CN115349514B - 一种新鲜组织冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新鲜组织冻存液，属于生物样本冻存技术领域，所述新鲜组织冻存液中包括冷冻保护剂、离子缓冲液、组织细胞合成代谢营养物质、糖类化合物、抗氧化和抗细胞凋亡剂，其中，所述冷冻保护剂为渗透型冷冻保护剂和/或非渗透型冷冻保护剂；所述离子缓冲液中阴离子包括酸根离子和氢氧根离子；所述组织细胞合成代谢营养物质包括氨基酸、核苷和/或核苷酸；所述糖类化合物为单糖、二糖和多糖中的至少一种；所述抗氧化和抗细胞凋亡剂包括维生素、维生素衍生物和/或谷胱甘肽，所述新鲜组合冻存液的pH为7.2～7.6。利用本发明的新鲜组织冻存液进行生物样本冻存，可以有效实现人和动物的新鲜组织的低温冻存(2‑8℃)及运输，极大降低了冻存及运输成本。

Description

一种新鲜组织冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物样本冻存技术领域，特别地，涉及一种新鲜组织冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

生物样本尤其是活体组织，具有重要的科研和临床应用价值，活组织保存技术是实现这些价值的基础。常用的活体组织样本保存方法主要是新鲜保存和冻存。活体组织新鲜保存即将样本置于新鲜组织冻存液中后于2-8℃保存并运输，但一般保存时间不超过48小时。活体组织冻存即将组织置于低温环境中保存，以使组织暂时脱离生长状态，保存组织的特性。相较新鲜样本的时效性，活体组织冻存后更便于长期保存及运输，适用于需要一段时间内分批次采集的样本，或者较难采集到的珍贵样本。

目前常见的新鲜组织采用的冻存方式与细胞冻存类似，一般为程序降温冻存，组织冻存液一般由DMSO、血清、细胞培养液组成，需要现用现配。且由于血清的成分不定，冻存液稳定性差，使得组织冻存液的保质期较短，保存条件也较为苛刻，需要-80℃或液氮保存。以上要求严重限制了组织冻存技术的发展。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种新鲜组织冻存液及冻存方法，使得新鲜组织样本采集后在保存与运输中，能够保持高细胞活性和基因信息的完整，并且组织细胞的基因表达也不发生改变。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种新鲜组织冻存液，所述新鲜组织冻存液中包括冷冻保护剂、离子缓冲液、组织细胞合成代谢营养物质、糖类化合物、抗氧化和抗细胞凋亡剂，其中，所述冷冻保护剂为渗透型冷冻保护剂和/或非渗透型冷冻保护剂；所述离子缓冲液中阴离子包括酸根离子和氢氧根离子；所述组织细胞合成代谢营养物质包括氨基酸、核苷和/或核苷酸；所述糖类化合物为单糖、二糖和多糖中的至少一种；所述抗氧化和抗细胞凋亡剂包括维生素、维生素衍生物和/或谷胱甘肽，所述新鲜组织冻存液的pH为7.2～7.6。

低温条件下，细胞内外溶液中的水分易形成冰晶，对细胞膜造成破坏；同时长时间的低温保存会引起组织细胞的自由基的产生和细胞凋亡通路的激活等。因此需要相应的低温保存介质维持组织细胞内外渗透压、改变细胞膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性、维持组织细胞基本的生理代谢所需的物质及抗氧化和抗细胞凋亡等。本发明可能有效解决上述技术问题。

在本发明中，冷冻保护剂是指保护细胞抵抗低温损害的化合物，能改变生物样品冰冻时的物理和化学环境，减轻或防止降温冰冻和复温解冻时组织细胞的损害，尽可能保持生物样品原有的生化和生理特性。所述渗透型冷冻保护剂是利用保护剂的小分子结构在溶液中易结合水分子发生水合作用，增加溶液的黏性，从而在降温的过程上减缓水分子结晶形成，减小“胞内冰晶损伤”，来达到保护细胞、组织的目的。在本发明的一些实施方案中，所述渗透型冷冻保护剂选自包括二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙烯醇的组中的至少一种。所述非渗透型冷冻保护剂为大分子非渗透性物质，其虽能溶于水但不能自由进出细胞，其加入到溶剂后可以使溶剂呈过冷状态，抵制冰晶形成，可以使特定温度电解质的浓度降低，减小溶质损伤，并通过改变渗透压引起细胞脱水减小胞内的冰晶形成。在本发明的一些实施方案中，所述非渗透型冷冻保护剂选自包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、左旋糖苷、白蛋白的组中的至少一种。在本发明的一些实施方案中，可以将渗透型冷冻保护剂和非渗透型冷冻保护剂联合使用，促使细胞完成脱水，同时可以减少渗透型冷冻保护剂的使用浓度来减少毒性损害。复温时，其可以提供一个高渗透压的环境，防止过多水分进入细胞太快而引起细胞膨胀损伤。

