JP2007297281A - 体内活性酸素消去剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】80%近い病気の原因とされている体内活性酸素を処理するための体内活性酸素消去剤を提供すること。
【解決手段】ナノサイズ貴金属(白金、パラジウム、金又は銀)コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤は、その還元力により体内活性酸素を処理することができる。また、経口により簡便に摂取可能であり、体内活性酸素の関与する疾患の予防または処置に有用である。
【選択図】図4
【解決手段】ナノサイズ貴金属(白金、パラジウム、金又は銀)コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤は、その還元力により体内活性酸素を処理することができる。また、経口により簡便に摂取可能であり、体内活性酸素の関与する疾患の予防または処置に有用である。
【選択図】図4
Description
本発明は、ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤、特に経口により摂取可能な該体内活性酸素消去剤に関する。更に本発明は、体内活性酸素が関与する疾患を予防または処置するための体内活性酸素消去剤に関する。
呼吸により取り込まれた酸素は、その2−3%が体内で活性酸素に変化すると考えられている。活性酸素は、酸素とは異なり不対電子を有し、他の分子から電子を奪って安定化しようとするため酸化力が大変強いことが知られている。代表的な活性酸素は、スーパーオキシドアニオン(O2 −)、1重項酸素(1O2)、ヒドロキシラジカル(・OH)および過酸化水素(H2O2)である。活性酸素は、体内に侵入した細菌やウィルスを傷害でき、生体防御に重要な役割を果たす。また、細胞内で糖類からエネルギー(ATP)を生成する過程にも関与する。
健康な状態では、体内における活性酸素の生成と消去のバランスが保たれている。体内における活性酸素の消去は、スーパーオキシドアニオン(O2 −)および一重項酸素(1O2)の場合はスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、ヒドロキシルラジカル(・OH)の場合はグルタチオンペルオキシダーゼ、過酸化水素(H2O2)の場合はカタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼなど、還元力を有する体内の様々な物質により行われる。さらに、ビタミン類は活性酸素に電子(e−)を与えて消去する。
本発明は、様々な疾患の原因となる体内活性酸素を消去し、それにより体内活性酸素が関与する疾患の発症を予防し、またそれら疾患を処置することを目的とする。
発明者らは、上記課題を解決するうえで、ナノメートルサイズの金属超微粒子(特開2001−079382号、特開2001−212102号)が持つ電気化学的性質に注目した。発明者らは、ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液に還元力があることを、酸化還元色素:DCIP(2,6ジクロロインドフェノールナトリウム二水和物)およびラジカル色素:DPPH(1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル)を用いて確認している(特願2004−092569号)。DCIP(酸化型)は電子(e−)及びプロトン(H+)を供与すると還元されてDCIPH2(還元型)となる(図1)。また、ラジカル色素(DPPHラジカル)に電子(e−)を供与するとラジカルが消去される(図2)。これらの知見を基に、ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液が実際に体内活性酸素を消去できることを確認し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下のものを提供する:
