CN1816617B - 贮藏肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及贮藏细胞的方法，其中在-196℃到37℃的温度下将细胞贮藏在含有基本营养培养基和脂质体的组合物中，所述方法的特征是所述的脂质体含有一种或多种固醇并且所述的细胞是肿瘤细胞。更具体地，本发明涉及贮藏肿瘤细胞的简单有效的方法，其中细胞中的RNA和/或DNA基本上不被降解，从而可以在贮藏后分析RNA和/或DNA。

Description

贮藏肿瘤细胞的方法
发明领域
本发明涉及贮藏肿瘤细胞，如组织样品、活组织检查样品或者外植块的方法。更具体地，本发明涉及贮藏肿瘤细胞的简单有效的方法，其中细胞中的RNA和/或DNA基本上没被降解，从而可以在贮藏后分析RNA和/或DNA。
发明背景
肿瘤活组织检查样品通常用于诊断目的和得到关于潜在有效治疗的信息。例如，通过分析基因表达水平或者肿瘤细胞形状可以鉴定可能应答特定药物的患者。可以表征造成肿瘤生长的潜在突变。在许多测试中，肿瘤来源的RNA被用作分析的起始材料，例如，使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)进行分析。然而，不幸的是，已知RNA是尤其不稳定的。
由于不总是可能在得到肿瘤样品，如活组织检查样品后立即进行所有必要的测试，因此需要贮藏样品的方法。在一些情况中，仅在某时间以后或者可以用于分析以前肿瘤的新试验存在之后，进行某些测试的必要性才变得清晰。在长时间内贮藏肿瘤活组织检查样品是令人期望的。
已经开发了贮藏肿瘤细胞样品的几种方法。一种允许RT-PCR扩增RNA的方法是通过将细胞或组织浸入液氮深度冷冻细胞或组织并在-80℃贮藏。为了防止RNA酶对RNA的降解，必须在冷冻状态匀浆后将组织与RNA提取缓冲液混合。由于该方法严格需要液氮，所以该方法是劳动密集型的并且不适于保存临床条件中得到的组织样品。
通常，将病理样品与福尔马林混合并石蜡包埋(FSPE)。这些样品可用于组织学分析，但是RNA分析存在问题。已经开发了特定方法从此类组织提取RNA，例如，K.Dannenberg等人(美国专利6,248,535和美国专利6,428,963)开发的方法。肿瘤细胞的贮藏和RNA或者DNA的提取的该方法也是非常劳动密集的。
在水中贮藏可以进行蛋白质的免疫组织学分析，但是RNA被快速降解。
贮藏肿瘤细胞，如肿瘤活组织检查样品的一种标准方法是使用液体组合物RNAlater，其可以通过商业途径从Ambion或Qiagen获得。如在美国专利6,528,641中描述的，该RNA保存介质沉淀样品中的RNA以及样品蛋白质，从而保护RNA免受RNA酶的破坏。该沉淀由高盐浓度，通常由硫酸铵导致。
RNAlater不仅适于从组织提取RNA并以后分析RNA(W-H.Wang等人(2001)，Molecular Vision，卷7：89-94)，而且适于贮藏必须进行组织学或免疫组织化学分析的组织样品(S.R.Florell等人(2001)，Mod.Pathol.，卷14(2)：116-128)。然而，这些方法直接杀死待贮藏的样品中的细胞。
保存细胞的生存力将是有用的，例如，可用于克服所采集的组织样品的大小的限制。将细胞进行培养可以允许增殖细胞。还可能在以后的时间点直接从培养物或者冷冻和解冻细胞进行培养后对细胞的生物功能进行测定。
保存生存力对于贮藏用于移植的器官是至关重要的。已经认识到为灌注和贮藏器官开发的某些溶液也适于保存组织或培养细胞。例如，US 5,599,659公开含有例如视网膜来源的成纤维细胞生长因子、环糊精和硫酸软骨素的化学成分明确的细胞培养基可以用于保存器官或者组织或者血管内皮细胞的培养物。
WO93/09220涉及详细说明的基本培养基，其任选加入了可以用于造血祖细胞或白血病细胞的维持和生长的生长促进剂，像血细胞(hem)、氯高铁血红素、IL-3、SCF、EPO、IGF或类维生素A。
美国专利号6,004,579和6,495,532提出使用液体组合物，其含有脂质体，其中具有用于抑制程序性细胞死亡的溶血磷脂酸。然而，这些组合物对于贮藏肿瘤细胞不理想并且具有其他缺点，例如，磷脂被摄入到组织中。
作为一方面的器官和作为另一方面的健康或者病理组织样品和细胞的区别在于它们对氧的需求并且保持器官生存力所需的氧分压可以破坏组织样品或者细胞。从而本发明的根本问题在于提供贮藏肿瘤细胞的容易且有效的方法，所述方法使得能够在贮藏后分析肿瘤细胞。
本发明
从而本发明提供了贮藏细胞的方法，其中将细胞在-196℃到37℃的温度下贮藏在含有基本营养培养基和脂质体的组合物中，所述方法的特征是脂质体含有一种或多种固醇并且细胞是肿瘤细胞。
本发明人令人惊奇地发现肿瘤细胞可以长时间贮藏在含有包含一种或多种固醇的脂质体的基本营养培养基中而基本上不破坏细胞或降解其中的RNA和/或DNA。本发明的方法具有特殊优点：肿瘤细胞，如肿瘤活组织检查样品可以在室温下贮藏在一种组合物中数天，甚至数周。从而从患者得到的肿瘤活组织检查样品可以长时间贮藏和分析。肿瘤活组织检查样品甚至可以以冷冻状态贮藏在相同组合物中。这将允许制备肿瘤活组织检查样品文库，其可以用于药物靶标鉴定和多种药学研究目的。肿瘤文库的制备将例如允许将用某种药物治疗的患者的应答与肿瘤样品的详细分子分析联系起来。这将显著简化具有相同肿瘤类型的其他患者的最佳治疗策略。
细胞可以贮藏在根据本发明方法的组合物中任意的时段，但是优选贮藏至少1或数天到几年。
根据本发明的特别优选的实施方案，细胞可以在本发明方法中以如此方式贮藏从而细胞中的RNA和/或DNA在贮藏期间基本上不被降解。这将允许全面分析肿瘤细胞的表达模式和肿瘤类型的分类。根据本申请，术语“细胞中的RNA和/或DNA在贮藏期间基本上不被降解”是指贮藏后细胞中的各自分子类型与贮藏前细胞的分子类型相比表明仍然可以分析60％以上的RNA和/或DNA。例如，贮藏前通过RT-PCR分析某些RNA，如编码目的组织中表达的已知的管家基因的RNA浓度，可能分析肿瘤样品质量。贮藏后重复试验。根据本申请中该术语的使用，当分析揭示贮藏后扩增产物达到贮藏前扩增产物的至少60％，优选至少80％时，RNA在贮藏期间基本上不被降解。
备选地或额外地，使用本领域公知的用于分析蛋白质的多种方法的任意一种可以分析细胞的蛋白质表达图。再次优选在贮藏期间蛋白质基本上不被降解。贮藏后还可以通过组织学染色或者原位杂交分析细胞。
根据本发明的特别优选的实施方案，肿瘤细胞可以如此贮藏从而它们在贮藏后仍然能够增殖。为此，如果需要可以从组织分离肿瘤细胞并且可以在细胞培养基中根据公知的技术增殖肿瘤细胞。用于贮藏肿瘤细胞的组合物有利地可以用于肿瘤细胞的增殖。
根据本发明的一方面，贮藏细胞的方法包括几个步骤，其中首先将细胞在室温下贮藏在组合物中，随后在-196℃到0℃温度下贮藏在所述组合物中。根据另一优选的实施方案，在室温下将细胞贮藏在所述组合物中1到14天，随后在-196℃到0℃温度下贮藏在所述组合物中至少1个月，优选几年，其中细胞中的RNA和/或DNA在贮藏期间基本上不被降解。在室温贮藏期间，当营养物被耗竭时，可以更换组合物，如每3天更换组合物，其可以增强细胞的生存力。
在另一方面，本发明提供了冷冻任意细胞类型的细胞并将它们以冷冻状态贮藏的方法，其中将细胞冷冻在含有基本营养培养基和脂质体的组合物中，该方法的特征在于脂质体含有一种或多种固醇。在该组合物中立即冷冻细胞而不实质上影响细胞的生存力是可能的，这可能是因为组合物抑制或者减小细胞中的结晶。为此，冷冻或者解冻期间不必向组合物加入添加剂像DMSO或者HES以保存细胞的生存力，这使得当DMSO的毒性会产生问题，例如，对于敏感细胞时，所述方法特别合适。
因此，该组合物优选不含有低温防护剂，如HES(羟基乙基淀粉)、甘油、阿拉伯半乳聚糖、DMSO(二甲亚砜)或者乙二醇。优选地，该组合物没有血清或者不明确的蛋白质。
在优选实施方案中，在冷冻前，将细胞在室温下贮藏在组合物中最多1周或最多72小时。备选地，冷冻前可以将细胞贮藏在4℃。
通过本领域技术人员常用的方法可以冷冻或解冻细胞。尽管特定的冷冻或解冻方案对于实施本发明的方法不是必需的，但是优选将细胞冷冻60分钟(min)以上到达-120℃，然后转移到液氮中。在优选的实施方案中，使用下面的冷冻方案，利用计算机控制的冷箱冷冻细胞：首先，在4℃保持组织15分钟，然后以-99℃/分钟冷冻到-5℃，以0.5℃/分钟冷冻到-7℃，以-30℃/分钟冷冻到-60℃，以8.4℃/分钟冷冻到-18℃，保持在-18℃3分钟，以-2℃/分钟冷冻到-40℃，以-4℃/分钟冷冻到-80℃，以-10℃/分钟冷冻到-120℃，之后在液氮中冷却到-170℃到-196℃。
