ES2257050T3 - Conservacion por el frio de hematies humanos. - Google Patents
Conservacion por el frio de hematies humanos.Info
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Abstract
Compuesto de hematíes que comprende: (a) hematíes, (b) una combinación de reactivos de modificación bioquímica, seleccionados del grupo constituido por pentoxifilina, flurbiprofeno, nicotinamida, niketamida, nifedipina, amilorida, taxol, citocalasina B, trealosa y ribosa, y (c) uno o varios agentes protectores por el frío, y que comprende además un compuesto para almacenamiento; y que comprende opcionalmente un inhibidor de proteasa y/o un bioflavonoide o un derivado de bioflavonoide.
Description
Conservación por el frío de hematíes humanos.
La sangre está compuesta de plasma y de
constituyentes celulares y desempeña un papel primordial en varios
sistemas fisiológicos clave del cuerpo humano, incluyendo la
inmunología, la hemostasia y la oxigenación del tejido. El
movimiento de los gases respiratorios, oxígeno (O_{2}) y óxido de
carbono (CO_{2}) es la función principal de los eritrocitos o
glóbulos rojos. Este movimiento facilitado de O_{2} y CO_{2}
es llevada a cabo por la hemoglobina, una proteína multisubunidad
que contiene hierro, contenida dentro de los hematíes. La
necesidad de encapsular la hemoglobina dentro de los hematíes es
doble. En primer lugar, la hemoglobina tiene parámetros ligantes
específicos para asegurar la entrega de dichas moléculas críticas a
los sitios adecuados. Regulando la concentración de cofactores e
iones libres, el hematíe facilita el entorno apropiado para la
recogida y liberación óptimas de O_{2}. En segundo lugar, el hem
libre tiene efectos tóxicos tanto en los sistemas renal como
hepático y puede llevar a situaciones tales como la
hemoglobinuria.
Los componentes estructurales de los hematíes que
encierra la hemoglobina comprenden la doble capa de membrana y el
citosqueleto. La propia membrana contiene colina y
aminofosfolípidos, colesterol y proteínas de membrana integral. A
lo largo de la superficie interna de la membrana se encuentra el
citosqueleto. Este esqueleto similar a una malla está compuesto de
moléculas de espectrina filamentosas unidas entre sí como focos de
complejos de F-actina y proteína 4.1. Esta malla
citosquelética está unida a la membrana a través de interacciones
de proteina-proteina tales como la conexión mediada
anquirina/proteína 4.2. de espectrina y la proteína de membrana
integral Band 3 y posiblemente a través de las interacciones
directas de proteína-lípido. A través de estas
conexiones, el citosqueleto proporciona estabilidad y forma al
hematíe. En ausencia de ligante adecuado dentro de la malla del
citosqueleto o la conexión del citosqueleto a la membrana, el
resultado es un hematíe críticamente debilitado. Varias
enfermedades humanas han sido identificadas procedentes de la
ausencia de una proteína específica o de una interacción de
proteína defectuosa. La mayor parte de estos defectos conducen a
glóbulos rojos morfológicamente anormales y a severas anemias
hemolíticas.
Una gran variedad de lesiones y de procedimientos
médicos requieren la transfusión de sangre completa o de una
variedad de componentes de la sangre. Se utilizan rutinariamente
las transfusiones de sangre para aumentar la capacidad de entrega
de oxígeno y el volumen circulatorio en los pacientes. El acceso
seguro, rápido y fácil a las unidades de hematíes que se puedan
utilizar para transfusiones, no es solamente importante para las
víctimas de traumatismos con pérdida masiva de sangre sino
igualmente para pacientes que son sometidos a una operación
quirúrgica selectiva o que tengan enfermedades tales como varios
tipos de anemias hemolíticas hereditarias que den por resultado una
pérdida de hematíes en circulación. La capacidad de almacenar
glóbulos rojos durante largos periodos de tiempo asegura que esté
disponible un suministro de hematíes para transfusión cuando se
necesiten. Los usos potenciales incluyen el almacenamiento de
serotipos únicos, unidades destinadas a transfusiones autólogas y
al almacenamiento en grandes cantidades de sangre de tipos
generales para situaciones de emergencia. Las limitaciones de las
metodologías de almacenamiento actuales han llevado en parte a
escasez ocasional de suministro de sangre que daba por resultado
que se pospusieran operaciones quirúrgicas selectivas y que se
solicitaran donaciones a bancos de sangre y a hospitales.
Actualmente, están aprobados dos métodos para el
almacenamiento a largo plazo de hematíes. La mayoría de las
unidades de glóbulos rojos son almacenadas en
citrato-fosfato-dextrosa a 4ºC. Por
ejemplo, cuando se recibe sangre de un donante en un centro de
procesamiento se separan los eritrocitos y se almacenan según
varios métodos generalmente como unidad de eritrocitos empacados que
tengan un volumen de 200 a 300 ml y un valor de hematocrito de 70 a
90. No obstante, debido a la depleción (vaciado) metabólica y
degradación física consiguiente pueden almacenarse estos hematíes
solamente hasta 42 días. Asimismo, aunque el 70% de esos hematíes
almacenados quedan en circulación después de la transfusión, no se
ha demostrado la capacidad real de entrega de O_{2}.
Durante el almacenamiento, los hematíes humanos
experimentan cambios morfológicos y bioquímicos incluyendo la
disminución del nivel celular del trifosfato de adenosina (ATP) y
2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG),
cambios en la morfología celular y en la hemólisis progresiva. La
concentración de APT tras un breve ascenso inicial desciende
progresivamente hasta un 30-40% de su nivel inicial
al cabo de seis semanas de almacenamiento. Se producen cambios
morfológicos durante el almacenamiento que conducen finalmente al
desarrollo de espiculas que pueden presentarse como vesículas
cambiando radicalmente la relación
superficie-volumen de las células y su capacidad de
deformación al pasar a través de canales estrechos. La fluidez de
la membrana celular de lo hematíes, que es esencial para el paso de
los hematíes a través de los canales estrechos en el bazo y en el
hígado, está en estrecha correlación con el nivel de ATP. La
concentración de ATP y la morfología de los hematíes sirve como
indicador de la adecuación de las células almacenadas para la
transfusión.
El segundo método, es el almacenamiento en frío a
-80ºC utilizando un 40% (p/v) de glicerol como protector por el
frío. No obstante, este aditivo penetra en las membranas de muchas
células biológicas y posee propiedades indeseables cuando se
inyectan en los humanos. Aunque puede utilizarse este método de
almacenamiento hasta durante 10 años, debe retirarse por lavado el
glicerol antes de la transfusión. El procedimiento de lavado,
utiliza un equipo costoso y necesita mucho tiempo y trabajo. Además,
un nivel significativo de hemólisis (normalmente
10-15%) tiene lugar durante el procedimiento de
lavado. Finalmente, como se considera que este procedimiento
compromete la esterilidad de las unidades de hematíes, limita
significativamente el almacenamiento posterior al lavado. Por
consiguiente, este método de almacenamiento, solamente se utiliza
para sangre que tenga unos tipos de factores muy raros y autólogos
y unidades de donación dirigidas que no serán utilizadas durante
un plazo de 42 días. En 1992, los datos más recientes disponibles
indicaban que aproximadamente un 14% (casi dos millones de
unidades) del suministro disponible de hematíes para transfusiones
quedaba descartado. La capacidad de conservador por el frío de
hematíes sin el gasto y tiempo de lavado adicionales o reduciendo
al menos el número de ciclos de lavado necesarios permitiría salvar
un porcentaje significativo de estas unidades descartadas
proporcionando de este modo una baza adicional contra la escasez de
sangre.
Las teorías actuales de conservación por el frío
de hematíes consideran que la formación y propagación de hielo es
el factor primordial sino el único que afecta a la recuperación de
la célula y a su viabilidad después del almacenamiento. Por
consiguiente, la investigación de métodos para la conservación por
el frío de hematíes, solamente tiene en cuenta ligeras variaciones
de las metodologías de los protectores por el frío tradicionales.
Se explican métodos anteriores para la conservación, almacenamiento
y transfusión de glóbulos rojos en Horn, Sputtek, Standl, Rudolf,
Kuhnl and Esch, Transfusion of Autologous, Hydroxyethyl
Starch-Cryopreserved Red Blood Cells, Anesth.
Analg. 1997; 85; 739-745. Sin embargo, la modulación
inducida por temperatura de la bioquímica celular, es un fenómeno
bien conocido por los expertos en este campo. Las descripciones de
la presente, presentan métodos para utilizar la bioquímica de los
hematíes para solucionar los desequilibrios inducidos por el frío
que conducirían normalmente a la hemólisis celular tras la
conservación por el frío. A través de estos métodos, puede
reducirse el nivel de protección por el frío no específica contra
la formación de hielo.