(1)ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤;特に、経口により摂取可能な該体内活性酸素消去剤;
(2)体内活性酸素が、スーパーオキシドアニオン(O2 −)、1重項酸素(1O2)、ヒドロキシラジカル(・OH)および過酸化水素(H2O2)より成る群から選択される1またはそれ以上のものである、(1)記載の体内活性酸素消去剤;
(3)ナノサイズ貴金属コロイドを構成する貴金属超微粒子の平均粒子径が2〜5nm、および/またはナノサイズ貴金属コロイドのゼータ電位がマイナス(−)20mV〜マイナス(−)60mVである、(1)または(2)記載の体内活性酸素消去剤;
(4)体内活性酸素が関与する疾患を予防または処置するための、(1)から(3)のいずれかに記載の体内活性酸素消去剤。
(1)ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤;特に、経口により摂取可能な該体内活性酸素消去剤;
(2)体内活性酸素が、スーパーオキシドアニオン(O2 −)、1重項酸素(1O2)、ヒドロキシラジカル(・OH)および過酸化水素(H2O2)より成る群から選択される1またはそれ以上のものである、(1)記載の体内活性酸素消去剤;
(3)ナノサイズ貴金属コロイドを構成する貴金属超微粒子の平均粒子径が2〜5nm、および/またはナノサイズ貴金属コロイドのゼータ電位がマイナス(−)20mV〜マイナス(−)60mVである、(1)または(2)記載の体内活性酸素消去剤;
(4)体内活性酸素が関与する疾患を予防または処置するための、(1)から(3)のいずれかに記載の体内活性酸素消去剤。
本発明の体内活性酸素消去剤は、ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液の還元力により体内活性酸素を消去することができ、体内活性酸素が関与する疾患の予防および処置に有用である。
本発明は、ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を含む体内活性酸素消去剤に関する。
本発明における「ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液」とは、ナノサイズ貴金属コロイドが安定に分散している水溶液を意味する。ナノサイズ貴金属コロイドは、粒子径がナノメートルサイズであり、マイナス(−)に帯電した貴金属超微粒子と、その周囲でイオン解離(H+、OH−)した水分子の電気二重層より構成される(図4)。
本発明における「ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液」とは、ナノサイズ貴金属コロイドが安定に分散している水溶液を意味する。ナノサイズ貴金属コロイドは、粒子径がナノメートルサイズであり、マイナス(−)に帯電した貴金属超微粒子と、その周囲でイオン解離(H+、OH−)した水分子の電気二重層より構成される(図4)。
粒子径がナノメートルサイズとは、平均粒子径が2〜20nm、好ましくは2〜5nmであるサイズを意味する。貴金属超微粒子の粒子径は、電子顕微鏡観察(TEM観察)により、例えば日立製HF−2000形電界放出透過電子顕微鏡を用いて測定することができる(特開2002−212102号)。
図4に示す様に、貴金属超微粒子のマイナス電荷により、その周囲の水分子はプラス(H+)側を貴金属超微粒子側に向け、マイナス(OH−)側を外側に向けた構造をとっている。この電気二重層が形成するナノサイズ貴金属コロイドのゼータ電位は電子供与体としての性質およびコロイドの安定性に重要であり、マイナス(−)20mV〜マイナス(−)60mVであることが好ましい(特開2002−212102号)。当該表面電位は、電気泳動光散乱法により測定することができる(特開2002−212102号)。
貴金属は、例えば白金、パラジウム、金または銀であるが、経口により摂取することを考慮して食品添加物として認められている白金、パラジウムまたは金が好ましく、特に白金およびパラジウムが好ましい。