优选地，用于在组合物中长期贮藏细胞的温度是-170℃到-196℃。优选将细胞贮藏在液氮中，例如，“Biosafe”低温罐中。
根据本发明，术语“基本营养培养基”是指含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和/或抗氧化剂的组合物。基本营养培养基通常为液体组合物。
用于本发明方法的培养基还可以含有也适于贮藏肿瘤细胞的任意数量的化合物。特别地，优选培养基含有一种或多种抗微生物剂和/或生长因子。根据另一优选的实施方案，生长因子包括上皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生上皮生长因子和/或血管内皮生长因子。该组合物优选不含有任何溶血磷脂酸。
如上面提到的基于水的溶液中的脂质体以脂质泡存在，该脂质泡具有围绕亲水核的同心脂质双层(编者：Falbe，Regitz，R
Figure 200480018934210000210003_0
mpp-Chemie-Lexikon，1990，Georg Thieme Verlag，Stuttgart)。
用于本发明方法中的组合物中的脂质体含有一种或多种固醇。优选地，固醇包括胆固醇。
根据特别优选的实施方案，使用Liforlab组合物实施本发明的方法，Liforlab组合物含有下面的表1-4中描述的物质。
肿瘤细胞可以是任意肿瘤细胞，如来源于肿瘤细胞系或者肿瘤组织，如肿瘤活组织检查样品或者肿瘤外植块的肿瘤细胞。根据优选的实施方案，肿瘤细胞是肿瘤活组织检查样品。
肿瘤细胞优选来源于人或者哺乳动物并且肿瘤优选为实体瘤，如黑素瘤或者肾细胞、胃、乳腺、食管或者结肠癌。
根据另一优选的实施方案，本发明的方法包括以下步骤，其中
a)从人获得肿瘤活组织检查样品；
b)在室温下将活组织检查样品贮藏在含有包含胆固醇的脂质体的组合物中1-14天；和
c)随后将活组织检查样品在-196℃到0℃温度下在所述组合物中贮藏至少1个月，优选数年；
其中在贮藏期间细胞中的RNA和/或DNA基本上不被降解。优选地，贮藏后细胞仍然能够增殖。
该处理方法允许在外植后特别有利地直接收集肿瘤活组织检查样品，通过快件或者常规邮件(室温下)将肿瘤活组织检查样品送到诊断实验室和/或以冷冻状态长期贮藏肿瘤活组织检查样品，以及分析肿瘤类型以将肿瘤类型与患者对某种药物治疗的应答联系起来。
这种贮藏的另一优点是其将使得可能将肿瘤样品的基因组和蛋白质组分析与相同个体的互补的非肿瘤组织进行比较。非肿瘤组织可以来源于新鲜活组织检查样品或者其可以与肿瘤样品平行贮藏。
根据另一方面，本发明涉及组合物用于贮藏细胞的用途，其中所述组合物含有如上定义的基本营养培养基和脂质体，其特征在于所述的脂质体含有一种或多种固醇并且所述的细胞是肿瘤细胞。
另一方面，本发明涉及组合物，其含有肿瘤细胞、基本营养培养基和脂质体，所述脂质体含有一种或多种固醇。该组合物中的肿瘤细胞优选为肿瘤活组织检查样品。
根据优选的实施方案，组合物含有肿瘤活组织检查样品、脂质体和基本营养培养基，所述脂质体含有胆固醇和一种或多种生长因子，优选上皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生上皮生长因子和/或血管内皮生长因子，所述基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖、抗氧化剂。
在相关方面，本发明涉及肿瘤活组织检查样品文库，其含有贮藏在不同容器中的如上定义的组合物中的许多不同的活组织检查样品。
本发明还涉及各自肿瘤活组织检查样品文库的用途，用于诊断筛选方法、药物功效验证和/或鉴定抗肿瘤药物靶标的方法中。
例如，来自肿瘤活组织检查样品文库的细胞可以经解冻、进行培养并植入裸鼠中。从而，它们可以用于药物筛选，一方面检验某些药物对于该特定肿瘤是否有效，另一方面筛选针对某些肿瘤的潜在活性物质的文库。例如，如果与不用药物治疗的对照动物相比，经药物治疗的相当大百分比的小鼠中肿瘤的生长减慢、转移瘤数目降低或者肿瘤部分或全部退化，那么认为该药物对所述肿瘤有效。
根据该实施方案，本发明涉及制备用于治疗肿瘤的药物组合物的方法，其包括使用来自根据权利要求28的肿瘤活组织检查样品文库的肿瘤活组织检查样品来筛选活性抗肿瘤物质并将如此鉴定的活性物质与适宜的药物添加剂或者载体一起配制以得到药物组合物。
在一般方面，本发明提供了两相液态组合物用于贮藏和稳定肿瘤组织的用途，其中液态组合物的第一相含有基本营养培养基，第二相含有脂质体。基本营养培养基含有生理上相容的浓度的水溶性或者可分散的营养物和生理盐，例如，氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和抗氧化剂。第二相的脂质体为纳粒(nanoparticle)，其含有固醇，优选胆固醇，和任选地，脂肪酸和细胞生长因子。脂质体的假定结构包含外部亲脂覆层和内部亲水核心。
用于本发明的两相组合物具有至少约300mOsM/kg的重量摩尔渗透压浓度。优选地，两相组合物具有约385到425mOsM/kg的重量摩尔渗透压浓度。两相组合物的pH优选为约7.2到约7.4。纳粒优选具有约100nm到约300nm，更优选约100nm到约200nm的平均直径。
用于本发明的组合物可以含有微量元素、简单糖类、缓冲剂、质膜体积增大剂、能量底物、黄嘌呤氧化酶抑制剂，等，它们溶于或者分散于水性介质中。
在优选的实施方案中，基本营养培养基包括生理上适宜浓度的盐、水溶性维生素、氨基酸和核苷酸。这些包括例如，并且不限于，腺苷及其磷酸酯、尿苷及其磷酸酯、其他核苷酸和脱氧核苷酸；B族维生素，例如，B1、B2、B6、B12、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等；维生素辅酶和辅因子，例如，烟酰胺和黄素腺嘌呤二核苷酸，和它们的各自磷酸酯、辅酶A等；多种生理盐和痕量矿物质，例如，钠、钾、镁、钙、铜、锌和铁的盐；必需氨基酸，尽管任选包括所有20种天然存在的氨基酸，和/或它们的衍生物。基本培养基还包括例如，pH缓冲剂，如磷酸盐缓冲剂和N-2-羟基乙基-哌嗪-N’-2-乙磺酸(“HEPES”)缓冲剂；简单糖，例如，葡萄糖；渗透增强剂，如任意适宜的葡聚糖、甘露糖等；以及任选的混杂组分，如别嘌呤醇、软骨素、辅羧酶、生理有机酸，例如，丙酮酸和任选地，天然来源的营养提取物，例如，酵母维生素提取物。
从而，基本营养培养基含有多种营养物和矿物质因子，它们的浓度类似于在血液、血清、血浆和/或正常身体组织中发现的浓度，尽管这其中的某些不是天然血液组分。
任选地，用于本发明的组合物还可以包括抗微生物剂，如抗生素、抗细菌剂、特定抗体和/或其他公知的用于控制器官、组织和/或细胞中微生物污染的活性剂。多数公知的抗微生物剂由Goodman和Gilman′s，The pharmacological basis of therapeutics，第10版，McGraw Hill，特别是第43到51章详细提及。
组合物可以还含有抗凝血剂、溶血栓和/或抗血小板药物，例如肝素和相关葡糖胺聚糖、双香豆素、丙苯香豆素、醋硝香豆酮和双香豆乙酸乙酯、茚满二酮和它们的衍生物，和阿司匹林和潘生丁；等等。任选还包括非甾体消炎剂。
在备选实施方案中，任选包括生理浓度或高于生理浓度的维生素C(抗坏血酸)。
不含不明确的蛋白质或者动物血清的许多通过商业途径可获得的细胞或者组织培养基产品可以适于作为基本营养培养基或者制备本发明组合物的起点，条件是此类培养基与该组合物用途的特定要求相容。
组合物的第二相是含有脂质体或纳米大小颗粒的液态水性乳剂，所述脂质体或纳米大小颗粒被认为具有亲脂外层和亲水核心。通常，第二相包括能够形成并稳定外部亲脂层的亲脂组分，包括例如，胆固醇、磷脂酰胆碱、维生素E、鱼肝油，等。额外的组分包括基于脂质的能源，包括生理相容量的游离脂肪酸。
优选地，两相组合物的脂质体含有游离脂肪酸，其选自油酸、亚油酸、棕榈酸或者硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、和它们的组合。
优选地，两相组合物不含有药学上重要量的磷脂酸或者糖，或者溶血磷脂酸或者糖。