在本发明中，所述离子缓冲液用于维持组织细胞渗透压、缓冲和调节酸碱度。在本发明的一些实施方案中，所述离子缓冲液中阳离子包括钠离子和/或钾离子。在本发明的一些实施方案中，所述酸根离子选自包括碳酸根、碳酸氢根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、甲酸根、乙酸根、高锰酸根、锰酸根、盐酸根、氯酸根、亚氯酸根、草酸氢根、草酸根的组中的至少一种。由此，用于制备所述离子缓冲液的物质包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、甲酸钠、乙酸钠、高锰酸钠、锰酸钠、盐酸钠、氯酸钠、亚氯酸钠、草酸氢钠、草酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、甲酸钾、乙酸钾、高锰酸钾、锰酸钾、盐酸钾、氯酸钾、亚氯酸钾、草酸氢钾和草酸钾。

在本发明的一些实施方案中，所述氨基酸选自谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、络氨酸、天冬酰胺、亮氨酸中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述核苷选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和胸苷中的一种。

在本发明中，所述糖类化合物可以是一种单糖、双糖或聚糖，也可以是同种类糖或不同种类糖的混合物，例如为多种单糖的混合物，或者多种双糖的混合物，或者多种多糖的混合物，或者是一种或多种单糖与一种或多种双糖的混合物，或者是一种或者多种单糖与一种或多种多糖的混合物，或者是一种或多种双糖与一种或多种多糖的混合物，或者是一种或多种单糖、一种或多种双糖与一种或多种多糖的混合物。在本发明的一些实施方案中，所述单糖选自包括阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖的组中，所述双糖选自包括有蔗糖、海藻糖、乳糖的组中，所述多糖为葡聚糖和/或淀粉。在本发明中，一些糖类化合物也同时属于冷冻保护剂，此时该糖类作为两种成分存在。

在本发明的一些实施方案中，所述维生素选自维生素A、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸或烟酰胺)、维生素B6(吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(钴胺素、羟基钴胺或甲基钴胺)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(胆利钙素)、维生素E(生育酚或三双键生育酚)和维生素K(叶绿醌)中的至少一种。在本发明的一些优选实施方案中，所述维生素选自核黄素、烟酰胺、维生素C、维生素D、水溶性维生素E叶酸中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方案中，所述新鲜组织冻存液中，所述离子缓冲液中阳离子包括钠离子和钾离子，阴离子包括盐酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子和氢氧根离子；所述组织细胞合成代谢营养物质包括甘氨酸、亮氨酸和腺苷；所述糖类化合物为葡萄糖、淀粉和海藻糖；所述抗氧化和抗细胞凋亡剂包括维生素B9、维生素C和谷胱甘肽。

在本发明的一些更优选实施方案中，所述新鲜组织冻存液包括氯化钾0.1-0.4g/L、磷酸氢钠0.1-0.4g/L、磷酸二氢钠0.1-0.4g/L、氢氧化钾0.1-0.4g/L、葡萄糖1.0-4.0g/L、羟乙基淀粉10.0-40.0g/L、甘氨酸10-30mg/L、亮氨酸10-30mg/L、腺苷10-30mg/L、谷胱甘肽0.1-1.0mg/L、叶酸0.1-1.0mg/L、维生素C 0.1-1.0mg/L，DSMO 10～20％(v/v)，白蛋白0.05～0.15％(v/v)。

本发明第二方面提供本发明第一方面任一所述的新鲜组织冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将各物质加入至容器中；

S2，用无核酸酶水进行定容；

S3，将配制好的溶液的pH调节至7.2～7.6。

本发明第三方面提供本发明第一方面任一所述的新鲜组织冻存液在冻存新鲜组织中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述新鲜组织选自包括心、脑、肾、肝、肺、胃、肠、脾、体组织、肿瘤组织的组中的至少一种。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明的新鲜组织冻存液，组分简单，易于制备，原材料易获得，价格低廉，使用效期长。

(2)本发明的新鲜组织冻存液能够维持组织细胞的活性，同时不改变组织细胞的基因表达及细胞形态，保存后的组织样本无需复苏就能直接用于后续实验。

(3)本发明新鲜组织冻存液成分具有良好生物相容性，无有害成分，安全环保。同时冻存液可以有效维持组织细胞的核酸完整性和基因表达的稳定性，不改变组织细胞的基因表达，维持组织细胞的原始状态，可用于基因检测和研究等；保存后的组织经过消化解离制备成单细胞悬液，细胞活性高，可用于单细胞测序实验。保存后的组织空间结构完整，组织细胞形态完整，且细胞基因表达不改变，可用于空间转录组测序实验。