本発明におけるナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液は、金属塩還元反応法と呼ばれる方法によって調製される(特開2001−079382号)。本方法においては、貴金属イオン溶液、貴金属イオン溶液に混合する水(精製水からろ過により不純物を取り除いたもの)、界面活性剤、還元剤、およびpH補償剤を準備する。
貴金属イオン溶液は、例えば塩化白金酸溶液、塩化パラジウム酸溶液、塩化金酸溶液、または硝酸銀溶液である。該溶液は、市販されている貴金属ハロゲン化物を水に溶解することにより調製される。
界面活性剤は、分散安定剤としてナノサイズ貴金属コロイドの沈殿および凝集を防止するために添加するものである。界面活性剤は、食品に使用可能なグリセリン脂肪酸エステルが好ましい。また、食品でもあるデンプンのような糖類も分散安定剤として使用できる。デンプンの場合も添加量はグリセルン脂肪酸エステルとほぼ同量である。これらの分散安定剤は、工業的に分散安定剤として使用されている界面活性剤であるポリマー、例えばPAA(ポリアクリル酸アミド)、PVP(ポリビニルピロリドン)、ドデシルトリメチルアンモニウムプロミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリココールモノラウレートなどと比較して、消化管に影響する恐れが低いことを特徴とする。
還元剤は、貴金属イオン溶液の還元反応を進行させるために添加するものであり、例えばエタノール等の低分子アルコールである。低分子アルコールは、工業的に還元剤として使用されているヒドラジン1水和物(H2NNH2・H2O)、テトラヒドロホウ酸塩(Na[BH4])、亜硫酸ナトリウム(Na2SO3・7H2O)、重亜硫酸ソーダ(NaHSO3)、ホルムアルデヒド(HCHO)、アセトアルデヒド(CH3CHO)などと比較して、消化管に影響する恐れが低いことを特徴とする。
pH補償剤は、貴金属イオン溶液を添加することにより酸性となる処理液のpHを中性又は弱アルカリ性に調整するものである。従ってpH補償剤は貴金属イオン溶液と同時に処理液中に添加する。pH補償剤は、アルカリ金属類、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどが好ましく、特に炭酸水素ナトリウムが好ましい。
ナノサイズ貴金属コロイドを調製する操作は、まず水を攪拌しつつ温度を上げ、一定の温度に達したのち界面活性剤と還元剤とを添加する。次いでこの処理液中に貴金属イオン溶液およびpH補償剤を同時に添加する。貴金属イオン溶液を一定の温度に達した後に添加することは重要である。貴金属イオン溶液中の貴金属イオンに還元剤を作用させて水中で還元させる。貴金属イオン溶液を添加した処理液の温度を一定に保持したまま攪拌を続け、貴金属イオンが還元された時点(白金、パラジウム、銀などの場合は液中色が黒色に変色した時点、金の場合は赤紫色に変色した時点)で処理液の加温・攪拌を終了する。その結果処理液中にナノサイズ貴金属コロイドが得られる。
ここに、貴金属イオン溶液には、参考例において「塩化白金酸溶液5ml(Pt 1g含有)」と示すように、質量(g)/容量(ml)比で1/5の量の貴金属イオンが含まれていることを想定している。貴金属の種類(白金、パラジウム、金など)によって若干の差があるが、貴金属イオン溶液1に対し水を400〜2000倍用いる場合、界面活性剤の添加量は貴金属イオン溶液の0.2〜2倍である。還元剤の添加量は貴金属イオン溶液の40〜100倍、pH補償剤の添加量は5%濃度のもので貴金属イオン溶液の10〜30倍の範囲内に設定すべきである。
界面活性剤の添加量を貴金属イオン溶液の量の0.2〜2倍にコントロールすることによって、生成したナノサイズ貴金属コロイドの安定性が確保される。処理液中の界面活性剤の添加量が多くなればなるほど界面活性剤が凝集するようになり、逆に界面活性剤の添加量が少ないと処理液中に生成したナノサイズ貴金属コロイドが沈殿するようになる。還元剤の添加量は、貴金属イオン溶液の40〜100倍の範囲より多くても少なくても、生成したナノサイズ貴金属コロイドが沈殿するようになる。また、pH補償剤の添加量が金属イオン溶液の10〜30倍の範囲より多くても少なくても、生成したナノサイズ貴金属コロイドが沈殿するようになる。なお、各添加剤の添加量は他の添加剤の添加量との関係で決定されることは明らかである。
