JP4653945B2 - 薬理機能水、およびその用途 - Google Patents
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Description
本願出願人は、先に出願しすでに公開され、この引用によって本願発明にその記載内容が取り込まれる再公表特許WO99/10286号において、水素イオン指数(以下、「pH」と称する。)と酸化還元電位(以下、「ORP」と称する。)とを互いに独立して制御できる電解槽および電解水生成装置を開示している。同出願の概要は以下に示す通りである。すなわち、被電解原水が導入される電解室と、前記電解室内と前記電解室外を区画する一つ以上の隔膜と、前記電解室内外のそれぞれに、前記隔膜を挟んで設けられた少なくとも一つ以上の電極板対と、前記電解室内に設けられた電極板を陰極とする一方で前記電解室外に設けられた電極板を陽極として両極間に電圧を印加する電源回路と、を備え、前記電解室外の電極板が前記隔膜に接触または僅かな隙間を介して設けられている還元電位水生成装置である。同装置における陰極側には、原水のpHを大きく変えることなく、ORPが大きく負の値に引き下げられた電解還元電位水(以下、「還元電位水」という場合がある。)が生成される。以下では、特にことわらない限り、「電解処理」とは、上述の還元電位水生成装置を用いて毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水式に電解処理することをいう。
この式は、図1に示すように、pHとORPとが比例関係(pHがアルカリ側に傾くほどORP値は負に傾く)にあることを示している。ここで、pHに対応するORP値が所定値を超える値を示すとは、ORP値が上記ネルンストの式にしたがう値を下回ることをいう。ここでは、こうした条件を満足する水を還元電位水と呼ぶことにする。たとえば、上記のネルンストの式にpH7を代入すると、ORPは−493(mV)程度になる。つまり、pH7ではORPが−493(mV)程度以下の水が還元電位水に相当することになる。ただし、ここで定義した還元電位水の範疇に属するもののなかでも、溶存水素濃度の多少の差が厳然として存在するが、これについては、その溶存水素濃度の定量分析方法と併せて後に詳述する。
2.1 抗酸化方法
本発明によれば、水素溶存水に、水素酸化還元酵素(ただし、予め生体内に存在するものを除く)または貴金属コロイドである触媒を作用させる過程を通じて、該水素溶存水中に含まれる基質としての分子状水素を、生成物としての活性水素に分解(活性化)する反応を促進させることにより、電子の欠乏に起因して酸化状態にあるか、または酸化から防御したい抗酸化対象を、電子が充足された還元状態にすることを特徴とする抗酸化方法が提供される。
水素溶存水とは、水素を含有している水全般を想定している。また、ここでいう水(原水という場合もある。)とは、水道水、精製水、蒸留水、天然水、活性炭処理水、イオン交換水、純水、超純水、市販のペットボトル水、後述する生体水、水中で化学反応により分子状水素を発生させた水など、すべての水を含む。さらに、こうした水に電解助剤や後述する還元剤を加えた水全般をも、本発明の技術的範囲の射程に捉えている。さらにいえば、水素を含有している水であるという条件さえ満足すれば、その液性が酸性か、中性か、またはアルカリ性かの別を問わず、また、その溶存濃度の高低をも、原則として問わない。ただし、本発明を適用することで発現する抗酸化機能は、触媒を介して分子状水素を活性水素に置換する過程で放出される電子に由来しているので、分子状水素の溶存濃度が高いほうが、より大きな抗酸化機能の発現を期することができる。
触媒とは、前記水素溶存水中に含まれる基質としての分子状水素を、生成物としての活性水素に分解する反応を触媒する機能を有するもの全般を想定している。すなわち、本発明に係る触媒機能の本質は、分子状水素の活性化を円滑に促進することにあるが、その機能のなかには、分子状水素から電子を受け取る(ひとつの分子状水素を活性化することで2個の電子が得られる;H2 →2e− +2H+ )こと、並びに、受け取った電子を一旦プール(触媒への吸着や吸蔵の概念を含む)した後、又はプールすることなく抗酸化対象に供与すること、が含まれる。なお、電子を抗酸化対象に供与するとは、酸化状態にある抗酸化対象それ自体を還元するケースと、酸化から防御したい抗酸化対象を酸化しようと企む活性酸素種などの酸化物質それ自体を還元するケースと、の両者を含む概念である。
以下に、電子伝達体の候補を挙げておく。なお、電子伝達体は酸化型であるか還元型であるかを問わないが、還元型の電子伝達体では、あらかじめ余剰電子を持っているため、電子をより放出しやすい点で有利であるといえる。
メチルチオニン塩化物、テトラメチルチオニン塩化物
化学式=C16H18ClN3S・3(H2O)
還元型メチレンブルーは、ロイコメチレンブルーという。
化学式=C13H10N2O
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)が産生する抗生物質のひとつである。ピオシアニンは可逆的に酸化還元反応を行い、酸化型は、アルカリ性で青色を呈色する場合と、酸性で赤色を呈色する場合と、の2種類がある。また、還元型は、還元型メチレンブルー(ロイコメチレンブルー)と同様に無色である。
略称=PMS
化学式=C14H14N2O4S
フェナジンメトスルフェートは光分解されやすい傾向がある。
光に不安定な上記PMSの代替として開発され、光に安定である。
たとえば、FeCl3 , Fe2(SO4)3 , Fe(OH)3 など多数がある。本来の目的は、鉄(III)イオンであるFe(3+)をイオンとして得るための試薬である。生体中には、赤血球のヘモグロビンのヘム鉄としての存在が考えられる。なお、ヘム鉄は、独立した鉄イオンとは性質が異なる。
生体中に存在するが、体外から吸収したものであり、ヒトでは合成できない。
略称=GSH
生体内に多く存在するSH化合物であり、ヒトもこれを合成する遺伝子をもっていると推察される。3個のアミノ酸(グルタミン酸−システイン−グリシン=Glu-Cys-Gly)からなるポリペプチドであり、グリオキサラーゼの補酵素であり、細胞内還元剤、老化防止剤としての機能などが知られている。また、グルタチオンは、酸素(O2)を直接(非酵素的に)還元する機能を有している。
アミノ酸のひとつであるSH化合物であり、タンパク質を摂取して、消化分解した最終的な生成物である。上述したグルタチオンの構成要素であり、SH基を有するアミノ酸である。これも、グルタチオンのように、2個のシステインCysが、それぞれ水素原子1個を放出して、ジスルフィド結合(−s−s−)して酸化型システインになる。
生体中にはほとんど存在しないが、イチゴ類に0.05%程度含まれている。基本的な還元剤であり、ヒドロキシルラジカルを、非酵素的に、かつ効果的に消去し、水に変える機能を有している。
(k) 没食子酸(C7H6O5)(3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸)
植物の葉、茎、根などに広く存在し、一般に止血剤や、食品用抗酸化剤(食品添加物)として用いられる。そのアルカリ性水溶液は、特に還元力が強い。酸素と反応しやすい傾向がある。
抗酸化対象とは、電子の欠乏に起因して酸化状態にあるか、または酸化から防御したい対象物全般を想定している。なお、ここでいう酸化とは、酸素、熱、光、pH、イオン等の直接的または間接的な作用によって対象物から電子が引き抜かれる現象をいう。そして、抗酸化対象とは、具体的には、たとえば、生体細胞や生体臓器、または、ビタミン等の抗酸化物質、食品、医薬部外品、医薬品、化粧品、飼料、後述する酸化還元色素、ならびに水それ自体などを、本発明の技術的範囲の射程に捉えている。なお、ここで抗酸化対象として列挙したものはあくまで例示に過ぎず、これらのみに拘泥する趣旨ではないことを明らかにしておく。
本発明によれば、原水に、基質としての分子状水素を含有させてなる水素溶存水と、前記水素溶存水に含有され、前記分子状水素を、生成物としての原子状水素に分解する反応を触媒する貴金属コロイドと、からなる抗酸化機能水を有効成分として含有し、副作用なしに薬理機能を発揮することを特徴とする薬理機能水が提供される。
2H2 O+2e− →2OH− +H2 ↑
なる反応が生じる。また、隔膜115を挟んだ電解室113外の電極板116の表面、すなわち当該電極板116と隔膜115との間においては、
H2 O−2e− →2H+ +1/2・O2 ↑
なる反応が生じる。
H2 O−2e− →2H+ +1/2・O2 ↑
なる反応が生じる一方、隔膜115を挟んだ電解室113外の電極板116の表面、すなわち当該電極板116と隔膜115との間の水膜においては、
2H2 O+2e− →2OH− +H2 ↑
なる反応が生じる。
以下に、本発明に係る水素溶存水に貴金属コロイド触媒(Ptコロイド/Pdコロイド)を含有させたとき、同水素溶存水中に含まれる化学的に不活性な分子状水素が活性化することで発現する還元活性またはラジカル消去活性の各評価試験について、各自の実施例と参考例をそれぞれ示す。
(1−A);還元力評価試験手順
和光純薬工業株式会社製の標準緩衝液6.86(リン酸塩水溶液)および9.18(ホウ酸塩水溶液)を、それぞれ精製水で10倍希釈したpH緩衝水溶液を調製する。以下では、これら2種類の希釈水を、「基本水6.86」、「基本水9.18」とそれぞれ呼ぶ。また、田中貴金属製の白金コロイド(その粒径分布は2〜4nmであり、分散剤としてポリビニルピロリドンを含有)4%溶液0.6gを、和光純薬工業株式会社製の蒸留水500mLに溶かしたものを「Pt基準液」と呼ぶ。なお、Pt基準液の白金成分の濃度C(Pt)は、計算式C(Pt)=0.6g×0.04/500mLから48mg/L濃度となる。そして、上記2種類の基本水6.86および9.18と、Pt基準液とを用いて、各4種類、都合8種類のサンプル水溶液を調製した。それらを以下に示す。
ii.基本水(6.86)1494mLに、Pt基準液を6mL加えた、Ptコロイド入りの水溶液
iii.基本水(6.86)を電解処理した水溶液
iv.基本水(6.86)1494mLにPt基準液を6mL加えてPtコロイド入りの水溶液とし、さらに、同水溶液を電解処理した水溶液
v.基本水(9.18)
vi.基本水(9.18)1494mLに、Pt基準液を6mL加えた、Ptコロイド入りの水溶液
vii.基本水(9.18)を電解処理した水溶液
viii.基本水(9.18)1494mLに、Pt基準液を6mL加えてPtコロイド入りの水溶液とし、さらに、同水溶液を電解処理した水溶液
なお、上記i〜viiiの都合8通りの各サンプル水溶液において、pH、ORP(mV)、温度T(°C)、Ptコロイドの濃度を、次の表2にまとめて示す。
(参考例1)
サンプルiの基本水6.86である触媒非含有水溶液にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例1とし、その結果を図6に示す。
サンプルiiの(基本水6.86+Pt基準液)である触媒含有水溶液にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例2とし、その結果を図6に示す。
サンプルiiiの(基本水6.86+電解処理)である触媒非含有電解処理水にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例3とし、その結果を図6に示す。
サンプルivの(基本水6.86+電解処理+Pt基準液)である触媒含有電解処理水にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を実施例1とし、その結果を参考例1〜3と対比させつつ図6に示す。
サンプルvの基本水9.18である触媒非含有水溶液にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例4とし、その結果を図7に示す。
サンプルviの(基本水9.18+Pt基準液)である触媒含有水溶液にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例5とし、その結果を図7に示す。
サンプルviiの(基本水9.18+電解処理)である触媒非含有電解処理水にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を参考例6とし、その結果を図7に示す。
サンプルviiiの(基本水9.18+電解処理+Pt基準液)である触媒含有電解処理水にメチレンブルーを加えた水溶液のメチレンブルー吸光度(A589)を実施例2とし、その結果を参考例4〜6と対比させつつ図7に示す。
実施例1、2の結果を参考例1〜6と対比させつつ考察すると、実施例1、2の触媒含有電解処理水は、参考例1〜6と比較して、そのpHの差異にかかわらず特異的にメチレンブルーを還元しており、触媒含有電解処理水だけが大きな還元活性を示しているといえる。なお、メチレンブルー水溶液の青色呈色の有無を目視で確認すると、実施例1、2の触媒含有電解処理水だけが無色透明であり、メチレンブルーの青色消失を視認できた。なお、参考例1〜6では、メチレンブルーの青色消失は視認できなかった。また、実施例1、2の触媒含有水素溶存水では、多量の白色沈殿物(還元型メチレンブルー)を目視確認できた。
(2−A);還元力評価試験手順
株式会社ニッポンジーン製造、和光純薬工業株式会社販売の、特注1MのTris-HCl(pH7.4)と、同1MのTris-HCl(pH9.0)を、それぞれ和光純薬工業株式会社製の蒸留水で20倍希釈し、Tris-HClの50mM濃度水溶液を調製する。以下では、これら2種類の希釈水を「基本水7.4」、「基本水9.0」とそれぞれ呼ぶ。また、田中貴金属社製のパラジウムコロイド(その粒径分布は2〜4nmであり、分散剤としてポリビニルピロリドンを含有)4%溶液0.6gを、和光純薬工業株式会社製の蒸留水500mLに溶かしたものを「Pd基準液」と呼ぶ。このPd基準液のパラジウム成分の濃度C(Pd)は、Ptコロイドと同様の計算式から、C(Pd)=0.6g×0.04/500mL=48mg/L濃度となる。
(実施例3)