(4)本发明的新鲜组织冻存液采用低温(-20±5℃)保存及运输(干冰+冰袋)新鲜组织，可以降低细胞冰点，减少冰晶形成；降低组织细胞的新陈代谢速率，维持细胞活性的同时可以降低细胞基因表达的改变，使细胞保持在初始的状态。

(5)利用本发明的新鲜组织冻存液进行冻存，区别于传统的超低温冻存(-80℃或液氮)，也不同于一般新鲜组织保存液的保存时间不超过48小时，本发明所述冻存液使用方法可有效实现人和动物的新鲜组织的低温存储(-20±5℃)及运输，且新鲜组织在该冻存液中保存30天后仍能用于后续检测及研究。

附图说明

图1示出了本发明实施例2中新鲜组织冻存液#1～#6冻存组织30天后DNA检测结果，A：新鲜组织冻存液#1；B：新鲜组织冻存液#2；C：新鲜组织冻存液#3；D：新鲜组织冻存液#4；E：新鲜组织冻存液#5；F：新鲜组织冻存液#6。

图2示出了本发明实施例2中新鲜组织冻存液#1～#6冻存组织0天、7天、15天和30天后RNA检测结果，A：新鲜组织冻存液#1；B：新鲜组织冻存液#2；C：新鲜组织冻存液#3；D：新鲜组织冻存液#4；E：新鲜组织冻存液#5；F：新鲜组织冻存液#6。

图3示出了本发明实施例3中心、脑、肾、胃、肠、脾组织在新鲜组织冻存液#5和新鲜组织冻存液#6中冻存30天后RNA检测结果。

图4示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在新鲜组织冻存液#5中冻存后解离细胞存活率(AO/PI染色)检测结果。

图5示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在新鲜组织冻存液#6中冻存后解离细胞存活率(AO/PI染色)检测结果。

图6示出了本发明实施例4中中小鼠肝、脑、心、肠组织在新鲜组织冻存液#5和新鲜组织冻存液#6中冻存30天后解离细胞AO/PI染色检测结果。

图7示出了本发明实施例5中小鼠脾肝组织在新鲜组织冻存液#5冻存0天、15天和30天后组织RNA-Seq结果。

图8示出来了本发明实施例6中小鼠肾组织和肝组织在新鲜组织冻存液#5中冻存48小时后OCT包埋切片染色结果。

图9示出了本发明实施例7中人肺癌、结直肠癌、乳腺癌在新鲜组织冻存液#5中冻存30天后解离单细胞活率结果。

图10示出了本发明实施例7中人肺癌、结直肠癌、乳腺癌在新鲜组织冻存液#5中冻存30天后解离细胞AO/PI染色检测结果。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1不同新鲜组织冻存液配制

按照表1所示分别进行不同新鲜组织冻存液的配制

表1新鲜组织冻存液#1-#6配制表

其中，新鲜组织冻存液#6中营养成分更加充足，希望延长冻存时间及细胞活率

将上述溶液充分混匀后于-20±5℃保存。

实施例2小鼠肝脏组织冻存后核酸降解评估

由于肝脏的细胞种类繁多，并且功能也不尽相同，所以冻存条件较为严苛。另外同个个体肝脏可以等分成多份进行对比研究，能很好避免因个体差异造成测试的偏差。发明人取C57BL小鼠新鲜肝脏组织，切割成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量0.25g±10％的组织块，分别冻存于1.5实施例1制备的新鲜组织冻存液#1～#6中，置于-20±5℃冰箱冻存，分别于冻存7天、15天、30天取组织进行组织样本DNA、RNA提取。Agilent 2100生物分析仪进行RNA检测，采用琼脂糖凝胶电泳检测组织DNA。结果如图1、图2和表2所示。

表2小鼠肝脏组织在冻存液#1～#6中的冻存结果如下表所示

注：“/”表示前一次取样RNA发现降解后，不进行后续检测。

由图1可知，小鼠肝脏组织在新鲜组织冻存液#1～#6冻存30天，组织DNA均没有发生降解。

图2和表2可知，对于RNA样本，在冻存7天时，利用新鲜组织冻存液#1、新鲜组织冻存液#3和新鲜组织冻存液#4冻存的组织，RNA均发生了降解。冻存到15天，利用新鲜组织冻存液#2冻存的组织，RNA也发生了降解。冻存到30天，利用新鲜组织冻存液#5和新鲜组织冻存液#6冻存的组织，RNA依然没有发生降解，表明新鲜组织冻存液#5和新鲜组织冻存液#6非常好。