在另一优选的实施方案中，第二相包括亲水性的支持内分泌因子，如氢化可的松、甲状腺素、或者其衍生物，等。此外，支持组分包括细胞生长因子，例如，上皮和内皮生长因子，包括生理相容量的血管内皮生长因子、血小板衍生的内皮生长因子、上皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生内皮生长因子，等。任选地，预计包括在第二相中的其他因子包括细胞间信使，如前列腺素类，例如，前列腺素E1。优选地，还包括生理上相容的表面活性剂和去污剂，例如，一种或多种水溶性表面活性剂，优选分子量为数千道尔顿的两亲性嵌段共聚物，如聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物表面活性剂(例如，Pluronic F-68；来自BASF)和/或非离子型表面活性剂。适宜的非离子型表面活性剂包括，例如，山梨醇酯的聚氧化乙烯衍生物，例如，通过商业途径以TWEEN(Atlas Chemical Co.)得到的聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯表面活性剂。尤其优选TWEEN 80
Figure 200480018934210000210003_2
。
应该与脂质体结合的氧在保持细胞的代谢中起重要作用。需要注意的是，尽管本发明的方法不需要富集氧的额外步骤，但是此类富集对于增强肿瘤细胞的生存力，特别是具有高速增殖或者高代谢更新(turnover)的那些肿瘤细胞的生存力是有益的。从而可以为不同肿瘤优化组合物中所含氧的含量。
通过让空气或氧气通过溶液鼓泡可以富集氧。组合物摄取的氧气量也取决于组合物中含有的固醇或胆固醇的量。脂质体中固醇的量、脂质体的量或者两者可以改变以达到对不同肿瘤的最佳结果。在本发明的优选实施方案中，组合物富含氧气。组合物含有例如，至少0.00475g/L胆固醇，尤其至少0.00525g/L胆固醇，并且富含氧气。优选地，氧气通过组合物冒泡直到其用氧饱和。可以对不同的肿瘤组织容易地测试胆固醇和氧气的最优、最小和最大量。
组合物的制备
美国临时专利申请号60/469,200公开用于本发明方法的组合物可以用于保存器官和组织的生存力。
通常通过两步方法产生用于本发明的组合物。第一步是制备第一相的预混合物，其是上述基本营养培养基，在本文中称作Premix-I，和制备第二相的预混合物，其本文中称作Premix-II，其中将所希望的组分预混合、溶解和/或悬浮在水中。然后通过微流化器或者类似的装置，在有效提供精细分散的乳剂，例如，纳粒规模乳剂的条件下处理Premix-II组合物。然后使所得乳剂组合物与提供多种微量营养物和其他组分的Premix-I混合，以完成本发明组合物的生产。
制备预混合组合物
下面的表1-4一起列表概述了Premix-I和Premix-II的优选组分和重量范围。表1-4所列组分是在一升所有处理均已完成之后的最终组合物中发现的量。这些组分被分类到这些表中以方便描述，以便通过其中在下文讨论的实施例中制备组合物的方法对组分分组。除非另外说明，表1-4中所示所有量都为克/升最终组合物，即，包括水相和乳剂相的组合物。
表1-4中给出的组分量是基于1升的总批体积。如文中例证的，1升批体积为将Premix-I和Premix-II混合后的最终体积，其中Premix-II已经被处理成微米规模或纳米规模乳剂。技术人员将理解所描述的方法根据需要可以易于放大或缩小到更小或更大的批大小。
用于制备组合物的所有化学品都是基本上纯的并且可以从生化药品的许多供应商得到。优选地，这些化学品是USP级或相当等级的。水应该是WFI(注射用水)级，优选USP级。技术人员将理解所用的化学品任选地可以通过表现出相同纯度和活性的基本上相当的化学品替代。
              表1
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      盐酸腺嘌呤                                       0.00019-0.00021
                                      B-12                                       0.00065-0.0007
                                      生物素                                       0.00000038-0.00000042
                                      硫酸铜                                       0.00000124-0.00000137
                                      硝酸铁                                       0.000048-0.000053
                                      硫酸铁                                       0.00048-0.00053
                                      盐酸腐胺                                       0.000077-0.000085
                                      盐酸吡哆醇                                       0.000029-0.000033
                                      核黄素                                       0.00021-0.000231
                                      胸苷                                       0.00035-0.00039
                                      硫酸锌                                       0.00041-0.000454
                   表2A
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      腺苷                                       0.950-1.050
                                      腺苷5’一磷酸                                       0.0019-0.0021
                                      腺苷三磷酸                                       0.0019-0.0021
                                      别嘌呤醇                                       0.133-0.147
                                      B’烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸                                       0.038-0.042
                                      B’烟酰胺腺嘌呤二核苷酸                                       0.0019-0.0021
                                      氯化钙                                       0.152-0.168
                                      氯化胆碱                                       0.0085-0.0094
                                      硫酸软骨素                                       0.0038-0.0042
                                      辅羧酶                                       0.038-0.042
                                      辅酶A                                       0.0095-0.00105
