DE2459582A1

DE2459582A1 - Verfahren zur gewinnung von ebersamen

Info

Publication number: DE2459582A1
Application number: DE19742459582
Authority: DE
Inventors: Francois Du Mesnil Du Buisson; Marc Paquignon
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1973-12-18
Filing date: 1974-12-17
Publication date: 1975-06-26
Also published as: NL7416460A; FR2254640A1; FR2254640B1; BE822950A; GB1488397A

Description

Die Erfindung "betrifft das Gebiet der künstlichen Befruchtung insbesondere von Säuen. Sie ist insbesondere auf ein Verfahren zur Gewinnung von Ebersamen, gerichtet, der sich bei tiefer Temperatur konservieren läßt und nach dem Auftauen für die künstliche Besamung von Säuen geeignet ist und hierbei zu einer hohen Rate von Würfen führt.

Die künstliche Befruchtung von Säuen mit dem vorher durch Gefrieren konservierten Sperma, des Ebers -ist bekanntlich mit großen praktischen Schwierigkeiten verbunden. Zahlreiche Untersuchungen wurden seit etwa 10 Jahren über das Gefrieren des Eberspermas, den Anteil der beweglichen Spermatozoen nach dem Auftauen, die Rate der Würfe nach dem Auftauen sowie über die eigenliehe Technik der Besamung durchgeführt. So konnte die Aufrechterhaltung der Befruchtungsfähigkeit des gefrorenen Spermas bei der direkten Befruchtung im Eileiter auf chirurgischem Wege und der Vorteil der Einführung des Samens in die Zervix nachgewiesen werden.

Die künstliche Besamung bei Schweinen ist eine vielversprechende Lösung, aber die Handhabung des Samens und

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die Einzelheiten der Technik sind noch schwierig. So macht sich das Bedürfnis für Verfahren der Konservierung des Eberspermas hei tiefer Temperatur bemerkbar, die es ermöglichen, nach Anwendung bei einer Besamungstechnik hohe Raten von Würfen zu erzielen. Eine allgemeine Untersuchung dieses Problems wurde von J.P.Signoret, P. du Mesnil du Buisson und F.Bariteau unter dem Titel "!'insemination artificielle porcine" in "Bulletin Technique d¹Information" Nr.2571 Pebruar-März 1971, herausgegeben vom Landwirtschaftsministerium, Rue de

Varennes, Paris, veröffentlich„ >

Eine der größten Schwierigkeiten ist der Einsatz der Verdünnungsmittel des Samens, die ihn in die Lage versetzen, die Arbeitsgänge des Gefrierens.und Auftauens zu überstehen, ohne seine Aktivität insbesondere hinsichtlich der Fertilität der besamten Säue zu verlieren. In zahlreichen Veröffentlichungen wurden in den letzten Jahren die mit den verschiedensten Verdünnungsmitteln erzielten Ergebnisse beschrieben. Ein Beispiel für den

2Q Stand der Technik ist die Veröffentlichung von i ! M.Paquignon und P. du Mesnil du Buisson "Pertilite et prolificit£ des truies inseminees avec du sperme congele — Comparaison de deux dilueurs - Resultats preliminaires" in "Journees Rech. Porcine en Prance", Paris 1973s herausgegeben von I.T.P., 149 Rue de Bercy, Paris.

Dieser Artikel nennt zahlreiche Veröffentlichungen. Diese Literatur insgesamt veranschaulicht gut den Stand der Technik. Noch zu erwähnen bleibt die französische Patentschrift 71=42.579, in der die Behandlung des Ebersamens durch Gefrieren bei sehr tiefer Temperatur nach Gewinnung, Zentrifugieren, Verdünnen und Gefrieren der Samenflüssigkeit und durch Auftauen durch Einführen von gefrorenen Tabletten in ein Verdünnungsmittel und abschließende Einführung der so erhaltenen Verdünnung in den Uterus der Sau als bekannt angegeben wird. Die in

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dieser französichen Patentschrift 71.42.579 beschriebene Methode der Vorbehandlung und Verwendung des Spermas "besteht aus zwei Arbeitsgängen:

a) Die Samenflüssigkeit -wird nach der Gewinnung und vor dem Zentrifugieren deaktiviert.

b) Eine Lösung, die die Spermien mobilisiert, wird nach dem Auftauen der Verdünnung zugesetzt.

Es wird ferner festgestellt, daß das gleiche Verdünnungsmittel vorteilhaft für die Deaktivierung und für die Mobilisierung der Spermien im Augenblick der Besamung verwendet werden kann.