Están actualmente disponibles dos procedimientos
generales para la conservación en frío de células vivas en
términos del protector por el frío utilizado. Uno utiliza la adición
de altas concentraciones de solutos penetrantes de peso molecular
bajo. Debido a la toxicidad y a los problemas osmóticos, se
requieren equipo y técnicas especializadas para retirar los solutos
después de la descongelación. El segundo utiliza polímeros de peso
molecular elevado que no entren en las células. El tratamiento
posterior a la descongelación en este caso, es más simple desde el
punto de vista logístico, pero el almacenamiento debe realizarse a
una temperatura muy baja, normalmente en nitrógeno líquido. La
formación de hielo que es un inconveniente principal de cualquier
método de crioconservación por el frío de células, se inicia
mediante núcleos de cristal de hielo. Cuando baja la temperatura y
el agua se transforma en hielo, la célula es progresivamente
deshidratada y en algún punto, se produce la lesión de la célula.
La naturaleza de la lesión por deshidratación se cree que resulta
de las tensiones de la membrana que llevan a la rotura de dicha
membrana. Esta forma de lesión puede evitarse mediante la adición
de solutos con una concentración multimolar, de modo que la
cantidad de hielo formado sea insuficiente para dar como resultado
la deshidratación perjudicial para la célula.
Durante muchos años, se ha sabido que algunas
moléculas pueden ser protectoras por el frío. Es necesario, que
estos penetrantes conservantes por el frío reduzcan la cantidad de
hielo extracelular formado y de este modo, reduzcan la
deshidratación de la célula aunque al mismo tiempo aumente la
concentración intracelular para que resulte menos probable la
cristalización intracelular. Dicho soluto, para que resulte útil,
no debe ser tóxico en altas concentraciones y debe penetrar
libremente en la célula. Se han utilizado a este efecto glicerol y
dimetilsulfóxido (DMSO). El glicerol es notablemente no tóxico, en
concentraciones altas, pero penetra lentamente en las membranas de
las células, por lo tanto resulta difícil de introducir y eliminar.
El dimetilsulfóxido penetra rápidamente pero se vuelve
crecientemente tóxico cuando se sobrepasan concentraciones de 1 M
(aproximadamente 7%). Los polímeros con peso molecular elevado tales
como el polivinilpirrolidona (PVP) dextrano y más recientemente el
almidón de hidroxietilo (HES) no penetra en la célula y el
mecanismo según el cual confieren protección por el frío ha sido
objeto de especulaciones.
Como se indica anteriormente, con el fin de
prolongar el almacenamiento de hematíes, es necesario almacenar
las células o tratarlas de alguna manera, para evitar un descenso de
ATP y a ser posible de 2,3-difosfoglicerato (2,3
DPG), además de la protección contra el daño producido por los
cristales de hielo. Normalmente, dichas soluciones contienen
fosfato, glucosa y adenina que funcionan para prolongar la duración
en almacén al mantener el nivel de ATP en las células. Además, la
actividad glucolítica mejora en los hematíes si el pH intracelular
medido a 4ºC es de aproximadamente 7.4. La osmolalidad efectiva de
la solución de suspensión es otro factor importante al ampliar el
tiempo de almacenamiento de los hematíes. Se ha demostrado que los
aumentos inducidos hipotónicamente en un volumen medio de células
reduce sustancialmente la hemólisis y mejora la morfología de las
hematíes durante el almacenamiento. Aunque el mecanismo no ha
quedado demostrado, es posible que la tumefacción osmótica aumente
la tensión en la superficie de la célula oponiéndose de este modo a
los cambios de forma usualmente asociados a los hematíes
almacenados. Aunque la hipotonicidad de la solución aditiva queda
limitada por el peligro de hemólisis durante la adición de la
solución, los hematíes que son normalmente discos bicóncavos
pueden hincharse para alcanzar casi el doble de su volumen normal
con una osmolalidad externa de aproximadamente 170 mOsm antes de
su hemólisis. Si la solución aditiva es demasiado hipotónica, los
hematíes estallarán (hemólisis). Como resultado, no pueden
utilizarse soluciones que sean demasiado hipotónicas. Aunque
generalmente se piensa que el mantenimiento de ATP y de 2,3DPG se
refiere a un almacenamiento a 4ºC es importante el mantenimiento
de la concentración de estos metabolitos para el almacenamiento
tras la descongelación. A los efectos de los niveles de ATP,
hemólisis, pérdida de potasio y esparcimiento de microvesículas,
sobre el mantenimiento y almacenamiento de hematíes véase
Greenwalt, Rugg and Dumaswala, The Effect of Hypotonicity
Glutamine, and Glycine on Red Cell Preservation, Transfusion
1997; 37; 269- 276.
La patente WO9314191 describe un compuesto
conservador por el frío para hematíes (RBS) que comprende sales de
tampón básico (KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, MgCl_{2},
inosina, adenina, glutamina, ácido nicotínico, glutación), glucosa,
almidón hidroxietilo y PVP.
La patente WO9613158 describe compuestos para el
almacenamiento de plaquetas que contengan amilorida, nitroprusido
de sodio, adenosina, quinacrina, dipiridamol, ticolpidina, heparina
y DMSO.
El objetivo del almacenamiento ampliado de
hematíes es mantener las características metabólicas y
morfológicas de modo que los parámetros in vivo (capacidad de
entrega de oxígeno y vida media circulatoria), sean comparables a
hematíes frescos no congelados. Adicionalmente, el nivel de
hemólisis durante el ciclo de almacenamiento debe quedar dentro de
niveles aceptables para permitir la transfusión directa de la
unidad de hematíes descongelados sin complicaciones debidas a la
toxicidad de la hemoglobina. Se pueden cumplir estos objetivos
utilizando el método de la presente invención. El método aquí
descrito ofrece las ventajas de los dos métodos actualmente
aprobados, almacenamiento prolongado en estado congelado y
disponibilidad inmediata como en el almacenamiento
refrigerado.
refrigerado.
Los hospitales y los bancos de sangre se
beneficiarán enormemente de unos hematíes congelados que puedan
utilizarse directamente para la transfusión. La mayoría de los
planteamientos de investigación actuales para lograrlo tratan
simplemente de sustituir el glicerol por un protector por el frío
no tóxico, utilizable en transfusiones. No obstante, los resultados
han demostrado que se necesita utilizar la mayoría de los
protectores por el frío con concentraciones que puedan utilizarse
para las transfusiones o cuyas cualidades protectoras no sean
suficientes para mantener la hemólisis a niveles aceptables de
transfusión. Asimismo, la mayoría de los procedimientos requieren
un almacenamiento a -193ºC en vapor de nitrógeno líquido. Esto
sería costoso y difícil de incorporar en los procedimientos actuales
de bancos de sangre haciendo que resultara impracticable el
almacenamiento a largo plazo a temperaturas por debajo de -
80ºC.
La invención aquí descrita va dirigida a los
citados problemas de almacenamiento, cambios morfológicos, cambios
metabólicos y eficacia funcional a largo plazo de los hematíes.
Asimismo, la presente invención logra resultados inesperados y
sorprendentes en la conservación de hematíes a través de su
tratamiento con los compuestos y métodos de la presente invención y
que anteriormente, se hubieran considerado imposibles.
La presente invención ofrece un método para
almacenar hematíes en estado congelado a temperaturas bajo cero
(-10º a -193ºC)de modo que las unidades de hematíes
descongeladas resultantes contengan células viables.
Específicamente, esto se logra a través de una combinación de
estabilización bioquímica y solución protectora por el frío. Un
reactivo de estabilización bioquímica es uno que proporciona una
protección por el frío no tradicional, porque por sí solo no
disminuye la formación ni la cantidad de hielo durante el proceso
de congelación en la concentración utilizada. En caso de que la
solución protectora por el frío combinada esté compuesta de
reactivos protectores por el frío para transfusiones, la unidad de
hematíes descongelados resultante puede utilizarse directamente
para la transfusión. En todos los casos, la incorporación de la
tecnología de estabilización bioquímica permite la conservación por
el frío de hematíes utilizando concentraciones de protectores por
el frío inferiores a las que serían necesarias en ausencia de
estabilización bioquímica.
La estabilización bioquímica implica la adición
de reactivos cuyo objetivo son componentes específicos de hematíes
y el paso bioquímico susceptible de deteriorarse durante el ciclo
de congelación/descongelación. La estabilización con dichos
reactivos hace que las células se vuelvan parcialmente resistentes
a los daños producidos por la congelación/descongelación, lo que da
como resultado final la hemólisis. Se puede poner como objetivo la
estabilización bioquímica para mantener los componentes
metabólicos, el potencial antioxidante, la distribución iónica
intracelular, la fluidez de la membrana y la integridad de la
estructura citoesquelética. Asimismo, se pueden manipular
directamente de pasos de segundos mensajeros específicos, tales
como la ciclooxigenasa, lipoxigenasas, monofosfato de hexosa y
pasos de fosforilación, por medio de reactivos bioquímicos o
indirectamente a través de la regulación de moléculas mensajeras
específicas, incluido el monofosfato de adenosina cíclica
(c-AMP), el monofosfato de guanina cíclica
(c-GMP), el calcio intracelular, el trifosfato de
inositol y el diacilglicerol.