                                      环糊精                                       0.475-0.525
                                      脱氧腺苷                                       0.038-0.042
                                      脱氧胞苷                                       0.038-0.042
                                      脱氧鸟苷                                       0.038-0.042
                                      葡聚糖70                                       33.25-36.75
                                      核黄素腺嘌呤二核苷酸                                       0.038-0.042
                                      叶酸                                       0.0026-0.0028
                                      葡萄糖                                       3.800-4.200
                                      谷胱甘肽                                       0.950-1.050
                                      甘氨酸                                       0.0179-0.0197
            表2B
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      肝素                                       0.171-0.189
                                      HEPES                                       3.396-3.753
                                      次黄嘌呤                                       0.002-0.0022
                                      肌醇                                       0.0124-0.137
                                      胰岛素                                       0.0095-0.0105
                                      L-丙氨酸                                       0.00428-0.00473
                                      L-精氨酸                                       0.141-0.155
                                      L-天冬酰胺                                       0.0076-0.0084
                                      L-天冬氨酸                                       0.064-0.070
                                      L-半胱氨酸                                       0.0297-0.0329
                                      L-胱氨酸                                       0.0167-0.0185
                                      L-谷氨酸                                       0.007-0.0078
                                      L-谷氨酰胺                                       4.750-5.250
                                      L-组氨酸                                       0.030-0.033
                                      L-异亮氨酸                                       0.052-0.0572
                                      L-亮氨酸                                       0.057-0.063
                                      L-赖氨酸                                       0.0095-0.0105
                                      L-甲硫氨酸                                       0.019-0.021
                                      L-苯丙氨酸                                       0.0337-0.0373
                                      L-脯氨酸                                       0.0164-0.0182
                                      L-丝氨酸                                       0.025-0.0276
                                      L-苏氨酸                                       0.051-0.056
                  表2C
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      L-色氨酸                                       0.009-0.0095
                                      L-酪氨酸                                       0.053-0.059
                                      L-缬氨酸                                       0.050-0.055
                                      氯化镁                                       0.058-0.0643
                                      硫酸镁                                       0.0475-0.0525
                                      甘露糖                                       3.135-3.465
