吹込んだ後、６０℃で１時間加熱後の４５０ｎｍ近傍の吸光度を測定し、その吸光度の値から前記検量線Ｃを用いて水素ラジカルの濃度を読み取る。
【００２８】
ここで電解還元水は１０〜５００倍に濃縮されていることが好ましい。
この水素ラジカルの検出方法は次の反応に基く、光吸収特性を利用するものである。即ち、３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩（ＤＢＮＢＳ）が水素ラジカルと反応し、ＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成する。そしてＤＢＮＢＳアゾ化合物は波長が４５０ｎｍの吸収ピークを有するため、その着色によって水素ラジカルを検出できる。
【００２９】
【化１】
反応式で示すと、ＤＢＮＢＳ（式Ａ）は水又は水溶液中の水素ラジカルと反応して、ＤＢＮＢＳ−Ｈ・（式Ｂ）となり、その２分子が反応して二量体（式Ｃ）を生成する。その後加熱下で脱水してＤＢＮＢＳアゾキシ化合物（式Ｄ）が生成する。更に２個の水素と２個の酸素がとれて安定なＤＢＮＢＳアゾ化合物（式Ｅ）が生成する。このＤＢＮＢＳアゾ化合物の４５０ｎｍの吸収を検出することにより、水素ラジカルの定性分析が可能となる。
【００３１】
ＤＰＰＨは周波数が５１７ｎｍに特異吸収を有する安定なフリーラジカルである。ＤＰＰＨは水素ラジカルと定量的に反応し、５１７ｎｍの吸収が消失する。一方、白金黒（粒状白金）は大きな表面積を有し、ガス状の水素分子を水素ラジカル（原子状水素）に変換してそれを保持する。そのため溶液中で白金黒の存在下で水素ガスを吹込むことにより、容易に水素ラジカルを発生させることができる。そこで白金黒存在下で所定濃度のＤＰＰＨ水溶液に水素ガスを吹込み、その吹込み時間とＤＰＰＨの５１７ｎｍでの吸光度の減衰の関係を求めることにより、水素ラジカル濃度と水素ガスの吹込み時間との関係の検量線Ａが作成できる。
【００３２】
一方、前述の如くＤＢＮＢＳ（式Ａ）は水素ラジカルと反応して、式Ｂの活性水素付加中間体（ＤＢＮＢＳ−Ｈ・）およびその二量体（式Ｃ）を経てＤＢＮＢＳアゾキシ化合物（式Ｄ）を生成する。その後加熱により生じるＤＢＮＢＳアゾ化合物の４５０ｎｍ近傍の特異吸収を定量分析に使用する。白金黒存在下で水素ガスを吹き込むと水素ラジカルが発生することは前述のとおりであり、したがって、４５０ｎｍ近傍の吸光度と水素ガスの吹込み時間の関係を求めることにより、検量線Ａおよび検量線Ｂを用いて４５０ｎｍ近傍の吸光度と水素ラジカルの濃度の関係を示す検量線Ｃを求めることができる。
【００３３】
そこで試料中の水素ラジカル濃度を求めるには、試料溶液に所定濃度のＤＢＮＢＳを添加し、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルを反応させＤＢＮＢＳアゾ化合物を生成させた後、その４５０ｎｍ近傍の吸光度を測定し、前記検量線Ｃから水素ラジカル濃度を測定する。
【００３４】
水素ラジカルの測定において、電解還元水は１０〜５００倍に濃縮して使用することが好ましい。例えば電解還元水１２５ｍｌにＤＢＮＢＳ保存液を２００μｌ添加し、攪拌した後、ロータリエバポレーターで６０℃の恒温槽にて濃縮乾固する。これを１ｍｌの超純水（Milli Q水）で濃縮乾固物を溶解して回収する。次に６０℃恒温槽にて約１時間保温し、氷上に５分間静置し例えば１２，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得る。
【００３５】
測定例１： ＤＢＮＢＳを用いた白金黒−水素による水素ラジカル発生の検出
１−１ 試薬
ＤＢＮＢＳはラボテック（株）製を、白金黒は石福金属鉱業（株）製を、水素ガスは大洋サンソ（株）製を使用した。ＤＢＮＢＳは超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）に１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し４℃に保存し、２週間以内に使い切るようにした。
【００３６】
１−２ 白金黒−水素による水素ラジカル発生
水素ガスは白金表面上で原子状の水素になる。そこで０．０１ｍｇ／ｍｌの白金黒を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを吹きこんだ。５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分後にそれぞれ２００μｌずつ回収し１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を６０℃の恒温槽にて１時間保温した。コントロールとしては水素ガスを吹き込ませなかったものを６０℃時間保温処理した。
【００３７】
１−３ 水素ラジカルの検出
