DD238304A3 - PROCESS FOR INCREASING THE STORAGE STABILITY OF BLOOD WAVES AND SPERM - Google Patents

PROCESS FOR INCREASING THE STORAGE STABILITY OF BLOOD WAVES AND SPERM Download PDF

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DD238304A3 DD26022084A DD26022084A DD238304A3 DD 238304 A3 DD238304 A3 DD 238304A3 DD 26022084 A DD26022084 A DD 26022084A DD 26022084 A DD26022084 A DD 26022084A DD 238304 A3 DD238304 A3 DD 238304A3
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Gerd Matthes
Hans A Hackensellner
Thomas Montag
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Univ Berlin Humboldt
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Abstract

Verfahren zur Erhoehung der Lagerungsstabilitaet von biologischem Material zum Zwecke der Vorrathaltung. Hauptanwendungsgebiete sind die Medizin, Veterinaermedizin/Tierproduktion und Biologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Erhaltung der strukturellen und funktionellen Integritaet von Blutzellen und Sperma im Rahmen der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch eine Erhoehung der Membranstabilitaet zu erreichen. Das Wesen der Erfindung beruht auf der Zugabe von Penicillin bzw. Penicillin-Derivaten in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0 g/l zum Konservierungsmedium, und Zusaetzen von Eisen-II-Ionen, in Konzentrationen von 10-40 mol/l mit der das biologische Material behandelt wird. Die erreichte deutliche Steigerung des Ueberlebens von Zellen, Geweben und Organen in einem Medium mit derartigen Zusaetzen verspricht ueberall dort bedeutende oekonomische Auswirkungen, wo vitales biologisches Material zum Zwecke der Wiederverwendung zur Verfuegung stehen muss.Method for increasing the storage stability of biological material for the purpose of stockpiling. Main fields of application are medicine, veterinary medicine / animal production and biology. The object of the invention is to achieve an improved preservation of the structural and functional integrity of blood cells and sperm in the context of hypothermic and / or cryothermal preservation by an increase in membrane stability. The essence of the invention is based on the addition of penicillin or penicillin derivatives in concentrations of 0.1 to 10.0 g / l to the preservation medium, and addition of ferrous ions, in concentrations of 10-40 mol / l with the biological material is treated. The significant increase in the survival of cells, tissues, and organs in a medium containing such supplements promises significant economic effects wherever vital biological material needs to be available for reuse.

Description

Die Verträglichkeit der Verbindungen mit biologischem Material ist nachgewiesen. Die erfindungsgemäß erreichte Steigerung des Überlebens von Blutzellen und Spermien in einem Medium mit derartigen Zusätzen verspricht überall dort bedeutende ökonomische Auswirkungen, wo vitales biologisches Material zum Zwecke der Wiederverwendung zur Verfügung stehen muß, wie z. B. in Blutzeil- und Spermienbanken. Zurtechnisch-ökonomischen Auswirkung wird eingeschätzt, daß Erhöhungen der Überlebensrate von konsverviertem biologischen Material bis etwa auf das Mehrfache des Kontrollwertes auftreten können. Die Erfindung wird nachstehend an folgenden Ausführungsbeispielen erläutert:The compatibility of the compounds with biological material has been proven. The invention achieved by increasing the survival of blood cells and sperm in a medium with such additives promises significant economic impact everywhere where vital biological material must be available for the purpose of reuse, such. B. in blood cells and sperm banks. For technical-economic impact, it is estimated that increases in survival of conserved biological material may occur to about several times the control value. The invention is explained below with reference to the following exemplary embodiments:

I.BeispielI.Beispiel

Aus ACD-Vollblutkonserven wurde nach üblichen Verfahren ein Thrombozytenkonzentrat präpariert und bei 00C Dimethylsulfoxid (DMSO) als basaler Gefrierschutzstoff zugesetzt (Endkonzentration 0,7mol/l). Erfindungsgemäß erfolgte zu dieser Suspension ein Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 2,0g/l und unterschiedlichen Konzentrationen von Fe (M)SO4(0,10,20 und40/imol/l). Nach einer Inkubationszeit von 30min wurden die Proben kontrolliert (Kühlrate 1 K/min) bis -196°C gefroren und bei dieser Temperatur mindestens 24 Stunden gelagert. Nach einem schnellen Wiedererwärmen/Auftauen wurden die Proben schrittweise verdünnt und zur Vitalitätstestung (Zellzahl, HSR = hypotonic shock response, Aggregation mittels ADP bzw. Kollagen) eingesetzt. Die Tab. 1 enthält die Ergebnisse der Untersuchungen und verdeutlicht den signifikanten Anstieg der Überlebensraten unter dem Einfluß der verwendeten protektiven Wirkstoffe.From ACD whole blood preserves, a platelet concentrate was prepared by conventional methods and added at 0 0 C dimethyl sulfoxide (DMSO) as a basal cryoprotectant (final concentration 0.7 mol / l). In accordance with the invention, this suspension was supplemented with benzylpenicillin sodium in a concentration of 2.0 g / l and different concentrations of Fe (M) SO 4 (0.10, 20 and 40 / g / l). After an incubation period of 30 minutes, the samples were frozen in a controlled manner (cooling rate 1 K / min) to -196 ° C and stored at this temperature for at least 24 hours. After a rapid reheating / thawing, the samples were gradually diluted and used for vitality testing (cell count, HSR = hypotonic shock response, aggregation by means of ADP or collagen). Tab. 1 contains the results of the investigations and illustrates the significant increase in survival rates under the influence of the protective agents used.