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液をPtコロイド濃度が190μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例3とし、その結果を図8、図9にそれぞれ示す。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液をPtコロイド濃度が190μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例4とし、その結果を実施例3と対比しつつ図8に示す。なお、実施例3と実施例4の各サンプル水の相違点はpHである。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液をPtコロイド濃度が95μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例5とし、その結果を実施例3と対比しつつ図9に示す。なお、実施例3と実施例5の各サンプル水の相違点はPtコロイド濃度である。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pd基準液をパラジウムコロイド濃度が444μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例6とし、その結果を図10、図11にそれぞれ示す。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pd基準液をパラジウムコロイド濃度が444μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例7とし、その結果を実施例6と対比しつつ図10に示す。なお、実施例6と実施例7の各サンプル水の相違点はpHである。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pd基準液をパラジウムコロイド濃度が111μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例8とし、その結果を実施例6と対比しつつ図11に示す。なお、実施例6と実施例8の各サンプル水の相違点はパラジウムコロイド濃度である。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液とPd基準液とのモル比が約1となる混合溶液を貴金属混合(Pt+Pd)コロイド濃度が160μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例9とし、その結果を図12、図13にそれぞれ示す。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、実施例9と同様の混合溶液を貴金属混合(Pt+Pd)コロイド濃度が160μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例10とし、その結果を実施例9と対比しつつ図12に示す。なお、実施例9と実施例10の各サンプル水の相違点はpHである。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、実施例9と同様の混合溶液を貴金属混合(Pt+Pd)コロイド濃度が80μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例11とし、その結果を実施例9と対比しつつ図13に示す。なお、実施例9と実施例11の各サンプル水の相違点は貴金属(Pt+Pd)コロイド濃度である。
実施例3、4を対比している図8は、pH7.4およびpH9.0におけるPtコロイド添加水素溶存水のMB還元活性を示す。同図によれば、pHの相違によるMB還元活性に大差はみられず、両者ともに高いMB還元活性を示している。
(3−A);還元力評価試験手順
上記(1−A)で調製したものと同様の基本水6.86を2000mL調製し、このなかから1000mLにPt基準液4mLを加えて、Ptコロイド入り基本水6.86を約1リットル調製する。残りの1000mLにはまだPtコロイドを加えないでおく。このようにして、Ptコロイド無しの基本水6.86を約1リットルと、Ptコロイド入りの基本水6.86約1リットルとを調製する。
(実施例12)
触媒前添加電解処理水(MB入り基本水6.86+Ptコロイド電解前添加)の、測定開始から30分間までにおける、メチレンブルー吸光度(A572;波長572nmにおける吸光度)の最小値を実施例12とし、その結果を図14に示す。
触媒後添加電解処理水(MB入り基本水6.86+Ptコロイド電解後添加)の、測定開始から30分間までにおける、メチレンブルー吸光度(A572)の最小値を実施例13とし、その結果を実施例12と対比させつつ図14に示す。
実施例12、13を対比している図14は、Ptコロイドの添加時期(電解処理前か後か)を異ならせたときの電解処理水のMB還元活性を示す。同図によれば、Ptコロイドは電解処理前に加えた方が、より高いMB還元活性を得られることがわかる。この理由は現在追跡調査中であるが、MB還元活性のもととなる活性化した水素が、電解処理水中の酸素等の酸化物質がもつ酸化力を無効化していることに由来するものと推測される。これは、Ptコロイド入りの活性炭処理水を原水として電解処理を施した電解処理水の溶存酸素濃度を、その電解処理直後に計測してみたところ、同電解処理水の溶存酸素濃度がほとんどゼロになっていることから導き出された推論である。そうすると、かかる電解処理の例に限らず、水素封入処理や水素ガスバブリング処理においても、触媒(Ptコロイド)の処理前添加は、より高いMB還元活性を得る(酸素等の酸化物質がもつ酸化力の無効化に由来)観点から好ましいものと考えられる。さらに、例えば原水に還元剤を添加する処理を施すことで溶存水素水を得る場合においても、原水にあらかじめPtコロイドを加えておくことは、上記と同様により高いMB還元活性を得る観点から好ましいものと考えられる。なお、触媒としてはPtコロイドに限らず、Pdコロイドや、PtコロイドとPdコロイドとの混合コロイドの場合も同様に、触媒の処理前添加は、より高いMB還元活性(触媒活性)を得る観点から好ましい。これは、貴金属コロイド触媒を電解処理前に添加した場合、電解処理の過程で貴金属コロイド触媒のなかに水素を効率的に吸蔵させることができ、こうして貴金属コロイド触媒のなかにたくわえられた水素が、より高いMB還元活性(触媒活性)をもたらすものと考えられる。
フリーラジカルDPPHは、抗酸化剤との反応により非ラジカル体となって不活性化され、波長520nm付近における吸光度が減少する。この減少量を測定することにより、抗酸化剤のラジカル消去活性を測定することができる。
上記の(1−A)で調製したものと同様に、表2に示すサンプルi〜viiiの都合8通りの各サンプル水溶液がもつ抗酸化活性をそれぞれ調べるために、各水溶液16mLに、DPPH(0.16g/L濃度)溶液を4mL加え、DPPHモル濃度を81.15(μM)に調製して、DPPHを添加してから3分後の各サンプル水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540;波長540nmにおける吸光度変化)を、分光光度計で測定した。
(参考例7)
サンプルiの基本水6.86である触媒非含有水溶液にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度差(ΔA540)を参考例7とし、その結果を図15に示す。なお、同図におけるDPPH吸光度変化(ΔA540)は、本サンプルi(ブランク)の吸光度に対する、サンプルi〜ivの吸光度との差分(ΔA540)を示す。したがって、参考例7のDPPH吸光度変化(ΔA540)はゼロとなる。
サンプルiiの(基本水6.86+Pt基準液)である触媒含有水溶液にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例8とし、その結果を図15に示す。
サンプルiiiの(基本水6.86+電解処理)である触媒非含有電解処理水にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例9とし、その結果を図15に示す。
サンプルivの(基本水6.86+電解処理+Pt基準液)である触媒含有電解処理水にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を実施例14とし、その結果を参考例7〜9と対比させつつ図15に示す。
サンプルvの基本水9.18である触媒非含有水溶液にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例10とし、その結果を図16に示す。なお、同図におけるDPPH吸光度変化(ΔA540)は、本サンプルv(ブランク)の吸光度に対する、サンプルv〜viiiの吸光度との差分(ΔA540)を示す。したがって、参考例10のDPPH吸光度変化(ΔA540)はゼロとなる。
サンプルviの(基本水9.18+Pt基準液)である触媒含有水溶液にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例11とし、その結果を図16に示す。
サンプルviiの(基本水9.18+電解処理)である触媒非含有電解処理水にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例12とし、その結果を図16に示す。
サンプルviiiの(基本水9.18+電解処理+Pt基準液)である触媒含有電解処理水にDPPHを加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を実施例15とし、その結果を参考例10〜12と対比させつつ図16に示す。
実施例14、15の結果を参考例7〜12と対比させつつ考察すると、基本水6.86および9.18の両者において実施例14、15の触媒含有電解処理水は、参考例7〜12と比較して、特異的にDPPHラジカルを消去しており、大きな抗酸化活性、またはラジカル消去活性を示している。ちなみに、Ptコロイド触媒は電解処理前に添加している。なお、図15に示すように、参考例9では、触媒非含有電解処理水であるにもかかわらずDPPHラジカル消去活性が認められる。これは、たとえば本件明細書で開示した電解処理水などの高濃度水素溶存水においては、還元対象たる酸化物質が強い酸化力をもつラジカルである場合、このラジカルによる分子状水素からの強制的な水素引き抜き反応によって、触媒の助けがなくともラジカル消去活性の発現が期せる可能性を示唆しているものと考えられる。
(5−A);抗酸化活性評価試験手順
上記(2−A)と同様に、「基本水7.4」、「基本水9.0」を用意し、次に、406μMのDPPH溶液と、基本水7.4および基本水9.0をそれぞれ50mL採取し、真空ポンプにて10分間脱気した後に水素ガスを10分間封入する操作を3回繰り返す。なお、かかる操作は水素溶存水中における水素以外の気体成分の除去を狙ったものである。
(参考例13)
水素溶存水(基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)にPt基準液を加えていない水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例13とし、その結果を図17に示す。
水素溶存水(基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液をPtコロイド濃度が190μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を実施例16とし、その結果を参考例13と対比させつつ図17に示す。なお、参考例13と実施例16の相違点は、Ptコロイドの添加有無である。
水素溶存水(基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)にPt基準液を加えていない水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を参考例14とし、その結果を図18に示す。
水素溶存水(基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、Pt基準液をPtコロイド濃度が190μg/Lとなる量だけ加えた水溶液のDPPH吸光度変化(ΔA540)を実施例17とし、その結果を参考例14と対比させつつ図18に示す。なお、参考例14と実施例17の相違点は、Ptコロイドの添加有無である。
参考例13と実施例16を対比している図17は、Ptコロイドの添加有無を相違点としたpH7.4における水素溶存水のDPPHラジカル消去活性を示す。また、参考例14と実施例17を対比している図18は、Ptコロイドの添加有無を相違点としたpH9.0における水素溶存水のDPPHラジカル消去活性を示す。同図によれば、Ptコロイド無しの参考例13、14では、測定時間(30分間)内で自然退色したと考えられる分だけの吸光度変化がみられる一方、Ptコロイド入りの実施例16、17では、自然退色分を超える明らかなDPPHラジカル消去活性の発現が観察された。なお、pHの相違によるDPPHラジカル消去活性のレベル差はみられなかった。
次に、本発明に係る水素溶存水に酵素ヒドロゲナーゼ触媒を含有させたとき、同水素溶存水中に含まれる化学的に不活性な分子状水素が活性化することで発現する還元活性評価について、その実施例と参考例をそれぞれ示す。かかる還元活性評価試験では、貴金属コロイド触媒含有水素溶存水の還元活性評価試験と同様に、抗酸化対象として酸化還元色素メチレンブルーを用いる。この場合の還元活性評価原理は、前述した貴金属コロイド触媒でした説明と同様のため、その重複した説明を省略する。
(6−A);還元活性評価試験手順
上記(2−A)で調製したものと同様に、「基本水7.4」、「基本水9.0」を用意し、これらの基本水7.4および基本水9.0をそれぞれ84mL採取し、1g/L濃度のMB水溶液をそれぞれに4mL加え、121.7μM濃度のMB入り基本水7.4および基本水9.0を各調製する。さらに、これらのMB入り基本水7.4、9.0をそれぞれ50mL採取し、真空ポンプにて10分間脱気した後に水素ガスを10分間封入する操作を3回繰り返す。なお、かかる操作は水素溶存水中における水素以外の気体成分の除去を狙ったものである。一方、125μM濃度のヒドロゲナーゼ溶液を蒸留水で4倍希釈したものを、1mL用のマイクロカプセルに投入し、同カプセルに窒素ガス(不活性ガス)を封入することで酸素を除去する。
(実施例18)
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、上述の如く調製したヒドロゲナーゼ溶液を10μL加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例18とし、その結果を図19に示す。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水7.4+脱気処理+水素ガス封入処理)に、ヒドロゲナーゼ溶液を加えていない水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を参考例15とし、その結果を実施例18と対比しつつ図19に示す。なお、実施例18と参考例15の各サンプル水の相違点は酵素ヒドロゲナーゼの含有有無である。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、上述の如く調製したヒドロゲナーゼ溶液を10μL加えた水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を実施例19とし、その結果を図20に示す。
MB入り水素溶存水(MB入り基本水9.0+脱気処理+水素ガス封入処理)に、ヒドロゲナーゼ溶液を加えていない水溶液のメチレンブルー吸光度変化(ΔA572)を参考例16とし、その結果を実施例19と対比させつつ図20に示す。なお、実施例19と参考例16の各サンプル水の相違点は酵素ヒドロゲナーゼの含有有無である。
