DD238304A3

DD238304A3 - Verfahren zur erhoehung der lagerungsstabilitaet von blutwellen und sperma

Info

Publication number: DD238304A3
Application number: DD26022084A
Authority: DD
Inventors: Gerd Matthes; Hans A Hackensellner; Thomas Montag
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1984-01-13
Filing date: 1984-01-13
Publication date: 1986-08-20

Abstract

Verfahren zur Erhoehung der Lagerungsstabilitaet von biologischem Material zum Zwecke der Vorrathaltung. Hauptanwendungsgebiete sind die Medizin, Veterinaermedizin/Tierproduktion und Biologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Erhaltung der strukturellen und funktionellen Integritaet von Blutzellen und Sperma im Rahmen der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch eine Erhoehung der Membranstabilitaet zu erreichen. Das Wesen der Erfindung beruht auf der Zugabe von Penicillin bzw. Penicillin-Derivaten in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0 g/l zum Konservierungsmedium, und Zusaetzen von Eisen-II-Ionen, in Konzentrationen von 10-40 mol/l mit der das biologische Material behandelt wird. Die erreichte deutliche Steigerung des Ueberlebens von Zellen, Geweben und Organen in einem Medium mit derartigen Zusaetzen verspricht ueberall dort bedeutende oekonomische Auswirkungen, wo vitales biologisches Material zum Zwecke der Wiederverwendung zur Verfuegung stehen muss.

Description

Die Verträglichkeit der Verbindungen mit biologischem Material ist nachgewiesen. Die erfindungsgemäß erreichte Steigerung des Überlebens von Blutzellen und Spermien in einem Medium mit derartigen Zusätzen verspricht überall dort bedeutende ökonomische Auswirkungen, wo vitales biologisches Material zum Zwecke der Wiederverwendung zur Verfügung stehen muß, wie z. B. in Blutzeil- und Spermienbanken. Zurtechnisch-ökonomischen Auswirkung wird eingeschätzt, daß Erhöhungen der Überlebensrate von konsverviertem biologischen Material bis etwa auf das Mehrfache des Kontrollwertes auftreten können. Die Erfindung wird nachstehend an folgenden Ausführungsbeispielen erläutert:

I.Beispiel

Aus ACD-Vollblutkonserven wurde nach üblichen Verfahren ein Thrombozytenkonzentrat präpariert und bei 0⁰C Dimethylsulfoxid (DMSO) als basaler Gefrierschutzstoff zugesetzt (Endkonzentration 0,7mol/l). Erfindungsgemäß erfolgte zu dieser Suspension ein Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 2,0g/l und unterschiedlichen Konzentrationen von Fe (M)SO₄(0,10,20 und40/imol/l). Nach einer Inkubationszeit von 30min wurden die Proben kontrolliert (Kühlrate 1 K/min) bis -196°C gefroren und bei dieser Temperatur mindestens 24 Stunden gelagert. Nach einem schnellen Wiedererwärmen/Auftauen wurden die Proben schrittweise verdünnt und zur Vitalitätstestung (Zellzahl, HSR = hypotonic shock response, Aggregation mittels ADP bzw. Kollagen) eingesetzt. Die Tab. 1 enthält die Ergebnisse der Untersuchungen und verdeutlicht den signifikanten Anstieg der Überlebensraten unter dem Einfluß der verwendeten protektiven Wirkstoffe.

Tabelle 1:

Steigerung der Überlebensraten gefrierkonservierter Thrombozytenkonzentrate unter Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium (2g/l)und Fe(II)SO₄(0,10,20υηα40μπηοΙ/Ι)ζυΓη kryoprotektiven Medium. Angaben in Prozent Steigerung gegenüber dem Kontrollwert, η = 5.

Parameter Steigerung der Überlebensrate (%)

Zusatz von Fe(II)SO₄ (μητιοΙ/Ι) 0 (Kontrolle) 10 20 40

112,5 123,2 108,9

163,7* 166,7* 154,2*

127,7* 181,9* 182,3*

104,9 115,4 105,3

* statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05)

2. Beispiel

Bullensperma wurde unter üblichen Bedingungen gewonnen und nach TGL 22261 der Gefrierkonservierung unterzogen, wobei dem Verdünner erfindungsgemäß zusätzlich Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 1 g/l und Fe (H)SO₄ in einer Konzentration von 20μ.ιτιοΙ/Ι zugesetzt worden war. Der zur Beurteilung der Spermienvitalität verwendete Thermoresistenztest wurde unmittelbar nach dem Auftauen sowie 1,2,3 und 4 Stunden danach an den Proben durchgeführt. Die Tab. 2 stellt die Ergebnisse dar, nach denen ein signifikanter Anstieg der Spermienmotilität bei Verwendung der protektiven Wirkstoffe deutlich sichtbar wird.

Tabelle 2:

Thermoresistenzrest zur Beurteilung der Motilitätvon Bullensperma nach Lagerung bei — 196°Cmitund ohne Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 1 g/l und Fe(II)SO₄ (Endkonzentration 20μηηοΙ/1) zum Standardverdünner nachTGL22261,n = 5.