Um einen kurzen Überblick über die zur Zeit vorgeschlagenen Methoden des Gefrierens des Eberspermas mit dem Ziel der Befruchtung von Säuen nach dem Besamen durch Einführen in die Zervix zu geben, können die folgenden ι Verfahren genannt werden:

1) Direkte Verdünnung des Samens mit einem Verdünnungsmittel, das gegebenenfalls Glycerin enthält, oder

j ' 2) erste Zentrifugierung des Samens bei,Umgebungstempe-

20 ratur, sofortiges Verdünnen mit einem Verdünnungsmittel, das Glycerin enthält, und zweite Zentrifugierung bei einer Temperatur von etwa +5⁰C oder

3) Deaktivieren des Samens nach der Gewinnung und vor dem Zentrifugieren und anschließendes endgültiges

25 Verdünnen oder

4) einmaliges Zentrifugieren nach der Gewinnung und unmittelbares Verdünnen des Sediments mit einem glycerinhaltigen Verdünnungsmittel.

Das Verfahren (4) wird beispielsweise von D.Rohloff und G. Allmeling in Berliner und Münchener tierärztliche

Wochenschrift 17 (1972) 550-332 beschrieben. 509826/0912 -

; ι

Dieses Verfahren hat den Vorteil der Einfachheit. Wie jedoch der Artikel, der es beschreibt, zeigt, wird mit ihm keine Gestation der besamten Säu:e erzielt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren des vorstehend dargelegten allgemeinen Typs, das es ermöglicht, nach einmaligem Zentrifugieren des Ebersamens und durch zwei aufeinanderfolgende Verdünnungen, wobei die erste insbesondere mit einem glycerinfreien Verdünnungsmittel und die zweite insbesondere mit einem glycerinhaltigen Verdünnungsmittel vorgenommen wird, Gestationen mit einer höheren Rate als bei den bekannten Verfahren zu erreichen. Dieses Ergebnis war keineswegs vorauszusehen, denn auf dem Gebiet der Erfindung haben selbst eine sehr geringe Änderung der Bedingungen des Gefrierens und/oder eine Änderung der Zusammensetzung des oder der Verdünnungsmittel und/oder eine Änderung in der Aufeinanderfolge der Stufen des Verfahrens einen großen Einfluß auf die erhaltenen Ergebnisse, wie das reichliche verfügbare Schrifttum zeigt.

20' In ihrer allgemeinen Form betrifft die Erfindung somit j ein Verfahren zur Gewinnung von Ebersamen, der für die Konservierung bei tiefer Temperatur .geeignet ist, durch Auffangen des Spermas, Grobfiltration, Zentrifugieren, Verdünnen des Sediments der Zentrifugierung mit wenigstens einem Verdünnungsmittel und Gefrieren. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Zentrifugieren bei Umgebungstemperatur das Sediment der : Zentrifugierung mit einem ersten Verdünnungsmittel ver- : dünnt, das kein Kälteschutzmittel oder Kryoschutzmittel enthält, anschließend eine zweite Verdünnung mit einem '·- Verdünnungsmittel vornimmt, das ein Kryoschutzmittel ^: enthält, und dann die Temperatur des verdünnten Samens senkt und ihn in an sich bekannter V/eise gefriert.

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Gemäß einem entscheidend wichtigen Merkmal der Erfindung wird das ohne Fraktionierung der Flüssigphase des Ejakulats gewonnene Sperma nach der Gewinnung und vor jeder Verdünnung zentrifugiert, und die Zugabe des zweiten Terdünnungsmittels, das ein Kryoschutzmittel enthält, erfolgt erst nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach dem Zentrifugieren.

Unter dem hier gebrauchten Ausdruck "Kryoschutzmittel" ist jede Verbindung zu verstehen, die die Konservierung des Samens während des Gefrierens gewährleistet. Das

bekannte Kryoschutzmittel, das vorteilhaft für die Zwecke der Erfindung verwendet wird, ist das Glycerin, jedoch . können im zweiten Verdünnungsmittel auch andere Kryoschutzmittel, z.B. Dimethylsulfoxyd, Polyvinylpyrrolidon, Äthylenglykol oder Gemische dieser Verbindungen, verwendet werden. Auch andere Kryoschutzmittel sind geeignet, z.B. die Kryoschutzmittel, die in dem Artikel von , J.W. MacPherson (1968) "Semen processing-liquid and ί frozen" in Proceeding of 2nd Tech. Conf. on a.i. and reproduction, National Association of Animal Breeders, Seite 64 bis'67j beschrieben werden.

Der Zeitraum zwischen der Gewinnung des -Spermas und der Zentrifugierung kann von 0 bis etwa-4 Stunden variieren. Beispielsweise kann die Zentrifugierung gemäß der Erfindung unmittelbar nach der Gewinnung und Grobfiltration .

des Spermas oder auch innerhalb einer Zeit, die im allge-. meinen 4 Stunden nicht überschreitet, vorgenommen werden. Es ist zu bemerken, daß nach der manuellen Gewinnung und Filtration durch Gaze das ganze Ejakulat zentrifugiert

30 wird.