実施例18、19の結果を参考例15,16と対比させつつ考察すると、実施例18、19の触媒含有水素溶存水は、参考例15、16と比較して、そのpHの差異にかかわらず特異的にメチレンブルーを還元しており、触媒含有水素溶存水だけが大きな還元活性を示しているといえる。なお、メチレンブルー水溶液の青色呈色の有無を目視で確認すると、実施例18、19の触媒含有水素溶存水だけが無色透明であり、メチレンブルーの青色消失を視認できた。なお、参考例15、16では、メチレンブルーの青色消失は視認できなかった。また、実施例18、19の触媒含有水素溶存水では、多量の白色沈殿物(還元型メチレンブルー)を目視確認できた。
(A) 発想の経緯
本願出願人が開発した還元電位水生成装置11にて電解処理した電解処理水(電解還元水)には、電解処理時に陰極反応で生成された水素が確かに溶存している。かかる電解処理水中にどの程度の濃度の水素が溶存しているかは、溶存水素計を用いて一応、計測できる。ここで一応と表現したのは、一般に溶存水素計は電極反応における電気化学的物理量をテーブルルックアップ方式で溶存水素濃度に置換するといった計測原理を採用しているため、たとえば被検定水の液性などの外部要因に依存して計測値が比較的大きく変動する傾向があるからである。
触媒含有電解処理水を含む水素溶存水に対して、酸化還元色素メチレンブルーの所定濃度溶液を滴下していった際において、かかる滴下後の溶液が還元呈色反応を示さなくなるまで(以下、「終点」という場合がある。)に加えられたメチレンブルーの合計滴下量が、溶存水素濃度(顕在抗酸化力)定量分析の尺度になることを、以下の実験を通して確認していく。
本発明に係る水素溶存水に触媒を含有させたとき、同水素溶存水中に含まれる化学的に不活性な分子状水素が活性化することで発現する還元力(抗酸化力)の実効的な量、つまり、実効的な溶存水素濃度DH(mg/L)を定量分析するために、触媒としてPtコロイドを、また、酸化還元色素としてメチレンブルーを用いて、触媒(Ptコロイド)添加水素溶存水に対するメチレンブルーの酸化還元滴定を行った。
基本的な実験手順は、あらかじめいくつかのサンプル水(溶存水素濃度などの諸特性値計測済み)を用意しておき、これらのサンプル水に対して触媒(Ptコロイド)を加えるとともに、メチレンブルーの滴下処理を施してゆく。そして、各々のメチレンブルー合計滴下量等から求められる溶存水素濃度の実効値と、溶存水素計での実測値との相関性の有無を比較評価する。
以下に、被検定水に加えたメチレンブルー水溶液の濃度と合計添加量から、被検定水中の実効的な溶存水素濃度DHを求める計算式と、計算式の導出過程と、を示しながら、実効的な溶存水素濃度DHの意味するところを説明する。
B=N・A(μmol/L×mL)
=N・A(mμmol) ・・・ (式1)
となる。ここで、メチレンブルー分子の化学式をMBClとし、水素分子の化学式をH2とすると、Ptコロイドにより活性化した水素分子と、メチレンブルー分子との、水溶液中における反応は、次の反応式1で表現される。
ここで、HClは塩酸であり、MBHは還元型メチレンブルーである。反応式1によれば、1モルの水素分子と、1モルのメチレンブルー分子とが反応して、1モルの還元型メチレンブルー分子が生成している。電子の授受で説明するために、反応式を半反応式で2式に分離して書くと、次のようになる。
MB+ +(H+ + 2e−)→ MBH ・・・ (半反応式2)
半反応式1は、水素分子1モルが2モルの電子を放出することを意味する一方、半反応式2は、メチレンブルー陽イオン1モル、つまり、メチレンブルー分子1モルが2モルの電子を受け取ることを意味している。ここで、水素分子1モルは、電子を2モル放出するから2グラム当量である一方、メチレンブルー陽イオン1モル、つまり、メチレンブルー分子1モルは、電子を2モル受け取るから2グラム当量である。結果的には、水素分子と、メチレンブルー陽イオン、つまり、メチレンブルー分子と、のグラム当量数は、両者ともに同じ2であるから、水素分子とメチレンブルー分子とは、モル比でいえば1対1で反応することになる。
C=B=N・A(mμmol) ・・・ (式2)
となる。さらに、被検定水の体積は200mLであり、被検定水の実効的な水素分子の体積モル濃度H2 (mol/L)は、モル数C(mol)を体積(mL)で割った値であるから、
H2 (mol/L)=C/200(mμmol/mL)
=C/200(μmol/L) ・・・ (式3)
となる。さらに、この単位を質量濃度(g/L)に変換する場合には、相当する水素分子の質量濃度をDとすれば、水素分子H2 に関する次の比例式、
1mol/2g=H2 (μmol/L)/D ・・・ (式4)
から、この式4に式3を代入すると、
D=2・C/200(μg/L)
=C/100(μg/L) ・・・ (式5)
となる。これが、被検定水200mLに含まれる、実効的な水素分子の質量濃度である。なお、上記の実効的な水素分子の質量濃度Dは、マイクログラムオーダーであるが、ミリグラムオーダーに変換するには、分子と分母に1000を乗じて、
D=C・1000/100・1000(μg/L)
=C・10−5 (mg/L) ・・・ (式6)
とすればよい。
D=N・A(mμmol)・10−5 (mg/L) ・・・ (式7)
が成立する。
(参考例17)
ミズ株式会社製電解水生成装置「ミニウォーター」(活性炭フィルター搭載)にて標準水量で電解レンジ「4」の電解条件を用いて連続電解処理を行ったアルカリ性電解水を被検定水とし、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に1g/L濃度(体積モル濃度;2677.4μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は1mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は0.03(mg/L)であった。本参考例17に係る被検定水の、pH、酸化還元電位ORP(mV)、電気伝導度EC(mS/m)、水温T(°C)、溶存酸素濃度DO(mg/L)、溶存水素濃度DHの実測値(mg/L)、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値(mg/L)を表3に示すとともに、DHの実測値と実効値を図23に示す。なお、各種物性値を計測するのに用いた各種計器類としては、先に述べたものと同様のものを使用した。
藤沢市水道水をオルガノ社製イオン交換カラムに通して処理した精製水をいったん沸騰させたあと、水素ガスのバブリング処理を施しながらその温度を20°Cまで冷ました水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は6.2mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.66(mg/L)であった。本参考例18に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
上述したサンプルiの基本水6.86を毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水式に電解処理した電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は5.9mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.58(mg/L)であった。本実施例20に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
上述したサンプルvの基本水9.18を毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水式に電解処理した電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は5.0mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.34(mg/L)であった。本実施例21に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
和光純薬工業株式会社製の標準緩衝液4.01(フタル酸塩水溶液)を精製水で10倍希釈したpH緩衝水溶液を、毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水式に電解処理した電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は6.3mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.69(mg/L)であった。本実施例22に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
上述したサンプルiの基本水6.86を毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した循環電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は9.6mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は2.57(mg/L)であった。本実施例23に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
上述したサンプルvの基本水9.18を毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した循環電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は12.3mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は3.29(mg/L)であった。本実施例24に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
実施例22と同様のpH緩衝水溶液を毎分1リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した循環電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は12.4mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は3.32(mg/L)であった。本実施例25に係る被検定水の、各種物性値を表3に示すとともに、溶存水素濃度DHの実測値と実効値を図23に示す。
表3および図23によれば、溶存水素濃度DHの実測値と実効値のあいだには、実測値が高いときにはそれに応じて実効値も高くなることから、相応の相関性があることがわかる。また、参考例18、および、実施例20〜25の溶存水素濃度DHの実効値は、参考例17のDH実効値と比較して、いずれも1.3(mg/L)を超えるという高い濃度を示した。特に、実施例20〜25のDH実効値は、常温(20°C)かつ大気圧下での分子状水素の水への飽和溶解濃度がおよそ1.6(mg/L)であるのに対して、およそ2.5〜3.3(mg/L)というきわめて高い濃度を示した。
次に、XOD実験系におけるエピネフリン酸化法を用いたラジカル消去活性評価試験方法について、下記(A)にて説明する。また、同試験方法を用いたときの本発明に係る抗酸化機能水(AntiOxidant- functioning Water;以下、「AOW」と言う場合がある。)等が発現するラジカル消去活性について、AOWとして水素溶存水に貴金属コロイド触媒(Ptコロイド/Pdコロイド/Pt・Pd混合コロイド)を加えた例を挙げて、下記(B)にて各自の実施例と参考例をそれぞれ示す。なお、XOD実験系とは、酸素溶存溶液系において、キサンチンに生体酵素であるキサンチンオキシダーゼ(XOD)を作用させる過程を通じて、キサンチンの酸化により放出される電子によって酸素を1電子還元してスーパーオキサイドアニオンラジカル(以下、単に「(・O2 -)」と言う場合がある。)を生成する実験系(以下、「XOD実験系」という。)を言う。
(A−1) 発想の経緯
従来のフリーラジカルの測定法としては、例えば「フリーラジカルとくすり」(発行所 株式会社廣川書店 ISBN 4-567-49380-X)のp133-141に記載されている通り、チトクロムc還元法が知られている。
・RH3 + O2 ⇒ RH2 +・O2 - + H+
RH2 + ・O2 - + H+ ⇒ ・RH + H2O2
・RH + O2 ⇒ R + ・O2 - + H+
ただし、(RH3 −)は還元型エピネフリン、(R)は酸化型エピネフリン(アドレノクローム)である。生理的pH付近では、還元型エピネフリンと(・O2 - )との反応性は低いが、還元型エピネフリンを大量投与すれば、還元型エピネフリンと(・O2 - )との2次反応速度が速まる。そこで、本エピネフリン酸化法では、還元型エピネフリンのモル濃度を、例えば約1mM程度の高濃度にしておくことが好ましい。さらに、還元型エピネフリンは、例えば鉄イオンなどの微量の遷移金属により容易に酸化されてしまう傾向がみられる。かかる外乱の影響を除くために、EDTA等のキレート剤を被検定液中に共存させておくことが必要である。
エピネフリン酸化法を用いたラジカル消去活性(SOD様活性)試験に使用する試薬類を以下に列挙する。
(2)キサンチン(2,6-ジオキソプリン)・・・和光純薬工業製
(3)キサンチンオキシダーゼ懸濁液(バターミルク由来)・・・和光純薬工業製
(4)EDTA−2Na・2水和物・・・同仁化学研究所製・和光純薬工業販売
(5)1mol/L水酸化ナトリウム溶液・・・和光純薬工業製
(6)L(+)−アスコルビン酸・・・和光純薬工業製
(7)(±)エピネフリン(dl−エピネフリン)(dl−アドレナリン)・・・和光純薬工業製
(A−3) 試薬の調製方法
前記(A−2)で列挙した試薬の調製方法は下記の通りである。
蒸留水100mLに、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩末(以下、「PBS」という。)500mL用2袋を溶解し、これを2等分する。一方の50mLに、EDTA−2Naを0.19g溶解する。これをEDTA原液とする。このEDTA原液を0.5mL、EDTAなしの溶液を49.5mLそれぞれ採り、これらを混合する。
蒸留水350mLに、キサンチン=0.228≒0.23gおよび1(mol/L)水酸化ナトリウム水溶液80滴を加えて、キサンチンを溶解する。それを35mL採り、EDTA入りPBS緩衝原液を加えて100mLとする。
キサンチンオキシダーゼ懸濁液を、EDTA入りPBS緩衝原液で100倍希釈する。これは、実験実施ごとに調製する。