Más específicamente, se puede añadir una
combinación de reactivos a las unidades de hematíes para lograr
cada uno de los objetivos citados. Por ejemplo, se pueden añadir
reactivos para mantener o mejorar las concentraciones
intracelulares de ATP al igual que para bloquear las ATPasas de ATP
depleción tales como la inhibición mediada de la amilorida del
intercambiador Na+/H+. Se puede prevenir el deterioro por oxidación
de la membrana o hemoglobina mediante la adición de antioxidantes
tales como tocoferol, ascorbato y bioflavonoides al igual que a
través de la estimulación del paso del monofosfato de hexosa
mediante la ribosa. Se puede regular la distribución tónica
mediante la activación o inhibición de bombas de iones específicas.
Puede controlarse el calcio con nifedipina o verapamil mientras que
la amilorida realizará la regulación del sodio como se menciona
más arriba. Puede seguir manteniéndose la distribución iónica de
potasio y cloruro mediante la inhibición del cotransportador
K+/Cl- con bumetanida. Pueden regularse los pasos de ciclooxigenasa
y lipoxigenasa mediante la adición de flurbiprofeno, dipiridamol o
aspirina mientras que se pueden manipular los acontecimientos de
fosforilación mediante la inhibición por inhibidores de cinasa tales
como H7
(1-(5-isoquinolinilsulfonil)-2-metilpiperazina),
estaurosporina o queleritrina o estimulación con carnitina
palmitoil diacilglicerol. La estabilización y fluidez de la
membrana están controladas mediante la adición de pentoxifilina,
nicotinamida o amantadina y se puede mantener la estructura
citoesquelética a través de la estabilización de la actina mediante
el uso de Taxol [2aR-[2a\alpha, 4\beta, 4a\beta, 9\alpha
(\alphaR*, \betaS*, 11\alpha, -12\alpha, 12a\alpha,
12b\alpha)]-\beta-(Benzoilamina)-\alpha-ácido
hidroxibencenopropanoico
6,12b-bis(acetiloxi)-12-(benzoiloxi)-2a,
3, 4, 4a,
5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahidro-4,11-dihidroxi-4a,
8, 13,
-13-tetrametil-5-oxo-7,11-metano-1H-ciclodeca
(3,4)benz [1,2-b]
oxet-9-yl-éster), o citocalasinas o
la estabilización de espectrina con poliaminas. El paso de segundo
mensajero regulado por el nucleótido cíclico específico puede ser
activado mediante el uso opcional de adenosina
(c-AMP elevadas) y el nitroprusido de sodio u otros
donantes de óxido nítrico (c-GMP elevadas).
Además de para la estabilización bioquímica se
utilizan protectores por el frío para proteger la unidad de
hematíes de los daños causados por la formación de cristales de
hielo durante el ciclo de congelación/descongelación. Pueden
utilizarse los protectores por el frío individualmente o como
mezclas realizadas con compuestos penetrantes y/o no penetrantes.
Los ejemplos de protectores por el frío potenciales incluyen aunque
sin limitaciones el dimetilsulfóxido, el pirrolidona de polivinilo,
dextrano, maltodextrinas, 2,3- butanediol, el almidón de
hidroxietilo, el polietilenglicol, la glucosa y otros
carbohidratos.
En un modo de realización, para la conservación
de hematíes humanos, el método incluye procurar un volumen de
hematíes empacados en ADSOL, una solución aditiva actualmente con
licencia vendida por Baxter Travenol, utilizando protocolos
estándar de bancos de sangre. Se elimina el ADSOL mediante
centrifugación y se añade un volumen de solución de conservación
que contenga los protectores por el frío deseados y cualquier
reactivo bioquímico adicional. Las muestras de sangre roja que
contengan protectores por el frío son sumergidas en nitrógeno
líquido para su congelación y se trasladan de inmediato a
congeladores de -80ºC para un almacenamiento de mayor duración. Se
puede poner como objetivo la estabilización bioquímica para
mantener los componentes metabólicos, potencial antioxidante,
distribución iónica intracelular, fluidez e integridad de la
membrana de la estructura citoesquelética. Además, se pueden
manipular pasos de segundo mensajero específico tal como
cicloxigenasa, lipoxigenasa, monofosfato de hexosa y pasos de
fosforilación, directamente mediante reactivos bioquímicos o
indirectamente a través de la regulación de moléculas de mensajero
específico, incluyendo c-AMP,
c-GMP, calcio intracelular, trifosfato de inositol y
diacil glicerol. En un modo de realización preferido, los
reactivos bioquímicos están presentes en una concentración tal que
impidan la hemólisis de los hematíes durante el ciclo de
congelación/descongelación e incluso preferiblemente que tengan
concentraciones de 500 \muM de nifefipina, 20 \muM, citocalasina
B, 500 \muM, de Taxol, 5 \muM de pentoxifilina y 25 \mug/ml
de flurbiprofeno. Los reactivos bioquímicos están presentes en un
2,5% de DMSO como agente portador. Todas las condiciones contienen
7,5% de dextrano (Dex; 40.000 MW), 2% depirrolidona de polivinilo
(PVP; 40.000 MW), 5% de almidón de hidroxietilo, y 5% de
polietilenglicol. Las concentraciones bajas para transfusiones de
protectores por el frío pueden funcionar combinadas con la
protección de los hematíes durante la conservación por el frío
mejor que cualquier protector por el frío por sí solo. Asimismo, la
adición de reactivos y la modulación bioquímica con las
concentraciones bajas de protectores por el frío para transfusiones
funciona combinada para la protección adicional de los hematíes
durante la conservación por el frío. Un método alternativo consiste
en añadir la solución salina isotónica o solución conservante que
contiene los reactivos bioquímicos y un volumen de Glycerolyte 57
(Fenwall), de preferencia un 20% aproximadamente de glicerol y
congelar la bolsa a -80ºC. Los aditivos usados incluyen
nicotinamida, niketamida, nifedipina, pentooxifilina y
flurbiprofeno. El 20% de glicerol con la adición de aditivos
bioquímicos reduce el nivel de hemólisis y cumple los criterios
para una unidad de sangre para transfusiones basados en la
hemólisis global y niveles de hemoglobina libre residual.
En dicho modo de realización, los reactivos
bioquímicos debieran estar presentes en una concentración que
permita disminuir la hemólisis durante el ciclo de
congelación/descongelación y aumentar la actividad funcional in
vitro comparada con la de los hematíes conservados con las
mismas condiciones pero en ausencia de reactivos bio-
químicos.
químicos.
En otro modo de realización adicional de la
presente invención, un compuesto de hematíes se forma con
hematíes, un compuesto de hematíes y reactivos bioquímicos tal como
se especifica en la reivindicación 1 y una combinación de uno o
más agentes protectores por el frío.
Otro modo de realización está destinado a un
compuesto de hematíes humanos que comprende hematíes humanos, un
compuesto de hematíes y agentes bioquímicos. Pueden añadirse
reactivos para mantener o mejorar las concentraciones
intracelulares de ATP al igual que para bloquear la ATPasas de ATP
depleción tales como la inhibición de la amilorida del
intercambiador Na+/H+. Puede lograrse que no se produzcan daños por
oxidación en la membrana o en la hemoglobina mediante la adición de
antioxidantes tales como tocoferol, ascorbato y bioflavonoides al
igual que mediante la estimulación del paso del monofosfato de
hexosa mediante la ribosa. Puede regularse la distribución iónica
mediante la activación o inhibición de bombas de iones específicas.
Puede controlarse el calcio con nifedipina o verapamil mientras que
la amilorida realizará la regulación del sodio tal como se ha
mencionado anteriormente. Asimismo, puede mantenerse la
distribución iónica del potasio y del cloruro mediante la
inhibición del cotransportador K+/Cl- con bumetanida. Pueden
regularse los pasos de cicloxigenasa y lipoxigenasa mediante la
adición de flurbiprofeno o aspirina mientras que los
acontecimientos de fosforilación pueden manipularse mediante la
inhibición con inhibidores de cinasa tales como
H7(1-[5-isoquinolinilsulfonil]-2-metilpiperacina),
estaurosporina o queleritrina o estimularse mediante diacilglicerol
palmitoil carnitina. La estabilización y fluidez de la membrana se
controla mediante la adición de pentoxifilina, nicotinamida o
amantadina y puede mantenerse la estructura citoesquelética
mediante la estabilización de la actina mediante el uso de TAXOL o
citocalasinas o la estabilización de espectrina con poliaminas.