反応後のコントロールのＤＢＮＢＳ水溶液をキャリブレーションし、ＤＢＮＢＳ自身の吸光度を０とし、各ＤＢＮＢＳ試料の３５０〜６００ｎｍの波長をスキャンし差スペクトルを得た。この差スペクトルの測定は白金黒−水素処理によってＤＢＮＢＳが新たな物質に変化したことを検出するためである。また白金黒−水素処理によって生成する活性水素にＤＢＮＢＳが特異的に反応するかを調べるために白金黒のみ、水素ガスのみ、窒素ガスのみ、白金黒−窒素ガス処理した試料も行なった。
【００３８】
白金黒−水素反応によって得られたＤＢＮＢＳアゾ化合物の試料の吸収スペクトルは図１（Ｐｔ−Ｈ2）に示す如く、４２５ｎｍから４５０ｎｍにピークを持つなだらかな可視吸収スペクトルを示した。それらの試料はオレンジ色に着色していた。このことは白金黒−水素処理によってＤＢＮＢＳが新たなオレンジ色の着色物質であるＤＢＮＢＳアゾ化合物に変化したことを示す。そしてそのピークの高さは図３に示される如く、吹き込んだ水素ガス量に依存して増加していき、４５分間吹き込みにおいて最大となり、その後は減少した。
【００３９】
また白金黒−水素反応特異性を調べるために行なった白金黒のみ、水素ガスのみ、窒素ガスのみ、白金黒−窒素ガス処理した試料では全く着色が認められず、紫外部吸収においても波形に変化が認められなかった。吸収スペクトルの４５０ｎｍにおける吸光値を水素ラジカルと反応して得られたものは水素ラジカル反応値（ＡＨ値）とした。
【００４０】
測定例２： ＤＢＮＢＳを用いた電解還元水中の水素ラジカルの検出
２−１ 試薬
測定例１と同じものを用いた。
【００４１】
２−２ 電解還元水
０．０１％ＮａＣｌ水を日本トリム社製の電解還元水装置ＴＩ−８０００でレベル４（５Ａ）で電解還元し、陰極側の電解還元水を得た。
【００４２】
２−３ 水素ラジカルの検出
電解還元水１２５ｍｌにＤＢＮＢＳ保存液を２００μｌ添加し、攪拌した後、ロータリエバポレーターで６０℃の恒温槽にて濃縮乾固した。１ｍｌの超純水（Milli Q水）で濃縮乾固物を溶解し、回収した。次に６０℃恒温槽にて１時間保温し、氷上に５分間静置し、１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を得た。コントロールとして上記超純水で同様に行なったＤＢＮＢＳ試料をキャリブレーションし、ＤＢＮＢＳ試料の３５０〜６００ｎｍの波長をスキャンし差スペクトルを得た。
【００４３】
測定例１で求めた吸収スペクトルと同様のスペクトルが電解還元水において認められ（図４：電解還元水）、電解還元水中に水素ラジカルが存在することが確認された。
【００４４】
測定例３： 電解還元水の濃度と水素ラジカル反応値の関係、および電解強度と水素ラジカル反応値の関係
電解還元水の濃度と水素ラジカル量の相関関係があるかどうかを試験した。電解還元水を超純水（Milli Q水）で希釈して、それぞれ試料の水素ラジカル反応値を測定した。また電解強度と水素ラジカル反応値との関係を調べるためにＮａＣｌ濃度が０．０００１％から０．０１％までの水を用意し、それぞれを電解還元した水の活性水素反応を測定した。電解還元水は日本トリム社製の電解還元水装置ＴＩ−８０００でレベル４（５Ａ）で電解還元し、陰極側の還元水を得た。
【００４５】
電解還元水の％体積が２５、５０、７５、１００％の水を希釈により作成し、水素ラジカル反応値を測定したところ、図５に示す如く電解還元水の濃度とともに水素ラジカル反応値が上昇していたので、この測定系は電解還元水の試料においても定量性があることが明らかとなった。また電気分解で電解還元水を得る際の電解強度を変化させた水溶液を作成するために、水溶液の塩濃度（ＮａＣｌ濃度）を変えて得られた電解還元水においては図６に示す如く、電解強度（ＮａＣＬ濃度）とともに水素ラジカル反応値も上昇した。このことは電解強度を強くすることによって水素ラジカルも多く発生することを意味する。
【００４６】
測定例４： 水素ラジカルとＤＢＮＢＳとの反応過程の解析
４−１ 試料
ＤＢＮＢＳはラボテック（株）製、白金黒粉末Ｍタイプは石福金属鉱業（株）、水素ガスは大洋サンソ（株）製のものをそれぞれ用いた。
【００４７】
４−２ ＤＢＮＢＳの反応
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金黒を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを１時間吹き込み、加熱処理しないものと、６０℃で１時間加熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを分析試料に用いた。
【００４８】
４−３ 分析試料の調整
（１） 高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）分析試料
分析試料をそれぞれ０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌを用いた。