スターラー用の攪拌子とともに、蒸留水100mLをバイアルびんに入れてゴム栓をし、ゴム栓には排気用の注射針と、窒素ガスボンベに通じた注射針を刺しておく。この状態で、蒸留水入りバイアルびんをスターラー台に乗せて、強く攪拌しながら、蒸留水に窒素ガスを封入し、蒸留水内部を完全に窒素ガス置換する。この窒素ガス置換処理を30分間行う。その後、エピネフリンを0.15グラム投入し、栓をして、スターラーにて緩やかに攪拌し、窒素ガスを封入しておく。この窒素ガス置換処理は実験終了まで継続する。これがエピネフリン溶液の調製である。かかる調製におけるポイントは、エピネフリン添加前では攪拌を強くし、エピネフリン添加後では攪拌を緩やかにすることである。
従来のXOD実験系では、すべての試薬類と被検定水溶液を、順次セルに添加し、最後にキサンチンオキシダーゼ(XOD)を添加して、このXODの添加により反応を開始させるとともに、分光光度計による測定を開始させていた。
(参考例19)
被検定水として、蒸留水(和光純薬製)を採用したときの、(A−4)にて記載の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例19とする。なお、本参考例19のラジカル消去活性測定データについて、製造ロットの異なるキサンチンオキシダーゼを使用した試験条件では、製造ロット間でそのラジカル消去活性特性がわずかに異なる場合があることを付言しておく。
被検定水として、水素ガス置換した蒸留水(和光純薬製)を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例20とする。なお、本参考例20のラジカル消去活性測定データについて、参考例19と同様に、製造ロットの異なるキサンチンオキシダーゼを使用した試験条件では、製造ロット間でそのラジカル消去活性特性がわずかに異なる場合があることを付言しておく。
被検定水として、蒸留水(和光純薬株式会社製、以下同じ。)に、実施例3〜5に記載のPt基準液をPtコロイド濃度が48μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換した抗酸化機能水(AOW)を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例26とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液をPtコロイド濃度が96μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例26と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例27とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液をPtコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例26と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例28とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液をPtコロイド濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例26と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例28とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液をPtコロイド濃度が768μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例26と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例30とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例6〜8に記載のPd基準液をPdコロイド濃度が48μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換した抗酸化機能水(AOW)を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例31とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例31と同様のPd基準液をPdコロイド濃度が96μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例31と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例27とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例31と同様のPd基準液をPdコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例31と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例33とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例31と同様のPd基準液をPdコロイド濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例31と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例34とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例31と同様のPd基準液をPdコロイド濃度が768μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例31と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例35とする。
被検定水として、蒸留水に、前述の難波氏らによる論文「Ptコロイドの作り方と使い方」を元に本件出願人が製造した、その粒径分布が約1〜2nmである白金コロイド溶液を、Ptコロイド濃度が66μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例36とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例36と同様の白金コロイド溶液をPtコロイド濃度が96μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例36と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例37とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例36と同様の白金コロイド溶液をPtコロイド濃度が144μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例36と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例38とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例36と同様の白金コロイド溶液をPtコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例36と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例39とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例36と同様の白金コロイド溶液をPtコロイド濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例36と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例40とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例36と同様の白金コロイド溶液をPtコロイド濃度が768μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例36と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例41とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:2となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が96μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例42とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例42と同様の(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例42と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例43とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例42と同様の(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例42と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例44とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例42と同様の(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が768μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例42と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例45とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:5となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が144μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例46とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:10となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が240μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例46と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例47とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:15となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が336μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例46と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例48とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:20となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が432μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例46と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例49とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:25となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が528μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例46と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例50とする。
被検定水として、水素ガス置換した蒸留水を採用したときの、(A−4)にて記載の手順の一部を改変した試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例21とする。上記試験手順の改変部分は、キサンチン溶液300μLと、キサンチンオキシダーゼ溶液100μLとを試験セル内へ添加することに代えて、つまり、(・O2 - )の生成系を除去した代わりに、酸素供給用の蒸留水を900μLから1300μLに増量した点である。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:5となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が144μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、(A−4)にて記載の手順の一部を改変した試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例51とする。上記試験手順の改変部分は、参考例21と同様である。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:10となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が240μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例51と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例52とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:15となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が336μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例51と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例53とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:20となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が432μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例51と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例54とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液と実施例31と同様のPd基準液とがモル比で1:25となるように混合調製された(Pt+Pd)混合コロイドを、その濃度が528μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例51と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例55とする。