貴金属イオン溶液の量に比べて水の量が多いと、それだけ水中での貴金属イオン溶液、還元剤、pH補償剤の濃度が相対的に低下し、処理液中に生成されるナノサイズ貴金属コロイドの分散安定性に問題が起きる。さらに、還元処理反応工程において貴金属濃度が2000ppmを超えると分散安定性が悪くなる(特願2003−404273号)
貴金属イオン溶液の量に比べて水の量が多いと、それだけ水中での貴金属イオン溶液、還元剤、pH補償剤の濃度が相対的に低下し、処理液中に生成されるナノサイズ貴金属コロイドの分散安定性に問題が起きる。さらに、還元処理反応工程において貴金属濃度が2000ppmを超えると分散安定性が悪くなる(特願2003−404273号)
還元処理温度は50〜75℃の範囲であり、70℃付近が望ましい。
本明細書の参考例では、水に還元剤と界面活性剤とをいれて還元性雰囲気を処理液中に形成した後に貴金属イオン溶液を添加したが、或いは、逆に水の温度を上げて界面活性剤を入れ、一定温度に達した後に、処理液中に貴金属イオン溶液とpH補償剤とを添加し、その後還元剤を添加して処理液中に還元性雰囲気を形成してもよい。
上記の還元処理後、埃などの混入防止、ナノサイズ貴金属コロイド以外の低分子イオンの除去、および脱塩のためろ過および洗浄精製処理を行い、本発明におけるナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を得る。得られた溶液中の貴金属濃度は200〜500ppmである。
本発明の体内活性酸素消去剤は、上記方法により調製したナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液であってよく、また、該水溶液に加えて、食品として、または製薬的に許容される適当な溶媒および/または添加物を含んでもよい。
本発明の体内活性酸素消去剤が消去可能な活性酸素種には、スーパーオキシドアニオン(O2 −)、1重項酸素(1O2)、ヒドロキシラジカル(・OH)および過酸化水素(H2O2)が含まれる。
本発明の体内活性酸素消去剤は、経口により摂取可能なため簡便に服用できる点で特に有用である。ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液の量として、1日4〜10ccを目安に摂取する。水または他の飲み物、例えば茶、コーヒー、ジュース等で希釈して摂取することもできる。
本発明の体内活性酸素消去剤はまた、体内活性酸素が関与する疾患を予防または処置するのに使用することができる。継続して飲用し体内活性酸素を処理することにより当該疾患の発症を予防し、また、当該疾患を有する患者においても疾患の進行を抑制し、症状を改善できると期待される。体内活性酸素が関与する疾患の例は表1に示している。ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液の量として1日4〜30cc、好ましくは8〜30cc、より好ましくは12〜30ccを目安に摂取する。水または他の飲み物で希釈して摂取してもよい。
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例に限定されるものではない。
(参考例) ナノサイズ白金コロイド含有水溶液の調製
<水A>精製水を1μmの濾紙(定量濾紙No.5C、アドバンテック東洋株式会社)でろ過し、4300mlを準備した。
<還元剤B>エタノール(CH3CH2OH)450mlを準備した。
<界面活性剤C>グリセリン脂肪酸エステルとして三菱化学フーズ社製「L−10D」0.5gおよび理研ビタミン社製「J−0381V」1.5gを計量してそれぞれ精製水10mlに溶解し混合した。
<金属イオン溶液D>塩化白金酸溶液(H2PtC16)を準備し、この塩化白金酸溶液5ml(Pt 1g含有)を計量した。