【００４９】
（２） ＮＭＲ、ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析における分析試料
ＨＰＬＣより、分離した非加熱処理である反応中間体は、無水酢酸（和光純薬株式会社製）を用いアセチル化し安定化させたものを用い、加熱処理により分離されたアゾ化合物は、再度ＨＰＬＣ分取することにより分離度を完全なものにして用いた。
【００５０】
（３） 微量元素分析における分析試料
非加熱処理の反応中間体はＨＰＬＣより分離したもの用い、加熱処理により分離されたアゾ化合物はＮＭＲ、ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析と同様のものを用いた。
【００５１】
４−４ 機器測定条件
（１） ＨＰＬＣはWaters社のWaters600E、移動相はMilli-QWater、流速は５ｍｌ／ｍｉｎ、注入量は、Waters717のオートサンプラーで採取した２０００μｌ、カラムはWaters社製Nova-Pak C18 １９×３００ｍｍを用いた。また検出器にはWaters社のWaters996フォトダイオードアレイ検出器を用い２００−６００ｎｍの波長領域において１．２ｎｍ間隔でデータを取込んだ。スペクトルクロマトグラムによる解析は、コンパックＶ７００パーソナルコンピュータを用いミレニアム３２（Waters社）で作成したプログラムで行なった。
【００５２】
（２） ＴＯＦ−ＭＡＳＳ分析計は、Voyager（パーセプティブ、バイオシステム社）を使用した。Voyagerは、窒素レーザ（３３７ｎｍ）を搭載した、加速電圧２０ｋＶのレーザイオン化飛行時間型質量分析装置である。加速電圧は、２０ｋＶを使用し、飛行モードはリニアモードで分析を行なった。マトリックスは、２−（４−ヒドロキシ−フェニルアゾ）−安息香酸（ＨＡＢＡ）（アルドリッチケミカル社製）１．３ｍｇを、５０：５０水・アセトニトリル１ｍｌに溶解し使用した。試料スライドに０．５μｌの試料を塗布して自然乾燥した後、同量のマトリックス溶液を添加し、再度自然乾燥してイオン源に導入した。
【００５３】
（３） ＮＭＲは、４００ＭＨｚ ＮＭＲ（ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＧＳＸ４００ＮＭＲシステムスペクトロメータ）を使用し、1Ｈ−ＮＭＲ測定を行なった。溶媒として、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）（和光純薬株式会社製）およびデュートリウムオキシド（Ｄ2Ｏ）（アルドリッチケミカル社製）を使用した。
【００５４】
４−５ 解析結果
（Ａ） 高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）測定結果
（ｉ） 分析試料（１）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの吹き込み速度で水素ガスを１時間吹き込み、０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌをフォトダイオードアレイ検出器付きＨＰＬＣ用いて、非加熱処理の試料を測定した。その測定結果を図７に示す。図７において非加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物の保持時間約９．０分に認められるピークは２８０ｎｍに吸収ピークが認められた。これは式Ｃに示される二量体に相当する。
【００５５】
（ii） 分析試料（２）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液２０ｍｌに４５ｍｌ／ｍｉｎの通気速度で水素ガスを１時間吹き込み、６０℃で１時間加熱処理したものを氷冷し反応を停止させたものを０．４５μｍのフィルタで濾過し、その２０００μｌをフォトダイオードアレイ検出器付きＨＰＬＣ用いて、加熱処理の試料を測定した。測定結果を図８に示す。図８において加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物の保持時間８．５分に認められるピークは４５０ｎｍに吸収ピークが認められた。これは式Ｅで示されるＤＢＮＢＳアゾ化合物に相当する。
【００５６】
（Ｂ） マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）の測定結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、マススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて測定した。
【００５７】