和光純薬工業株式会社製の標準緩衝液6.86(リン酸塩水溶液)を精製水で10倍希釈したpH緩衝水溶液(基本水6.86)を被検定水とし、この被検定水の、(A−4)にて記載の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例22とする。
参考例22と同様の基本水6.86を、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒非含有電解処理水を被検定水とし、この被検定水の、参考例22と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例23とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が48μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、参考例22と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例56とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が96μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例56と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例57とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例56と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例58とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例56と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例59とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が768μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例56と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例60とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が48μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、参考例22と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例61とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が96μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例61と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例62とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例61と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例63とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例61と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例64とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が768μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、参考例23と同様の電解条件にて連続通水式に電解処理した触媒前添加1パス電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例61と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例65とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が48μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、参考例22と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例66とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が96μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例66と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例67とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例66と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例68とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例66と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例69とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例26と同様のPt基準液を、その濃度が768μg/Lとなる量だけ加えたPtコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPtコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例66と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例70とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が48μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、参考例22と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例71とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が96μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例71と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例72とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例71と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例73とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例71と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例74とする。
参考例22と同様の基本水6.86を1リットル採り、これに実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が768μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り基本水6.86を調製する。こうして調製したPdコロイド入り基本水6.86を、実施例66と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、この被検定水(AOW)の、実施例71と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例75とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例26と同様のPt基準液をPtコロイド濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、参考例21と同様に改変した試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例76とする。
被検定水として、蒸留水に、実施例31と同様のPd基準液をPdコロイド濃度が384μg/Lとなる量だけ加えた後、これを水素ガス置換したAOWを採用したときの、実施例76と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを実施例77とする。
被検定水として、蒸留水にアスコルビン酸(AsA)を、その濃度が35.5μMとなる量だけ加えたAsA水溶液を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例24とする。
被検定水として、蒸留水にアスコルビン酸(AsA)を、その濃度が71μMとなる量だけ加えたAsA水溶液を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例25とする。
被検定水として、蒸留水にアスコルビン酸(AsA)を、その濃度が142μMとなる量だけ加えたAsA水溶液を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例26とする。
被検定水として、蒸留水にアスコルビン酸(AsA)を、その濃度が284μMとなる量だけ加えたAsA水溶液を採用したときの、参考例19と同様の試験手順に従うラジカル消去活性測定データを参考例27とする。
参考例19、20と、実施例26〜30とを対比している図26は、Ptコロイド(粒径分布が2〜4nm)濃度を主パラメータとした、Ptコロイド触媒含有水素溶存水(AOW)が発現するラジカル消去活性の経時変化特性を示す。ここで、参考例19、20の両者を比較対照としたのは、3mL容量の試験セルのうち1/3の容量を占める被検定水(液)から酸素を除去したときの、ラジカル消去活性特性の傾向を把握しておく主旨である。なお、被検定水として、参考例20の水素ガス置換した蒸留水に代えて、窒素ガス置換した蒸留水を採用した場合であっても、両者のラジカル消去活性の経時変化特性はまったく重なることを、図示しない実験により確認済みである。これは、酸素の除去程度が一致している限りにおいて、比較対照としてのガスの種類は、ラジカル消去活性の経時変化特性に影響を及ぼさないことを意味する(以下同様)。さて、同図によれば、参考例19、20のラジカル消去活性特性(以下、比較例のものを「対照特性」と省略する。)と比較したとき、分光光度計での吸光度(A480)の経時変化測定開始時点(以下、「測定開始時点」と省略する。)から約680秒経過後において、実施例26〜30のAOWが呈するラジカル消去活性特性(以下、実施例のものを「主題特性」と省略する。)は、いずれの濃度でも対照特性を有意に下回っていることがわかる。つまり、実施例26〜30のAOWは、ある程度の経過時間さえおけば、広範な濃度範囲において良好なラジカル消去活性を発現しはじめることがわかる。また、実施例26〜30の主題特性をよく解析すると、Ptコロイドの濃度依存的に、濃度が濃いほどラジカル消去に要する時間が短くなっている。つまり、AOWが発現するラジカル消去活性は、Ptコロイドの濃度依存的に高まることがわかる。なお、貴金属触媒としてPtコロイドを採用した場合には、実施例26〜30の主題特性では、いずれの濃度でも対照特性を有意に上回る時間領域が存在する。この理由については、後述の「パラジウム(Pd)コロイドの対酸素難反応性・触媒活性・水素吸蔵能力」の項目部分で言及し、ここではこれ以上触れないこととする(以下同様)。
本発明に係る抗酸化方法、抗酸化機能水およびその用途を、例えば生体などの酸素溶存溶液系で実施しようと試みたとき、大きな障壁となるのが酸素の存在である。特に生体では、酸素は栄養素を酸化してエネルギーを獲得する目的で、または、生体にとって必須な各種の酸素添加反応を行う目的で用いられる関係上、酸素が豊富に存在している。ここでの問題の本質は、抗酸化機能水中に溶存する水素を、貴金属コロイド触媒を介して酸素が消費すること、換言すれば、貴金属コロイド触媒を介して水素と酸素が反応してふつうの水に戻ること、並びに、酸素自身が貴金属コロイド触媒を介して活性化された水素によって1電子還元されることで消去対象である(・O2 - )を逆に生成してしまうことに由来するラジカル消去活性の減衰である。この命題に係る現象は、触媒活性が高まるほど増幅される傾向が認められる。つまり、触媒活性とラジカル消去活性はトレードオフ関係にあり、触媒活性が高まるほどラジカル消去活性が減衰していく。したがって、これは容易には解決し得ない根深い問題であると言える。
以下に、上述の酸化還元色素を用いたDH定量分析方法による追加の実施例を示す。
実施例73と同様の触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は7.8mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は2.09(mg/L)であった。本実施例78に係る被検定水の、各種物性値を表4に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図40に示す。
参考例22と同様の基本水6.86を、実施例71と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒無添加循環電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は8.5mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は2.28(mg/L)であった。本実施例79に係る被検定水の、各種物性値を表4に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図40に示す。
藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水に、実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が384μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り活性炭処理水を調製する。こうして調製したPdコロイド入り活性炭処理水を、実施例71と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は9.7mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は2.60(mg/L)であった。本実施例80に係る被検定水の、各種物性値を表4に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図40に示す。
藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水を、実施例79と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒無添加循環電解処理水を被検定水とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は10.6mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は2.84(mg/L)であった。本実施例81に係る被検定水の、各種物性値を表4に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図40に示す。
藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水に、実施例31と同様のPd基準液を、その濃度が192μg/Lとなる量だけ加えたPdコロイド入り活性炭処理水を調製する。こうして調製したPdコロイド入り活性炭処理水を、実施例80と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に3分間にわたり電解処理した触媒前添加循環電解処理水を被検定水(AOW)とし、同被検定水200mLに、上述の窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は12.0mLであり、上記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は3.21(mg/L)であった。本実施例82に係る被検定水の、各種物性値を表4に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図40に示す。
線虫の一種であるCaenorhabditis elegans(C.elegans、以下、「C.エレガンス」)は、ショウジョウバエやマウス・ラット等と並んで、多細胞生物の老化モデルとして世界中で広く使用されている。また、C.エレガンスでは、全ゲノムの塩基配列が決定されており、遺伝子破壊やGFP融合遺伝子による発現解析などの手法を組み合せて、ヒトの遺伝病原因遺伝子や癌遺伝子などの個体レベルでの機能や作用機構を調べるための「生きた試験管」として注目されている。
(A−1) 使用する試薬類
本試験に使用する試薬類は以下のとおりである。
(2)Sバッファ(S buffer)
塩化ナトリウム:NaCl(0.1M)
リン酸カリウム:Potassium phosphate(pH6.0)
C.エレガンスは雌雄同体であるため次世代と混同しない工夫が必要である。そこで、準拠手順に従って、試薬FudRを、C.エレガンスにおける次世代の出現を阻害する目的で使用している。また、Sバッファは、pHの相違による影響を除くため等の目的で使用する。
(1)準拠手順に従って、同調培養した野生型の第1期幼虫を集める。寒天培地入り9cmシヤーレに、500〜1000匹くらいの虫を入れる。この操作時における虫の日齢は約4日である。
(参考例28)
飼育用水として、藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水(浄水)を採用したときの、(A−2)に記載の試験手順に従う線虫C.エレガンスの寿命データを参考例28とする。
参考例28と同様の活性炭処理水(浄水)を1リットル採り、これに実施例6〜8に記載のPd基準液を、Pdコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ加えた水を、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水(AOW)を飼育用水として採用したときの、(A−2)に記載の試験手順に従う線虫C.エレガンスの寿命データを実施例83とする。
参考例28(飼育用水として浄水を用いた群)と、実施例83(飼育用水として抗酸化機能水を用いた群)とを対比している図41、42は、Ptコロイド触媒含有電解水(AOW)が、C.エレガンスの寿命に与える影響を示す。また、本試験に係る独立2群間における平均寿命の差の有意差検定を、スチューデントのt検定(Student's t-test)にて行った結果を表5に示す。
ヒドロキシラジカル(・OH)は、強い酸化力を有しており、生体において、遺伝子DNAの鎖を切断し、脂質の過酸化を誘発させるなど、生体に対して極めて甚大な損傷を及ぼすことが知られている。つまり、生体にとって、ヒドロキシラジカル(・OH)の生成量を如何に抑制するかが重要である。
(A−1) 試料
本測定に供される試料は以下のとおりである。
(2)試料2:バブリングにより水素ガス置換した蒸留水
(3)試料3:田中貴金属社製のPdコロイド(その粒径分布は2〜4nmであり、分散剤としてポリビニルピロリドン(PVP)を含有)を、約200μg/L濃度で含有させたのち、バブリングにより水素ガス置換した蒸留水(AOW)
(4)試料4:試料3と同様の田中貴金属社製のPdコロイドを、約200μg/L濃度で含有させたのち、バブリングにより窒素ガス置換した蒸留水
(A−2) 使用した試薬類
本測定に使用した試薬類は以下のとおりである。
(2)5,5-ジメチル-1-ピロリン-N-オキシド (5,5-Dimethyl-1-pyrroline-N-oxide:DMPO) ・・・ナカライテスク(Nacalai Tesque)製
(A−3) 使用した装置類
本測定に使用した装置類は以下のとおりである。
(2)付属装置:
i.マイクロ波周波数カウンター:HP5351・・・HEWLETT PACKARD社製
ii.ガウスメーター(gaussmeter):ER035M・・・BRUKER社製
(A−4) 測定手順
(1)溶液調製:
試料と混合される溶液の調製はすべて窒素ガス流通下で行った。次述の純水は窒素ガスバブリングして用いた。試料又は溶液の容器は、ホールピペット(0.5mL,1.0mL)とメスフラスコ(10mL,50mL)を使用した。
i.30%過酸化水素水(9.8M)を0.5mL取り、これを純水で希釈して全量を50mLとし、100mM溶液とした。
i.1mMに調製した過酸化水素水(H2O2)を1mL、DMPOを15μLとり、試料で希釈して全量を10mLにした。このときのH2O2濃度は0.1mM、DMPO濃度は13mMである。
測定温度 室温
磁場掃引範囲 3440〜3540 G
変調 100kHz, 1G
マイクロ波 9.80 G Hz, 16mW
掃引時間 41.943 s*1 times
時定数 81.92ms
データポイント数 1024 points
キャビティー TM110, 円筒型
(B) 測定結果、並びに結果の考察
試料1〜4のすべてにおいて、DMPOの・OHラジカルアダクト(DMPO-OH)が観測された。これは、試料1〜4に対する紫外線照射によって生じた過酸化水素由来のヒドロキシラジカル(・OH)がDMPOに捕捉され、DMPO-OHが生じたからである。試料1〜4に対して紫外線照射を開始してから60秒経過後のESRスペクトルより求めたDMPO-OHの相対強度を表6に示す。
ビタミンCは水溶性のビタミンであり、このうち還元型ビタミンCであるアスコルビン酸は強い還元力を有しており、生体において、活性酸素種、例えばスーパーオキサイドアニオンラジカル(・O2 - )を消去し、また、酸化されたビタミンEを還元型に再生させる。しかし、アスコルビン酸(還元型ビタミンC)は、酸素に触れるなどして酸化されると、モノデヒドロアスコルビン酸を経て、デヒドロアスコルビン酸(酸化型ビタミンC)に変化してしまう。かかる酸化型ビタミンCでは、生体において還元力を発揮し得ない。つまり、ビタミンCは、生体に取り込む際において、還元型の状態に維持されていることが重要である。そこで、抗酸化機能水(AOW)に還元型ビタミンCを含有させた還元型ビタミンC入りAOWの製品化を想定して、抗酸化機能水(AOW)は還元型ビタミンCの酸化を抑制するか?についての試験を行った。以下に、試験プロトコールの概要を示す。
(A−1) 使用した試薬類
本試験に使用した試薬類は以下のとおりである。
(2)L(+)−アスコルビン酸試薬特級・・・和光純薬工業(Wako Pure Chemical)製
(3)pH緩衝液: Tris-HCl(7.4)、Tris-HCl(9.0)、Glycine-HCl(2.2)の3種類
(A−2) 使用した分析装置類
本測定に使用した装置類は以下のとおりである。
(2)付属装置:恒温セルホルダー・・・Amersham Pharmacia Biotech 社製
(A−3) 溶液調製
(1)窒素ガス置換した蒸留水100mLに、アスコルビン酸(AsA)を50mg添加し、アスコルビン酸水溶液とする。ただし、アスコルビン酸水溶液は大気暴露環境に放置しておくと徐々に酸化していくため、試験ごとに新しいアスコルビン酸水溶液をつくり、これを使用する。
(1)分光光度計の石英セル(光路長:1cm、容量:3cc)に、ALDRICH(アルドリッチ)製のゴム栓をしておき、セル内部の空気を水素ガス置換しておく。
(参考例29)
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した蒸留水(7.4)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例29とする。
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した蒸留水(9.0)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例30とする。
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した蒸留水(2.2)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例31とする。
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した水素水(7.4)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例32とする。
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した水素水(9.0)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例33とする。
被検定水として、上記(A−3)−(2)でpH調製した水素水(2.2)を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを参考例34とする。
被検定水として、水素水(7.4)に、実施例3〜5に記載のPt基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例84とする。
被検定水として、水素水(9.0)に、実施例84と同様のPt基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例85とする。
被検定水として、水素水(2.2)に、実施例84と同様のPt基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例86とする。
被検定水として、水素水(7.4)に、実施例6〜8に記載のPd基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例87とする。
被検定水として、水素水(9.0)に、実施例87と同様のPd基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例88とする。
被検定水として、水素水(2.2)に、実施例87と同様のPd基準液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例89とする。
被検定水として、水素水(7.4)に、田中貴金属株式会社製のPt/Au合金コロイド(Ptをコアとする一方、Auをシェルとし、PtコアをAuシェルが完全に被覆する構造をもつ合金コロイドである。Pt/Auの金属モル比は、3.71/6.29であり、1個のPt/Au合金クラスターにおけるPt/Au原子数比は、55/92である。つまり、Pt/Au合金クラスターは、Ptコア(55原子)をAuシェル(92原子)が完全に被覆している、マジックナンバー:147の正20面体型合金クラスターである。)含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例90とする。
被検定水として、水素水(9.0)に、実施例90と同様のPt/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例91とする。
被検定水として、水素水(2.2)に、実施例90と同様のPt/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例92とする。
被検定水として、水素水(7.4)に、田中貴金属株式会社製のPd/Au合金コロイド(Pdをコアとする一方、Auをシェルとし、PdコアをAuシェルが完全に被覆する構造をもつ合金コロイドである。Pd/Auモル比は、3.72/6.28 であり、1個のPd/Au合金クラスターにおけるPd/Au原子数比は、55/92である。つまり、Pd/Au合金クラスターは、Pdコア(55原子)をAuシェル(92原子)が完全に被覆している、マジックナンバー:147の正20面体型合金クラスターである。)含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例93とする。
被検定水として、水素水(9.0)に、実施例93と同様のPd/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例94とする。
被検定水として、水素水(2.2)に、実施例93と同様のPd/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約200μg/Lとなる量だけ加えた抗酸化機能水を採用したときの、上記(A−4)に記載の試験手順に従う還元型ビタミンCの残存率測定データを実施例95とする。