Tabelle 1:Table 1:

Steigerung der Überlebensraten gefrierkonservierter Thrombozytenkonzentrate unter Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium (2g/l)und Fe(II)SO4(0,10,20υηα40μπηοΙ/Ι)ζυΓη kryoprotektiven Medium. Angaben in Prozent Steigerung gegenüber dem Kontrollwert, η = 5.Increasing the survival rates of freeze-preserved platelet concentrates with the addition of benzylpenicillin sodium (2 g / l) and Fe (II) SO 4 (0,10,20υηα40μπηοΙ / Ι) kυΓη cryoprotective medium. Figures in percent increase over the control value, η = 5.

Parameter Steigerung der Überlebensrate (%)Parameter increase in survival rate (%)

Zusatz von Fe(II)SO4 (μητιοΙ/Ι) 0 (Kontrolle) 10 20 40Addition of Fe (II) SO 4 (μητιοΙ / Ι) 0 (control) 10 20 40

112,5 123,2 108,9112.5 123.2 108.9

163,7* 166,7* 154,2*163.7 * 166.7 * 154.2 *

127,7* 181,9* 182,3*127.7 * 181.9 * 182.3 *

104,9 115,4 105,3104.9 115.4 105.3

* statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05)* statistically significant compared to control (p <0.05)

2. Beispiel2nd example

Bullensperma wurde unter üblichen Bedingungen gewonnen und nach TGL 22261 der Gefrierkonservierung unterzogen, wobei dem Verdünner erfindungsgemäß zusätzlich Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 1 g/l und Fe (H)SO4 in einer Konzentration von 20μ.ιτιοΙ/Ι zugesetzt worden war. Der zur Beurteilung der Spermienvitalität verwendete Thermoresistenztest wurde unmittelbar nach dem Auftauen sowie 1,2,3 und 4 Stunden danach an den Proben durchgeführt. Die Tab. 2 stellt die Ergebnisse dar, nach denen ein signifikanter Anstieg der Spermienmotilität bei Verwendung der protektiven Wirkstoffe deutlich sichtbar wird.Bull sperm was obtained under standard conditions and subjected to the TGL 22261 cryopreservation, wherein the diluent according to the invention additionally benzylpenicillin sodium in a concentration of 1 g / l and Fe (H) SO 4 was added in a concentration of 20μ.ιτιοΙ / Ι. The thermoresistance test used to assess sperm vitality was performed immediately after thawing and 1,2,3 and 4 hours later on the samples. Table 2 presents the results showing that a significant increase in sperm motility is evident when using the protective agents.

Tabelle 2:Table 2:

Thermoresistenzrest zur Beurteilung der Motilitätvon Bullensperma nach Lagerung bei — 196°Cmitund ohne Zusatz von Benzylpenicillin-Natrium in einer Konzentration von 1 g/l und Fe(II)SO4 (Endkonzentration 20μηηοΙ/1) zum Standardverdünner nachTGL22261,n = 5.Thermoresistance residue for evaluation of motility of bull sperm after storage at - 196 ° C with and without addition of benzylpenicillin sodium in a concentration of 1 g / l and Fe (II) SO 4 (final concentration 20μηηοΙ / 1) to the standard diluent according to TGL22261, n = 5.

Zellzahlcell number 100100 HSRHSR 100100 Aggregationaggregation — mit ADP- with ADP 100100 — mit Kollagen- with collagen 100100

Zeitpunkt nachTime after Kontrollecontrol Spermienmotilität (%)Sperm motility (%) dem Auftauenthawing (Std.)(Hours.) Zusatz vonAddition of Penicillin und Fe(II)SO4 Penicillin and Fe (II) SO 4

0 26 ±5 32 ±4*0 26 ± 5 32 ± 4 *

1 23 ± 7 34 ± 4*1 23 ± 7 34 ± 4 *

2 16±7 21±62 16 ± 7 21 ± 6

3 10±5 13±73 10 ± 5 13 ± 7

4 4±2 3±14 4 ± 2 3 ± 1

statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (p < 0,05)statistically significant compared to control (p <0.05)