<pH補償剤E>炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)5gを準備し、ろ過した100mlの精製水に溶解した。
(参考例) ナノサイズ白金コロイド含有水溶液の調製
<水A>精製水を1μmの濾紙(定量濾紙No.5C、アドバンテック東洋株式会社)でろ過し、4300mlを準備した。
<還元剤B>エタノール(CH3CH2OH)450mlを準備した。
<界面活性剤C>グリセリン脂肪酸エステルとして三菱化学フーズ社製「L−10D」0.5gおよび理研ビタミン社製「J−0381V」1.5gを計量してそれぞれ精製水10mlに溶解し混合した。
<金属イオン溶液D>塩化白金酸溶液(H2PtC16)を準備し、この塩化白金酸溶液5ml(Pt 1g含有)を計量した。
<pH補償剤E>炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)5gを準備し、ろ過した100mlの精製水に溶解した。
水Aを容器にいれ、これを攪拌しながら温度を上げた。水の温度が60℃になった時点で水Aに還元剤Bおよび界面活性剤Cを添加した。その後水Aを攪拌しながら温度を上げ、処理液の温度が70℃になった時点で金属イオン溶液DとpH補償剤Eとを同時に添加した。
温度を70℃に保持したまま処理液の攪拌をつづけ、金属イオンが還元した時点で攪拌および加温を停止し、白金コロイドを得た。
攪拌終了後の白金コロイドを1μmの濾紙(定量濾紙No.5C、アドバンテック東洋株式会社)でろ過し、12時間静置した。静置後、分画分子量10,000の限外ろ過膜(日本ミリポア株式会社)で、精製水15,000mlを加えながら洗浄精製のためのろ過を行い、透過水側の透過水を塩分計で測定して塩分不検出になったことで洗浄精製ろ過処理を完了した。
温度を70℃に保持したまま処理液の攪拌をつづけ、金属イオンが還元した時点で攪拌および加温を停止し、白金コロイドを得た。
攪拌終了後の白金コロイドを1μmの濾紙(定量濾紙No.5C、アドバンテック東洋株式会社)でろ過し、12時間静置した。静置後、分画分子量10,000の限外ろ過膜(日本ミリポア株式会社)で、精製水15,000mlを加えながら洗浄精製のためのろ過を行い、透過水側の透過水を塩分計で測定して塩分不検出になったことで洗浄精製ろ過処理を完了した。
得られたナノサイズ白金コロイド含有水溶液の白金濃度は500ppm、酸化還元電位(ORP)は−200mV以下の負電位であった。日立製HF−2000形電界放出透過電子顕微鏡で観察した白金超微粒子の粒子径は2〜3nmの範囲であった。また、電気泳動光散乱装置(大塚電子株式会社)で測定したゼータ電位はマイナス(−)50.1mVであった。
(実施例)
体外(in vitro)での評価結果から体内(in vivo)での活性酸素消去能を推測するのに適した各種活性酸素の発生方法と測定方法を選択し(「活性酸素測定マニュアル」浅田浩二他、株式会社講談社発行)、本発明の体内活性酸素消去剤の体内活性酸素消去能を実証した。
体外(in vitro)での評価結果から体内(in vivo)での活性酸素消去能を推測するのに適した各種活性酸素の発生方法と測定方法を選択し(「活性酸素測定マニュアル」浅田浩二他、株式会社講談社発行)、本発明の体内活性酸素消去剤の体内活性酸素消去能を実証した。
(実施例1) スーパーオキシドアニオン(O2 −)の消去
本発明の体内活性酸素消去剤のin vitroにおけるスーパーオキシドアニオン(O2 −)消去能を、白血球浮遊液にPMA(ホルボールミリステートアセテート)刺激剤を加えて白血球内外に発生するスーパーオキシドアニオン(O2 −)を測定する方法により検討した。
本発明の体内活性酸素消去剤のin vitroにおけるスーパーオキシドアニオン(O2 −)消去能を、白血球浮遊液にPMA(ホルボールミリステートアセテート)刺激剤を加えて白血球内外に発生するスーパーオキシドアニオン(O2 −)を測定する方法により検討した。