Pueden activarse los pasos de segundo mensajero regulado por
nucleótida cíclica específica mediante el uso opcional de adenosina
(c-AMP elevadas) y nitroprusido de sodio u otros
donantes de óxido nítrico (c-GMP elevadas). Los
reactivos bioquímicos están presentes en una concentración tal que
impida la hemólisis de los hematíes durante el ciclo de
congelación/descongelación.
La estabilización bioquímica de la presente
invención se basa en la aplicación de efectores específicos, cuyo
objetivo reside en aspectos específicos de la bioquímica celular
para proteger las células contra daños específicos. El método de
conservación por el frío es tal que las células almacenadas pueden
ser utilizadas en la transfusión directamente después de la
descongelación, mediante la combinación de reactivos bioquímicos y
bajas concentraciones de protectores por el frío para transfusión.
La estabilización bioquímica implica la regulación del componente
metabólico, iónico, citoesquelético y de membrana, haciendo que los
hematíes tratados sean menos susceptibles de recibir daños
inducidos durante la congelación y descongelación a temperaturas
entre -10ºC y -193ºC.
En otro modo de realización, los efectores
celulares específicos son nifedipina, citocalasina B, Taxol,
pentoxifilina, flurbiprofeno, niketamida, ribosa y trealosa. Se
añaden estos modificadores a hematíes empacados y solución
conservante. Cada uno de los modificadores afecta a una bioquímica
celular específica diferente. En un aspecto de la presente
invención, la nifedipina un inhibidor que actúa a través de la
cascada de calcio controla el calcio mientras que la citocalasina B
y el Taxol son modificadores citoesqueléticos y proporcionan la
estabilización de la célula a través de la estabilización de la
actina. En otro aspecto de la presente invención, pueden
controlarse la estabilización y fluidez de la membrana a través de
la pentoxifilina, un modificador de membrana. Se añade ribosa para
evitar los daños por oxidación en la célula mediante la
estimulación del paso de monofosfato de hexosa.
Los efectores del segundo mensajero han
demostrado que proporcionaban estabilización bioquímica a los
hematíes en combinación con otros. Además, es importante señalar que
la adición de dichos reactivos permite que la modulación
bioquímica mejore la protección por el frío en concentraciones de
glicerol más bajas que dan normalmente por resultado que casi el
100% de los hematíes estén inadecuadamente protegidos durante los
ciclos de congelación/descongelación y lavado. Al describir los
productos químicos que han resultado útiles como efectores de los
pasos de segundo mensajero, debe entenderse que los productos
químicos efectivamente mencionados junto con materiales
equivalentes desde el punto de vista funcional, quedan englobados
dentro del ámbito de la presente invención. En la solicitud se han
señalado específicamente los productos químicos que los
solicitantes conocen o que han demostrado su utilidad como
modificadores.
Algunos productos químicos de los que se piensa
que son materiales equivalentes desde el punto de vista funcional,
para que los modificadores actúen a través del paso de segundo
mensajero, son seleccionados entre monofosfato cicloadenosina,
c-(AMP), monofosfato cíclicoguanina, c-(GMP), calcio intracelular,
trifosfato de inositol y diacilglicerol. Los modificadores
equivalentes desde el punto de vista funcional que actúan a través
del paso de segundo mensajero regulado por nucleótido cíclico son
aquellos seleccionados del grupo de adenosina, nitroprusido de
sodio y otros donantes de óxido nítrico. Puede lograrse que se
eviten daños por oxidación en la membrana o en la hemoglobina
mediante la adición de antioxidantes equivalentes desde el punto
de vista funcional tales como tocoferol, ascorbato y bioflavonoides
al igual que a través de la estimulación de paso de monofosfato de
hexosa mediante ribosa. Puede regularse la distribución iónica a
través de la activación o inhibición de bombas de iones
específicas. Los modificadores de calcio equivalentes desde el
punto de vista funcional pueden ser elegidos del grupo de
nifedipina o verapamil mientras que la amilorida realizará la
regulación del sodio tal como se ha indicado más arriba. Puede
mantenerse una distribución iónica adicional de potasio y cloruro
a través de la inhibición del cotransportador K+/Cl- con bumetanida.
Pueden regularse los pasos de ciclooxigenasa y lipoxigenasa a
través de la adición de modificadores de flurbiprofeno equivalentes
desde el punto de vista funcional, dipiridamol o aspirina mientras
que se pueden manipular los acontecimientos de fosforilación
mediante la inhibición por medio de inhibidores de cinasa tales
como H7
(1-[5-isoquinolinilsufonil]-2-metilpiperazina),
estauroporina o queleritrina o estimularse con
diacilglicerolpalmitoi/carnitina, que son reactivos igualmente
equivalentes desde el punto de vista funcional. Los reactivos que
son reguladores equivalentes desde el punto de vista funcional de
la estabilización y fluidez de la membrana son pentoxifilina,
nicotinamida o amantadina, mientras que para la regulación de la
estructura citoesquelética a través de la estabilización de la
actina, los reactivos son TAXOL o citocalasinas y para la
estabilización de la espectrina, las poliaminas. Pueden activarse
los pasos de segundo mensajero regulados por el nucleótido cíclico
específico a través del uso de adenosina equivalente desde el
punto de vista de la funcionalidad (c-AMP
elevadas) y nitroprusido de sodio u otros donantes de óxido nítrico
(c-GMP elevadas):
La duración de los hematíes posterior a la
descongelación después de la conservación por el frío puede
alargarse con éxito mediante el almacenamiento de las células a
-80ºC con los reactivos bioquímicos de la presente invención.
Cuando se almacenaban los hematíes durante 3-7 días
en un congelador a -80ºC y se descongelaban a 37ºC en un baño de
agua y se analizaban para conocer la hemólisis posterior al
almacenamiento, en comparación con hematíes almacenados en
concentraciones de glicerol únicamente, el porcentaje de hemólisis
fue el siguiente: 14,36% con nifedipina, 15,01% con Taxol y
citocalasina B, 11,46% con nifedipina, pentoxifilina y
flurbiprofeno y 11,66% con nifedipina, citocalasina y Taxol. Estos
resultados resultan favorables para mejorar la protección por el
frío cuando se comparan con concentraciones de glicerol que dan
por resultado normalmente que casi el 100% de los hematíes estén
inadecuadamente protegidos durante los ciclos de
congelación/descongelación y lavado.
Para realizar el experimento, se obtuvo una
unidad de hematíes empacados en ADSOL utilizando los protocolos
standard de bancos de sangre. Se eliminó el ADSOL por centrifugación
y se añadió un volumen de solución de conservación que contenía
los protectores por el frío y reactivos bioquímicos deseados. Las
concentraciones finales de protector por el frío utilizadas fueron
7,5% dextrano, 2% pirrolidona de polivinilo, 5% almidón
hidroxietilo y 2,5% de dimetilsulfóxido como portador de reactivo
bioquímico. Los reactivos utilizados incluían 500 \muM de
nifedipina, 20 \muM de citocalasina B, 500 \muM de Taxol, 5 mM
de pentoxifilina y 25 \mug/ml de flurbiprofeno. Después de
eliminar el ADSOL y añadir la solución de conservación, se
colocaron 50 ml de hematíes en bolsas de congelar que tenían un
volumen máximo de 150 ml. Se añadió un volumen igual en cada bolsa.
Se congelaron las bolsas por inmersión y se almacenaron a -80ºC
durante 2-7 días y se descongelaron sumergiéndolas
durante 10 minutos en un baño de agua a 37ºC. Se determinó el nivel
de hemólisis de descongelación como la relación de hemoglobina
libre respecto a la hemoglobina total. Puede realizarse la
transfusión directamente después del almacenamiento de esta mezcla
de reactivo bioquímico.
El almacenamiento de hematíes a una temperatura
de -10ºC a -193ºC requiere la adición de un agente protector por
el frío tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Los agentes
protectores por el frío tales como el DMSO son moléculas polares
que penetran en la membrana de la célula y sirven para conservar la
viabilidad de la célula durante el proceso de conservación por el
frío. Además del DMSO, otros agentes protectores por el frío
utilizados en la presente invención incluyen la pirrolidona de
polivinilo, las maltodextrinas de dextrano,
2,3-butanadiol, almidón de hidroxietilo,
polietilenglicol, glucosa y combinaciones de los mismos. Se ha
informado del éxito de la conservación por el frío con algunas
moléculas hidrosolubles que no penetran en las células, sin
embargo, se desconoce el mecanismo exacto que produce este
resultado. Se ha especulado, que este fenómeno que incluye que los
polímeros protejan las células bajando la concentración salina
extracelular a temperaturas de subcongelación tal como hacen los
crioprotectores penetrantes o que los polímeros podrían adsorber
las células y de este modo, proteger las membranas. También se ha
especulado, que durante la congelación se desarrolla un gradiente
de electrolito desde el interior hacia el exterior de las células
causando un escape de electrolitos que alivia el estrés osmótico.