Claims (1)

-ι --ι - Erfindungsanspruch:Invention claim: Verfahren zur Erhöhung der Lagerungsstabilität von Blutzellen und Sperma bei der hypothermen oder kryothermen Konservierung, gekennzeichnet dadurch, daß dem Konservierungsmedium Penicillin bzw. Penicillin-Derivate in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0g/l, vorzugsweise 1,0g/l und Eisen-Il-Ionen, in Konzentrationen von 10 ^3 40μητιοΙ/Ι, vorzugsweise 20//.mol/l, zugesetzt werden.Method for increasing the storage stability of blood cells and sperm during hypothermic or cryothermal preservation, characterized in that penicillin or penicillin derivatives are added to the preservation medium in concentrations of 0.1 to 10.0 g / l, preferably 1.0 g / l and iron. Il ions, in concentrations of 10 ^ 3 40μητιοΙ / Ι, preferably 20 //. Mol / l, are added. Anwendungsgebieteapplication areas Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Lagerungsstabilität von Blutzellen und Sperma, mit dem Ziele einer Verbesserung der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch Beeinflussung der strukturellen und funktionellen Integrität des biologischen Materials, insbesondere der Stabilität von Membranen, Die Erfindung ist überall dort nutzbringend einsetzbar, wo Zellen, Gewebe und Organe vital aufbewahrt und vorrätig gehalten werden sollen, wiez. B. bei der Spermien- und Blutzellkonservierung.The invention relates to a method for increasing the storage stability of blood cells and sperm, with the objectives of improving the hypothermic and / or cryothermal preservation by influencing the structural and functional integrity of the biological material, in particular the stability of membranes, The invention is useful everywhere where cells, tissues and organs should be stored and kept in stock, eg. B. in sperm and blood cell preservation. Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions Die hypotherme und die kryotherme Konservierung von Zellen, Geweben und Organen unter Erhaltung der Lebensfähigkeit dienen der Vorrathaltung von biologischem Material, die in Abhängigkeit von der gewählten Konservierungsart jeweils Stunden bis Tage oder Wochen (Hypothermiekonservierung) bzw. Jahre (Kryokonservierung) betragen kann. Dabei wird das biologische Material für die Hypothermiekonservierung mit einer Konservierungslösung bzw. für die Kryokonservierung mit einem kryoprotektiven Medium (= Konservierungslösung mit Zusatz von Kryoprotektiva) behandelt und nach Einhaltung bestimmter Temperaturparameter bei der gewählten Lagerungstemperatur gehalten. Bekannt sind z. B. Verfahren zur hypothermen Konservierung von Zellen (Erythrozyten: RAPOPORT, 1947; Sperma: SHERMAN, 1955), Geweben (Kornea: KAUFMANN, 1968) und Organen (Niere, HUMPHRIES, 1974). Die Kryokonservierung ist heute mit Einschränkungen möglich fürZellen (Erythrozyten: ROWE, 1965, Sperma: POLGE, 1947) und Gewebe (Kornea: O'NEILL, 1967; Spalthaut: STRUMIA, 1945). Ein bekanntes Verfahren nach DE-OS 2459582 beschreibt den Zusatz von Penicillin als Bestandteil des Verdünners im Rahmen der Kryokonservierung von Sperma, wobei die bakterizide Wirkung des Penicillins beabsichtigt ist. Im Verlaufe der Konservierung nach diesen oder ähnlichen Verfahren treten jedoch reversible und irreversible Schädigungen auf, die sich nachteilig auf das Überleben der Zellen, Gewebe und Organe auswirken. Im Mittelpunkt der durch den Vorgang der Konservierung und die nachfolgende Lagerung auftretenden Veränderungen des biologischen Materials stehen Beeinträchtigungen der Stabilität von Membranen und der Membranfunktion, die letztlich zur Begrenzung der Lagerfähigkeit führen. So findet beispielsweise im Laufe der hypothermen Konservierung von Blutzellen oder Sperma oder einer der Gefrierkonservierung sich anschließenden hypothermen Lagerung ein vermehrter Ausstrom von intrazellulären Bestandteilen statt, der auf eine Membranstörung hinweist (VALERI, 1975; AKERBLOM, 1974; SHERMAN, 1967). Damit schränken die Konservierungs- und Lagerungsschäden die Möglichkeit der Anwendung des konservierten biologischen Materials ein.The hypothermic and the cryothermal preservation of cells, tissues and organs while preserving the viability serve the Vorhathaltung of biological material, which may be depending on the chosen Konservierungsart each hours to days or weeks (Hypothermiekonservierung) or years (cryopreservation). The biological material for Hypothermiekonservierung with a preservative solution or for the cryopreservation with a cryoprotective medium (= preservative solution with the addition of cryoprotectants) treated and maintained after observing certain temperature parameters at the selected storage temperature. Are known z. B. Methods for the hypothermic preservation of cells (erythrocytes: RAPOPORT, 1947, semen: SHERMAN, 1955), tissues (cornea: KAUFMANN, 1968) and organs (kidney, HUMPHRIES, 1974). Cryopreservation is currently possible with limitations for