好中球の細胞膜には、NADPHを基質としてスーパーオキシドアニオン(O2 −)を生じる電子伝達系がある(図3)。PMA刺激剤を好中球浮遊液に加えると、好中球内外にスーパーオキシドアニオン(O2 −)が生成する。さらに、好中球はpH7.0の中性付近ではスーパーオキシドアニオン(O2 −)しか生成しないと言われている。生成したスーパーオキシドアニオン(O2 −)は、チトクロムc還元法により測定した。チトクロムc還元法は、測定方法が簡便で連鎖反応が起こらず、還元型の自動酸化が遅い。pH7.0付近ではスーパーオキシドアニオン(O2 −)による反応速度定数とチトクロムcの反応速度定数はほとんど変わらない。
本発明の体内活性酸素消去剤として、参考例の方法で製造した、粒子径2〜3nm、ゼータ電位マイナス(−)50.1mVのナノサイズ白金コロイド含有水溶液(白金濃度:500ppm)を用いた。
PMA刺激剤により白血球が産生するスーパーオキシドアニオン(O2 −)を測定するため、下記の液を調合した。
37℃で波長550nmの吸光度の増加をBeckman Du-65 Spectrophotometerで測定し、1〜4分の間の直線性のある部分での1分間の吸光度変化を求めた(Δ550nm/min)。
スーパーオキシドアニオン(O2 −)産生能は以下の式から求めた:
O2 −産生能(nmol/min)=
(SOD非存在下Δ550nm/min−SOD存在下Δ550nm/min)×54。
上記白血球浮遊液にナノサイズ白金コロイド含有水溶液を0.1%、1%または10%添加して測定した結果を、図5及び表2に示す。
上記実験結果から、0.1%ナノサイズ白金コロイド含有水溶液でも約40%のスーパーオキシドアニオン(O2 −)を消去することができ、1%以上添加すると全てのスーパーオキシドアニオン(O2 −)を消去できることが確認できた。
37℃で波長550nmの吸光度の増加をBeckman Du-65 Spectrophotometerで測定し、1〜4分の間の直線性のある部分での1分間の吸光度変化を求めた(Δ550nm/min)。
スーパーオキシドアニオン(O2 −)産生能は以下の式から求めた:
O2 −産生能(nmol/min)=
(SOD非存在下Δ550nm/min−SOD存在下Δ550nm/min)×54。
上記白血球浮遊液にナノサイズ白金コロイド含有水溶液を0.1%、1%または10%添加して測定した結果を、図5及び表2に示す。
(実施例2) 過酸化水素(H2O2)の消去
本発明の体内活性酸素消去剤の、in vitroにおける過酸化水素(H2O2)消去能について検討した。過酸化水素(H2O2)消去能は、式:
H2O2 → H2O + O2
に示す様に、過酸化水素(H2O2)が水(H2O)と酸素(O2)に分解される反応に基づいて確認した。
本発明の体内活性酸素消去剤の、in vitroにおける過酸化水素(H2O2)消去能について検討した。過酸化水素(H2O2)消去能は、式:
H2O2 → H2O + O2
に示す様に、過酸化水素(H2O2)が水(H2O)と酸素(O2)に分解される反応に基づいて確認した。
本発明の体内活性酸素消去剤として、参考例の方法で製造した、粒子径2〜3nm、ゼータ電位マイナス(−)50.1mVのナノサイズ白金コロイド含有水溶液(白金濃度:500ppm)を用いた。
容量300mLの三角フラスコを用いて、30%過酸化水素(H2O2)20mLに対してナノサイズ白金コロイド含有水溶液1mLを添加した。瞬時に水蒸気が白煙状態で噴出した。箸の先端に火をつけて燃やした後一旦火を消し、三角フラスコの上部に差し込んだところ、勢いよく燃え出した。この結果は、過酸化水素(H2O2)が水(H2O)と酸素(O2)に分解されたことを示唆している。
次に、過酸化水素(H2O2)の分解を酸素発生速度により評価した。塩酸(HCl)でpH7.2に調整した1mM過酸化水素水(20mMトリス含有)3.3mlを酸素測定用密閉ビーカに入れ、酸素電極をセットした。ナノサイズ白金コロイド含有水溶液(0.1ml)を添加して、溶存酸素の増加を測定した。充分酸素を吹き込み飽和させたときの溶存酸素濃度(20℃;284μM、30℃;237μM、文献値)を使用して増加酸素を計算した。
表3に示すように酸素発生速度に温度依存性があることから、化学反応、即ち過酸化水素(H2O2)の分解反応に起因して酸素(O2)が発生していることがわかる。