Nach der Zentrifugierung und Entfernung des Überstandes wird das Sediment mit einem Verdünnungsmittel, das kein Kryoschutzmittel enthält, insbesondere mit einem glycerinfreien Mittel verdünnt. Ein geeigneter Verdünnungsgrad ist 1 Teil S'ediment auf etwa 2 Gew.-Teile glycerin-

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freies Verdünnungsmittel, aber dieses Verhältnis kann nach Bedarf verändert werden. Beispielsweise können auf 1 Teil Sediment 1 bis 10 Gew.-Teile glycerinfreies Verdünnungsmittel verwendet werden. Die Temperatur, bei der die erste Verdünnung vorgenommen wird, liegt vorteilhaft in der Mähe der Umgebungstemperatur oder leicht darüber, jedoch kann hiervon in geringem Maße abgewichen und beispielsweise zwischen 15 und 35 G gearbeitet werden«

Im allgemeinen wird der Samen nach der Zugabe des ersten Verdünnungsmittels allmählich von Umgebungstemperatur auf eine mittlere Temperatur von etwa 15 0 gekühlt. Die Dauer dieses Abkühlens ist unterschiedlich, denn der Zeitraum zwischen dem Zentrifugieren und der zweiten Verdünnung kann zwischen 1 und 7 Stunden variieren. Im allgemeinen erfolgt der Zusatz des zweiten Verdünnungsmittels, das ein Kryoschutzmittel, z.B. Glycerin, enthält, 4 bis 5 Stunden nach dem Zentrifugieren. Beispielsweise wird der Samen, dem das erste Verdünnungsmittel zugesetzt worden ist, in 4 bis 5 .Stunden von Umgebungstempe-

ratur auf die mittlere Temperatur von !5⁰C gekühlt und dann ein zweites Mal durch Zusatz eines Verdünnungsmittels, das ein Kryoschutzmittel enthält, verdünnt. Dieses zweite Verdünnungsmittel kann mit dem ersten Verdünnungsmittel identisch sein, jedoch mit dem Unterschied, daß es zusätzlich ein Kryoschutsmittel, z.B.

Glycerin, enthält. Bei einer Ausführungsförm der Erfindung hat das zweite Verdünnungsmittel ungefähr das gleiche Volumen wie das erste glycerinfreie Verdünnungsmittel.

In gewissen Fällen ist die Kühlung des Samens, dem das erste Verdünnungsmittel zugesetzt worden ist, keine unerlässliche Maßnahme. Die Temperatur, bei der das zweite Verdünnungsmittel zugesetzt wird, kann in weiten Grenzen variieren und muß zwischen +4⁰C und +30⁰C liegen.

Im allgemeinen wird das zweite Verdünnungsmittel bei

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: einer Temperatur zugesetzt, die leicht unterhalb von Umgebungstemperatur (27⁰C) liegt, und dies ist die Temperatur, bei der vorzugsweise die Zentrifugierung und der Zusatz des ersten Verdünnungsmittels vorgenommen werden.

5 Wenn die erste Verdünnung bei Temperaturen oberhalb von Umgebungstemperatur, jedoch unter 37°C vorgenommen wird,

; erfolgt die zweite Verdünnung vorzugsweise, nachdem man

ι den Samen, dem das erste Verdünnungsmittel zugesetzt wor-

; den ist, der Abkühlung überlassen bat. Die -zweite Ver-

'10 dünnung kann jedoch auch bei Temperaturen oberhalb von

I Umgebungstemperatur vorgenommen werden, vorausgesetzt,

j daß der Zeitraum zwischen den beiden Verdünnungen aus-

I reicht, wobei der Samen nach Zusatz des ersten Verdünnungs·

j mittels bei der gewählten Verdünnungstemperatur gehalten

15 werden muß. '

Nach vollständiger Verdünnung unter'den vorstehend ge-

ι nannten Bedingungen wird die Temperatur des Samens von

j . der Temperatur, bei der das zweite Verdünnungsmittel zu-

• gesetzt worden ist, allmählich auf eine Temperatur von

! 20 etwa 4° bis 12⁰C, vorzugsweise 4° bis 5°C, gesenkt. Vor-

j zugsweise wird die Temperatur des Samens allmählich ge-

; senkt, um jeglichen Wärmeschock zu vermeiden. Schließlich

j erfolgt das eigentliche Gefrieren nach den bekannten

'- Tabletten- oder Pelletsverfahren über Trockeneis, wie von

j 25 H.ITagase und liwa (1964) V₀Cong Int. Reprod„Anim.Insem.

j Artif., Trente 4, Seite 410 bis 415, beschrieben. Zur

j Konservierung für längere Zeit werden die Pellets in der

I dem Fachmann bekannten Weise in Rohre überführt, die in

j flüssigen Stickstoff getaucht sind.