アセチル化した２８０ｎｍに吸収を持つ非加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のマススペクトルは図９に示す如くｍ／ｚ６７５．４４９にイオンピークが示され、これは中間体（式Ｃ）よりＢｒが１つ脱離し、式Ｃの中間体のヒドロキシル基が１つアセチル化したものと一致した。
【００５８】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物をマススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて測定した。
【００５９】
４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のマススペクトルが図１０に示す如くｍ／ｚ６５６．３２９にイオンピークが示され、Ｎａが２つ脱離したＤＢＮＢＳアゾ化合物（式Ｅ）と一致した。
【００６０】
（Ｃ） ＮＭＲ測定結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、1Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した結果を図１１に示す。図１１からアセチル化した２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物のスペクトルが示されている。コントロールとしてアセチル化に用いた無水酢酸を同様にＨＰＬＣ分取により採取したものを示した。コントロールと比較し、ケミカルシフト２．０ｐｐｍにメチル基の存在が示されたことにより、非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物のヒドロキシル基と無水酢酸が直接反応が生じたことを示している。
【００６１】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、1Ｈ−ＮＭＲを用いて測定した結果を図１２に示す。
【００６２】
４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理のＤＢＮＢＳ反応物のプロトン、ケミカルシフトは６．６〜６．７ｐｐｍであり、６．７５７５ｐｐｍ，６．６３４ｐｐｍに左右に１本づつの対照なシグナルに分裂している。これはアゾ基の形成にともなって、メタ位のプロトン間にカップリングが生じたことを示している。
【００６３】
（Ｄ）微量元素分析結果
（ｉ）分析試料（１）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、２８０ｎｍに吸収を有する非加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、微量元素分析した。炭素含量１９．９３％（計算値１９．３５％）、水素含量１．６１％（計算値１．６１％）、窒素含量３．７６％（計算値３．７６％）となった。これは中間体より、Ｎａが２つ脱離し、３水和物のものと一致する。
【００６４】
（ii）分析試料（２）
上記ＨＰＬＣ測定において得られた、４５０ｎｍに吸収を有する加熱処理ＤＢＮＢＳ反応物を、微量元素分析した。
炭素含量２１．５３％（計算値２１．４３％）、水素含量１．７３％（計算値１．７９％）、窒素含量３．８４％（計算値４．１７％）となった。これはＤＢＮＢＳアゾ化合物より、Ｂｒ、Ｎａが１つづつ脱離し４水和物としたものと一致する。
測定例５：水素ラジカルの定量分析
５−１ １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）と水素ガス吹込み時間との関係（検量線Ａの作成）
０．１Ｍの酢酸干渉液（ｐＨ５．５）１．９６ｍｌにエタノールおよび０．５ｍＭのＤＰＰＨ・エタノール溶液１ｍｌと１．０ｍｇ／ｍｌの白金黒・酢酸緩衝液０．０５ｍｌを加えて全量を５ｍｌとし、４５ｍｌ／ｍｉｎの速度で水素ガスを吹込み、一定の時間ごとに２００μの試料を採取し、ＤＰＰＨの特異吸収である５１７ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の減衰と吹込み時間の関係を示すグラフ（検量線Ａ）として図１３を得た。
【００６５】
５−２ 検量線Ｂの作成
０〜１００μＭのシステインとＤＰＰＨを反応させ、ＤＰＰＨの５１７ｎｍ近傍の吸光度の減衰とシステイン濃度との相関のグラフを求めた。グラフ（検量線Ｂ）として図１４を得た。
【００６６】
５−３ ３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルフォン酸のナトリウム塩アゾ化合物（ＤＢＮＢＳアゾ化合物）の吸光度と水素ラジカル濃度の関係（検量線Ｃの作成）
０．０１ｍｇ／ｍｌの白金を含む２．５ｍｇ／ｍｌのＤＢＮＢＳ溶液に４５ｍｌ／ｍｉｎの速度で水素ガスを吹込み、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルを反応させながら、一定の時間ごとに２００μｌの試料を採取し、ＤＢＮＢＳと水素ラジカルの反応生成物であるＤＢＮＢＳアゾ化合物の特異吸収である４５０ｎｍの吸光度を測定し図１５に示す検量線Ｃを作成した。