参考例29、32と、実施例84、87、90、93とを対比している図43は、緩衝液(pH7.4)により液性を中性とした各種被検定水に還元型ビタミンCを含有させたときの、還元型ビタミンC残存率(%)の経時変化特性を示す。同図に基づいて、液性を中性としたときの還元型ビタミンCの保存性について、参考例29(蒸留水)と比較すると、実施例84(Ptコロイド含有水素水)が特に優れており、次いで、実施例90(Pt/Au合金コロイド含有水素水)、実施例93(Pd/Au合金コロイド含有水素水)、実施例87(Pdコロイド含有水素水)、参考例32(水素水)の順序で、良好な保存性を示した。
まず、得られた結果について総括的に考察してみる。中性・酸性・塩基性のすべての液性領域において、参考例19〜31(蒸留水)と比較したとき、その他の例では良好な保存性を示した。その理由のひとつに、その他の例では、参考例19〜31(蒸留水)と比べて溶存酸素濃度が低いことが、還元型ビタミンCの酸化抑制にとって有利に働いたことものと考えられる。また、液性が酸性側のほうが、還元型ビタミンCの保存性を高めるのに有利であることがわかる。これは、ビタミンCは酸であるため、酸性側のほうがプロトン解離性が低く、電子が放出しにくいためと考えられる。逆に、液性が塩基側に傾くと、プロトン解離性が高くなり、電子を放出しやすくなるものと考えられる。したがって、水溶液中に含有させた還元型ビタミンCの保存性を高めるには、溶液の液性は酸性側に傾いているほうが好ましいことがわかる。
(AsA + O2 ⇒ MDA・ +・O2 -)
さらに、モノデヒドロアスコルビン酸(MDA・)2分子が、不均化反応により、還元型ビタミンC(AsA)と、デヒドロアスコルビン酸(DHA)と、を生成する。デヒドロアスコルビン酸(DHA)とは、還元型ビタミンC(AsA)の2電子酸化物である。
このような過程を経て、還元型ビタミンC(AsA)は徐々に酸化されていき、最終的にすべての還元型ビタミンC(AsA)はデヒドロアスコルビン酸(DHA)に変わっていくことになる。こうした過程が、液性が酸性側に傾いているほど抑制されることは、先に述べた通りである。
デヒドロアスコルビン酸(DHA)の生成を遅らせた時間に比例して、還元型ビタミンC(AsA)としての状態を保持する時間も増えることになる。これが、実施例84(Ptコロイド含有水素水)が、参考例32(水素水)と比較して、還元型ビタミンC(AsA)の保存性に優れている理由であると考えられる。
このとき生成する過酸化水素に対して、実施例84(Ptコロイド含有水素水)は、非常に反応性が高く、速やかに水にまで還元することができる。また、混入してくる酸素分子に対して、実施例84(Ptコロイド含有水素水)は、非常に反応性が高く、速やかに過酸化水素、あるいは水にまで還元することができる。
H2O2 + (H2+Pt) ⇒ 2(H2O) + Pt
これに対し、実施例90(Pt/Au合金コロイド含有水素水)、実施例93(Pd/Au合金コロイド含有水素水)、実施例87(Pdコロイド含有水素水)に含有されている貴金属触媒は、白金(Pt)と比較して、酸素に対する反応性が低く、また、過酸化水素に対しても反応性が低いものと考えられる。
過酸化脂質(lipid peroxide)とは、活性酸素種を含むフリーラジカルが、生体内の不飽和脂肪酸(植物油や魚の脂肪に多く含有される。)と結びついて生じる有害物質をいう。この過酸化脂質は、薬物や有害物質による肝・腎障害、虚血性再灌流障害、動脈硬化などの循環器系疾患、胃潰瘍、胃粘膜障害などの消化器官系疾患、呼吸器系疾患、糖尿病の合併症(例えば高血圧、脳梗塞、心筋梗塞など)、白内障、皮膚疾患、各種炎症性疾患、神経疾患、癌、老化などに深く関与していることが指摘されている。かかる脂質の過酸化を如何にして抑制するかが、生体にとってきわめて重要である。
(A−1) 実験動物・飼育環境
日本クレア(株)より6週齢で購入した雄性SD系ラット(SPF:specific pathogen free)を7日間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間および実験期間を通して室温24±1℃、湿度55±5%の飼育室(照明時間:8時〜20時、空調設備:All Fresh 方式)に設置のプラスチック製ケージにて飼育した。
(1)冷却遠心機: 5930型・・・KUBOTA社製
(2)ホモジナイザー:HG-92G・・・TAITEC社製
(3)紫外・可視分光光度計(UV/Visible Spectrophotometer):Ultrospec 3100 pro・・・Amersham Pharmacia Biotech 社製
(4)ラジカル開始剤(AAPH:2,2-Azobis-amidinopropane dihydrochloride)
(5)8-OHdG測定キット:日本老化制御研究所
(A−3) 被験物質の概要
(1)浄水(対照群1-0, 1-1にて使用)
(2)Ptコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の浄水(対照群1-2にて使用)
(3)Pdコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の浄水(対照群1-3にて使用)
(4)触媒無添加循環電解処理水(電解水素水、試験群1-1にて使用)
(5)触媒前添加循環電解処理水(Ptコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群1-2にて使用)
(6)触媒前添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群1-3にて使用)
(A−4) 試験方法および試験項目
(1)体重・摂餌量・摂水量の測定
体重、摂餌量、並びに摂水量については、毎日午前10〜11時の間に測定した。
試験開始初日から7日目までの7日間のあいだ、各群のラットに対して割り当てられた各々の被験物質(200mL容量の遮光ガラス瓶に200mL封入)を、開栓直後に、ディスポーザブル胃ゾンデを用いて、一個体につき2mLだけ強制経口投与した。その際に、給水瓶の水を新鮮なものに交換した。つまり、給水瓶に残っていた古い水を捨てたあと、強制経口投与に用いた後の新鮮な残水を、給水瓶内の空気層を出来得る限り除去するように給水瓶の許容量まで静かに満たし、給水の飲口をセットして、自由に与えた。なお、強制経口投与については、午前10〜11時、午後5〜6時の1日あたり2回実施した。また、ラジカル開始剤AAPH(以下、AAPHと省略する場合がある。)投与直前に、被験物質を上述の要領で強制経口投与した。その際に、上述の要領で給水瓶の水を新鮮なものに交換し、解剖時まで自由に与えた。
AAPHは水溶性であるため、生理食塩水を用いて50mg/kg B.W.に調製した。調製はAAPH投与日に行った。こうして調製したAAPHを、試験開始後7日目に、後述する対照群1-0を除く6群のラットに腹腔内投与することで、脂質の過酸化を誘発させた。なお、対照群1-0については生理食塩水を腹腔内投与した。
AAPH投与後より解剖までの12時間のあいだ(この間は絶食)、代謝ケージを用いて尿を採取した。採取した尿については不純物を濾過したのち、分析に供するまで−80℃下に凍結保存した。
AAPH投与終了後より12時間経過後(この間は絶食)、エーテル麻酔下で解剖した。肝臓を主体に肉眼的観察を行った後、肝臓を摘出し、分析に供するまで−80℃下にて凍結保存した。
上記(A−4)−(4)にて採取した尿について、8-OHdG濃度を測定した。なお、8-OHdGは酸化ストレスの指標としてひろく用いられている。
上記(A−4)−(5)にて摘出した肝臓を解凍後、氷冷下でホモジナイズし、チオバルビツール酸(TBA)法により肝臓中の過酸化脂質(TBARS:チオバルビツール酸反応物)量を測定した。なお、TBARSは脂質過酸化の指標としてひろく用いられている。
得られた測定データについて、群毎の平均値±標準誤差を算出した。各群間の統計的有意差を検定するため、スチューデントのt検定(Student's t-test)を行い、p値 (p-value) が5%以下 (p<0.05) の場合を統計学的に有意であるとした。
(対照群1-0)
飼育用水として、藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水(浄水)を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を対照群1-0とする。なお、対照群1-0は、ごくふつうの環境で飼育した群であり、対照群1-0では、AAPHに代えて生理食塩水が腹腔内投与されている。つまり、対照群1-0では、過酸化脂質の誘発はない。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を対照群1-1とする。なお、対照群1-0と対照群1-1との相違点はAAPHの投与有無である。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水に、実施例3〜5に記載のPt基準液を、Ptコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ含有させたものを採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を対照群1-2とする。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水に、実施例6〜8に記載のPd基準液を、Pdコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ含有させたものを採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を対照群1-2とする。なお、対照群1-2と対照群1-3との相違点は、含有させる貴金属コロイドの種類である。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水1リットルを、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒無添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を試験群1-1とする。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水1リットルに、実施例3〜5に記載のPt基準液を、Ptコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群1-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を試験群1-2とする。
飼育用水として、対照群1-0と同様の浄水1リットルに、実施例6〜8に記載のPd基準液を、Pdコロイド濃度が192μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群1-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を10匹のラットに対して行った群を試験群1-3とする。なお、試験群1-2と試験群1-3との相違点は、含有させる貴金属コロイドの種類である。
体重・摂餌量・摂水量
AAPH投与前7日間における体重推移について、対照群1-0~3と試験群1-1~3の7群において群間差は認められなかった。同期間中の摂餌量、摂水量についても、同7群において群間差は認められなかった。
AAPH投与前7日間およびAAPH投与後の状態観察について、投与前では、外観や行動に異常は認められなかった。一方、投与後では、各群やや被毛が逆立っていたものの、行動については、投与前と比較して異常な変化は観察されなかった。
尿中の8-OHdG濃度について、対照群1-0~3と試験群1-1~3の7群を対比している図46及び表7は、貴金属コロイド(Pt又はPd)触媒含有電解水素水(AOW)の飲用が、ラット遺伝子DNAの酸化損傷抑制に与える影響を示す。
解剖時に摘出した肝臓の肉眼的観察では、対照群1-1~3の3群との比較において、試験群1-1~3の3群について弾力性が認められ、正常な肝臓に近い状態であった。
肝臓中の過酸化脂質量について、対照群1-0~3と試験群1-1~3の7群を対比している図47及び表8は、貴金属コロイド(Pt又はPd)触媒含有電解水素水(AOW)の飲用が、ラットにおける脂質過酸化抑制に与える影響を示す。
被験物質強制経口投与・自由摂取の抗酸化作用について、ラジカル開始剤AAPHを腹腔内投与することで生体内に脂質過酸化を誘発させたモデル動物を用いて比較検討した。なお、本発明でいう抗酸化作用とは、フリーラジカルや過酸化脂質に由来する細胞成分の不可逆的酸化反応が原因で起こるDNA損傷、細胞の突然変異、形態変化、細胞死などを含む酸化的細胞傷害を防止、または抑制する作用をいい、広義にはフリーラジカル消去活性および脂質過酸化反応の抑制活性をも包含するものである。
ラットアジュバント関節炎は、自己免疫疾患の範疇に属する慢性関節リウマチの動物モデルのひとつとしてよく用いられている。自己免疫疾患とは、自己の細胞の破壊がきっかけとなり、破壊された細胞またはその成分に対する自己抗体ができ、自己の白血球による破壊が継続するもの、と定義付けられた、原因不明の疾患である。こうした自己免疫疾患に苦しむ患者の数は年々増加してきており、必然的に副作用を伴う既成概念の治療剤とはまったく一線を異にする、副作用なしに薬理機能を発揮する新規な予防/治療剤の開発が強く待ち望まれている。
(A−1) 実験動物・飼育環境
日本チャールスリバー(株)より8週齢で購入した雌性Lewis系ラット(SPF:specific pathogen free)を7日間予備飼育して実験に供した。ラットは予備飼育期間および実験期間を通して室温24±3℃、相対湿度55±15%のSPFバリア飼育室(照明時間8時〜18時、換気回数18回/時)にて、1ケージあたり4匹を飼育した。
(1)足容積測定装置: TK−105型・・・室町機械製
(2)結核菌:M. tuberculosis H37Ra・・・和光純薬製、ロットNo.2116641
(3)流動パラフィン・・・和光純薬製、ロットNo.EWQ1149
(A−3) 被験物質の概要
(1)浄水(対照群2-1にて使用)
(2)触媒無添加循環電解処理水(電解水素水、試験群2-1にて使用)
(3)触媒後添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群2-2にて使用)
(4)触媒前添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約600μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群2-3にて使用)
(5)触媒前添加循環電解処理水(Ptコロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群2-4にて使用)