I 30 Das Gefrieren kann auch nach der Schuppenmethode erfolgen,

^: die bereits bei der Besamung von Schafen, Rindern und Ziegen angewandt wird.

_; Gemäß der Erfindung können für die' Verdünnung bekannte

; Verdünnungsmittel verwendet werden, wobei das eine kein

■-" ■-■ 5038 2 6 /09 12 "

Kryoschutzmittel wie Glycerin und das andere ein Kryoschutzmittel enthält.

Als Beispiel wird nachstehend eine geeignete Zusammensetzung für das erste Verdünnungsmittel genannt, das "beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden kann. Ausgegangen wird hierbei von einem als "Verdünnungsmittel A" bezeichneten ersten Produkt der folgenden Zusammensetzung:

Auf 1 Liter destilliertes Wasser:
Trinatriumcitrat.5,5 H₂O 24,28 g

Wasserfreie D-Glucose 3,00 g

"Chelaton"* 3,70 g

KCl 0,40 g

Natriumbicarbonat 2,10 g

SuIfamid 3,00 g

Antibiotika:Penicillin 1000 000 I.E.

Streptomycin 1,00 £

+Dinatriumsalzdihydrat von Äthylendiamintetraessig- ; säure CH₂N(CH₂-COOH)-CH₂-COONa₂.2 H₃O/"(CH₂N)₂ (CH₂COOH)₂(CH₂COONa)₂.2H₂0_7.

Zu 72 ml dieser Lösung'(Verdünnungsmittel A) werden 16 ml Eigelb, 6,4 g Milchpulver und 6 ml destilliertes Wasser gegeben. Hierbei wird ein für die Zwecke der Erfindung geeignetes erstes Verdünnungsmittel," nachstehend als "Verdünnungsmittel I" bezeichnet, erhalten.

Ein Grundgemisch der gleichen Zusammensetzung kann nach Zusatz von 6 ml Glycerin an Stelle von 6 ml destilliertem Wasser als zweites Verdünnungsmittel verwendet werden.

Natürlich kann jede Menge des Verdünnungsmittels I unter Beachtung der Mengenverhältnisse der vorstehend genannten Bestandteile hergestellt werden.

'30 Ein weiteres .Verdünnungsmittel, das als erstes Verdünnungsmittel beim Verfahren gemäß der Erfindung-geeignet ist, hat die folgende Zusammensetzung:

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Wasserfreie D-G-lucose 5,67 g

Eigelb 22,50 ml

Destilliertes Wasser - 77,50 ml

Ein als zweites Verdünnungsmittel geeignetes, glycerinhaltiges Verdünnungsmittel hat die folgende Zusammensetzung:

Wasserfreie D-Glucose · 5*67 g

Eigelb . ■ 22,50 ml

Glycerin 6 ml

Destilliertes Wasser 77,50 ml

Das letztgenannte Verdünnungsmittel wird im Artikel von C.Polge, S. Salamon und I.Wilmut in Vet.Rec. 87 (1970) 424-428 beschrieben. . :

Das Verdünnungsmittel A der vorstehend genannten Zusammensetzung kann auch als erstes Verdünnungsmittel verwendet werden, jedoch muß in diesem Pall die zweite Verdünnung bei einer Temperatur von 15°C o.der höher vorgenommen werden.

Zur künstlichen Besamung von Säuen wird der in dieser Weise bei sehr tiefer Temperatur gefrorene Ebersamen aufgetaut. Hierzu werden die gefrorenen Tabletten in bekannter Weise in ein flüssiges Produkt gegeben, das eine Temperatur von 35°bis 60⁰C hat, wodurch sich eine Verdünnung des Spermas ergibt, die für die Besamung, d.h. für die Einführung in den Uterus der Sau, geeignet ist. Nach der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung kann zum Auftauen als flüssiges Produkt, das die Tabletten aufnimmt, bei 37⁰O gehaltenes Samenplasma des. Typs verwendet werden, der beispielsweise in der Arbeit von B.Crabo, S.Einarsson, A.M.Lamm, O.Soosalu und S.Viring

(1972) "Vllth Intern.Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination", Zusammenfassung Seite 331, beschrieben wird. Ein weiteres geeignetes flüssiges Produkt ist ein glycerinfreies Verdünnungsmittel, das bei einer 509826/0912

Temperatur von 4-0° bis 50⁰G verwendet wird. Ein Verdünnungsmittel, das für die Zwecke der Erfindung zum Auftauen "besonders gut geeignet ist, ist das Verdünnungsmittel A, dessen Zusammensetzung vorstehend genannt wurde. Die Verwendung dieses Verdünnungsmittels zum Auftauen gewährleistet gutes Überleben und Aufrechterhaltung der Motilität der Spermatozoen.