                                      烟酰胺                                       0.0019-0.0021
                                      泛酸                                       0.0021-0.0024
                                      氯化钾                                       0.296-0.328
                                      盐酸吡哆醛                                       0.0019-0.0021
                                      丙酮酸                                       0.209-0.231
                                      碳酸氢钠                                       1.140-1.260
                                      氯化钠                                       6.650-7.350
                                      磷酸氢二钠                                       0.0676-0.0748
                                      磷酸二氢钠                                       0.0516-0.0570
                                      硫胺                                       0.0021-0.0023
                                      转铁蛋白                                       0.00475-0.00525
                                      尿苷                                       0.038-0.042
                                      尿苷三磷酸                                       0.038-0.042
                                      超滤的Yeastolate(SigmaChemical Company，目录号Y2000)                                       38-42mL
           表3
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      L-胱氨酸                                       0.0167-0.0185
                                      L-酪氨酸                                       0.053-0.059
                      表4
                                      物质                                       浓度(g/L)
                                      胆固醇                                       0.00475-0.00525
                                      鱼肝油                                       0.00095-0.00105
                                      上皮生长因子                                       0.00000285-0.00000315
                                      肝细胞生长因子                                       0.0000048-0.0000053
                                      氢化可的松                                       0.00095-0.00105
                                      亚油酸                                       0.00095-0.00105
                                      亚麻酸                                       0.00095-0.00105
                                      油酸                                       0.00095-0.00105
                                      磷脂酰胆碱                                       0.6％
                                      血小板衍生的内皮生长因子                                       0.00000095-0.00000105
                                      Pluronic F-68                                       0.950-1.050
                                      前列腺素E1                                       0.000042-0.0000263
                                      三碘代-L-甲状腺素                                       0.00000475-0.0000053
                                      TWEEN 80                                       0.002375-0.002625
                                      血管内皮生长因子                                       0.0000046-0.00000525
                                      维生素E                                       0.0019-0.0021
制备Premix-I的方法
通过将组分以有效实现均匀且澄清的水性组合物的顺序溶解或分散，而避免不希望的反应或者形成不溶复合体来制备Premix-I。为此，Premix-I中的组分优选不一起混合直到所有都完全溶解或分散在水中。优选地，如本文例证的，将表1、2A-2C和表3中所列的组分分别加工成三种不同的起始溶液，尽管技术人员将明白该基本组合物任选可以通过所例证方案的变通方案制备。
然后合并起始溶液以制备Premix-I，其组成了相1，即非乳液基本营养培养基。
制备Premix-II的方法
Premix-II包括组合物的乳液形成组分。大致地，这些包括所得乳液颗粒的亲水层，例如，希望在细胞内递送的组分。Premix-II还包括形成所得乳液颗粒的疏水层的组分，例如，亲脂外层，设想其允许与活细胞膜融合以递送亲水核心内含物，包括支持性内分泌因子、帮助乳化的适宜试剂，例如，增湿剂和/或嵌段共聚物去污剂，以及疏水相组分，如胆固醇和/或磷来源的脂质。优选地，这些由上面的表4列出，并且如下面实施例描述的组合。