Zellzahl	100
HSR	100
Aggregation
— mit ADP	100
— mit Kollagen	100

Zeitpunkt nach	Kontrolle	Spermienmotilität (%)
dem Auftauen
(Std.)	Zusatz von
	Penicillin und Fe(II)SO₄

0 26 ±5 32 ±4*

1 23 ± 7 34 ± 4*

2 16±7 21±6

3 10±5 13±7

4 4±2 3±1

statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05)

Claims

-ι -

Erfindungsanspruch:

Verfahren zur Erhöhung der Lagerungsstabilität von Blutzellen und Sperma bei der hypothermen oder kryothermen Konservierung, gekennzeichnet dadurch, daß dem Konservierungsmedium Penicillin bzw. Penicillin-Derivate in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0g/l, vorzugsweise 1,0g/l und Eisen-Il-Ionen, in Konzentrationen von 10 ^3 40μητιοΙ/Ι, vorzugsweise 20//.mol/l, zugesetzt werden.

Anwendungsgebiete

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Lagerungsstabilität von Blutzellen und Sperma, mit dem Ziele einer Verbesserung der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch Beeinflussung der strukturellen und funktionellen Integrität des biologischen Materials, insbesondere der Stabilität von Membranen, Die Erfindung ist überall dort nutzbringend einsetzbar, wo Zellen, Gewebe und Organe vital aufbewahrt und vorrätig gehalten werden sollen, wiez. B. bei der Spermien- und Blutzellkonservierung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die hypotherme und die kryotherme Konservierung von Zellen, Geweben und Organen unter Erhaltung der Lebensfähigkeit dienen der Vorrathaltung von biologischem Material, die in Abhängigkeit von der gewählten Konservierungsart jeweils Stunden bis Tage oder Wochen (Hypothermiekonservierung) bzw. Jahre (Kryokonservierung) betragen kann. Dabei wird das biologische Material für die Hypothermiekonservierung mit einer Konservierungslösung bzw. für die Kryokonservierung mit einem kryoprotektiven Medium (= Konservierungslösung mit Zusatz von Kryoprotektiva) behandelt und nach Einhaltung bestimmter Temperaturparameter bei der gewählten Lagerungstemperatur gehalten. Bekannt sind z. B. Verfahren zur hypothermen Konservierung von Zellen (Erythrozyten: RAPOPORT, 1947; Sperma: SHERMAN, 1955), Geweben (Kornea: KAUFMANN, 1968) und Organen (Niere, HUMPHRIES, 1974). Die Kryokonservierung ist heute mit Einschränkungen möglich fürZellen (Erythrozyten: ROWE, 1965, Sperma: POLGE, 1947) und Gewebe (Kornea: O'NEILL, 1967; Spalthaut: STRUMIA, 1945). Ein bekanntes Verfahren nach DE-OS 2459582 beschreibt den Zusatz von Penicillin als Bestandteil des Verdünners im Rahmen der Kryokonservierung von Sperma, wobei die bakterizide Wirkung des Penicillins beabsichtigt ist. Im Verlaufe der Konservierung nach diesen oder ähnlichen Verfahren treten jedoch reversible und irreversible Schädigungen auf, die sich nachteilig auf das Überleben der Zellen, Gewebe und Organe auswirken. Im Mittelpunkt der durch den Vorgang der Konservierung und die nachfolgende Lagerung auftretenden Veränderungen des biologischen Materials stehen Beeinträchtigungen der Stabilität von Membranen und der Membranfunktion, die letztlich zur Begrenzung der Lagerfähigkeit führen. So findet beispielsweise im Laufe der hypothermen Konservierung von Blutzellen oder Sperma oder einer der Gefrierkonservierung sich anschließenden hypothermen Lagerung ein vermehrter Ausstrom von intrazellulären Bestandteilen statt, der auf eine Membranstörung hinweist (VALERI, 1975; AKERBLOM, 1974; SHERMAN, 1967). Damit schränken die Konservierungs- und Lagerungsschäden die Möglichkeit der Anwendung des konservierten biologischen Materials ein.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Erhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität von Blutzellen und Sperma im Rahmen der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch eine Erhöhung der Membranstabilität des biologischen Materials zu erreichen.

Es liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Lagerungsstabilität des biologischen Materials zum Zwecke der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch Zusätze von membranresistenzsteigemden chemischen Verbindungen zum Konservierungsmedium zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß dem Konservierungsmedium vor dem Kontakt mit den zu konservierenden Blutzellen und Spermien Penicillin bzw. Penicillin-Derivate in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0g/1000ml, vorzugsweise bei 1,0g/1000ml und Eisen-Il-Ionen in Konzentrationen von 10-40μηηοΙ/Ι vorzugsweise bei 20>mol/l, zugesetzt werden.

Zunächst werden Penicillin bzw. Penicillin-Derivate im Konservierungsmedium vollständig gelöst. Danach wird das biologische Material, das in herkömmlicher Weise gewonnen wurde, dem Konservierungsmedium zugegeben. Für die hypotherme Konservierung schließt sich die Lagerung im Konservierungsmediuman. Für die kryotherme Konservierung erfolgt anschließend eine kurzfristige Inkubation bei hypothermen Temperaturen zur Gefrierschutzstoffverteilung, auf die die kontrollierte Temperatursenkung bis unter -80⁰CaIs letzter Sch ritt folgt. Bei Bedarf erfolgt das Wiedererwärmen bzw. Wiedererwärmen/Auftauen des hypotherm bzw. kryotherm gelagerten biologischen Materials. Bei einer Überprüfung der strukturellen und funktionellen Integrität des biologischen Materials läßt sich eindeutig nachweisen, daß das erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren die Vitalitäts- und Funktionsfähigkeit nach Dekonservierung deutlich erhöht.