尚、過酸化水素(H2O2)は自己分解して酸素を発生する可能性があるが、本実施例においてナノサイズ白金コロイド含有水溶液を添加しなかった場合は、酸素の発生、言いかえると過酸化水素の分解、は観察されなかった。
尚、過酸化水素(H2O2)は自己分解して酸素を発生する可能性があるが、本実施例においてナノサイズ白金コロイド含有水溶液を添加しなかった場合は、酸素の発生、言いかえると過酸化水素の分解、は観察されなかった。
(実施例3) 一重項酸素(1O2)の消去
本発明の体内活性酸素消去剤の、in vitroにおける一重項酸素(1O2)の消去能を、ぺルオキシタ−ゼ系より生成する1O2をMCLA(ウミホタルルシフェリン類縁体、2−メチル−6−[p−メトキシフェノール]−3,7−ジヒドロイミダゾ−[1,2−a]ピラジン−3−オン)を用いた化学発光法で測定することにより検討した。
本発明の体内活性酸素消去剤の、in vitroにおける一重項酸素(1O2)の消去能を、ぺルオキシタ−ゼ系より生成する1O2をMCLA(ウミホタルルシフェリン類縁体、2−メチル−6−[p−メトキシフェノール]−3,7−ジヒドロイミダゾ−[1,2−a]ピラジン−3−オン)を用いた化学発光法で測定することにより検討した。
ラクトぺルオキシタ−ゼ(LPO)は、酸性溶液(pH4.5)中で過酸化水素(H2O2)の存在下一重項酸素(1O2)を生じる。MCLAは、1重項酸素(1O2)と反応して付加物を作り、さらに脱水素されて活性化される。その結果生成したジオキセタンが開裂すると励起カルボニルを生じ、これが基底状態に戻る時発光する。MCLAはスーパーオキシドアニオン(O2 −)とも反応して全く同様な系で発光するが、系にスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)を添加してスーパーオキシドアニオン(O2 −)依存性発光を消去すれば、1重項酸素(1O2)依存性発光のみが測定できる。
実験には、Sigma社製LPO(0.15〜0.6μM ぺルオキシタ−ゼ液)、和光純薬製 MCLA(200μM)、1mM NaOCl、1M H2O2、1M KBr、0.2M 酢酸緩衝液(pH4.5)、D2Oを使用した。水(H2O)の場合より発光量が多いことから重水(D2O)を用いた。反応液の大部分を占める酢酸緩衝液はD2Oを用いて調整した。液のpHは、pHメーターでpH4.5であれば重水の場合pD4.8に相当する。
本発明の体内活性酸素消去剤として、参考例の方法で製造した、粒子径2〜3nm、ゼータ電位マイナス(−)50.1mVのナノサイズ白金コロイド含有水溶液(白金濃度:500ppm)を用いた。
1重項酸素(1O2)の定量のための検量線を作成した。最終反応量が1mlとなるように、1M H2O2(20μl)、1mM NaOCl(10〜30μl)、200μM MCLA(50μl)、1M KBr(20μl)、0.2M 酢酸緩衝液(0.5ml)およびD2Oを計量した。H2O2、KBr、酢酸緩衝液およびD2Oを混合した液に50μlの200μM MCLA液を加え、20秒後に1mM NaOCl(10〜30μl)をマイクロシリンダーを用いて敏速に注入することで反応を開始した(最終NaOCl濃度10〜30μM)。発光測定器としてLuminescence Reader(Aloka社、型式:BLR-102)を用いた。25℃に保持して、発光の積分値(総発光量)をNaOCl濃度(μM)との相関でプロットした。良い直線性が得られ、NaOCl濃度が30μMでの総発光量(実測値)が8程度で評価できる値になった。
次にD2O1000μlにナノサイズ白金コロイド含有水溶液を2μl、20μl、60μl、または200μl添加した溶液を準備した。それぞれナノサイズ白金コロイド含有水溶液を添加したD2Oを、D2Oの変わりに前述の液において使用して1mlとし、同様の方法でNaOCl濃度:30μMで測定した。その結果、ナノサイズ白金コロイド含有水溶液20μlを添加したものから発光が見られなくなった。この結果から、ナノサイズ白金コロイド含有水溶液は、1%以上で一重項酸素(1O2)を消去できることが確認できた。