Nach dem Auftauen variiert der Anteil der beweglichen Spermatozoen zwischen 25 und 30?ίο Die Motilität ist sehr gut.

Bei Anwendung des Konservierungsverfahrens gemäß der Erfindung und unter Verwendung von Ebersperma für die künstliche Befruchtung von Säuen wurde gefunden, daß der Anteil der trächtigen Säue im Durchschnitt 66$ und der mittlere Anteil von Eiern, die nach einer Trächtigkeitsdauer von 30 Tagen zur Entwicklung von Embryos führte, $ betrug. ·

. I Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter : erläutert.

ι _

20 Beispiel 1

Eber der Rasse Large-White wurden verwendet. Nach manueller Gewinnung und Eiltration des Spermas durch Gaze wird das ganze Ejakulat 15 Minuten bei 1800 U/Min, zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wird das Sediment im Volumenverhältnis von 1:2 mit einem Verdünnungsmittel der folgenden Zusammensetzung verdünnt:

Wasserfreie D-Glucose 5,67 g

Eigelb 22,50 ml

Destilliertes Wasser 71,50 ml

Der Samen wird in 1 Stunde von 27⁰C auf 15⁰C gekühlt, 4 Stunden bei 15°C gehalten und dann mit einem Verdün nungsmittel der folgenden Zusammensetzung verdünnt;

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Wasserfreie D-Glucose 5j67 g

Eigelb 22,50 ml

Glycerin 6 ml

Destilliertes Wasser 71,50 ml

■5 Das glycerinhaltige Verdünnungsmittel wird in der gleichen Menge wie das glycerinfreie Verdünnungsmittel verwendet. Die Temperatur des Samens wird dann innerhalb einer Stunde von 15°C auf 5°C gesenkt. Das Einfrieren erfolgt in "Pellets" von 0,07 "bis 0,08 ml auf Trockeneis nach der Technik von Nagase und Mwa (siehe oben), Nach einer Wartezeit von 4 Minuten werden die Pellets in durchsichtige. Röhrchen überführt, die in flüssigen Stickstoff getaucht sind. Das Auftauen erfolgt bei 50 C im Verdünnungsmittel A der vorstehend genannten Zusarnmen-Setzung, wobei 1 Raumteil gefrorenes Sperma pro 5 Raum-

! teile Verdünnungsmittel A verwendet wird. Die Besamung erfolgt 34 Stunden nach Beginn des'Östrus. Von sieben besamten Säuen wurden sechs trächtig (Kontrollen zwischen

dem 30. und 50.Tag). ■ j

j 20 Beispiel 2 !

j Nach manueller Gewinnung und Filtration durch Gaze wird ; das ganze Ejakulat 15 Minuten bei 28° bis 30⁰C mit ; 1900 U/Min, zentrifugiert (800 g·)." Das in zwei Teile ge- ! teilte Sediment wird im Verhältnis von 1:2 mit dem Ver-

j 25 üjünnungsmittel I der oben genannten Zusammensetzung verdünnt. Der Samen wird in 5 Stunden von 28⁰C auf T5°C gekühlt und dann erneut mit dem gleichen glycerinhaltigen Verdünnungsmittel (Glyceringehalt 6$) (Volumen des glycerinhaltigen Verdünnungsmittels = Volumen des glycerinfreien Verdünnungsmittels) verdünnt. Die Temperatur des Samens wird dann in einer Stunde von 15°C auf 5°C gesenkt. Das Sperma wird dann in Tabletten gefroren. Für diesen Versuch wurden _:sechs Ejakulate verwendet.

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Beispiel 3

Der Versuch wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei eine erste Verdünnung im Verhältnis von 1 :2 mit dem in Beispiel 1 genannten glycerinfreien Verdünnungsmittel vorgenommen wird. Der Samen wird anschließend drei verschiedenen Behandlungen in einem faktoriellen Versuch (3x3) (siehe Abbildung) unterworfen, der sich auf die Art der Kühlung auf 5°C (Kurven A, B und C) und die Temperatur der Glycerinbehandlung (3O⁰C - 15⁰C - 5⁰C) erstreckte.

In der Abbildung sind die Art der Kühlung (Zeit-Temperatur-Kurven) und die Temperatur der Zugabe des zweiten glycerinhaltigen Verdünnungsmittels für die verschiedenen Behandlungen dargestellt. Die Zeit ist in Stunden als Abszisse und die Temperatur in C als Ordinate aufgetragen.

/' Pur jede Art der Kühlung wurde der Glycerinzusatz in vergleichbarer Weise bei Temperaturen von 30 C₁ 15°C und 5 C vorgenommen. Der Glycerinzusatz bei 15 C für die Behandlung (B) erfolgte bei einer Probe nach einer Kühlzeit von 1 Stunde und bei einer anderen Probe nach einer Kühlzeit von 5 Stunden. Die zweite Verdünnung mit dem glycerinhaltigen Verdünnungsmittel ist mit der vorstehend beschriebenen identisch. Dieser Versuch wurde mit dem Samen von vier Ejakulaten von drei Ebern wiederholt.