【００６７】
５−４ 試料中の水素ラジカル濃度の測定
（１）試料調製
電解還元水をｐＨ７．０に調製し、その製造条件によりレベル１〜レベル４の試料を調製した。ここで電解還元水は隔膜で隔てられた陰極室と陽極室のそれぞれにＮａＯＨを含む水溶液を導入し、陰極と陽極の間に通電し、前記ＮａＯＨ水溶液を電気分解し、前記陰極室で得られたものである。これらの酸化還元電位（ＯＲＰ）およびｐＨを表１に示す。対照例として超純粋（ＭｉｌｌｉＱ水）を用いた。
【００６８】
１２５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水、レベル１〜４の電解還元水のそれぞれにＤＢＮＢＳストック溶液（１２．、５ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて、１２５倍に減圧濃縮した。ＭｉｌｌｉＱ水１ｍｌで濃縮後のナス型フラスコの内壁を洗い、しばらく静置し溶液を回収した。回収後の溶液を６０℃湯浴中（遮光）で加熱し、その後氷中で冷却し反応を停止した。回転速度１２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して上澄を採取した。
【００６９】
（２）吸光度の測定
上記試料の周波数４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定は同じ試料について、それぞれ三個の試料を用いて測定し、その平均値を求めた。吸光度の測定結果を表１に示す。
【００７０】
（３）水素ラジカル濃度の測定
コントロールとして用いたＭｉｌｌｉＱ水の４５０ｎｍでの平均吸光度０．０３５８を各レベルの試料の吸光度を差し引く、その差の吸光度の値から、検量線Ｃを用いて、水素ラジカル濃度を求めた。なお１２５倍に濃縮した電解還元水は水素ラジカル濃度がレベル１〜４で０．０３ｍＭ〜０．１２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）の範囲である。
【００７１】
【表１】
【実施例】
実施例１
図１および図２に示す装置を使用して電解還元水を製造した。電解還元水の製造プロセスは上述したとおりである。水道水を逆浸透膜でろ過して得られた純水にＮａＯＨを０．０１質量％の濃度で添加し、得られたＮａＯＨ水溶液を、電圧５Ｖ〜１００Ｖ、電流５ｍＡ〜２Ａ、電解時間５分〜１２０分の条件下、電流密度３．２ｍＡ／ｃｍ2（電解度１）、６．４ｍＡ／ｃｍ2（電解度２）、１２．９ｍＡ／ｃｍ2（電解度３）、１６．２ｍＡ／ｃｍ2（電解度４）、２５．８ｍＡ／ｃｍ2（電解度５）でそれぞれ電気分解して、５種類の電解還元水を製造した。得られた電解還元水について、温度、ｐＨ、酸化還元電位、溶存酸素量、溶存水素量、および水素ラジカル濃度を測定した。酸化還元電位は、東亜電波工業製「酸化還元電位計」を用い、１２℃〜１４℃で検体水に測定用電極を漬けることによって測定した。溶存酸素量は東亜電波製溶存酸素計ＤＯ−１４Ｐ型にて測定した。また、溶存水素量は東和電波製溶存水素計ＤＨＤ１−１型にて測定した。水素ラジカル濃度は上述した方法に従って測定した。
【００７３】
得られた電解還元水についての測定結果を、水道水の測定結果とともに表２および表３に示す。表２および表３は同じような結果を示しているが、採取した水を変えて、異なる日に測定したものである。両表を比較参照して、再現性のよいデータが得られることがわかった。また表４に、電気分解の条件（電流密度の値）を示す。水道水は、電気分解を行なっていないので、その電流密度は０．０ｍＡ／ｃｍ2と表わしている。電気分解の条件で重要なのは、電流密度であり、これを、マイクロコンピュータで制御する。電流密度を決めると、必要な電圧とＮａＯＨの濃度が必然的に決まってくる。
【００７４】
【表２】
【表３】
【表４】
実施例２
得られた電解還元水（表２中の電解度５のもの）の、癌転移抑制効果を評価した結果を以下に示す。
【００７８】
図１６は、高転移性ヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の、in vitroでの、転移モデル系における電解還元水の抑制効果を示したものである。ＨＴ１０８０は、細胞銀行（例えば、ＪＣＲＢ Ｃｅｌｌ ＢａｎｋまたはＡＴＣＣ（米国））より入手したものを用いた。
【００７９】