微流化
在5000psi(344750hPa)或更高压力下高压匀浆的技术在本领域公知为“微流化”。该方法用于产生具有平均直径小于200nm的均匀大小分布的脂质体或者纳粒。除了微流化，任选使用其他标准乳化方法，例如，超声处理、阀匀浆[Thornberg E.和Lundh，G.(1978)J.Food.Sci.43：1553]和刀片搅拌，等等。希望将水溶性表面活性剂，优选分子量为几千道尔顿的两亲性嵌段共聚物，如聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物表面活性剂(例如，Pluronic F68)和/或TWEEN 80加入到水性溶液中以便稳定所包被的颗粒防止它们聚集。表面活性剂还用于增强(超)声处理的效果(如果使用该方法)。
用于微流化的优选装置的实例为Microfluidizer No.HC5000V(Microfluidics Corp.，Newton，Mass.)，其使用密封的空气压缩器提供压缩空气，例如，来自Sullair-Solutions(Michigan City，Indiana)的No.ES-6。上述装置使用高压和高剪切匀浆处理和乳化Premix-II组合物。
简言之，使用微流化器通过高压匀浆处理Premix-II组合物。将Premix-II连续加到微流化器池中，并强行通过特别设计的空穴或者相互作用腔，在那里高剪切力和空化力(cavitation forces)形成高度分散的乳液。通过几轮，平均小滴或者脂质体大小、分布和成分的组合产生所希望的终产物，例如，优选的纳粒。
生产商的操作手册提供了微流化器Model No.HC5000V的操作细节，所述操作手册可以从Microfluidics Corporation得到，目录号为85.0112。
附图简述
图1显示了400倍放大下胃癌的上皮组织的肿瘤活组织检查样品的HES染色。样品在切割前贮藏在水中24小时。
图2显示了400倍放大下胃癌的上皮组织的肿瘤活组织检查样品的HES染色。样品在切割前贮藏在Liforlab中24小时。
图3显示了400倍放大下胃癌的上皮组织的肿瘤活组织检查样品的HES染色。样品在切割前贮藏在水中72小时。
图4显示了400倍放大下胃癌的上皮组织的肿瘤活组织检查样品的HES染色。样品在切割前贮藏在Liforlab中72小时。
实施例
下面的实施例阐明了本发明。
实施例1制备液体组合物Liforlab
制备Premix-I
1.制备溶液1
使用适宜的天平，制备上面表1中所列的每种组分的10,000倍浓缩液。为了方便，如下所述预先制备几种这些组分的贮存液，并将贮存液的适宜量混合到溶液1中。
100,000倍浓度的硫酸铜贮存液
称量0.130g硫酸铜并混合到1000ml WFI级水中。必要时，混合下逐滴加入5N HCl，直到完成溶解。混合直到溶解，并在-20℃保存。
10,000倍浓度的硫酸铁、硝酸铁、和硫酸锌贮存液
使用0.1mL/升批料(终产物的最终体积)。通过称量5.0g硫酸铁、0.5g硝酸铁和4.3g硫酸锌到1000mL WFI级水中制备贮存液。必要时，通过逐滴加入5N HCl降低pH以助溶解直到溶解完全。该溶液在-20℃保存。
100,000倍浓度的生物素贮存液
使用0.01mL/升最终溶液。
通过称量0.040g生物素到5mL WFI级水中制备生物素贮存液。如果需要，在搅拌期间逐滴加入5N HCl，直到溶解完成。加到1000mL，并在-20℃保存。
1000倍维生素B12和胸苷贮存液
使用1mL/升最终溶液。
通过称量0.670g维生素B12和0.370g胸苷到1000mL WFI级水中并混合直到溶解制备该贮存液，并在-20℃保存。
一旦制备了所有贮存浓缩液，将它们以与它们的浓度一致的体积加到溶液2，例如，1000倍＝1mL/升等等。然后将其他组分加入到1000mL WFI级水并在磁力搅拌器上混合直到溶解完成。将所得溶液以0.1mL/L最终批体积(终产物)的比例加入下述溶液2。
2.制备溶液2
使用合适的天平(balance)，称量表2A、2B和2C中所列每种组分并加入到最终批体积中WFI级水的约50％终体积，即，对于1升最终批，用约500mL WFI级水制备溶液2。将其混合直到溶解完成。
3.制备溶液3
使用合适的天平，称量表3中所列每种组分并加入到合适大小的混合容器，该容器含有5％总批体积的WFI级水。混合时，逐滴加入5N NaOH直到混合物变得澄清，表明完全溶解。
然后通过取溶液1，将其与溶液2以0.1mL/升最终批体积(终产物)的比例合并以形成合并的(1+2)溶液制备Premix-I，同时搅拌。然后将溶液3的完整批与(1+2)溶液混合产生Premix-I，其可以立即使用或者保存。
Premix-II的制备
Premix-II的组分量如前面的表4给出。为了方便，首先将Premix-2的许多组分制备为贮存液，然后以合适的体积用于制备Premix-II。贮存液如下。
10,000倍的内分泌因子贮存液
使用0.1mL/升最终溶液。
通过称量0.052g HGF、0.050g三碘代-L-甲状腺素、0.050g VEGF和0.030g EGF到1000mL WFI级水中，搅拌直到溶解完成来制备该贮存液。以X0.1mL计算批大小并加入到步骤4/处理4的溶液中，-20℃保存。
1000×氢化可的松贮存液
使用1mL/升最终溶液。
通过称量0.95g氢化可的松到10mL 95％乙醇中，搅拌直到溶解完成来制备该贮存液。以X1mL计算批大小并将贮存液加入到下面步骤2的溶液中，2-8℃保存。
1000倍前列腺素E1贮存液(“PGE1”)
使用1mL/升最终溶液。
通过称量0.034g PGE1到1000mL WF1级水中并搅拌直到溶解完成来制备。计算的批大小为X1mL并将贮存液加入到下面步骤4的溶液中，-20℃保存。
100,000X的PDGF贮存液
使用0.01mL/升最终溶液。
通过称量0.095g PDGF到1000mL WF1级水中并搅拌直到溶解完成来制备该贮存液。计算的批大小为X0.01mL并将贮存液加入到下面步骤4的溶液中，-20℃保存。
然后通过下面的步骤使用上文表4中给出的组分制备Premix-II。
1.通过称量1g到小于50％总批体积(按最终产物批为1升计算，该体积小于500ml)的WFI级水中制备Pluronic F-68溶液。将其在低热(小于100℃)下混合约1小时。持续混合直到完成溶解。所得水性组合物在使用前冷却到约35-40℃。
2.量取10mL 95％乙醇加入到玻璃混合容器并置于磁力搅拌盘上。根据表3称量磷脂酰胆碱并加入该溶液，然后混合1小时。
3.根据表4称量胆固醇、亚油酸、亚麻酸、维生素E、TWEEN 80、鱼肝油、氢化可的松和油酸。优选地，这些可以首先制备为10,000X浓缩液或者贮存液以实现所希望的工作浓度。将这些物质加入到步骤2的溶液并混合1小时。
4.将步骤2和3的溶液加入到步骤1的溶液并混合1小时。所得组合物看起来不透明且混浊。
5.如所指出的称量肝细胞生长因子(“HGF”)、三碘代-L-甲状腺素、前列腺素E1、血管内皮生长因子(“VEGF”)、上皮生长因子(“EGF”)、血小板衍生内皮生长因子(“PDGF”)。优选地，这些化学品制备为它们的工作贮存液。
6.将步骤5的成分加入到步骤4的溶液并混合1小时以产生Premix-II液体组合物。
Liforlab：通过微流化制备基于胆固醇的纳粒
从如上的Premix-I和Premix-II组合物制备Liforlab溶液，如下：
1.打开微流化器的空气压缩器并将管道压调节到100CFM下120PSI(2.83m3/分钟下8274hPa)。这自动将微流化器的压力室充入压缩空气。
2.调节微流化器压力到5000PSI(344750hPa)。
3.将制备的Premix-II加入到机器贮存器中并将微流化器控制调节到完全打开设定。
4.Premix-II穿过活性空穴室(active cavitation chamber)并排出到收集容器。
5.当所有Premix-II被处理和收集时，完成一个循环。
6.重复步骤(1)-(5)四次，和/或直到所处理的液体组合物以透明外观出现在收集容器中。
7.然后将液体组合物通过0.2微米滤膜无菌过滤并贮藏在4-8℃备用。
8.然后将上面步骤7的产物与所制备的Premix-I缓慢混合，以避免起泡沫和化学成分的解离。
9.基于表1-4，用WFI级水填充最终溶液到所希望的批体积。最终批体积为1升。