Das Einfrieren erfolgte bei allen Behandlungen ausgehend von dem auf 5°C gekühlten Samen und außerdem bei den Behandlungen (A) und (C) ausgehend von dem auf 15 C gekühlten Samen. Der Samen wurde in Tabletten von 0,1 ml auf Trockeneis nach der Technik von Nagase und Niwa (siehe oben) gefroren. Die Proben, denen das Glycerin bei 5°C zugesetzt worden ist, wurden in weniger als 50 Sekunden eingefroren. Nach einer Wartezeit von 4 Minuten auf Trockeneis wurden die Tabletten in flüssigen

35 Stickstoff überführt.

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Die Tabletten wurden im Verdünnungsmittel A bei 50 C (10 Tabletten auf 5 ml Verdünnungsmittel) aufgetaut. Die Untersuchungen der verschiedenen Proben wurden wilkürlich 5 Minuten und 3 Stunden nach dem Auftauen durchgeführt.

Ergebnisse

Der Anteil von lebenden Spermatozoen, die nach dem Auftauen mit dem Verdünnungsmittel der Beispiele 1" und 3 erhalten wurden, ist wesentlich höher als der Anteil, der mit dem in Beispiel 2 genannten Verdünnungsmittel I erhalten wurde (26,1$ gegenüber 13,6$) (Tabelle I).

Nach einer Incubationszeit von 3 Stunden ist das Verdünnungsmittel der Beispiele 1 und 3 immer überlegen. Der Unterschied zwischen den beiden Verdünnungsmitteln ist jedoch nicht mehr bedeutsam. Die Abnahme der überlebenden Spermatozoen bei dem Verdünnungsmittel der Beispiele 1 und 3 ist sogar stärker als bei Verv/endung des Verdünnungsmittels I (36$ gegenüber 27$). \

Tabelle I · ^:

Einfluß des verwendeten Verdünnungsmittels auf den Anteil

der lebenden Spermatozoen nach dem Auftauen und nach

3 Stunden Incubation. ^ ,

Zeitpunkt der Unter	Fach dem	I (	13,6	Auf-·	Nach 3-stün-	Vermin
suchung des Spermas	tauen		diger In	derung
			cubation	des An
				teils
				lebender
				Sperma
				tozoen
Verdünnungsmittel
der Beispiele 1 und"3			16,66	36$
Verdünnungsmittel	>*
von Beispiel 2		9,83	27$

η = 6; *Signifikant beim. Schwellenwert von

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Der Glycerinzusatz bei 15°0 nach einer Kühldauer von 1 Stunde oder 5 Stunden (Kühlmethode (B)) hat keinen wesentlichen Einfluß auf den Anteil lebender Spermatozoen vor dem Gefrieren (60,4> gegenüber 60,4$)» nach dem Auftauen (24,9$ gegenüber 25,9°/°) und nach 3-stündiger Incubation bei 37°C (19,2 % gegenüber 19,7 %).

Bei der statistischen Globalanalyse des faktoriellen Versuchs wurde für die Kühlgeschwindigkeit (B) der Glycerinzusatz bei !5⁰C nach einer Kühlseit von 5 Stunden zu Grunde gelegt.

Diese Analyse (Tabelle II) zeigt, daß die Kühlgeschwindigkeit und die Temperatur der Glycerinzugabe (ausgenommen der Prozentsatz lebender Spermatozoen nach 3-stündiger Incubation) einen großen Einfluß auf den Anteil lebender Spermatozoen zu den verschiedenen Zeitpunkten der Untersuchung des Spermas hat. Vor dem Gefrieren hat die Temperatur der Glycerinzugabe einen größeren Einfluß als die Kühlgeschwindigkeit. ¥acb dem Auftauen ist dieser Effekt umgekehrt, und nach der Incubation hat lediglich die Geschwindigkeit des Kühlens noch einen wesentlichen Einfluß. Es gibt keinerlei Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Behandlungen.