(実施例4) 体内活性酸素の消去
8−OHdG測定法を用いて、体内活性酸素による酸化損傷度を判定した。
体内のDNA成分の一つであるデオキシグアノシン(dG)は活性酸素で酸化されると8−ヒドロキシ−デオキシグアノシン(8−OHdG)に変化する。この8−OHdGは尿中に排出されるため、これを測定することにより体内活性酸素による酸化損傷度が判定できる(越智・高共著「生体内酸化ストレスの評価」、BIOClinica、2003年18巻14号(通巻235号)p62〜65(北陸館)、大澤著「食品の抗酸化機能とバイオマーカー」、ILSI、2002年9月(日本国際生命科学協会))。
8−OHdG測定法を用いて、体内活性酸素による酸化損傷度を判定した。
体内のDNA成分の一つであるデオキシグアノシン(dG)は活性酸素で酸化されると8−ヒドロキシ−デオキシグアノシン(8−OHdG)に変化する。この8−OHdGは尿中に排出されるため、これを測定することにより体内活性酸素による酸化損傷度が判定できる(越智・高共著「生体内酸化ストレスの評価」、BIOClinica、2003年18巻14号(通巻235号)p62〜65(北陸館)、大澤著「食品の抗酸化機能とバイオマーカー」、ILSI、2002年9月(日本国際生命科学協会))。
参考例に記載の方法で製造したナノサイズ白金コロイド含有水溶液(白金濃度:500ppm)である体内活性酸素消去剤10mlを市販のミネラルウォーター500mlに注入して使用した。
67歳、70kgの男性に、二日間(2004/3/29および30)朝昼夜と同じ時間に同じ食事を摂ってもらい、また夕食時のみ1合の焼酎を1合のお湯で割ったものを飲んでもらった。二日目の朝7時に指定の紙コップいっぱいに排尿してもらい、検査用サンプルチューブに小分けして冷凍庫に保管した(2004/3/30採取)。二日目は、前述の体内活性酸素消去剤を注入したミネラルウォーター全量を、朝10時から夜寝る前の10時までで平均して飲用してもらった。翌朝7時に紙コップに尿を採取した(2004/3/31採取)。検査用サンプルチューブに小分けして冷凍庫に保管した。冷凍保冷車で分析機関である日研ザイル株式会社検査部へ搬送した(2004/4/2受付)。2004/4/7に入手した8−OHdG測定結果報告書を表4に示す。
表4に示す様に、体内の活性酸素が大幅に消去されていることが確認できた。
本発明の体内活性酸素消去剤は、in vitroにおいてスーパーオキシドアニオン(O2 −)、1重項酸素(1O2)、および過酸化水素(H2O2)を消去できることが示された。ヒドロキシラジカル(・OH)は反応速度が非常に早く直接検出することは難しいが、DPPHラジカルの消去結果から(特願2004−092569号)、本発明の体内活性酸素消去剤はヒドロキシラジカル(・OH)も消去し得ると推測される。また、実施例4に示すように、in vivoにおいても活性酸素消去能を発揮することが確認された。従って本発明の体内活性酸素消去剤は、体内の余剰な活性酸素を消去して、疾患を予防するため、または既に発症した疾患を処置するための医薬品および飲料に利用可能である。他にも化粧品や医薬部外品に利用可能である。
Claims (6)
- ナノサイズ貴金属コロイド含有水溶液を含む、体内活性酸素消去剤。
- 経口により摂取可能な、請求項1記載の体内活性酸素消去剤。
- 体内活性酸素がスーパーオキシドアニオン、1重項酸素、ヒドロキシラジカル、過酸化水素より成る群から選択される1またはそれ以上のものである、請求項1または2に記載の体内活性酸素消去剤。
- ナノサイズ貴金属コロイドを構成する貴金属超微粒子の平均粒子径が2〜5nmである、請求項1から3のいずれかに記載の体内活性酸素消去剤。
- ナノサイズ貴金属コロイドのゼータ電位がマイナス(−)20mV〜マイナス(−)60mVである、請求項1から4のいずれかに記載の体内活性酸素消去剤。
- 体内活性酸素が関与する疾患を予防または処置するための、請求項1から5のいずれかに記載の体内活性酸素消去剤。
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