ＨＴ１０８０細胞は、１０％牛胎児血清添加ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ2／９５％ａｉｒ環境下で培養した。ケモタキセルのフィルタ（ポアサイズ８μｍ）に、マトリゲルを２５μｇ／フィルタとなるようにコートした。サブコンフルエントのＨＴ１０８０細胞を、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＭＥＭ培地（最少必須培地Minimum Essential Medium（栄養成分を最小限に留めた培地））に懸濁し、細胞数を４×１０5／ｍｌに調整した。得られたものの２００μｌをチャンバ上室に添加した。細胞添加後、直ちに下室（２４穴プレート側）に、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むＭＥＭ培地７００μを加え、ＣＯ2インキュベータ内で培養した。６時間後、チャンバを取出し、フィルタ上面の細胞を綿棒で除いた後、ＷＳＴ−１（生細胞の特異的な代謝能（細胞数）に応じて変色する試薬）の入った２４穴プレートに移し、１６時間培養後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。図中、ｃｔｒｌは、純水を培地に用いて行なった結果であり、ＮａＯＨｍｉｘは、表２中の電解度５で得られた電解還元水を培地用いて行なった結果である。ＮａＯＸｍｉｘの場合は、ｃｔｒｌの場合に比べて、著しくＨＴ１０８０細胞の浸潤転移が減少している。これは、電解還元水が、ヒト繊維肉腫細胞の浸潤転移を抑制することを表わしている。
【００８０】
図１７は、１週間細胞障害性試験を示す図である。ＨＴ１０８０細胞を、純水または電解還元水（電解度５のもの）を用いて調製した１０％牛胎児血清添加ＭＥＭ培地で、１週間培養後、ＷＳＴ−１を添加し、生細胞数を４５０ｎｍの吸光度で測定した。純水を用いた場合のｃｔｒｌの場合と電解還元水（ＮａＯＨｍｉｘ）を用いた場合との間には、目立った差はなかった。すなわち、電解還元水は、健康な細胞の増殖に対して、影響を与えないということが見出された。図１６と図１７の結果より、ＮａＯＨ電解還元水は、細胞毒性を持つことなく、転移浸潤活性を抑制するということが明らかとなった。
【００８１】
癌細胞の転移に重要な役割を果たすマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に焦点を合わせて、その中でも、特に癌転移と関係が深いことで知られるＭＭＰ２およびＭＭＰ９について解析した。ＨＴ１０８０細胞を、ケモタキセルチャンバ上で４８時間培養した後、その培養上澄みを、遠心装置で浄化後、回収した。上澄み１２μｌを、１ｍｇ／ｍｌゼラチンを含む１０％ポリアクリルアミドゲルに添加した。ゲル電気泳動を行なった後、ゲルを２％トリトンＸ−１００で１時間洗浄後、３７℃で６０時間保温した。その後、ゲルを０．１％Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓで染色した。この操作により、ゲラチナーゼ活性は、白抜きバンドとして検出された。図１８は、ザイモグラフィによるゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ活性の分析結果を示す図である。図１８において、白いバンドの幅が広いほど、癌転移を促進するＭＭＰの活性が強いことを示している。分析の結果、ＮａＯＨ電解還元水は、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の発現には影響を与えなかったが、ＭＭＰ２の活性化を顕著に抑制することが見出された。以上の結果から、ＮａＯＨ電解還元水がＭＭＰ２の活性化を抑えることによる癌転移抑制効果を持つことが明らかとなった。
【００８２】
癌細胞の転移機構を阻害することは、転移抑制のみならず、癌細胞の浸潤活性による血管新生の抑制と、癌細胞の悪性化を抑える上でも重要である。また、癌転移を抑制する薬剤は、長期間効果を持続し、なお副作用が極力少ないものでなければならない。本発明において、ＮａＯＨ電解水が細胞に障害を与えることなく、癌細胞の転移を抑制することが証明できた。これは、日常の飲料水として使用することで、癌の進行を予防できる可能性を示唆しており、これからの癌治療法に与える意義は大変大きいと考えられる。
【００８３】
実施例３
大腸菌を電解還元水中に放置し、そのコロニー形成への影響を調べた。大腸菌（Esherichia coli JM109）を、Milli-Q（純水）を使用して調製したLB Broth Base（LIFE TECHNOLOGIES）にて、３７℃、３〜４時間振とう培養し、ほぼ一定の吸光度（約０．５７６）まで培養した（約１５×１０7個／ｍｌ）。得られた培養液を、電解還元水（上記表２の電解度５のもの）およびMilli-Q（純水）でそれぞれ調製した生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）によって１／１０００００に希釈した。この希釈液を、室温で放置し、次いで、Milli-Q（純水）で調製したLB Broth Baseに１．５％寒天を加えた平板培地に０．１ｍｌ滴下し、コンラージ棒（日水製薬製）によって、均一に塗布し、培養した。希釈液の室温での放置時間をそれぞれ０、３０、６０、１２０および１８０分とし、それぞれの処理時間のものについて、上述した平板培養を行った。所定の時間培養した後、２つの平板培地上のコロニー数をそれぞれ肉眼で測定し、その平均値を求めた。各放置時間に対して得られたコロニー数の平均値は、表５に示すとおりである。電解還元水で培養液を処理することによって、その後の大腸菌の増殖が阻害されることがわかった。その阻害効果は、電解還元水により処理する時間が長くなるにしたがって、大きくなる傾向が見られた。