将pH调节到7.2±0.2。
然后最终发明性组合物通过0.2微米膜无菌过滤到无菌容器中用以贮藏。
它看起来为不透明的乳白色溶液，没有任何颗粒物质。小泡大小对纳粒分散体的光学外观具有显著影响。颗粒越小，溶液将看起来越透明。
实施例2比较Liforlab和RNAlater作为贮藏肿瘤外植块或者活组织检查样品的溶液
相对于RNAlater(Qiagen)的保存性质证实和评估了室温下用于保存细胞生存力的实施例1中制备的Liforlab的功效。
样品
制备后，立即将不同肿瘤的活组织检查样品或者来自动物的肿瘤外植块贮藏在至少1ml Liforlab或者RNAlater(Qiagen，Neuss)中。如果需要，可以切割肿瘤活组织检查样品。组织块优选具有0.5cm3的最大尺寸，从而试剂可以在组织中快速扩散。优选地，组织具有0.125cm3的大小。
方法
将肿瘤组织贮藏在溶液Liforlab或者RNAlater中限定的时间，例如，3天。
肿瘤组织与溶液一起在玻璃匀浆器或者锥形组织粉碎机(例如，来自Wheaton Science Products，NJ，USA)中机械匀浆。将匀浆后的组织转移到15ml管中，该管含有完全培养基(例如，L15培养基，含有10％失活的FCS，1％非必需氨基酸(100×，例如，Biochrom AG，Berlin)，0.05％葡萄糖、0.0011％碳酸氢钠，Ciprobay 200)(3×4ml)并洗涤(以150×g室温下离心10分钟)。
将细胞悬浮液转移到具有足够培养基以覆盖底部的细胞培养瓶(50ml，17.5cm2)。细胞在培养箱中37℃5％CO2中培养至少3天，不更换培养基。
当培养基的颜色从红色变成黄色时，视觉对照后改变培养基。当细胞足够密集时，将贴壁的细胞胰酶消化并传代。
为了进行胰酶消化，倾析培养基并用PBS冲洗仍然贴壁的细胞。加入2ml胰蛋白酶-EDTA溶液并在培养箱中37℃下孵育5分钟。通过轻轻拍打底部从培养瓶的底部分离细胞，并将它们转移到含有10ml培养基的15ml管中。用培养基洗涤1次后，可以再次培养细胞。第三次传代后，冷冻保藏细胞。
结果
贮藏在Liforlab溶液中的组织是软的并且容易匀浆。细胞使得所得溶液均匀地混浊。贮藏在RNAlater中的组织是固体和硬的，并且难以匀浆。在溶液中可以看到细胞块。
1周后，Liforlab细胞生长良好，而RNAlater细胞仍然漂浮在培养基的顶部。贮藏在Liforlab中的细胞规则地传代6周，并且它们增殖。将细胞在冷藏瓶中冷冻。
12天后停止培养RNAlater细胞的尝试，因为细胞仍然漂浮在培养基顶部并且不能预期细胞仍然将生长。细胞的形态不是均匀的(碎片化细胞)。该细胞不是活的。
总结
与贮藏在RNAlater中的肿瘤外植块的细胞相比，来自贮藏在Liforlab中的肿瘤外植块的细胞是活的并且仍然能够增殖。
实施例3比较Liforlab和RNAlater贮藏肿瘤细胞和稳定DNA的功效
通过定量分析肿瘤组织的DNA，实验确定Liforlab与RNAlater一样能够保护DNA。
样品
制备后，立即将移植自裸鼠的HCT8细胞所产生的肿瘤活组织检查样品贮藏在至少1ml Liforlab或RNAlater(Qiagen)中。组织块优选具有0.5cm3的最大尺寸，从而试剂可以在组织中快速扩散。优选地，组织具有0.125cm3的大小。
1.用常规方法分离DNA
方法
裂解：
将组织样品、500μL裂解缓冲液(10mM Tris pH8，400mM NaCl，2mM Na2EDTA pH8到8.2，高压灭菌)和20μL RNA酶A(20mg/mL)转移到玻璃匀浆器中并尽可能匀浆组织。将匀浆物转移到50mL falcon管中。用500μL裂解缓冲液洗涤匀浆器两次。该洗涤液加入到匀浆物中并温和涡旋。加入100μL 10％SDS，温和涡旋，然后加入25μL蛋白酶K(20mg/mL)并温和涡旋。
混合物在55℃孵育2小时，或者更好地，37℃在水浴中过夜孵育。消化后，加入500μL 5M NaCl(对于蛋白质的盐沉淀，约1.2mol/L)。混合物在中等水平下涡旋约5秒。
在冷离心机(4℃)中以3410g离心14分钟后，取出含有DNA的上清液并转移到新的15mL聚丙烯离心管中。如果来自沉淀的任何细胞残渣不小心吸入移液器，那么将样品再次离心并取出剩余上清液。
沉淀：
将上清液与2-2.5体积的100％乙醇混合。样品在-20℃贮藏30到60分钟后以3410g在4℃离心10到15分钟。如果可以见到DNA沉淀，在-20℃贮藏不是必要的。小心倾析上清液，注意沉淀位于上壁从而其不能在倾析步骤中损失。用1mL 70％乙醇洗涤DNA。然后将其转移到含有新的70％乙醇的高压灭菌的1.5ml管中。样品以3410g在4℃离心10分钟，除去上清液，再次注意沉淀。将样品再次在70％乙醇中洗涤，离心并取出上清液。管内的上面区域用组织小心干燥。沉淀应该在倒转的管中空气干燥。用500μL注射用水(aquainjectabila)吸收DNA。为了更好地溶解，沉淀可以在56℃孵育10分钟。然后在4℃贮藏样品。
2.用Qiagen分离DNA
方法
将多达25mg贮藏的活组织检查样品在清洁的载玻片上切割，记录重量，并使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)按照动物组织的DNeasy方案制备组织。
DNA量的光度分析
对于光度分析，制备1∶10稀释液并测量260、280和320nm的消光。260nm处的消光与280nm处的消光之比定义DNA的纯度并且应该在1.4到1.8之间。根据下面的公式计算产率：
消光(260nm)×50μg/ml×稀释度＝μg/ml RNA
结果
用常规方法制备的DNA的定量：
对于移植自肩部皮下位置的肿瘤，在室温贮藏6天后然后在4℃贮藏，使用Liforlab的每毫克组织产率为5.56μg，使用RNAlater的为6.36μg。对于移植自腋窝皮下位置并在4℃贮藏的肿瘤，使用Liforlab的产率为6.44μg，使用RNAlater的为4.94μg。通过DNA凝胶电泳证实结果。
实施例4比较Liforlab和RNAlater贮藏人活组织检查样品和稳定RNA的功效
通过对肿瘤组织RNA的定量分析，实验确定Liforlab与RNAlater一样能够保护RNA。
样品
将来自不同人肿瘤的活组织检查样品制备后立即贮藏在至少1mlLiforlab或者RNAlater(Qiagen)中。组织块优选具有0.5cm3的最大尺寸，从而试剂可以在组织中快速扩散。优选地，组织具有0.125cm3的大小。
为了防止污染，向Liforlab溶液加入青霉素/链霉素可能是理想的。
方法
1.制备
为了制备，将Ultra-Turrax匀浆器的切割区在使用前在70％乙醇中超声浴30’。用70％乙醇清洁载玻片和镊子。在整个步骤中戴上手套。
2.将肿瘤样品贮藏限定的时间，例如，室温下贮藏6天然后4℃贮藏。在清洁载玻片上切下最多25mg经贮藏的活组织检查样品，将其转移到5ml冷藏瓶中并记录重量。加入来自试剂盒的600μl RLT缓冲液，但是没有β-巯基乙醇。样品在ultra-turrax中在冰上匀浆3次，每次15秒，然后用水平3的超声处理4次，每次5秒。
3.每个样品制备完成后，用70％乙醇清洁设备。将匀浆物移液到无RNA酶的1.5ml管中并根据2002年4月Qiagen的“从动物组织样品分离总RNA的RNeasy mini方案”处理。在点5分离RNA并将其用没有RNA酶的2×30μl水吸收。
3.RNA的定量分析
用两种方法定量分析溶液中的RNA：光度分析和实时PCR。
3.1光度分析
对于光度分析，制备1/100溶液(5μl样品+495μl水)并测量260、280和320nm的消光以分析纯度和产率。320nm处的消光必须为0。260nm∶280nm的比应该在1.6到2.2之间。根据下式计算产率：
消光(260nm)×40μg/ml×稀释度＝μg/ml RNA
实时PCR
通过根据A.H.Elmaagacli等人(2001)，Brit.Journal ofHaematology，卷113，1072-1075)中描述的方法通过扩增GAPDH测量管家酶GAPDH的RNA的量。
简言之，用LightCycler(Roche，Mannheim，德国)使用最终体积为10μl的毛细管在一步中进行cDNA合成反应和PCR。对于RT-PCR混合物，使用通过商业途径可以得到的缓冲剂试剂盒，其包括逆转录酶、Taq聚合酶、Tris-HCl、dNTP(Superscript，Gibco LifeTecnologies，德国)、6μM MgSO4、0.14μl RNA酶抑制剂(Roche，德国)，10pmol引物和4pmol杂交探针。在55℃进行RT反应20分钟。持续反应，在95℃内部变性20秒，然后是95℃1秒，56℃15秒，和72℃18秒的55个循环。