(6)触媒前添加循環電解処理水(Pt/Au合金コロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群2-5にて使用)
(7)触媒前添加循環電解処理水(Pd/Au合金コロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水、試験群2-6にて使用)
(A−4) 試験方法、並びに、観察及び検査項目
(1)アジュバントの調製と関節炎の誘発
結核菌:M. tuberculosis H37Ra(和光純薬工業株式会社、ロットNo.2116641)の加熱死菌を適当量秤りメノウ乳鉢で微粉末にした後、流動パラフィン(和光純薬工業株式会社、ロットNo.EWQ1149)を少しずつ加えて懸濁し、3 mg/mlの懸濁液を作製した。ラットをエーテル麻酔下に固定台に固定し、作製したアジュバントの0.1 mlを右後肢の足蹠皮内に注射し関節炎を誘発させた。なお、誘発日をday 0とした。
Day 0からDay 23までの24日間のあいだ、各群のラットに対して割り当てられた各々の被験物質(200mL容量の遮光ガラス瓶に200mL封入)を、開栓直後にディスポーザブル胃ゾンデを用いて、一個体につき3mLだけ強制経口投与した。その際に、給水瓶の水を新鮮なものに交換した。つまり、給水瓶に残っていた古い水を捨てたあと、強制経口投与に用いた後の新鮮な残水を、給水瓶内の空気層を出来得る限り除去するように給水瓶の許容量まで静かに満たし、給水の飲口をセットして、自由に与えた。
毎日1回一般状態を観察し、記録用紙に記入した。
体重計にて各群ラットの体重を測定した。体重測定日はday 0、3、8、13、16および23とした。
同一検者が無作為に、感作部位の右後肢を除く右前肢、左前肢および左後肢の発赤、腫脹および強直の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従った0〜4点のスコアを付け、最高12点の合計で評価した。観察日は体重測定日と同一にした。
1:肢指など小関節が1本のみ発赤、腫脹を示す(mild)
2:小関節2本以上、あるいは手首、足首などの比較的大きな関節が発赤、腫 脹を示す(moderate)
3:1本の手または足全体が発赤、腫脹を示す(moderately-severe)
4:1本の手または足の全体的な腫脹が最大限に達し、しかも関節の強直を伴 う(severe)
(6)足容積測定
各群ラットの右後肢容積を、足容積測定装置を用いて測定した。測定日は体重測定日と同一にした。
得られた体重、関節炎スコア、並びに右後肢容積は、群毎の平均値±標準誤差で示した。各群 (n=8) 間の統計的有意差を検定するため、解析ソフト(Stat View, Abacus Inc., USA)を用いて統計処理を行った。体重及び肢容積データは分散分析(ANOVA)を行い等分散であることを確認した後、Fisher’s PLSD法である多重比較検定を行い群間の比較を行った。また、関節炎スコアデータはMann-WhitneyのU検定を用いて群間の比較を行った。いずれの場合も危険率5%未満 (p<0.05) を統計学的に有意であるとした。
(対照群2-1)
飼育用水として、藤沢市水道水を活性炭カラムに通して処理した活性炭処理水(浄水)を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を対照群2-1とする。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルを、毎分1.5リットルの流量で5A定電流の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒無添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-1とする。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルを、試験群2-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)したものに、実施例6〜8に記載のPd基準液を、Pdコロイド濃度が約300μg/Lとなる量だけ含有させた触媒後添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-2とする。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルに、実施例6〜8に記載のPd基準液を、Pdコロイド濃度が約600μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群2-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-3とする。なお、試験群2-2と試験群2-3との相違点は、含有させる貴金属コロイド(Pd)の添加時期並びに濃度である。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルに、実施例3〜5に記載のPt基準液を、Ptコロイド濃度が約300μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群2-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-4とする。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルに、実施例90と同様のPt/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約300μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群2-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-5とする。
飼育用水として、対照群2-1と同様の浄水1リットルに、実施例93と同様のPd/Au合金コロイド含有溶液を、コロイド濃度が約300μg/Lとなる量だけ含有させたものを、試験群2-1と同様の電解条件にて連続通水循環式(循環水量は0.8リットル)に1分間にわたり電解処理(2パス電解処理に相当)した触媒前添加循環電解処理水を採用したときの、(A−4)に記載の試験手順に従う操作を8匹のラットに対して行った群を試験群2-6とする。
体重
全試験期間を通じての体重推移について、対照群2-1と試験群2-1~6の7群を対比している図48及び表9は、貴金属コロイド触媒含有電解水素水(AOW)の飲用が、ラット体重推移に与える影響を示す。なお、図48について、線図の見易さを担保するため、標準誤差の表示を割愛した。
全試験期間を通じての状態観察について、全ての群において関節炎症状以外の異常な変化は観察されなかった。
全試験期間を通じての関節炎スコア推移について、対照群2-1と試験群2-1~6の7群を対比している図49及び表10は、貴金属コロイド触媒含有電解水素水(AOW)の飲用が、関節炎スコア推移に与える影響を示す。なお、図49について、線図の見易さを担保するため、標準誤差の表示を割愛した。
全試験期間を通じての感作肢(右後肢)容積推移について、対照群2-1と試験群2-1~6の7群を対比している図50及び表11は、貴金属コロイド触媒含有電解水素水(AOW)の飲用が、感作肢容積推移に与える影響を示す。なお、図50について、線図の見易さを担保するため、標準誤差の表示を割愛した。
被験物質強制経口投与・自由摂取のアジュバント関節炎に対する発症予防効果について、アジュバントを右後肢の足蹠皮内に注射することで関節炎を誘発させたモデル動物を用いて比較検討した。
以下に、上述の酸化還元色素を用いたDH定量分析方法による追加の参考例と実施例を示す。
前述の薬理試験における対照群1-0 ,1-1 ,2-1 にて使用した浄水を被検定水とし、同被検定水200mLに、前述の要領で窒素ガス置換した40倍濃度Pt基準液1mLを、シリンジを用いて被検定水収容室に注入して十分攪拌し混合させたあと、同被検定水に10g/L濃度(体積モル濃度;26773.8μM)のメチレンブルー水溶液を、被検定水の呈色変化を目視で観察しながら少量づつシリンジを用いて注入した。終点にいたるまでの同メチレンブルー水溶液の総注入量は0mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は0(mg/L)であった。本参考例35に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における対照群1-2 にて使用したPtコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の浄水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は0mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は0(mg/L)であった。本参考例36に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における対照群1-3 にて使用したPdコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の浄水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は0mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は0(mg/L)であった。本参考例37に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群1-1 ,2-1 にて使用した触媒無添加循環電解処理水(電解水素水)を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.4mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.71(mg/L)であった。本参考例38に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群1-2 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Ptコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.3mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.69(mg/L)であった。本実施例96に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群1-3 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約200μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.4mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.71(mg/L)であった。本実施例97に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群2-2 にて使用した触媒後添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.4mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.71(mg/L)であった。本実施例98に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群2-3 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Pdコロイド触媒(約600μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.7mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.79(mg/L)であった。本実施例99に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群2-4 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Ptコロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.3mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.69(mg/L)であった。本実施例100に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群2-5 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Pt/Au合金コロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.4mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.71(mg/L)であった。本実施例101に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
前述の薬理試験における試験群2-6 にて使用した触媒前添加循環電解処理水(Pd/Au合金コロイド触媒(約300μg/L濃度)含有の電解水素水を被検定水とし、参考例35と同様の要領にてメチレンブルー滴定によるDH定量分析方法を実施したところ、終点にいたるまでのメチレンブルー水溶液の総注入量は6.4mLであり、前記式7に各値を代入して求めた溶存水素濃度DHの実効値は1.71(mg/L)であった。本実施例102に係る被検定水の、各種物性値、並びに溶存水素濃度DHの実効値を表12に示すとともに、溶存水素濃度DHの実効値を図51に示す。
Claims (2)
- 分子状水素を活性水素に分解する触媒を含有せず、さらに該触媒を作用させる過程を通じて分子状水素から生成する生成物としての活性水素を含有せず、
ヒドロキシラジカルによる強制的な水素引き抜き反応を通じて該ラジカルとは反応するがスーパーオキサイドアニオンラジカルの消去活性はない高濃度水素溶存水を含有する薬理機能水を含有するヒドロキシラジカル選択的フリーラジカル消去剤であって、
前記水素溶存水とは、蒸留水に、分子状水素を曝気または加圧充填して処理した水であり、かつ、当該処理時に、前記蒸留水に0.89mg/L以上の分子状水素が含有されることを特徴とする薬理機能水を含有するヒドロキシラジカル選択的フリーラジカル消去剤。 - 前記ヒドロキシラジカル選択的フリーラジカル消去剤は、経口投与されることを特徴とする請求項1に記載のヒドロキシラジカル選択的フリーラジカル消去剤。
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