【００８４】
【表５】
実施例４
酸化ストレスを与えた神経細胞の細胞死を電解還元水によって抑制できるかどうか検討した。Neuroblastoma N1E115細胞を２％Dimethyl Sulphoxideを添加した培地で７日間培養し、さらに無血清培地で１日培養し、ニューロンに分化させた。その後、過酸化水素を培地に０、１００、２００、３００μＭそれぞれ添加し、２４時間培養して酸化ストレスを与えた。酸化ストレスを与えた細胞を、純水を使用して調製した０．０１％ＮａＣｌ水、および上記表２の電解度４の電解還元水を使用して調製した０．０１％ＮａＣｌ水にそれぞれ懸濁し、処理した後、ＷＳＴ−８アッセイを使用して４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。純水を使用したものと、電解還元水を使用したものの結果を比較したところ、過酸化水素０、１００および３００μＭ添加の場合には差が認められなかったが、２００μＭ添加の場合、電解還元水による処理を行った方が、吸光度が高く、電解還元水は、細胞の酸化ストレスに対する保護効果あるいは抑制効果を奏し得ることが示唆された。過酸化水素３００μＭ添加の場合に差がでなかったのは、酸化ストレスが強すぎたためであると考えられる。
【００８６】
【発明の効果】
上述したように本発明によれば、次亜塩素酸や塩素が十分に排除され、有用な生理学的活性を有し得る電解還元水を提供することができる。
【００８７】
本発明による電解還元水は、癌を治療または予防するための水として使用することができる。この場合、癌に対する治療が必要な患者に、本発明による電解還元水をそのまま投与（たとえば、飲用水として経口投与、あるいは静脈経路による非経口投与）することができる。したがって、本発明による電解還元水は制癌剤として機能することができる。さらに、本発明による電解還元水は、癌に対する治療が必要な患者に、他の有効成分（たとえば制癌剤）を投与するための担体として使用してもよい。この場合、他の有効成分と本発明による電解還元水との相乗作用または相加作用を期待することができる。また、本発明による電解還元水を癌の予防のため使用してもよい。この場合、予防を必要とするものは、適当量を必要に応じて、たとえば飲用水として摂取すればよい。
【００８８】
また、本発明による電解還元水は、細菌の増殖を阻害するための水として使用することができる。この場合、たとえば、次のような処理を行うことができる。（ａ）細菌を直接電解還元水にさらす。（ｂ）細菌の増殖を阻害することが必要な製品、たとえば、食品、飲料、化粧品、医薬品などの原料や成分として電解還元水を使用する。（ｃ）細菌の増殖を阻害することが必要な製品、たとえば、野菜、果実、魚、肉類等の生鮮食品、あるいは花卉類などを電解還元水によって洗浄する。（ｄ）細菌による汚染を防ぐため、食器類、容器類、食品製造設備などを電解還元水によって洗浄する。（ｅ）医療や必要な場合に、細菌の増殖した部位や、細菌の増殖を防ぐべき部位を、電解還元水によって洗浄する。これらの処理において、本発明による電解還元水は、抗菌剤として機能し得る。さらに、本発明による電解還元水は、他の有効成分（殺菌剤または抗菌剤）の担体として使用することができ、この場合、他の有効成分と本発明による電解還元水との相乗作用または相加作用を期待することができる。
【００８９】
さらに本発明による電解還元水は、細胞を酸化ストレスから保護するための水として使用することができる。この場合、たとえば、酸化ストレスを受けた細胞あるいは生体に電解還元水を供給することにより、酸化ストレスの影響を低減することができる。また、本発明による電解還元水を日常的に摂取することにより、酸化ストレスに起因する顕著な疾患の誘発を阻止することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 水の電気分解に使用される電解槽を示す模式図である。
【図２】 本発明に使用される電解還元水製造装置の一例を示す模式図である。
【図３】 ４５０ｎｍにおける水素ガス吹き込み時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【図４】 ＤＢＮＢＳアゾ化合物の吸収特性を示すグラフである。
【図５】 電解還元水と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。