Tabelle II :

Untersuchung des Anteils lebender Spermatozoen: Standardabweichung P für die verschiedenen Behandlungen

Zeitpunkt der Untersuchung des Spermas (lebende Sperma tozoen in °/o)

Behänd- Kühige- Temp.der lung schwin- Glycerin· digkeit zugabe

Vor dem Gefrieren

Nach dem Gefrieren

Nach 3-stündiger Incubation

*P <0,05; **P

Usache der Änderung

5,19** 4,23.* 12,10** 2,76** 7,22** 3,47* 2,95** 9,77** 0,47

Wechselbeziehung

2,21 0,18 0,79

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■ Ein Vergleich der Mittelwerte (Tabelle III) zeigt, daß

: . vor dem Gefrieren eine Glycerinzugabe bei 5 C mit sofor-

: tigern Gefrieren zu wesentlich schlechteren Ergebnissen

j (P<O,05) führt als eine Glycerinzugabe bei 15°C oder

i 5 30°C (52,7$ gegenüber 61,2$ und 61,1$). Nach dem Auftauen

; führt eine Glycerinzugabe bei 15 C zu einem Anteil an

I wiederbelebten Spermatozoen, der wesentlich höher ist

I als bei einer Glycerinzugabe bei 4°C (23,4$gegenüber

I 19*1°/°)· Eine Glycerinzugabe bei 3O⁰C ist von einer Zugabe

10 bei den beiden anderen Temperaturen nicht .wesentlich verschieden. Nach 3-stündiger Incubation ist keinerlei

! Einfluß des Zeitpunkts der Glycerinbehandlung vorhanden.

j Mit hoher.Kühlgeschwindigkeit vor dem Gefrieren (C) j werden wesentlich bessere Ergebnisse als bei den beiden

; 15 anderen Geschwindigkeiten erzielt (P<^0,05) (61,69ε

; gegenüber 5-6,3$ und 57$)* Nach dem Auftauen und nach der I Incubation werden bei der Kühlgeschwindigkeit (B) wesent-

i lieh bessere Ergebnisse erzielt (P<L0,05) (24,1$ gegenüber 21,4$ und 18,3$) und (17,6$ gegenüber 13,5$ und ; I 20 18,5$). . i

Das Gefrieren ausgehend von dem bei 15°C gehaltenen Samen ist dem Gefrieren ausgehend von einem bei 5⁰C gehaltenen Samen wesentlich unterlegen (12,1$ gegenüber 21,9$) (P <O,O1). !

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Tabelle III

Einfluß der Geschwindigkeit des Kühlens und des Zeitpunktes des Glycerinzusatzes auf den Anteil von beweglichen Spermatozoen nach verschiedenen Behandlungen

co ■■ ro

Behand
lungen

Lebende Spermatozoen
dem Gefrieren

5

4

57

vor

Lebende Spermatozoen nach
dem Auftauen

15

4

m

Lebende Spermatozoen nach
3-stündiger Incubation

15

,2* 1

1

5

Temp.der
Glycerin-
Zusatzes·

30 1

56

m

30

'⁵C ¹

7

Kühlge
schwin
digkeit

48,7*

61

20,9*

16,2*

18,3*

2,8* 10

^fI

.5*

A

61,2^a 61,

♦?

48,7*

58

.0*.

19,3^a

25,9^a

23,0^a

24,1-^a

11,3* 1

9,7^a 16

'⁵C ¹

4

,6^a

B*

60,0^a 60,
O

°c

60,8^a

23,5^a

23,5^a*

20,0^*

21,4*

16,7^a 1

2,9* 13

,5^b

C

62,0^a 62,
C

52,7_d

,6^a

2.0,85

23,4_C

19,7_d

21,5·

13,9fi

5>¹c ¹^

,2

5

61,1_C 61,

,3

²^d

14,0_c 1

Die Mittelwerte, aufiiie senkrecht (a,b) oder waagerecht (c,d) nicht der gleiche Buchstabe folgt, sind in der Signifikanz verschieden.

*Für die Arbeitsweise B mit Glycerinzusatz bei 15°C wurden nur die Werte festgehalten, bei denen der Glycerinzusatz nach einer Kühlzeit von 5 Std. erfolgte.

cn co ro

Claims

Patentansprüche

1)/Verfahreη zur Gewinnung von Ebersamen, der für die Konservierung bei tiefer Temperatur geeignet ist, durch Auffangen des Spermas, Grobfiltration, Zentrifugieren, Verdünnen des Sediments der Zentrifugierte mit wenigstens einem Verdünnungsmittel und Gefrieren, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Zentrifugieren bei Umgebungstemperatur das Sediment der Zentrifugierung mit einem ersten Verdünnungsmittel verdünnt, das kein Kryoschutzmittel enthält, anschließend eine zweite Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel vornimmt, das ein Kryoschutzmittel enthält, und dann die Temperatur des verdünnten Samens senkt und ihn-in an sich bekannter Weise gefriert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das ohne Fraktionierung der Flüssigphase des Ejakulats gewonnene Sperma nach der Gewinnung und vor jeder

/ Verdünnung zentrifugiert und das zweite Verdünnungs-

j mittel, das ein Kryoschutzmittel enthält, erst nach i

Ablauf einer bestimmten Zeit nach dem Zentrifugieren-

zusetzt.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,. dadurch gekennzeichnet, daß man als Kryoschutzmittel im zweiten Verdünnungsmittel Glycerin verwendet.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitraum.zwischen dem.Auffangen des Spermas und dem Zentrifugieren 0 bis etwa 4 Stunden beträgt.