Pueden utilizarse los protectores por el frío, solos o como mezclas
elaboradas con compuestos penetrantes y/o no penetrantes en
concentraciones para transfusiones para proteger los hematíes de
los daños causados por la formación de cristales de hielo durante el
ciclo de congelación/descongelación.
Por ejemplo, puede mostrarse mediante la
comparación de los siguientes porcentajes de hemólisis de
descongelación que las combinaciones de concentraciones para
transfusiones de protectores por el frío permite mayor protección
de la hemólisis que un único agente protector por el frío: 7,5% de
dextrano, 11,19% de hemólisis; 2% de pirrolidona de polivinilo,
47,39% de hemólisis; 5% de almidón de hidroxietilo, 43,17% de
hemólisis; 7,5% de dextrano y 2% de pirrolidona de polivinilo,
6,42% de hemólisis; 7,5% de dextrano y 5% de almidón de
hidroxietilo, 8,56% de hemólisis; 2% de pirrolidona de polivinilo y
5% de almidón de hidroxietilo, 23,46% de hemólisis y finalmente
7,5% de dextrano, 2% de pirrolidona de polivinilo y 5% de almidón
de hidroxetilo, 4,44% de hemólisis.
Un compuesto de almacenamiento de hematíes de la
presente invención incluye un compuesto de almacenamiento, un
compuesto de hematíes y un compuesto de reactivos bioquímicos,
estando presentes los reactivos en una concentración tal que
impida la hemólisis de los hematíes durante el ciclo de
congelación/descongelación y una concentración que aumente la
actividad funcional in vitro cuando se compare con los
hematíes conservados bajo las mismas condiciones pero con ausencia
de los reactivos bioquímicos. Tal como se utiliza el término aquí y
en las reivindicaciones el "compuesto de almacenamiento"
pretende significar un fluido farmacológicamente inerte en el cual
pueden suspenderse los hematíes y que no tenga efectos adversos
sobre las capacidades de conservación de los compuestos aquí
descritos, por ejemplo el suero fisiológico. Puede fijarse como
objetivo de estabilización bioquímica que mantenga los componentes
metabólicos, potencial antioxidante, distribución iónica
intracelular, fluidez e integridad de la membrana de la estructura
citoesquelética. Además, los pasos de segundo mensajero
específicos, tales como cicloxigenasa, lipoxigenasa, monofosfato de
hexosa y pasos de fosforilación, pueden ser manipulados
directamente mediante reactivos bioquímicos o indirectamente a
través de la regulación de las moléculas de mensajero específico
incluyendo el monofosfato de adenosina cíclica,
(c-AMP), monofosfato de guanina cíclica,
(c-GMP), calcio intracelular, trifosfato de inositol
y diacilglicerol.
En un modo preferido de realización, los
modificadores que actúan a través del paso del segundo mensajero,
se seleccionan de monofosfato cíclico adenosina,
(c-AMP), monofosfato guanina cíclica,
(c-GMP), calcio intracelular, trifosfato de
inositol y diacil glicerol. Pueden añadirse reactivos para mantener
o mejorar las concentraciones intracelulares de ATP tales como
glucosa, piruvato, o fosfato inorgánico al igual que bloquear las
ATPasas de ATP-depleción tales como la inhibición de
la amilorida del intercambiador Na+/H+. Puede lograrse la
prevención de daños por oxidación en la membrana o hemoglobina
mediante la adición de antioxidantes tales como tocoferol,
ascorbato y bioflavonoides al igual que a través de la estimulación
del paso del monofosfato de hexosa por medio de ribosa. Puede
regularse la distribución iónica a través de la activación o
inhibición de bombas de iones específicas. Puede controlarse el
calcio con nifedipina o verapamil mientras que la amilorida
realizará la regulación del sodio como se ha indicado anteriormente.
Asimismo, puede mantenerse la distribución iónica del potasio y
del cloruro a través de la inhibición del cotransportador de K+/Cl-
con bumetanida. Pueden regularse los pasos de la cicloxigenasa y
lipoxigenasa mediante la adición de flurbiprofeno o aspirina
mientras que los acontecimientos de fosforilación pueden
manipularse a través de la inhibición por inhibidores de cinasa
tales como
H7(1-[5-isoquinolinilsulfonil]-2-metilpiperacina),
estaurosporina o queleritrina o estimularse mediante
diacilglicerol palmitoil carnitina. Se controlan la estabilización y
fluidez de la membrana mediante la adición de pentoxifilina,
nicotinamida o amantadina y puede mantenerse la estructura
citoesquelética mediante la estabilización de la actina utilizando
TAXOL o citocalasinas o la estabilización de la espectrina con
poliaminas. Pueden activarse los pasos de segundo mensajero
regulado por nucleótido cíclico específico, mediante el uso de
donantes de otros óxidos nítricos (c-GMP
elevados).
En otro modo preferido de realización, los
reactivos bioquímicos son: nifedipina en una concentración de 500
\muM, citocalasina B en una concentración de 20 \muM, Taxol en
una concentración de 500 \muM, pentoxifilina en una
concentración de 5 mM, y flurbiprofeno en una concentración de 25
\mug/ml. El compuesto de almacenamiento de hematíes del presente
modo de realización puede incluir asimismo un agente crioprotector,
puede seleccionarse el agente protector de frío de sulfóxido de
dimetilo, pirrolidona de polivinilo, maltodextrinas de dextrano,
2,3-butandiol, almidón de hidroxietilo,
polietilenglicol, glucosa y combinaciones de los mismos. De
preferencia, los agentes protectores por el frío son: dextrano en
una concentración del 7.5%, pirrolidona de polivinilo en una
concentración del 2%; sulfóxido de dimetilo en una concentración de
2,5%; almidón de hidroxietilo en una concentración del 5%, y
polietilenglicol en una concentración del 5%. El almacenamiento
prolongado de hematíes debiera realizarse a una temperatura
inferior a la temperatura fisiológica normal de los hematíes. En
un modo de realización, la temperatura es de -10ºC a -193ºC. En
otro modo de realización, la temperatura por debajo de dicha
temperatura normal de los hematíes es 80ºC. (sic).
Los siguientes ejemplos demuestran la capacidad
de estabilización bioquímica para mejorar la conservación de los
hematíes a temperaturas inferiores a -10ºC. Se describen las dos
soluciones protectoras por el frío con base de glicerol y base
polimérica para transfusiones.
Se incluyen los ejemplos para demostrar los modos
de realización preferidos de la invención. Los técnicos en la
materia observarán que las técnicas descritas en los siguientes
ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para que
funcionen correctamente en la puesta en práctica de la invención, y
por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos
para la dicha práctica. No obstante, los técnicos en la materia, a
la luz de la presente descripción, apreciarán que son posibles
muchos cambios en los modos de realización específicos que se
describen en los ejemplos y que siguen teniendo un resultado
parecido o similar sin salirse del concepto y ámbito de la
invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
El siguiente ejemplo demuestra los daños
producidos durante el ciclo de congelación/descongelación cuando
disminuye la concentración de glicerol. Se observa que un porcentaje
significativo de daños hemolíticos es reversible mediante la
adición de una solución de conservación que contenga adenina,
glutamina, cloruro sódico, manitol y dextrosa, siendo el aditivo
esencial la dextrosa, y las concentraciones finales de 5 mM de
pentoxifilina y 25 \mug/ml de flurbiprofeno en DMSO como
portador.
Específicamente, se añadieron 50 ml de hematíes
empacados en una bolsa de congelación de PVC con un volumen máximo
de 150 ml. Se mezclo la solución salina isotónica o conservante que
contenía los reactivos bioquímicos adicionales pentoxifilina y
flurbiprofeno con los hematíes. Se añadió lentamente un volumen de
Glycerolyte 57 (Fenwall) hasta que se logró la concentración final
de glicerol. El volumen total de todas las adiciones fue de 50 ml,
haciendo que se lograra la concentración final de la unidad de
hematíes de 100 ml. Se congelaron las bolsas de PVC a -80ºC durante
2-7 días y se descongelaron sumergiéndolas en un
baño de agua de 37ºC durante 10 minutos. Se determinó el nivel de
hemólisis de descongelación como relación de hemoglobina libre
respecto de la hemoglobina total. Los niveles de hemólisis de
descongelación están representados a continuación en la Tabla
1.
| % Hemólisis | |
| 40% Glicerol | 1,91 |
| 30% Glicerol | 3,53 |
| 20% Glicerol | 35,29 |
| 20% + aditivos | 14,87 |
Estos resultados confirman la pérdida de
protección de los hematíes con concentraciones reducidas de
glicerol y la capacidad de los reactivos bioquímicos para
proporcionar una protección por el frío con concentraciones de
glicerol que por sí solas fueron incapaces de proteger totalmente
los glóbulos rojos durante la conservación por el frío.