【図６】 塩化ナトリウム濃度と水素ラジカル反応値の関係を示すグラフである。
【図７】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のＨＰＬＣ測定結果を示すチャートである。
【図８】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のＨＰＬＣ測定結果を示すチャートである。
【図９】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のマススペクトル測定チャートである。
【図１０】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のマススペクトル測定チャートである。
【図１１】 ＤＢＮＢＳ非加熱処理反応物のＮＭＲスペクトル測定チャートである。
【図１２】 ＤＢＮＢＳ加熱処理反応物のＮＭＲスペクトル測定チャートである。
【図１３】 検量線Ａを示すグラフである。
【図１４】 検量線Ｂを示すグラフである。
【図１５】 検量線Ｃを示すグラフである。
【図１６】 ＮａＯＨ電解還元水が癌細胞転移抑制効果を示す図である。
【図１７】 ＮａＯＨ電解還元水の細胞障害性試験の結果を示す図である。
【図１８】 ザイモグラフィによるゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ活性の分析の結果を示す図である。
【符号の説明】
１ 陰極、２ 陰極室、３ 陽極、４ 陽極室、５ 隔膜。
Claims (11)
- 電解質を含む一方、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である水の電気分解によって陰極に生成された電解還元水であって、
残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満であり、
塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下であり、
１２℃〜１４℃において−５〜−１０００ｍＶの酸化還元電位を有し、
１２℃〜１４℃において７〜１２のｐＨを示し、かつ
１２℃〜１４℃において水素ラジカルを０．０１μＭ〜１０μＭの濃度で含むことを特徴とする、電解還元水。 - １２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａにおいて０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍの溶存水素を含有することを特徴とする、請求項１に記載の電解還元水。
- １２℃〜１４℃、１０１３２５Ｐａにおける溶存酸素量が、１０ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の電解還元水。
- 中和されることによって７〜８のｐＨを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の電解還元水。
- 前記電解質がＮａＯＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の電解還元水。
- 純水に４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌの濃度でＮａＯＨを含有させた水の電気分解によって生成されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の電解還元水。
- 請求項１〜６のいずれかに記載の電解還元水を得るための電解還元水の製造方法であって、
水道水を蒸留することによって得られた、残留塩素の濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満でありかつ塩素イオンの濃度が５ｍｇ／ｌ以下である純水にＮａＯＨを溶解させる工程と、
得られたＮａＯＨを含む水を電気分解する工程と
を備えることを特徴とする、電解還元水の製造方法。 - 前記ＮａＯＨを含む水中のＮａＯＨの濃度が４ｍｇ／ｌ〜８００ｍｇ／ｌであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の電解還元水からなる、癌を治療または予防するための水。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の電解還元水からなる、細菌の増殖を阻害するための水。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の電解還元水からなる、細胞または生体を酸化ストレスから保護するための水。
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