实施例3小鼠其他脏器组织冻存后RNA完整性测试

分别取BALB/c小鼠心脏、脑、肾、胃、肠、脾组织，处理成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别冻存于1.5mL新鲜组织冻存液#5及新鲜组织冻存液#6中，-20±5℃冻存。于30天取样进行组织样本RNA提取，Agilent 2100生物分析仪检测RNA完整性。

结果显示，心、脑、肾、胃、肠、脾组织在新鲜组织冻存液#5和新鲜组织冻存液#6中冻存30天后，组织RNA均未发生明显降解(如图3所示)。

实施例4小鼠组织冻存后细胞活性检测

取BALB/c小鼠肝、脑、心、肠组织分别处理成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别冻存于1.5mL新鲜组织冻存液#5及新鲜组织冻存液#6中，-20±5℃冻存。分别于0天、15天、30天取组织进行单细胞解离，并进行AO/PI染色，以荧光细胞计数仪检测细胞存活率。

结果如图4和图5所示，15天内，新鲜组织冻存液#5及新鲜组织冻存液#6冻存的小鼠肝、脑、心、肠组织的活性都高于80％，保持了非常高的细胞活性；30天内，新鲜组织冻存液#5冻存的小鼠肝、脑、心、肠组织的活性都高于80％，保持了较高的细胞活性，满足单细胞转录组测序要求。而新鲜组织冻存液#6中冻存的小鼠肝、肾组织活性在30天活性均低于75％，对于单细胞转录组测序存在风险。由此可见，新鲜组织冻存液#5冻存效果在一些组织冻存中，明显优于新鲜组织冻存液#6(图4、图5和图6)。表明，单纯增加冻存液营养成分，并不一定能够延长冻存时间及细胞活率。

实施例5 RNA-Seq检测小鼠新鲜组织冻存后的基因表达

取BALB/c小鼠肝、肠组织分别处理成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别冻存于1.5mL新鲜组织冻存液#5中，-20±5℃冻存。分别于0天、15天、30天取组织进行RNA提取，使用RNA-Seq检测组织冻存过程中的基因表达是否与新鲜组织有明显差异。

结果如图7所示，新鲜组织冻存液#5冻存的小鼠肝、肠组织经冻存30天后，基因表达没有显著的改变，与原始新鲜样本保持一致，可进行后续单细胞测序和空间转录组测序实验。

实施例6小鼠组织冻存后的组织细胞形态检测

取BALB/c小鼠肾、肝组织分别处理成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量偏差不大于10％的组织块，分别冻存于1.5mL新鲜组织冻存液#5中，-20±5℃冻存。于30天取组织进行OCT包埋，切片，HE染色，使用数字病理切片扫描仪对组织进行切片扫描观察组织细胞形态。

结果如图8所示，肾、肝组织经30天冻存后，组织形态完整，无病理性损伤。

实施例7人临床组织冻存

取人新鲜临床结直肠手术、乳腺癌手术、肺癌手术样本处理成体积不大于1cm×1cm×1cm，重量偏差不大于10％的组织块，冻存于1.5ml新鲜组织冻存液#5中，-20±5冻存。30天取组织进行单细胞解离，并进行AO/PI染色，以荧光细胞计数仪检测细胞存活率。

结果如图9和图10所示，人结直肠、乳腺癌、肺癌组织经新鲜组织冻存液#5冻存30天后，组织细胞存活率均高于80％，表明新鲜组织冻存液#1冻存人临床组织样本能在30天内很好的维持组织细胞活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1. 一种新鲜组织冻存液，其特征在于，所述新鲜组织冻存液按1000mL计，包括氯化钾0.1g、磷酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g、氢氧化钾0.1g、葡萄糖1.0g、羟乙基淀粉40.0g、还原型谷胱甘肽0.1mg、叶酸0.1mg、维生素C 0.1mg、甘氨酸10mg、腺苷10mg、亮氨酸10mg、DSMO150mL、白蛋白1mL、无核酸酶水补足至1000mL，

所述新鲜组合冻存液的pH为7.2~7.6。

2.权利要求1所述的新鲜组织冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将各物质加入至容器中；

S2，用无核酸酶水进行定容；

S3，将配制好的溶液的pH调节至7.2~7.6。

3.权利要求1所述的新鲜组织冻存液在冻存新鲜组织中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述新鲜组织选自包括心、脑、肾、肝、胃、肠、脾、肿瘤组织的组中的至少一种。