5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß man das ganze Ejakulat bei einer Temperatur in der Nähe oder leicht oberhalb von Umgebungstemperatur zentrifugiert.

5 0 9 8 2 6/0912

6) Verfahren nach Anspruch 1 "bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man zum Verdünnen des Sediments der Zentrifugierung mit dem ersten Verdünnungsmittel 1 "bis

10 Teile, vorzugsweise etwa 2 Gewo-Teile Verdünnungsmittel pro Gew.-Teil Sediment verwendet.

7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Verdünnungsmittel dem Sediment der Zentrifugierung bei einer Temperatur zwischen 15 und 55°C, vorzugsweise bei einer Temperatur in der
Nähe oder leicht oberhalb von Umgebungstemperatur zusetzt.

8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7 s dadurch gekennzeichnet, daß man den Samen nach der Zugabe des ersten
Verdünnungsmittels von Umgebungstemperatur allmählich auf eine mittlere Temperatur von etwa 15°0 kühlt.

9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Verdünnung bei Temperaturen
oberhalb von Umgebungstemperatur vornimmt, anschliessend den Samen mit zugesetztem ersten Verdünnungsmittel kühlen läßt und dann die zweite Verdünnung vornimmt.

10) Verfahren nach Anspruch 1- bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitraum zwischen dem Zentrifugieren

und der Zugabe des zweiten Verdünnungsmittels etwa
1 bis 7 Stunden, vorzugsweise 4 bis 5 Stunden beträgt,

11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das zweite Verdünnungsmittel bei einer
Temperatur zwischen +4° und +30⁰C, vorzugsweise bei
einer Temperatur von 15⁰C zusetzt.

12) Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur des Samens von der Temperatur, bei der das zweite Verdünnungsmittel zugesetzt

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; worden ist, allmählich auf eine Temperatur von etwa

■ 4° bis 12⁰C, vorzugsweise von 4° bis 5°C senkt und ihn

■ ' dann in an sich bekannter Weise in Form von Tabletten

! oder Pellets gefriert.

I

13) Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeich- ; net, daß man ein erstes Verdünnungsmittel (Verdünnungsj mittel I) verwendet, das durch Zusatz von 16 ml Eigelb, i 6,4 g Milchpulver und 6 ml destilliertem Wasser zu 72 ml einer als "Verdünnungsmittel A" bezeichneten

\- - Lösung erhalten worden ist, die pro Liter destilliertem j Wasser die folgenden Bestandteile enthält:

24,28 g 1000000 g I.B 3,00 g 1,00 3,70 g 0,40 g 2,10 g • 3,00

Trinatriumcitrat.5,5 HgO wasserfreie D-Glucose

Dinatriumsalzdihydrat von Äthylendiamintetraessigsäure '

KCl

ITatriumbicarbonat Sulfamid

Antibiotika: Penicillin

Streptomycin

14) Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites Verdünnungsmittel das Verdünnungsmittel I verwendet, dem man an Stelle von 6 ml destilliertem Wasser 6 ml Glycerin zugesetzt hat.

15) Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein erstes Verdünnungsmittel der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Wasserfreie D-Glucose . 5,67 g

Eigelb 22,50 ml

'destilliertes Wasser · · . 77,50 ml

16) Verfahren nach Anspruch 1 bis 12 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites Verdünnungsmittel das Verdünnungsmittel nach Anspruch 15 verwendet, dem

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man an Stelle von 6 ml destilliertem Wasser 6 ml Glycerin zugesetzt hat.

17) Verfahren nach Anspruch 1 bis 12 und 1J>, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes Verdünnungsmittel das Verdünnungsmittel A gemäß Anspruch 13 verwendet und in diesem Fall die zweite Verdünnung'bei einer Temperatur von 15°C oder darüber vornimmt.

18) Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1. bis 17 erhaltene, bei sehr tiefer Temperatur gefrorene Tabletten oder Schuppen von Ebersperma.

19) Für die künstliche Befruchtung von Säuen geeignete Eberspermalösung, erhalten durch Zusatz von Tabletten nach Anspruch 18 zu einer bei einer Temperatur von J55° bis 6o°C gehaltenen Auftauflüssigkeit.

20) Lösung nach Anspruch 19* dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Auftauen der Tabletten im bei einer Temperatur von etwa 37 C verwendeten S.amenplasma erhalten worden ist.

21) Lösung nach Anspruch 19* dadurch"gekennzeichnet, daß sie durch Auftauen der Tabletten gemäß Anspruch 18 im bei einer Temperatur von etwa 5O⁰C verwendeten Verdünnungsmittel A gemäß Anspruch 1J> erhalten worden ist.

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