结果的实例在下一页的表1中给出。
实施例5Liforlab和水贮藏肿瘤外植体/活组织检查样品的比较
将来自人胃癌的坏死或者上皮组织的肿瘤活组织检查样品贮藏在水或者Liforlab中24、48、72或128小时。切割切片并用HES染色。
结果表明Liforlab稳定组织的结构比水强的多。结果的实例在图1到4中显示。在图3中，在水中贮藏胃的上皮组织72小时后，特别明显，组织是坏死和被降解的，其中在Liforlab中贮藏后，如图4所示，组织的结构得到保存。
表5：
                                      肿瘤组织/活组织检查样品来源                                       贮藏                                       RT的时间                                       RNA/组织(ng/mg)光度计                                       RNA/组织(ng/mg)实时PCR
                                      胃原体癌                                       LiforlabRNAlater                                       3d3d                                       990320                                       781.5559.0
                                      贲门癌                                       LiforlabRNAlater                                       2d2d                                       420620                                       127.530.4
                                      食管癌                                       LiforlabRNAlater                                       2d2d                                       458634                                       264.0370.8
                                      胃淋巴瘤                                       LiforlabRNAlater                                       3d3d                                       260200                                       452.7308.1
                                      食管癌                                       LiforlabRNAlater                                       1d1d                                       7562436                                       1142.5940.2
                                      肝转移                                       LiforlabRNAlater                                       1d1d                                       86373                                       185.0198.2

Claims (29)

1.贮藏细胞的方法，其中在-196℃到37℃的温度下将细胞贮藏在含有基本营养培养基和脂质体的组合物中，所述基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和/或抗氧化剂，所述方法的特征是所述脂质体含有一种或多种固醇并且所述细胞是肿瘤细胞，所述固醇的浓度为至少0.00475g/L。
2.权利要求1的方法，其中将细胞贮藏在组合物中至少1天。
3.权利要求1或2的方法，其中将细胞贮藏在组合物中至少1周。
4.权利要求1或2的方法，其中细胞贮藏在组合物中至少1个月。
5.权利要求4的方法，其中细胞贮藏在组合物中至少几个月。
6.权利要求1或2的方法，其中将细胞贮藏在组合物中至少1年。
7.权利要求6的方法，其中将细胞贮藏在组合物中至少几年。
8.权利要求1或2的方法，其中贮藏后通过组织学染色或者原位杂交分析细胞。
9.权利要求1或2的方法，其中在4到37℃的温度下将肿瘤细胞贮藏在组合物中。
10.权利要求9的方法，其中在室温下将肿瘤组织贮藏在组合物中。
11.权利要求1或2的方法，其中首先在室温下将细胞贮藏在组合物中，随后在-196℃到0℃的温度下将细胞贮藏在所述组合物中。
12.权利要求1或2的方法，其中基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和抗氧化剂。
13.权利要求1或2的方法，其中基本营养培养基含有抗微生物剂。
14.权利要求1或2的方法，其中脂质体含有胆固醇。
15.权利要求14的方法，其中组合物含有至少0.00525g/L胆固醇，并且组合物富含氧。
16.权利要求1或2的方法，其中脂质体含有一种或多种生长因子。
17.权利要求16的方法，其中所述生长因子包括上皮生长因子、肝细胞生长因子和/或血管内皮生长因子。
18.权利要求17的方法，其中所述上皮生长因子为血小板衍生的 上皮生长因子。
19.权利要求1或2的方法，其中肿瘤细胞是肿瘤细胞系或者肿瘤组织。
20.权利要求19的方法，其中肿瘤组织是肿瘤活组织检查样品或者肿瘤外植体。
21.权利要求1或2的方法，其中所述的细胞来自人或哺乳动物。
22.权利要求19的方法，其中所述的肿瘤是实体瘤。
23.冷冻细胞的方法，其中将细胞冷冻在含有基本营养培养基和脂质体的组合物中，所述基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和/或抗氧化剂，所述方法的特征是脂质体含有一种或多种固醇，所述固醇的浓度为至少0.00475g/L。
24.组合物用于贮藏细胞的用途，其中所述组合物含有基本营养培养基和脂质体，所述基本营养培养基含有氯基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和/或抗氧化剂，所述用途的特征是所述脂质体含有一种或多种固醇并且细胞是肿瘤细胞，所述固醇的浓度为至少0.00475g/L。
25.组合物，其含有肿瘤细胞、基本营养培养基和脂质体，所述基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和/或抗氧化剂，所述脂质体含有一种或多种固醇，所述固醇的浓度为至少0.00475g/L。
26.根据权利要求25的组合物，其中所述的肿瘤细胞是肿瘤活组织检查样品。
27.根据权利要求26的组合物，其中所述的肿瘤细胞是肿瘤活组织检查样品，所述的脂质体含有胆固醇和一种或多种生长因子，所述的基本营养培养基含有氨基酸、盐、维生素、核苷酸、糖和抗氧化剂。
28.根据权利要求27的组合物，其中所述的生长因子为上皮生长因子、肝细胞生长因子和/或血管内皮生长因子。
29.肿瘤活组织检查样品文库，其含有贮藏在不同容器中的根据权利要求27的许多不同的组合物。 
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