El siguiente ejemplo demuestra adicionalmente que
el daño inducido durante el ciclo de congelación/desconge-
lación cuando disminuye la concentración de glicerol, después de congelar y almacenar a -80ºC los hematíes. Se añadieron 50 ml de hematíes empacados a una bolsa de congelar de PVC. Se mezclo solución salina isotónica o de conservación que contenía los reactivos bioquímicos adicionales de interés con los hematíes. Se trataron las muestras como sigue antes de congelar a -80ºC:
lación cuando disminuye la concentración de glicerol, después de congelar y almacenar a -80ºC los hematíes. Se añadieron 50 ml de hematíes empacados a una bolsa de congelar de PVC. Se mezclo solución salina isotónica o de conservación que contenía los reactivos bioquímicos adicionales de interés con los hematíes. Se trataron las muestras como sigue antes de congelar a -80ºC:
1. 40% de Glicerol
2. 20% de Glicerol
3. Nicotinamida
4. Niketamida, Nifedipina
5. Niketamida, Nifedipina, Pentoxifilina,
Flurbiprofeno
6. Nicotinamida, Niketamida, Nifedipina,
Pentoxifilina, Flurbiprofeno.
Se añadió un volumen de Glycerolyte 57 (Fenwall)
lentamente hasta lograr la concentración final de glicerol. El
volumen total de todas las adiciones fue de 50 ml, haciendo que el
volumen final de la unidad de hematíes fuera de 100 ml. Se
congelaron las bolsas de PVC a -80ºC durante 2-7
días y se descongelaron sumergiéndolas en un baño de agua a 37ºC
durante 10 minutos. Se determinó el nivel de hemólisis de
descongelación como relación de hemoglobina libre respecto a la
hemoglobina total. Asimismo, se eliminó el glicerol de las unidades
de glóbulos rojos mediante dilución seriada con solución salina
similar a la de los protocolos de los bancos de sangre. Se
determinaron igualmente la hemólisis total y los niveles de
hemoglobina libre residual final.
La tabla 2 compara 40% de glicerol con 20% de
glicerol y 20% con los aditivos indicados. Los aditivos utilizados
incluían nicotinamida, niketamida, nifedipina, pentoxifilina y
flurbiprofeno. Los resultados de 20% de glicerol con todos los
aditivos cumplen los criterios para una unidad de sangre para
transfusión basados en la hemólisis total y los niveles de
hemoglobina libre residual. Estos resultados confirman la pérdida
de protección de los hematíes con concentraciones reducidas de
glicerol y la capacidad de los reactivos bioquímicos para
proporcionar la protección por el frío con concentraciones de
glicerol que por sí solas son incapaces de proteger totalmente el
hematíe durante la conservación por el frío.
| Estabilización bioquímica con protector por el frío basado en glicerol | |||
| Condición | Descongelación | Hemólisis(%) total | Final |
| 40% Glicerol | 2,01 | 14,1 | 0,45 |
| 20% Glicerol | 9,39 | 41,48 | 1,09 |
| Nicotinamida | 8,13 | 22,93 | 0,43 |
| Niketamida/Nifedipina | 9,65 | 37,23 | 0,8 |
| Niketamida/Nifedipina | |||
| Pentoxifilina/Flurbiprofeno | 9,94 | 34,48 | 0,69 |
| Nicotinamida Niketamida/Nifedipina | |||
| Pentoxifilina/Flurbiprofeno | 9,07 | 17,84 | 0,33 |
El siguiente experimento demuestra la capacidad
de la adición bioquímica para facilitar protección contra los
daños durante la conservación por el frío. El modelo utilizado es un
sistema de conservación por el frío de glicerol reducido. Se
añade 10% (p/v) a la unidad antes de descongelar a -80ºC. Un nivel
significativo de hemólisis tiene lugar de modo que se pueda
distinguir la protección por el reactivo añadido.
Se obtuvo una única unidad de hematíes empacados
en ADSOL utilizando protocolos standard de bancos de sangre. Se
eliminó el ADSOL por centrifugación y se añadió un volumen de
solución de conservación hasta que el hematocrito resultante fuera
de aproximadamente el 50%. De esta unidad de hematíes, se colocaron
50 ml de hematíes en cada una de las 3 bolsas de congelación de PVC
que tenían un volumen máximo de 150 ml. Se añadió un volumen igual
(50 ml) a cada una de las bolsas compuestas de la solución de
conservación citada y condiciones experimentales. La composición
final de la primera bolsa fue del 10% (p/v) de glicerol. La segunda
contuvo 10% (p/v) de glicerol y 2,5% de DMSO y 500 \muM de
nifedipina. Se congelaron las bolsas a -80ºC durante
2-7 días y se descongelaron sumergiéndolas en un
baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Se determinó el nivel de
hemólisis de descongelación como relación de hemoglobina libre
respecto de la hemoglobina total. Adicionalmente, se eliminó el
glicerol de las unidades de hematíes descongelados mediante
dilución seriada con solución salina de modo similar a los
protocolos de banco de sangre. Se determinó igualmente la hemólisis
total. Los resultados están representados en la Tabla 3 que
sigue.
| % Hemólisis | ||
| Descongelación | Total | |
| 10% Glicerol | 61,71 +/- 1,26 | 93,62 +/- 1,28 |
| c/2,5% DMSO | 59,45 +/- 0,90 | 81,86 +/- 2,72 |
| c/500 \muM Nifedipina | 55,12 +/- 1,58 | 70,94 +/- 2,96 |
Este ejemplo confirma asimismo la capacidad de la
modulación bioquímica para mejorar la protección por el frío con
concentraciones de glicerol que normalmente dan por resultado que
casi el 100% de los glóbulos rojos estén inadecuadamente protegidos
durante los ciclos de congelación/descongelación.
Este ejemplo demuestra la capacidad de la
estabilización bioquímica para mejorar la crioconservación de los
hematíes en conjunción con un protector por el frío con base de
glicerol. Se transfirió una parte alícuota de sangre a una bolsa
de almacenamiento de PVC, a la cual se habían añadido agentes
experimentales. Se añadió entonces el glicerol hasta lograr el
glicerol final deseado. Se congeló esta unidad a -80ºC, se almacenó
y descongeló en un baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Se
eliminó el glicerol mediante dilución seriada y centrifugación con
solución salina al 12%, 1,6% y 0,9% hasta que la hemoglobina libre
residual fuera inferior al 2% del contenido de hemoglobina
total.
La Tabla 4 muestra los resultados según el
procedimiento deseado. Los valores indican el porcentaje de
hemólisis en la muestra descongelada, la cantidad total de hemólisis
después del lavado y el porcentaje de hemoglobina libre residual
en la muestra final. Se calcula la hemólisis como relación de la
hemoglobina libre respecto al contenido de hemoglobina total en la
muestra.
| Condición | % Hemólisis | |
| Descongelación | Total | |
| 40% Glicerol | 1,9 | 6,1 |
| 20% Glicerol con Control | 37,9 | 52,0 |
| 20% Glicerol con Pentoxifilina | 20,6 | 27,6 |
| 20% Glicerol con Nifedipina | 20,2 | 38,5 |
| 20% Glicerol con Amilorida | 23,6 | 58,7 |
| 20% Glicerol con Flurbiprofeno | 22,9 | 46,9 |
| 20% Glicerol con Pentoxifilina Flurbiprofeno | 12,5 | 19,3 |
| 20% Glicerol con Niketamida | 11,0 | 17,0 |
| 20% Glicerol con Nicotinamida | 4,2 | 7,8 |
| 20% Glicerol con Niketamida Nifedipina Nicotinamida | 7,8 | 14,0 |
El siguiente ejemplo demuestra que la
estabilización bioquímica utilizando reactivos no protectores por
el frío reduce el nivel de hemólisis cuando se utilizan agentes
poliméricos alternativos como protectores por el frío primarios,
cuando se congela por inmersión la sangre roja y se almacena
a continuación a -80ºC. Se mezcló un volumen de glóbulos rojos
empacados con un volumen igual de solución de conservación que
contenía los protectores por el frío deseados y cualquier reactivo
bioquímico adicional. Las concentraciones finales de protectores
por el frío utilizadas fueron 7,5% de dextrano (Dex: 40.000 MW) y
2% de pirrolidona de polivinilo (PVP; 40.000 MW). Las muestras de
hematíes que contenían protectores por el frío fueron sumergidas
en nitrógeno líquido durante 3 minutos para que se congelaran y se
trasladaron de inmediato a un congelador a -80ºC para un
almacenamiento de mayor duración. Tras un almacenamiento durante
3-7 días, se descongelaron las muestras en un baño
de agua de 37ºC, y se determinó el nivel de hemólisis de
descongelación como relación de hemoglobina libre respecto de la
hemoglobina total. Asimismo, se eliminó el glicerol de las unidades
de hematíes descongeladas mediante dilución seriada con solución
salina de forma similar a los protocolos para bancos de sangre. Se
determinaron igualmente la hemólisis total y la hemoglobina libre
residual final.