cells (erythrocytes: ROWE, 1965, sperm: POLGE, 1947) and tissue (cornea: O'NEILL, 1967; split-skin: STRUMIA, 1945). A known method according to DE-OS 2459582 describes the addition of penicillin as part of the diluent in the context of the cryopreservation of sperm, wherein the bactericidal action of the penicillin is intended. In the course of conservation according to these or similar methods, however, reversible and irreversible damage occurs, which adversely affects the survival of cells, tissues and organs. At the heart of the changes in the biological material resulting from the process of preservation and subsequent storage are impairments in the stability of membranes and membrane function, which ultimately limits shelf life. For example, in the course of hypothermic preservation of blood cells or sperm or subsequent cryopreservation subsequent hypothermic storage, there is an increased outflow of intracellular components indicative of membrane disruption (VALERI, 1975, AKERBLOM, 1974, SHERMAN, 1967). Thus, the preservation and storage damage limits the possibility of using the preserved biological material. Ziel der ErfindungObject of the invention Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Erhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität von Blutzellen und Sperma im Rahmen der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch eine Erhöhung der Membranstabilität des biologischen Materials zu erreichen.The object of the invention is to achieve an improved preservation of the structural and functional integrity of blood cells and sperm in the context of hypothermic and / or cryothermal preservation by increasing the membrane stability of the biological material. Es liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Lagerungsstabilität des biologischen Materials zum Zwecke der hypothermen und/oder kryothermen Konservierung durch Zusätze von membranresistenzsteigemden chemischen Verbindungen zum Konservierungsmedium zu erhöhen.It is the object of the invention to increase the storage stability of the biological material for the purpose of hypothermic and / or cryothermal preservation by adding membrane-resistant chemical compounds to the preservation medium. Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß dem Konservierungsmedium vor dem Kontakt mit den zu konservierenden Blutzellen und Spermien Penicillin bzw. Penicillin-Derivate in Konzentrationen von 0,1 bis 10,0g/1000ml, vorzugsweise bei 1,0g/1000ml und Eisen-Il-Ionen in Konzentrationen von 10-40μηηοΙ/Ι vorzugsweise bei 20>mol/l, zugesetzt werden.According to the invention the object is achieved in that the preservative medium prior to contact with the blood cells and sperm to be preserved penicillin or penicillin derivatives in concentrations of 0.1 to 10.0g / 1000ml, preferably 1.0g / 1000ml and iron-II Ions in concentrations of 10-40μηηοΙ / Ι, preferably at 20> mol / l. Zunächst werden Penicillin bzw. Penicillin-Derivate im Konservierungsmedium vollständig gelöst. Danach wird das biologische Material, das in herkömmlicher Weise gewonnen wurde, dem Konservierungsmedium zugegeben. Für die hypotherme Konservierung schließt sich die Lagerung im Konservierungsmediuman. Für die kryotherme Konservierung erfolgt anschließend eine kurzfristige Inkubation bei hypothermen Temperaturen zur Gefrierschutzstoffverteilung, auf die die kontrollierte Temperatursenkung bis unter -800CaIs letzter Sch ritt folgt. Bei Bedarf erfolgt das Wiedererwärmen bzw. Wiedererwärmen/Auftauen des hypotherm bzw. kryotherm gelagerten biologischen Materials. Bei einer Überprüfung der strukturellen und funktionellen Integrität des biologischen Materials läßt sich eindeutig nachweisen, daß das erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren die Vitalitäts- und Funktionsfähigkeit nach Dekonservierung deutlich erhöht.First, penicillin or penicillin derivatives are completely dissolved in the preservation medium. Thereafter, the biological material obtained in a conventional manner is added to the preservation medium. For hypothermic preservation, storage is followed in the preservation medium. For the cryothermal preservation followed by a short-term incubation at hypothermic temperatures for antifreeze distribution, followed by the controlled temperature reduction to below -80 0 CIs last step. If necessary, the reheating or reheating / thawing of the hypothermic or cryothermally stored biological material takes place. In a review of the structural and functional integrity of the biological material can be clearly demonstrated that the process according to the invention significantly increases the vitality and functioning after deconservation.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP4082339A1 (en) 2021-04-29 2022-11-02 Forschungsverbund Berlin e.V. Agent for preserving mammalian sperm and use of the agent

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