La Tabla 5 representa la estabilización
bioquímica con un protector por el frío con base polimérica y el
porcentaje resultante de hemólisis. Todas las muestras contenían
7,5% de Dex y 2% de PVP, 2,5% de sulfóxido de dimetilo como
portador bioquímico, antes del almacenamiento a -80ºC, además del
aditivo indicado, como sigue:
1. DMSO
2. Nifedipina
3. Citocalasina, Taxol
4. Nifedipina, Pentoxifilina, Flurbiprofeno
5. Nifedipina, Citocalamina, Taxol.
Los reactivos utilizados incluyen 500 \muM de
nifedipina, 20 \muM de citocalasina B, 500 \muM de Taxol, 5 mM
de pentoxifilina y 25 \mug/ml de flurbiprofeno en varias
combinaciones.
Este ejemplo confirma además la capacidad de la
modulación bioquímica para mejorar la protección por el frío con
concentraciones de glicerol que normalmente dan por resultado que
casi el 100% de los hematíes sean inadecuadamente protegidos
durante los ciclos de congelación/descongelación y lavado. La
estabilización bioquímica con un protector por el frío polimérico y
porcentaje resultante de hemólisis están representados en la
Tabla 5.
| Estabilización bioquímica con protector por el frío con base polimérica | |
| Condición | % de Hemólisis |
| DMSO | 23,17 +/- 0,58 |
| Nifedipina | 14,36 +/- 0,45 |
| Citocalasina/Taxol | 15,01 +/- 0,70 |
| Nifedipina Pentoxifilina/Flurbiprofeno | 11,46 +/- 0,44 |
| Nifedipina/Citocalasina/Taxol | 11,66 +/- 0,37 |
El ejemplo siguiente describe un experimento para
medir la estabilización bioquímica y la lesión hemolítica
posterior a la descongelación con ocasión de la dilución, análoga a
la transfusión, después de congelar sumergiéndolos los hematíes y
almacenarlos a -80ºC. No se habla normalmente sobre este tipo de
lesión durante el almacenamiento pero se observa con la mayoría de
las soluciones crioprotectoras no basadas en glicerol. Se mezcló
un volumen de hematíes empacados con igual volumen de solución de
conservación que contenía los protectores por el frío deseados y
cualquier reactivo bioquímico adicional. Utilizando solución
aditiva protectora por el frío (CPA) que contenía 7,5% de dextrano
(Dex: 40.000 MW), 2% de pirrolidona de polivinilo (PVP: 40.000
MW), 5% de almidón de hidroxietilo (HES) y 5% de polietilenglicol
(PEG), se sumergieron las muestras de hematíes que contenían
protectores por el frío en nitrógeno líquido durante 3 minutos para
congelarlos y se trasladaron de inmediato a un congelador de -80ºC
para un almacenamiento más largo. Después del almacenamiento, se
dividieron las muestras descongeladas en dos partes alícuotas. Se
analizó de inmediato la primera parte alícuota y se incubó la otra
parte alícuota a 4ºC durante 3 horas antes del análisis. Las
valoraciones a punto final analizadas incluían la hemólisis en una
muestra descongelada y la hemólisis adicional que tenía lugar con
ocasión de la dilución 1:1 con una de las dos soluciones diluyentes
diferentes, PBS o plasma de isotipo.
En la Tabla 6, se observa la estabilidad de los
hematíes después de la descongelación, se observan los valores de
descongelación y el efecto beneficioso de la incubación a 4ºC en
los valores de hemólisis inducida por la dilución. Lo más
importante es la capacidad de los aditivos bioquímicos para mejorar
la protección durante el protocolo. Se utilizaron aditivos
bioquímicos para estabilizar las células después de la
descongelación y demostrar este efecto disminuyendo la hemólisis
inducida por la dilución. De este modo, se observa aquí que los
daños a los hematíes durante la conservación por el frío son
parcialmente reversibles y evitables o corregibles con la adición
de productos bioquímicos. Las condiciones de tratamiento fueron las
siguientes:
1. Sólo CPA
2. CPA + 50 mM de Ribosa
3. CPA + 50 mM de Ribosa
50 mM de Trealosa
500 \muM de Nifedipina
5 mM de Pentoxifilina
50 \mug/ml de Flurbiprofeno.
| Estabilización bioquímica contra hemólisis posterior a la descongelación | |||
| Condición | Inmediato | 4ºC | |
| PBS | PBS \hskip1cm Plasma | ||
| Plasma | |||
| Sólo CPA | Descongelación | 2,15 | 2,23 |
| (%) | 6,39 | 4,55 | |
| Dilución (%) | 5,57 | 3,73 | |
| CPA + Ribosa | Descongelación | 1,62 | 2,05 |
| (%) | 8,94 | 5,85 | |
| Dilución (%) | 6,60 | 3,85 | |
| CPA + Todos los aditivos | Descongelación | 2,71 | 2,56 |
| (%) | 3,53 | 2,62 | |
| Dilución (%) | 3,23 | 2,26 |
El siguiente experimento demuestra la capacidad
de los protectores por el frío alternativos con bajas
concentraciones para transfusiones para actuar combinados para
mejorar la protección contra la hemólisis inducida por
congelación/descongelación.
Se obtuvo una sola unidad de hematíes empacados
que contenía ADSOL y se preparó utilizando protocolos standard
para bancos de sangre. Se eliminó el ADSOL por centrifugación y se
añadió un volumen de solución de conservación. Se mezcló un volumen
de la unidad de hematíes resultante con un volumen igual de
solución de conservación que contenía el/los protector(es)
por el frío deseado(s). Las concentraciones finales de
protectores por el frío utilizadas fueron 7,5% de dextrano (Dex.
40.000 MW), 2% de pirrolidona de polivinilo (PVP: 40.000 MW) y 5%
de almidón de hidroxietilo (HES). Las muestras de glóbulos rojos que
contenían protectores por el frío fueron sumergidas en nitrógeno
líquido durante tres minutos para que se congelaran y se
trasladaron de inmediato a un congelador de -80ºC para un
almacenamiento ampliado. Tras el almacenamiento durante
3-7 días, se descongelaron las muestras a 37ºC en
un baño de agua, y se determinó el nivel de hemólisis de
descongelación tal como se describe como la relación de hemoglobina
libre respecto de la hemoglobina total. Los niveles de hemólisis
de descongelación están representados en la Tabla 7 que sigue.
| % de Hemólisis | |
| Dex | 11,19 +/- 0,38 |
| PVP | 47,39 +/- 2,42 |
| HES | 43,17 +/- 10,1 |
| Dex/PVP | 6,42 +/- 1,38 |
| Dex/HES | 8,56 +/- 0,82 |
| PVP/HES | 23,46 +/- 4,84 |
| Dex/PVP/HES | 4,44 +/- 0,04 |
Este ejemplo confirma que las concentraciones
extremadamente bajas de protectores por el frío para transfusiones
pueden funcionar combinadas para proteger los hematíes durante la
conservación por el frío mucho mejor que cualquier protector por
el frío por sí solo.
A la vista de la descripción que antecede, un
experto en la materia comprenderá y apreciará que un modo de
realización ilustrativo de la presente invención incluye un
compuesto de hematíes que incluye un compuesto de hematíes, un
compuesto para el almacenamiento y una combinación de reactivos que
alteren la bioquímica, estando presentes los reactivos que alteran
la bioquímica a una concentración tal que reduzca el porcentaje
de hemólisis de los hematíes durante el ciclo de
congelación-descongelación por debajo del
porcentaje de hemólisis de los hematíes en ausencia de reactivos
que alteren la bioquímica. Se seleccionan de preferencia los
reactivos del presente modo de realización ilustrativo de:
modificadores de componente glicólicos/metabólicos, modificadores
de potencial de antioxidación, efectores de distribución iónica
intracelular, modificadores de fluidez de la membrana,
modificadores de la estructura citoesquelética, efectores de paso
de segundo mensajero de ciclooxigenasa, efectores del paso de
segundo mensajero de lipoxigenasa, efectores de paso de segundo
mensajero de monofosfato de hexosa, efectores de paso de segundo
mensajero de fosforilación, modificadores de paso de segundo
mensajero regulado por nucleótido cíclico. Con mayor preferencia,
los reactivos del presente modo de realización ilustrativo se
seleccionan de modo que: el modificador de potencial de
antioxidación sea seleccionado entre el tocoferol, ascorbato,
\alpha-tocoferol, bioflavonoides, y derivados de
bioflavonoides incluyendo rutina, quercetina y curcumina; el
efector de la distribución iónica intracelular que actúa a través
del paso de segundo mensajero se selecciona entre nifedipina,
nisoldipina, benzamil, glibenciamida, clotrimizole de ditiazem,
tetrametilamonio difenilhidantoina, ácido disulfónico
4,4-diisotiocianatstilbene-2,2',
verapamil, amilorida, bumetanida,
N-(6-aminohexilo)-5-cloro-1-naftaleno
sulfonamida y derivados de los mismos; el modificador de fluidez
de la membrana se selecciona entre pentoxifilina, nicotinamida,
amantadina, carnitina, palmitoil carnitina, esfingosina,
dietilnicotinamida, (niketamida), trealosa, valinomicina, procaina,
tetracaina, rimantadina, propanolol e inhibidores de proteasa,
tales como la leupeptina; el modificador de la estructura
citoesquelética se selecciona entre TAXOL, citocalasinas,
paclitaxel, ácido okadáico y poliaminas tales como espermidina o
putrecina; el efector de los pasos de segundo mensajero de
ciclooxigenasa y de lipoxigenasa se selecciona entre
flurbiprofeno, ácido salicíclico e indometacina; el efector del paso
de segundo mensajero de monofosfato de hexosa se selecciona entre
ribosa o piruvato; el efector del paso de segundo mensajero de
fosforilación se selecciona entre H7
(1-[5-isoquinolinilsulfonil]-2-metilpiperazina),
estaurosporina, queleritrina y diaglicerol palmitoil carnitina; y
el modificador del paso de segundo mensajero de nucleótido cíclico
se selecciona entre dibutil AMP, dibutil GMP.
Puede formularse igualmente la composición
ilustrativa de modo que los reactivos que alteran la bioquímica
estén combinados con uno o más agentes protectores por el frío. En
un modo preferido de realización, el agente protector por el frío
puede ser un crioprotector permanente, de preferencia puede
seleccionarse el protector por el frío permanente entre glicerol,
sulfóxido de dimetilo, 2,3.butandiol,
1,2-propandiol, 1,3-propandiol,
polipropilenglicol, N,N-dimetilacetamida y
1,3,5-trimetil pentanetriol y combinaciones de los
mismos. Alternativamente, pueden formularse los compuestos de modo
que el agente protector por el frío sea un protector por el frío
no permanente, el cual puede seleccionarse de preferencia entre
almidón hidroxietilo, dextrano, pirrolidona de polivinilo,
polietileno, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.
También puede utilizarse una combinación de uno o más protectores
por el frío permanentes y uno o más protectores por el frío no
permanentes en la formulación del presente modo de realización
ilustrativo. Cuando la formulación incluya un protector por el frío
no permanente, se prefiere que el protector por el frío no
permanente tenga un peso molecular de al menos unos 5.000 MW.
Debiera formularse el modo de realización
ilustrativo de modo que los reactivos bioquímicos estén presentes
en una concentración tal que, con ocasión de la conservación in
vitro de hematíes a una temperatura inferior a la temperatura
fisiológica normal de los hematíes, durante un período de unos
2-7 días, los hematíes presenten una hemólisis
menor durante el ciclo de congelación-descongelación
y una actividad funcional in vitro mayor cuando se compare
con los hematíes conservados en las mismas condiciones pero en
ausencia de los reactivos bioquímicos. De este modo, en un modo de
realización preferido del presente modo de realización ilustrativo
la nifedipina tiene una concentración de 500 \muM, la citocalasina
B tiene una concentración de 20 \muM, el Taxol tiene una
concentración de 500 \muM, la pentoxifilina tiene una
concentración de 5 mM, el flurbiprofeno tiene una concentración de
25 \mug/ml, la niketamida tiene una concentración de (1% v/v),
la ribosa tiene una concentración de 50 mM y la trealosa tiene una
concentración de 50 mM.
Tiene que observarse igualmente que la presente
invención incluye un método para almacenar hematíes humanos que
incluye: (a) aislar los hematíes de sangre humana fresca; (b)
formar un compuesto de hematíes; y (c) almacenar el compuesto de
hematíes resultante a una temperatura inferior a la temperatura
fisiológica normal humana eficaz para conservar las células
sanguíneas durante un período de tiempo seleccionado. De
preferencia, el compuesto de hematíes debiera formularse de modo que
incluya: hematíes; un compuesto de almacenamiento; y un compuesto
de reactivos. El compuesto de reactivos debiera seleccionarse
entre: modificadores de componentes metabólicos, modificadores de
potencial antioxidante, efectores de distribución iónica
intracelular; modificadores de fluidez de la membrana;
modificadores de la estructura citoesquelética, efectores del paso
de segundo mensajero de ciclooxigenasa; efectores del paso de
segundo mensajero de lipoxigenasa; efectores de paso de segundo
mensajero de monofosfato de hexosa, efectores de paso de segundo
mensajero de fosforilación, modificadores de paso de mensajero
regulado por nucléotido cíclico, y combinaciones de los mismos. En
la práctica del presente método ilustrativo, la temperatura
inferior a la temperatura fisiológica normal eficaz para conservar
los hematíes durante períodos seleccionados de tiempo es de
preferencia de -10 a -193ºC, y con mayor preferencia de -80ºC.
Todos los compuestos y métodos descritos y
reivindicados aquí pueden realizarse y ejecutarse sin excesiva
experimentación a la luz de la presente descripción.
Claims (14)
1.Compuesto de hematíes que comprende:
(a) hematíes,
(b) una combinación de reactivos de modificación
bioquímica, seleccionados del grupo constituido por pentoxifilina,
flurbiprofeno, nicotinamida, niketamida, nifedipina, amilorida,
taxol, citocalasina B, trealosa y ribosa, y
(c) uno o varios agentes protectores por el
frío,
y que comprende además un compuesto para
almacenamiento; y que comprende opcionalmente un inhibidor de
proteasa y/o un bioflavonoide o un derivado de bioflavonoide.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
cual el agente protector por el frío es un protector por el frío
que puede penetrar en las membranas de las células, seleccionado del
grupo constituido por glicerol, dimetilsulfóxido,
2,3-butandiol, 1,2-propandiol,
1,3-propandiol, polipropilenglicol,
N,N-dimetilacetamida,
1,3,5-trimetilpentanetriol y las combinaciones de
éstos.
3. Compuesto según la reivindicación 1, en el
cual el agente protector por el frío es un protector por el frío
que no penetra en las membranas de las células, seleccionado del
grupo constituido por almidón hidroxietilo, dextrano, pirrolidona
de polivinilo, polietileno, polietilenglicol y las combinaciones de
éstos.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el
cual el protector por el frío que no penetra en las membranas de
las células, presenta un peso molecular de al menos 5000 MW.
5. Compuesto según la reivindicación 1, en el
cual uno o varios agentes protectores por el frío comprenden una
combinación de uno o varios protectores por el frío que penetran
en la membrana de las células y uno o varios agentes protectores
por el frío que no penetran en la membrana de las células.
6. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual el inhibidor de proteasa es la
leupeptina.
7. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el cual se selecciona un derivado de un
bioflavonoide del grupo constituido por rutina, quercetina y
curcumina.
8. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende nifedipina, citocalasina B,
taxol, pentoxifilina, flurbiprofeno, niketamida, trealosa y
ribosa.
9. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la cual la nifedipina tiene una
concentración de 500 \muM, la citocalasina B tiene una
concentración de 20 \muM, el taxol tiene una concentración de
500 \muM, la pentoxifilina tiene una concentración de 5 mM, el
flurbiprofeno tiene una concentración de 25 \mug/ml, de
niketamida tiene una concentración de 1% (v/v), la ribosa tiene una
concentración de 50 mM y la trealosa tiene una concentración de 50
mM.
10. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el cual los reactivos de modificación
bioquímica están presentes en una concentración tal que, con ocasión
de la conservación in vitro de los hematíes a una
temperatura por debajo de la temperatura fisiológica de los hematíes
durante un periodo de 2 a 7 días, los hematíes presentan una menor
hemólisis durante un ciclo de congelación- descongelación y una
mayor actividad funcional in vitro en comparación con los
hematíes conservados en las mismas condiciones pero en ausencia de
los reactivos de alteración bioquímica.
11. Un método destinado al almacenaje prolongado
de hematíes que comprende la creación del compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y el almacenamiento del
compuesto a una temperatura por debajo de la temperatura
fisiológica normal de los hematíes.
12. El método según la reivindicación 11, en el
cual la temperatura por debajo de la temperatura fisiológica
normal de los hematíes es de -10ºC a -193ºC.
13. El método según la reivindicación 11 ó 12, en
el cual la temperatura por debajo de la temperatura fisiológica
normal de los hematíes es de -80ºC.
14. El método según la reivindicación 11, en el
cual los hematíes son aislados de la sangre humana antes de la
elaboración del compuesto.
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